護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途的制作方法

專利名稱：護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥應用技術領域，特別涉及中藥護骨膠囊在預防由糖皮質激素引起 的骨質疏松疾病中的應用。
背景技術：
糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)是臨床上應用較多的一類藥物，但是大劑 量應用GCs可能導致多種并發癥，GCs誘導的繼發性骨質疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis,GI0)就是其中之一。地塞米松(Dex)是GCs的一種，因其具有良好的抗炎、 抗免疫作用而在臨床上應用極為廣泛，但長期大劑量使用Dex，可造成GIO等一系列嚴重的 不良反應，即使是生理劑量的Dex也可引起骨丟失等骨質疏松綜合癥狀。GIO先是引起骨 丟失，繼而導致骨折，嚴重影響了患者的健康狀況和生活質量。目前臨床上防治骨質疏松 (osteoporosis,0P)所用的西藥多以局部靶點為作用位點，這種療法對OP這種多因多果的 代謝性疾病的治療存在著一定的局限性。中醫藥主張多途徑、多靶點的用藥機制，因此從中 醫藥中尋找治療GIO的藥物意義重大。中藥護骨膠囊(HuGu capsule, HG)，以補腎、健脾、活血化瘀組方，其中組方為何 首烏、淫羊藿、熟地、龜甲、巴戟天、杜仲、續斷、骨碎補、當歸、山藥。前期研究發現HG防治 原發性骨質疏松療效顯著，而且該藥具有多方面調節成骨細胞和破骨細胞的作用。中醫認 為GIO的發病與腎虛有關，因而根據HG的組方，推測其可能具有預防GIO的作用。為了探 討HG是否可以預防GI0，本發明通過GCs誘導實驗動物GI0，采用骨形態計量學和骨生物力 學的方法，觀察HG對GIO的預防作用，為開發HG的新用途提供實驗依據。

發明內容
本發明的目的在于將中藥護骨膠囊，簡稱HG，開發出一種新用途，將其用在原發 性骨質疏松治療的基礎上開發為繼發性骨質疏松的預防，即糖皮質激素(GCS)所致的骨質 疏松GIO的預防應用。本發明的目的通過以下技術方案實現的通過動物實驗，確定藥效和定量指標。1動物模型、取材部位及實驗方法的選擇1. 1動物模型及取材部位的選擇GIO非常普遍，日益受到人們的重視。隨著GIO預防和治療的發展，需要對這一疾 病做更深入和廣泛的了解，因此，選擇并建立一個理想的動物模型和合適的研究方法，是探 討GIO病因和尋找治療藥物的關鍵。1)動物模型的選擇大鼠價格便宜，管理方便，生長迅速，生命周期短，有很好表型的骨骼系統，遺傳種 系清楚，能再現人類OP的狀態，而且重復性好。陸邦超等人以Dex lmg/kg肌肉注射大鼠，每周2次。結果發現8w后，這些大鼠 的骨密度、骨生化、骨力學、骨組織形態學指標均出現了顯著性變化，說明這些大鼠造模成功。為保證動物模型的高成功率及低死亡率，我們認為最佳造模劑量應為0. 25mg/100g體 重，此劑量約為Olgaard報導90天成模劑量的4倍，又遠低于彭國瑞報導的的長期應用激 素的最小致死量。因此本實驗以肌肉注射0以(2次/ ，2.51^/1^/次，64的方式制造GIO 的動物模型。2)取材部位的選擇骨組織是組織嚴密、排列有序的致密結締組織。骨強度與骨量、骨結構和微結構以 及骨質量密切相關。依據骨結構密度的不同，將骨分為皮質骨和松質骨。皮質骨體積是松 質骨體積的4倍，但松質骨較皮質骨有更大的表面積，在骨代謝中發揮重要作用。皮質骨在長骨可分為內外骨板和骨單位，骨板為實質，排列緊密，與最大力學載荷 相對應。皮質骨有兩面骨內膜和骨外膜。骨內膜的細胞常排列成一層，靜止時候扁平，活 躍時分化為成骨細胞，在骨轉換中起重要作用。松質骨分布于長骨的干骺端、椎體等處，其束狀或板狀結構構成三維分支網架，狀 如“腳手架”，承受力學負荷，對皮質骨的支撐作用尤為重要。松質骨是骨代謝最活躍的部 位，也是骨丟失最早出現的區域。選用鼠類做力學試驗的動物模型時，一般只能選用對長骨 的彎曲和對脊椎骨的壓力測試。因此本實驗的取材部位包括PTM、TX、LF和LV。1.2實驗方法的選擇1.2. 1骨組織形態計量學骨組織形態計量學(bone histomorphometry)是基于OP的細胞和組織學形態發 生改變導致功能改變而進行的一種體視學定量研究技術。該技術通過應用數學和幾何學的 方法對骨組織水平的質(骨結構)和量(骨量)等形態學變化的相當部位的形態計量學觀 察，可以科學地對骨建造和骨重建兩個過程，特別是可以對實驗藥物對骨的吸收過程和骨 的形成過程進行客觀的和科學的評價，可以更清楚地了解到藥物作用于骨代謝的具體環節 以及藥物對骨的作用及作用機制，是OP防治藥物藥效學研究的重要評價指標。美國食品和 藥品管理局(FDA)對防治OP癥新藥研究的藥效學指南指出，確定藥效的定量指標，必須提 供骨組織形態計量學參數，從參數中提供該新藥的作用機制和作用環節(骨重建、骨吸收 和骨形成)。1.2. 2骨生物力學骨生物力學檢驗直接反映防治骨質疏松藥物對骨組織結構的力學效應，是研制和 開發防治骨質疏松新藥的一個重要檢驗手段。骨在受到外力時，其內部組織結構和外部形 態都將隨之改變，這種改變直接反映在骨的結構力學和材料力學性能的變化上。骨所能承 受的載荷、變形等是反映骨結構力學特征的指標，這些指標受骨尺寸大小和幾何形狀的影 響，OP時，骨的結構力學性能參數均有不同程度的下降，骨抵抗外力的能力降低，骨脆性增 加，輕微外力即引起骨折。因此力學性能參數是反映和評價骨質量的最直接的指標，故美國 FDA發布的《0P指南》中要求有關OP的實驗應進行骨強度的生物力學測定。盡管骨密度測 定常作為臨床評價OP的替代方法，但是直接的生物力學測試為臨床前研究無疑能夠提供 更多有關骨力學性質的信息，因而，將生物力學測試作為一種“金標準”測試手段。骨生物 力學測試直接反映了防治OP藥物對骨組織結構的力學強度的影響，是研制和開發防治OP 新藥的一個重要手段。因此，本發明采用骨形態計量學和骨生物力學的方法，研究了 Dex及HG對大鼠皮質骨TX、LF和松質骨PTM、LV的影響情況，從而由此評價HG對GIO的預防作用。2HG對Dex造模大鼠的影響2. IHG對Dex造模大鼠體重和軟組織重量的影響本發明研究發現，HG沒有增加短期使用Dex的造模大鼠的體重，其體重仍低于 Ctrl組。長期使用Dex的大鼠的體重，是否通過長期使用HG-M干預，而得以恢復，需要進行 Dex與HG的長期實驗加以證實。與Mod組相比，HG_L、M組大鼠腎臟的重量顯著增加，而且HG-M組大鼠腎臟的重量 明顯高于GSB組。其它各組大鼠的脾臟的重量與Ctrl組相比顯著減少，而HG-M組大鼠脾 臟的重量與Ctrl組相比，卻沒有變化。說明HG-M對短期使用Dex導致大鼠的腎臟和脾臟 的重量下降產生了明顯的抑制效果。2. 2HG對Dex造模大鼠TX形態計量學的影響中藥HG，可以預防Dex誘發的皮質骨的骨丟失，其中HG-M的效果比HG-L和HG-H 好。其機理為通過增加骨內膜的熒光周長和骨形成率，并且降低破骨細胞的骨吸收率，從而 增加皮質骨的骨量。由此認為(I)HG增加了 Dex造模大鼠皮質骨的骨量。低劑量的HG既可抑制Dex 導致的皮質骨的減少；中劑量的HG的這種抑制作用最強；而高劑量的HG的抑制作用不如 中劑量HG。(2)HG增加了 Dex造模大鼠皮質骨的骨量的機理與促進骨形成和抑制骨吸收有 關。(3) GSB降低骨吸收，而未提高骨形成，這提示HG防治GIO的效果可能好于GSB。2. 3HG對Dex造模大鼠PTM形態計量學的影響從本發明的研究結果可以看出雖然Dex未造成PTM的骨丟失，但HG-M與Mod相 比，仍能增加MAR、減少Oc. N，從而使骨小梁的骨量％ Tb. Ar顯著增加。而且這一作用還超 過Ctrl和GSB。HG增加了松質骨的MAR，MAR代表了成骨細胞的活性。這個結果與HG對 皮質骨作用的機理不同，HG對皮質骨的作用機理是增加％ L. Pm，此指標代表成骨細胞的數 量，這也說明HG預防GIO的多途徑多靶點的特點。2. 4HG對Dex造模大鼠LV和LF骨生物力學的影響HG對Dex誘導的大鼠LF皮質骨的生物力學性能參數沒有影響，可能與骨骼的幾 何形狀改變有關。在自然環境的適應和改造過程中，骨頭得到不斷的進化，得到了最優化的 結構形態。也就是說，骨以最優化的結構形態趨適應相應的力學環境。同時，當力學環境改 變時，骨的組織結構形態發生變化，仍以最優結構形態去適應新的環境。但是HG-M組LV松 質骨的生物力學參數中，最大載荷、最大應力、最大變形均顯著性提高(P <0.05)。最大應 力主要受骨骼無機相質量的影響，屬于骨材料力學的指標，它們反映的是骨的材料本身的 力學性能，而與骨的大小及形態無關，主要由骨的構成成分及膠原的含量、排列決定。骨最 大載荷和最大變形可反映骨力學強度和骨韌性，是骨結構力學的重要指標，骨質疏松時，骨 的力學強度和骨韌性下降，易于發生骨折。Pak等學者研究認為，單純骨密度的提高與實際 骨質量的改善之間有時存在明顯偏差。單憑骨密度并不能準確地反映骨質量的變化，還需 要觀察生物力學性能指標，它們可以反映骨的內在質量和性能的改變，能夠表示骨的強度 和抵抗外力的能力。在骨質疏松發生過程中，最初表現為松質骨的骨量下降，隨后皮質骨變 薄，骨髓腔增大，骨強度減弱，導致抗外力作用下降。其中松質骨的生物力學檢測的敏感性 相對較高。本實驗中，HG-M組大鼠LF的骨材料和骨結構力學性能與模型組相比，均明顯提
5高，表明HG可改善骨質疏松模型大鼠的骨生物力學指標，具有抗GIO的作用。3 結論本發明的治療原發性OP的中藥-HG，可以預防Dex誘發的皮質骨的骨丟失，其中 HG-M的效果要比HG-L和HG-H好。其機理為通過增加骨內膜的熒光周長和骨形成率，并且 降低破骨細胞的骨吸收率，從而增加皮質骨的骨量。HG對大鼠皮質骨生物力學性能不影響， 這是由于骨骼幾何形狀的變化符合力學的結構有關。本實驗Dex未造成松質骨的骨丟失， 但與Dex和Ctrl比，HG-M仍可促進松質骨的成骨細胞的活性(MAR)，抑制破骨細胞的吸收 功能，進而增加松質骨的骨量。而且，大鼠腰椎松質骨的生物力壓縮實驗顯示，HG-M改善了 腰椎松質骨的材料力學狀況。上述結果提示HG可能具有預防Dex誘導的繼發性骨質疏松 (GIO)的作用。本發明的有益效果為短期、間斷使用Dex (6w, 2. 5mg kg-l,2/w)，僅使大鼠皮質骨丟失，由于骨骼幾何形狀的變化符合力學的結構要求，因而并未改變大鼠骨骼 的生物力學性能。此結果提示Dex的短期使用對大鼠不同部位的骨骼影響程度不同，先出 現皮質骨的骨丟失，而未出現松質骨的骨丟失。中藥HG可以預防Dex誘導的皮質骨的骨丟失，其中HG-M的綜合效果要比HG_L、H 好。其機理是通過增加骨內膜的熒光周長和骨形成率，并且降低破骨細胞的骨吸收率，從 而增加皮質骨的骨量。雖然Dex未造成松質骨的骨丟失，但與Dex和Ctrl比，HG-M仍可促 進松質骨的形成和礦化，抑制破骨細胞的吸收功能，進而增加松質骨的骨量。而且，HG-M還 改善了大鼠腰椎松質骨的生物力學性能，也就是提高了松質骨的材料力學和結果力學的功 能。提示HG具有預防Dex誘導的繼發性骨質疏松(GIO)的作用。


圖1是TX的橫切面和PTM的縱切面暴露圖。
圖2是TX測量范圍圖。
圖3是PTM測量范圍圖。
圖4是股骨三點彎曲試驗圖。
圖5是椎骨壓縮試驗圖。
圖6是HG對大鼠體重的影響圖。
圖7是HG對大鼠軟組織重量的影響圖。
圖8是HG對大鼠TX形態計量學靜態參數的影響圖。
圖9是HG對大鼠TX形態計量學動態參數的影響圖。
圖10是HG對大鼠PTM形態計量學靜態參數的影響圖。
圖11是HG對大鼠PTM形態計量學動態參數的影響圖。
圖12是HG大鼠腰椎生物力學性能的影響圖。
具體實施例方式下面結合說明書附圖，進一步說明本發明。護骨膠囊(HG)是根據“君、臣、佐、使”的配伍，采用補肝腎，益精血，調理陰陽的治則，輔以養血活血，祛風除濕，強筋壯骨，止痛鎮靜之法，經一定工藝加工而成的中藥復方膠 囊制劑。其中，制何首烏、淫羊藿補肝腎，益精血，祛風濕，在本方中為“君藥”；而熟地黃、龜 甲則滋腎陰，補血養陰，在方中為“臣藥”；再“佐”以巴戟天、杜仲、續斷、骨碎補等補肝腎，強 筋骨，祛風濕藥物加強君藥的作用，還增加了鎮痛的效果，使本方在治療OP的同時，兼止痛 鎮靜進而更有效發揮本方的綜合作用；而當歸、山藥作為“使藥”則有補血益精之效。是在 中醫理論指導下形成的國家中藥新藥(新藥證書編號國藥證字Z20040106)，目前已經生 產銷售近五年，在臨床應用上已獲得了很好的防治原發性骨質疏松的療效，但從HG的組方 來看，其對GIO的防治也有一定的理論基礎，推測其可能具有防治骨質疏松的作用。1動物模型的準備Dex制造OP動物模型選用SPF級SD雌性大鼠，每周給予Dex兩次，每次 2. 5mg/0. 5ml/kg，共計6w。分析和研究Dex對大鼠體重、軟組織重量以及不同部位骨骼的影 響。HG對大鼠GIO的預防。Dex制造OP動物模型的同時，給予HG干預，分析HG對Dex 造模大鼠體重、軟組織重量的干預情況；選用骨形態計量學和骨生物力學的方法，研究HG 對Dex造模大鼠不同部位骨骼的干預作用，探討HG對GIO的預防。2實驗材料2. 1主要藥品
藥品廠家規格批號地塞米松磷酸鈉注射液天津藥業集團新鄭股份有限公司5mg/ml0807031骨松寶膠囊貴州富華藥業有限責任公司0. 5g/ 粒20080909護骨膠囊東莞萬成制藥有限公司0. 45g/ 粒200803022. 2主要試劑
碳化鎢鋼刀Leica Co. GermanyJB-2型恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠新涇分廠TEC-2500病理組織漂烘儀Histo-line laboratoryDHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司Bioquant-Osteo骨形態學圖像分析系統BIOQUANT USA2. 4實驗動物及飼養條件實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌性，3m齡，體重(200 士 20)g。由廣州中醫藥大 學實驗動物中心提供，質量合格證編號SCXK (粵)20080020。飼養條件實驗動物分籠，每籠5只，飼養于室溫24 28°C，相對濕度50% 70% 的清潔環境中。隔日更換墊料，自由攝食和攝水。3實驗方法3. 1動物分組和給藥方案60只大鼠，適應性喂養Iw后，按照體重分層隨機分組的原則，分為6組，
正常對照組(Ctrl)................................................45d
(Mod) ********************氺* 氺*氺****+***********‘ 5 d
PHf^i^^liS (GSB) nnunmuuunuuunnnnmmu^nnnunnuuA5d HG低劑量組(HG~L) mmmmmmmmmmmmmmm@4:3d HG 中齊0 量組(HG-M) &&&M&&M&&&&M&&M&M&&&&&&M&45 d HG高劑量組(HG- 具體分組及給藥方案見下表
組別數量給藥方案Groupηdose scheduleCtrl1010ml/kg/d 0. 9% NaCl (ig) +4. 5mg/0. 5ml/kg/2/w 0. 9% NaCl (im)Mod10lOml/kg/d 0. 9% NaCl (ig) +2. 5mg/0. 5ml/kg/2/w Dex (im)GSB100. 3g/10ml/kg/d GSB (ig) +2. 5mg/0. 5ml/kg/2/w Dex (im)
9 注ig 灌胃；im 肌注。ml/kg/d/2/w 每周兩次給藥，每次每公斤大鼠體重的給藥 毫升數。大鼠給藥時間為每天9 OOam-IO 00am，每只大鼠每w稱重一次，并按重量調整給藥 量，給藥時間為6w。3. 2動物熒光標記及取材每只大鼠于處死前14d、13d和3d、2d分別皮下注射(ih)鈣黃綠素(Calcein) 5mg/ kg進行體內熒光標記，以在骨表面形成綠色雙熒光標志，兩次熒光標記間隔為lid。用藥結 束時，用3%戊巴比妥鈉(0. 5ml/kg)腹腔注射(ip)麻醉后右心室抽血處死，取其軟組織 肝臟(liver)、脾臟(spleen)、腎臟(kidney)、肺臟(lung)以及左脛骨(left tibia, LT)、 左股骨(left femur，LF)、第五腰椎(th left of fifth lumbar vertebra，LV)，去除肌肉， Low speed saw 鋸出胚骨上段(proximal tibia, PTM)和中段(tibia shaft，TX)。3. 3骨組織形態計量學方法3. 3. 1不脫鈣骨標本的包埋3. 3. 1. 1包埋前脛骨的處理1)暴露骨髓腔用Low speed saw將TX的橫切面和PTM的縱切面暴露，見圖1。2)骨標本的固定將暴露切面的PTM和TX，立即投入4%多聚甲醛固定液中固定 24-48h。3. 3. 1. 2包埋前單體(甲基丙烯酸甲酯)的洗脫1)將1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗(3L)中；2)加入5% NaOH溶液500ml，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄 去；3)重復操作“2)”三次，三次的下層溶液的總量和單體量相當(洗脫阻滯劑)；4)加入500ml蒸餾水，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄去；5)重復操作“4) ” 2-3次，直至分液漏斗內液體澄清，三次的下層溶液的總量大約 和單體量相當(洗脫NaOH)；6)將上述處理過的單體放入無水氯化鈣中，脫水兩次(1000ml :500g)；7)濾紙過濾，收集濾液；8)-20°C保存上述濾液，第二天取出觀察有無冰晶漂浮，若無，表明無水，可備用； 若有，則需重新脫水；3. 3. 1.3標本的脫水依次用70%、95%乙醇脫水，各2d ；100%酒精脫水兩次，各Id ；二甲苯透明Id。3. 3. 1.4骨標本的滲透先后用浸液I、浸液II、浸液III分別浸透骨標本，各2d。注三種浸液的配置方法如下
浸液I甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，磁力攪拌器上攪拌3h。浸液II甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化苯甲酰l.Og，磁力 攪拌器上攪拌4h。浸液III甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化苯甲酰2. 5g，磁力 攪拌器上攪拌6h。以上為TX骨標本的浸液配置方法，其中過氧化苯甲酰使用前已干燥。PTM骨標本 的浸液中，甲基丙烯酸甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯的比例為3 1，過氧化苯甲酰的比例不變。3. 3. 1. 5骨標本的包埋1)TX的包埋需在包埋前幾天(視當時的溫度確定，一般提前2-3d即可)預先倒 少量(約4ml)新鮮配置的浸液III于小玻璃瓶中作TX包埋塊的底部，蓋好瓶蓋，于水平陰 涼處靜置，浸液聚合變硬后以1.5cm高為宜。包埋時將TX平放于包埋塊底部，脛腓結合處 貼靠瓶壁，每個TX的放置角度相同。在TX上加入2cm高的(約4ml)新鮮配置的浸液III， 蓋好瓶蓋，于水平陰涼處靜置，直至包埋塊形成。2)PTM的包埋將新鮮配置的浸液III倒入容積約為12ml的小瓶中，PTM剖面貼平 底中部，骨骺端離開瓶壁一定距離，倒入的包埋劑約8ml，蓋好瓶蓋，于水平陰涼處靜置，直 至包埋塊形成。3. 3. 2不脫鈣骨組織片的制備3.3.2. 1載玻片的制備1)清洗防脫玻片在酸缸中浸泡Id后，取出，先用自來水沖洗，后用單蒸水，雙蒸水 沖洗，晾干。2)上膠IOOOml蒸餾水中加入9g明膠，加熱至溶液沸騰，將另配置的4%澄清硫 酸鉻鉀溶液倒入沸騰的明膠溶液中，不斷攪拌混合液至溶質溶解，停止加熱，待混合液(膠 液)冷卻至50°C 55°C即可，倒此膠液于恒溫水浴箱的玻璃缸中，將裝入提籃的載玻片在 此膠液中浸泡2min，使膠體粘附均勻，取出放入晾片板上，晾干備用。3)切片(1)打磨敲碎小玻璃瓶后，取出TX和PTM包埋塊。用石膏打磨機將其打磨至適當 大小。(2)切片TX將打磨好的TX塊狀物固定在Leica SP1600型鋸片機鋸片機上，鋸出 45μπι的切片，以脛腓骨分理處為第一片，依次往下鋸，每個TX塊狀物共計鋸5片。PTM將 打磨好的PTM塊狀物固定在Leica RM2500切片機上，切出5μπι和9μπι的薄片，每個PTM 塊狀物切5 μ m的薄片10片和9 μ m的薄片6片。用兩支沾有40%乙醇的軟毛刷輕輕地將 此薄片轉移到滴有一滴70%乙醇的明膠玻片上，然后使用兩把眼科鑷慢慢地展平切片，蓋 上一張事先備好的大小合適的薄塑料片，并用濾紙將多余的乙醇吸干。每個明膠玻片貼相 同寬度的薄片2片，每個塊狀物需明膠玻片8片。(3)烤片將切好的一組片，用夾子夾緊后，于40°C左右的電熱恒溫鼓風干燥箱中 烘約6h，取出備用。4) TX骨切片封片將上述已經切好的45 μ m TX骨切片按下法處理步驟一 45μπι TX骨切片
步驟二 超聲波 清洗2min步驟三蒸餾水 漂洗步驟四70%乙醇浸潤步驟五95%乙醇浸潤步驟六無水乙醇浸潤步驟七二甲苯 潤濕2次步驟八中性樹膠封片5) PTM骨切片染色、封片5μπι的薄片常以Masson-Goldner Trichrome染色，染色后，骨質為綠色，骨髓為 紅色，可以用來觀察骨小梁數量和其表面的成骨細胞和破骨細胞。9μπι的薄片封片后觀測 焚光。Masson-Goldner Trichrome染色過程如下所示(1)工作液的準備A. Weigert hematoxylin工作液配置標識為95 %乙醇的IOOOml溶液中含 Hematoxylin (蘇木素精)Ig的溶液a (已過濾)；配置標識為含29% Ferric chloride (氯化 鐵)4ml、稀鹽酸Iml (用40%的稀鹽酸加蒸餾水按照1 4稀釋)，然后加蒸餾水至IOOOml 的溶液b。等比例混合a液和b液，即得。B. Poncean Fuchsin工作液配置溶液c 標識為IOOml蒸餾水中含Poncean (麗春 紅)Ig的溶液；溶液d 標識為IOOml蒸餾水中含Acid Fuchsin (品紅)Ig的溶液，將溶液 c和d按照3 1混合成Poncean Fuchsin原液，將此液與0. 2%的冰乙酸按照1 5稀釋 成 Poncean Fuchsin 工作液。C. Phosphotungstic acid-Oranage G 工作液^！奪 4gPhosphotungstic acid ( 酸)和2g Oranage G(四號橙)加入IOOml蒸餾水中，過濾，即得。D. Light green 工作液將 0. 2g Light green(亮綠)和 0. 2ml 的冰乙酸加入 IOOml蒸餾水中，過濾，即得。(2)染色、封片等過程步驟一 5μπι和9μπι骨切片(已烘干，并去除上覆的塑料膜)步驟二2_Methyloxethyl acetate (脫塑劑)25min 2 次步驟三5 μ m骨切片繼續下述步驟9 μ m骨切片暫停下述步驟步驟四40%乙醇 5min步驟五70%乙醇 5min:ffeigert hematoxylin25min步驟七蒸餾水漂洗步驟八Poncean Fuchsin 工作液 17min步驟九的冰乙酸漂洗2次，每次Imin^ΜΛ- 羊iliit白勺 Phosphotungstic acid-Oranage G7min步驟^^一 的冰乙酸漂洗2次，每次Imin步驟十二 新鮮過濾的Light green工作液 15min_20min步驟十三1 %的冰乙酸漂洗2次，每次Imin步驟十四5μπι、9μπι切片繼續下述步驟
步驟十五95%乙醇 Imin步驟十六無水乙醇2min 2次步驟十七二甲苯 2min 2次步驟十八中性樹膠封片。3. 3. 3骨組織形態計量學測定3. 3. 3.1 測量范圍1)ΤΧ的測量范圍為其橫斷面的骨髓腔及皮質骨，見圖2。2) PTM的測量范圍為從生長板往下畫出1mm，以避開初級骨生長區，再從Imm往下 畫3_。見圖3。3. 3. 3. 2骨形態計量學測量及計算參數本實驗所有參數采用國際通用標準骨組織形態計量學術語命名，用圖像分析系統 直接測出。測量參數的中英文名稱、符號及單位如表3.1和表3. 3所示。但這些參數還不 能用于分析骨量、骨結構、骨形成和骨吸收等，要通過國際通用的公式對直接測得的參數進 行計算，才能用于分析，計算參數的中文名稱、符號及計算公式等如表3. 2和表3. 4所示。表3.1皮質骨測量參數
表3. 2皮質骨計算參數及計算公式 表3. 3松質骨測量參數 表3. 4松質骨計算參數 3. 3. 3. 3計算參數的意義1) TX靜態參數(1)皮質面積百分數(％ Ct. Ar):反映皮質骨在TX骨橫截面總骨組織面積中所占 的比例。(2)骨髓腔面積百分數(％ Ma. Ar):反映骨髓腔在TX骨橫截面總骨組織面積中所 占的比例。2) TX動態參數(內膜面和外膜面)(1)熒光周長百分數(％ P-L. Pm ； % E-L. Pm):反映皮質骨內外膜面熒光周長占骨 表面總周長的百分率，反映成骨細胞的數量。(2)骨礦化沉積率(Ε-MAR ；P-MAR)指皮質骨內外膜礦化的速率。反映骨礦化的快 慢，代表成骨細胞的活性。(3)骨形成率(E-BFR/BS ；P-BFR/BS)代表皮質骨內外膜骨表面形成的活躍程度。(4)骨吸收周長百分數(E-% Er. Pm):皮質內骨表面沒有類骨質和熒光部分的吸 收陷窩的周長，反映骨內膜破骨細胞的骨吸收功能。3) PTM靜態參數骨量(1)骨小梁面積百分數(％ Tb. Ar, % )指骨小梁面積占骨組織面積的百分率，反 映骨量的多少。該指標是評價骨量變化的最重要的客觀指標。骨結構(2)骨小梁寬度(Tb. Th)用于描述骨小梁形態結構，解釋骨量的變化。在數量一 定的情況下，寬度越厚，骨量越多。(3)骨小梁數量(Tb. N)用于描述骨小梁形態結構，解釋骨量的變化。在寬度一定 的情況下，數量越多，骨量越多。(4)骨小梁分離度(Tb. Sp)指骨小梁之間的平均距離，用來描述骨小梁的形態結 構。分離度越大，骨小梁之間的距離就越大，骨就越疏松。4) PTM動態參數(1)熒光周長百分數(％ L. Pm)反映骨小梁表面熒光周長占骨表面總周長的百分 率，也反映成骨細胞的數量。(2)骨礦化沉積率(MAR)指每天礦化的寬度。反映骨礦化的快慢，代表成骨細胞的活性。(3)骨形成率(BFR/BS)每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總周長的百分比，代 表骨表面骨形成的活躍程度。(4)骨形成率(BFR/BV):每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總面積的百分比，代 表骨形成和骨轉換的活躍程度。此參數越高，表示骨轉換也越高，是反映骨轉換的一個重要 指標。(5)骨形成率(BFR/TV):每年新形成的骨小梁面積占骨組織面積的百分比，代表 每年骨小梁表面新形成骨的總量。此參數與BFR/BV和BFR/BS不同，它受兩個因素影響，一 是骨量的多少，骨量越多就提供越多的新骨形成所需的骨小梁表面；二是骨形成活躍程度， 骨形成越活躍，在單位長度上形成的新骨就越多。所以有時雖然骨形成很活躍，但由于骨量 太少，此參數也會下降。(6)成骨細胞數(Ob. N):單位骨小梁周長上的成骨細胞數，反映與成骨細胞有關 的骨形成情況。(7)單位骨小梁周長破骨細胞數(Oc.N)單位骨小梁周長上的破骨細胞數，反映 與破骨細胞有關的骨吸收情況。3. 4骨生物力學研究方法骨生物力學研究的是骨組織在外力作用下的力學特性及受力后的生物學效應，是 骨量、骨結構及骨質量的綜合反映。對骨進行生物力學實驗研究，不但有助于對骨質量進行 直接評價，而且也是評價各種對抗骨丟失措施的最佳方法之一。由于很多情況下骨折與彎 曲載荷有關，因此有必要掌握骨在彎曲載荷下的力學性質。彎曲試驗常用來測量骨干皮質 骨的力學性能，最常見的彎曲試驗模式是三點彎曲。《美國食品與藥品管理委員會-骨質疏 松研究指南》建議應用標準嚙齒類動物-大鼠的股骨做為力學測試研究對象，從而對股骨的 測試在防治骨質疏松實驗中比其它部位更有臨床意義。壓縮試驗是一種常用的測量松質骨骨力學性能的技術。其優點是骨樣本受力方向 與生理狀態相近，而且使用時簡單方便，常用于松質骨力學性能的測試。因此，本實驗選用 椎骨壓縮試驗的方法來評價松質骨的生物力學性能。3. 4.1實驗方法3. 4. 1. 1股骨皮質骨生物力學測定取大鼠LF置于Z005型萬能試驗機(Zwick/Roell，Germany)行三點彎曲試驗。加 載點位于股骨中段測量處，兩施力點間距為20cm，加載速度為2mm/min，記錄并得出最大 荷載(N)，最大應力(MPa)和最大應變(% )03. 4. 1. 2椎骨松質骨骨生物力學測定取上述LV5，生理鹽水包裹，0°C以下保存，使用上述萬能試驗機進行椎骨試件壓縮 實驗，加載速度為Imm ·8-1，記錄并得出下述實驗數據最大荷載(N)，最大應力(MPa)和最 大應變(％ )。椎骨和股骨的受力情況見圖4和圖5。3.4. 2參數意義最大荷載(Max load, N)骨斷裂前所承受的最大外力，最大載荷代表在載荷-變 形曲線最高點處骨標本所承受的外力，反映股骨抗壓縮的能力；代表了骨的結構力學特性，
16也受骨的幾何形狀的影響。最大應力(Max stress, MPa)骨標本單位面積上所承受的最 大載荷值，表明骨材料在壓縮力作用下發生破壞時出現的最大抗壓強度；最大變形(Max deflection, %)在載荷作用下，骨標本的變形與標距之比，標識骨的塑性能力。3. 5統計學處理實驗數據用均數士標準差(^ ±s)來表示，采用SPSS14.0統計軟件處理，多個樣 本均數比較采用單因素方差分析(one-way AN0VA)，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用 Dunnett' s T3檢驗。以P < 0. 05，P < 0. 01表示具有統計學意義。4 結果4. IDex及HG對大鼠體重和軟組織的影響4. 1. 1對大鼠體重的影響如圖6所示Ctrl組大鼠的平均體重增長迅速，每w平均增長12. 31g ；而相應的 Mod組的體重卻增長緩慢，每w平均增長4. 94g。由表4. 1. 1可知Mod組的平均體重從服用 Dex第2w開始，就小于Ctrl組大鼠的平均體重(P < 0. 01)，持續到實驗結束時(P < 0. 01)。HG_L、M、H和GSB組的平均體重與Mod組的平均體重相比無差別。均低于Ctrl組 (P < 0. 01)。表4. 1. 1 Dex及HG對大鼠平均體重的影響(η = 10) 4. 1. 2 Dex及HG對大鼠不同軟組織重量的影響由表4. 1. 2和圖7可知與Ctrl組相比，Mod組大鼠肝臟、腎臟、脾臟的重量顯著 降低(前兩者P < 0. 01 ；后者P < 0. 05)，而肺臟的重量無差別。與Mod組相比HG_L、HG-M組大鼠的腎臟的重量顯著升高(P < 0. 05)，HG-M組大 鼠腎臟的重量與GSB組大鼠腎臟的重量相比，顯著增加(P < 0. 05)。表4. 1. 2 Dex及HG對大鼠軟組織的影響(η = 10) 4. 2 Dex及HG對大鼠TX和PTM形態計量學的影響
4. 2. 1 Dex及HG對大鼠TX形態計量學的影響4. 2. 1. 1 Dex及HG對靜態參數的影響由表4.2. 1和圖8可知與Ctrl組比Dex明顯減少了 TX的骨量(％Ct.Ar)，增大 了骨髓腔的面積(％Ma. Ar)，兩組之間這兩個指標的差異均達到了顯著性水平(P<0.01)， 與Mod組相比，HG-L組和HG-M組大鼠的皮質骨％ Ct. Ar的升高和％ Ma. Ar的降低均達到 了顯著性水平(P < 0. 01)，這與GSB組的結果一致。表4. 2. 1 Dex及HG對大鼠TX形態計量學靜態參數的影響(η = 10) *Ρ < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；ttttP < 0. 01 VS Mod如表4. 2. 2和圖9所示Dex造成了大鼠骨內膜的骨形成指標％ E-L. Pm、E-BFR/ BS顯著降低(前者P < 0.01，后者P < 0. 05)和骨吸收指標％ E-Er. Pm的顯著增加(P < 0.01)，兩組之間骨外膜的各項指標沒有顯著性差異。與Mod組相比，HG-L、M和H增加了骨內膜的％ E-L. Pm (分別為35. 11 %、56. 37 %， 73. 71%,52. 15% )，而且高于GSB組和Ctrl組，低中濃度的HG存在劑量依賴關系；HG-L、 M 還增加了 E-BFR/BS(155. 36% ) (P < 0. 05)，且高于 GSB 組和 Ctrl 組；HG-M、H 組的 E-% Er. Pm顯著減小(P < 0. 01)，而且低于HG-L組(前者P < 0. 05，后者P < 0. 01)，這與GSB
組的結果一致。表4. 2. 2 Dex及HG對大鼠TX形態計量學動態參數的影響(η = 10) *P < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；抑P < 0. 01 VS Mod ；aP < 0. 05 VS GSB >AP < 0. 01 VS GSB ；·Ρ < 0. 05 VS HG-L ；eeP < 0. 01 VS HG-L ；< 0. 05 VS HG-M4. 2. 2 Dex及HG對PTM形態計量學的影響4. 2. 2. 1 Dex及HG對PTM形態計量學靜態參數的影響由表4. 2. 3和圖10可知與Ctrl組相比，Mod組大鼠的PTM形態計量學靜態參數
無變化。與Mod組相比，HG-M組骨小梁的骨量(％ Tb. Ar)顯著增加(ρ < 0. 05)，并且高于 Ctrl組和GSB組(ρ < 0. 05) ；HG-H組骨小梁的寬度(Tb. Wi)顯著寬于GSB組(ρ < 0. 05)。表4. 2. 3 HG對Dex模型大鼠PTM靜態參數的影響
20
*P < 0. 05 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod >P < 0. 05 VS GSB4. 2. 2. 2 Dex及HG對PTM形態計量學動態參數的影響如表4. 2. 4和圖11所示與Ctrl組相比，Mod組PTM的動態參數不變。與Mod相比，HG-M組的MAR顯著增加(P < 0. 01)，并且高于HG-L組和GSB組(P < 0. 05) ；HG-M組的骨吸收指標Oc. N顯著降低(P < 0. 05)，且低于Ctrl組和HG-L組(與 Ctrl 組相比 P < 0. 01 ；與 HG-L 組相比 P < 0. 05)。表4. 2. 4 Dex及HG對大鼠PTM形態計量學動態參數的影響(η = 10) *Ρ < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；抑P < 0. 01 VS Mod ；aP < 0. 05 VS GSB ;·Ρ < 0. 05 VS HG-L ；*P < 0. 05 VS HG-M4. 3 Dex及HG對大鼠LF和LV生物力學性能的影響4. 3. 1 Dex及HG對大鼠LF生物力學性能的影響如表4. 2. 5所示與Ctrl組相比，Mod組LF皮質骨的生物力學參數無變化。其它各藥物組LF的生物力學參數無差別。表4. 2. 5 Dex及HG大鼠LF生物力學性能的影響(η = 10)
4. 3. 2 Dex及HG對大鼠LV生物力學性能的影響由表4. 2. 6和圖12可知Mod組LV的生物力學參數與Ctrl組相比無變化。與Mod組相比，HG-M組LV松質骨的最大載荷(Max load)最大應力(Max stress)、 最大變形(Max deflection)均顯著升高(P < 0. 05)。HG-H組的最大變形Max deflection 與HG-M相比，顯著降低(P <0.05)。表4. 2. 6 Dex及HG大鼠LV生物力學性能的影響(η = 10) flP < 0. 05 VS Mod ；*P < 0. 05 VS HG-M
權利要求
護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于將中藥組方為，何首烏、淫羊藿、熟地、龜甲、巴戟天、杜仲、續斷、骨碎補、當歸、山藥的護骨膠囊，用于預防繼發性骨質疏松的開發研究。
2.根據權利要求1所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于所 述的繼發性骨質疏松為糖皮質激素引起的繼發性骨質疏松病癥。
3.根據權利要求1所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊增加了地塞米松Dex造模大鼠皮質骨的骨量。
4.根據權利要求3所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊增加了地塞米松Dex造模大鼠松質骨的骨量。
5.根據權利要求1所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊HG增加了 Dex地塞米松造模大鼠皮質骨和松質骨的骨量的機理 與促進骨形成和抑制骨吸收有關。
6.根據權利要求1所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出陽性藥物組GSB降低骨吸收，而未提高骨形成，護骨膠囊HG預防骨質疏松 GIO的效果好于陽性藥物組GSB。
7.根據權利要求1所述的護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊HG-M組LV松質骨的最大載荷、最大應力、最大變形較模型組有 顯著升高(P < 0. 05)。
全文摘要
本發明屬于中醫藥應用技術領域，具體是指中藥護骨膠囊在預防繼發性骨質疏松的新用途。本發明通過骨組織形態計量學探討護骨膠囊(HG)對由糖皮質激素(GCs)誘導的繼發性骨質疏松(GIO)的預防作用，實驗結果證實，GCs短期即可誘導大鼠皮質骨的骨丟失，HG45天的干預，可阻止GCs誘導大鼠皮質骨的骨丟失，為開發中藥護骨膠囊(HG)預防繼發性骨質疏松的新用途提供實驗依據。
文檔編號A61K36/8945GK101890127SQ20101023044
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優先權日2010年7月19日
發明者曾昭利 申請人:東莞萬成制藥有限公司