專利名稱：一種人工抗菌肽及其基因與制備方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學與生物醫藥技術，特別涉及到一種人工抗菌肽及其基因與 制備方法。
背景技術：
抗菌肽(antibacterial ρ印tide)于1972年首次在昆蟲體內分離獲得，是由生 物體免疫系統在受到外界病原體侵襲時產生的一類非特異性免疫應答產物，具有廣譜抗細 菌、真菌、病毒及抑殺腫瘤細胞等作用。分子質量較小，富含疏水氨基酸和堿性氨基酸，多帶 正電荷，耐高溫、酸堿，穩定性強。對比抗生素，抗菌肽的抗菌譜更廣(Miyasaki K T, Lofel R, Lehrer RI. Sensitivity of periodontal pathogens to the bacterial activity of synthetic protegrins, antibioticpeptides derived from porcine leukocytes[J]. J Dent Res,1997,76 1453-1459. Andreu D, RivasL. Animal antimicrobial peptides :an overview[J]. Biopolymers, 1998,47 :415_433.)；其殺菌機理獨特，不易產生耐藥菌；作用 專一，對正常細胞無明顯毒副作用，無致畸作用，不易產生蓄積中毒。是一類理想的新型“綠 色”抗菌藥物。Hepcidin是2000年被發現的一種在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌肽，屬防御 素家族。Hepcidin的蛋白結構在不同物種間高度保守，其蛋白結構富含精氨酸、賴氨酸等 帶正電的氨基酸殘基，8個半胱氨酸形成4個二硫鍵，成發夾結構，第4和第5個半胱氨酸 在發夾的拐角處形成一個二硫鍵，在磷酸緩沖液中形成穩定的β折迭結構(王元忠，周建 新.H印cidin:具有抗茵活性的鐵調節激素[J],生理科學進展，2005，36 (4) :372_375·)。 和許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，Hepcidin具有抑制細菌和真菌生長的作用，在體外 抗菌試驗中，具有抗大腸桿菌、B群鏈球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等細 菌活性以及抗白色念珠菌、曲霉菌等真菌活性，其在體內和其它抗菌肽一樣參與宿主的 天然防御(Vyoral D, Petrak J. Hepcidin :a direct link between iron metabolism and immunity [J], Int J Biochem CellBiol，2005，37 (9) :1768_1773.周雷，張勇，王建 鋒，等.奶牛防御素5基因的克隆與原核表達[J].甘肅農業大學學報，2009，2(1) 7-10.)。同時，H印cidin還是維持鐵穩態的關鍵激素(Nicolas G, Viatte L, Lou DQ, et al. Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model ofhemocromatosis[J]. Nat Genet, 2003，34 :97_101·)
發明內容
本發明所述一種具備高抑菌活性的新抗菌肽，是根據Genbank上h印cidin抗菌 肽的氨基酸序列(Genbank ID :NP_001161799. 1)，人工設計并合成一種h印cidin抗菌肽的 核苷酸序列，并構建到表達載體中，轉化到酵母受體菌中誘導表達，表達產物表現出高表達 量，高活力等特性。體外抑菌實驗結果表明該抗菌肽生物活性強，對金黃色葡萄球菌、無乳 鏈球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌活性。
一種人工抗菌肽，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。一種人工抗菌肽，是通過對Seq ID No. 1所示的氨基酸序列進行取代、缺失、加入、 環化、L-型氨基酸變為D-型氨基酸而得到的與Seq ID No. 1所示的氨基酸序列所示的多 肽相同抗菌活性的氨基酸序列。上述人工抗菌肽在抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)中的應用。編碼上述人工抗菌肽的基因。所述基因的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。含有上述基因的表達載體。所述表達載體指pPICZ α A-h印cidin。上述人工抗菌肽的制備方法，指將上述表達載體轉化到宿主菌中，培養宿主菌使 其表達所述人工抗菌肽。所述宿主菌指大腸桿菌或酵母菌。所述酵母菌指畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。本發明對Genbank中記錄的h印cidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID NP_001161799. 1)進行人工改造和設計，得到本發明Seq ID No. 1所示的氨基酸序列，并 根據畢赤氏酵母對氨基酸的密碼子偏好性設計其核苷酸序列，得到編碼本發明人工抗菌肽 的基因。通過構建載體，轉化到宿主，誘導表達后發現，與原多肽表達蛋白相比，本發明的 人工抗菌肽具有表達量高，抗菌譜寬的優點。即原多肽的表達量約127.9mg/L，不能滿足 生產需要，生產成本過高；改造后的多肽的基因在畢赤氏酵母中的誘導表達量大大提高，約 214.2mg/L。原多肽僅對枯草芽孢桿菌有抑菌作用，且抑菌效果不理想。本發明的人工抗 菌肽不僅對枯草芽孢桿菌有抑菌效果，對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌均有明顯的抑殺作 用。
圖 1.重組質粒 pPICZ α A-h印cidin PCR 鑒定1 重組質粒 pPICZ α A_h印cidin 2. DNA Marker圖2重組酵母菌PCR鑒定1.重組酵母菌；2.空載體；3. DNAMarker圖3!fepcidin表達產物的SDS-PAGE分析1.空載體對照；2.篩選高拷貝h印cidin表達產物；3.未經篩選h印cidin表達產 物；4.蛋白Marker圖4本發明人工抗菌肽的抑菌對比試驗A.金黃色葡萄球菌；B.枯草芽孢桿菌；C.無乳鏈球菌菌斑1.氨芐青霉素；2 5.本發明的多肽；6陰性對照圖5原抗菌肽的抑制試驗A.枯草芽孢桿菌；1.陰性對照；2.陽性對照Amp ；3-5. 50 μ L原多肽表達上清液；B金黃色葡萄球菌；
1.AMP, 2.本發明的多肽，3-7.原多肽
具體實施例方式以下具體實驗操作步驟對本發明作進一步描述，實驗方法中如無特別說明，均為 常規方法。實施例1.構建重組酵母菌步驟1.根據Genebank上h印cidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID NP_001161799. 1)，設計出本發明抗菌肽的氨基酸序列Seq ID No. 1，再根據畢赤氏酵母對 密碼子的偏好性，在不改變氨基酸的條件下，設計編碼該多肽的核苷酸序列如Seq ID No. 2 所示，由北京Irwitrogen公司合成該核苷酸序列。并根據Seq ID No. 2設計一對引物H1/H2 Hl 5' GGCCTCGAGATGGCTCTGTCTTCCACAATC 3‘H2 5' CGCTCTAGATCAGGTCTTCCTGCAACAGCA 3‘在Seq ID No. 2的3’端引入終止密碼子，在Seq ID No. 2兩端分別引入Xho I和 Xba I酶切位點。合成原抗菌肽Genbank ID :NP_001161799. 1的氨基酸序列的基因如Seq ID No. 3 所示的核苷酸序列，并根據該序列設計合成引物如下H3 5' GGCCTCGAGATGGCTCTGAACACGAACATC 3‘H4 5' CGCTCTAGATCAGGTCTTGCAGCACCAGCC 3'，在 Seq ID No. 3 的 3，端引入終 止密碼子，在Seq ID No. 3兩端分別引入Xho I和Xba I酶切位點。步驟2.構建表達載體pPICZa A-h印cidin材料表達載體pPICZ a A購于Invitrogen公司。T4DNA連接酶、GoTaq酶、Xho I、 Xba I等限制性內切酶購自TaKaRa公司，氨芐青霉素(AMP)、Zeocin購于Invitrogen公司。方法PCR擴增合成的h印cidin基因整合在載體PCR2. 1-T0P0(合成基因過程中 Invitrogen附贈的)上，提質粒后PCR擴增PCR2. 1-TOPO中的h印cidin。反應條件如下 94°C預變性 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環，72°C延伸 IOmin0
_^_體積 L)
ddH2012.7~
1 OxPCR Buffer5
dNTP4
Γ , Primer 1 (HI)1
ν
Primer 2 (Η2)1
GoTaq 酶0.3
模板1
總體積25 PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用Xho I, Xba I雙酶切PCR產 物和pPICZ α A，通過T4DNA連接酶將人工合成基因h印cidin整合到pPICZ α A(購于Invitrogen)中，PCR鑒定陽性重組質粒，見圖1，命名為pPICZ α Α-h印cidin，PCR鑒定的陽 性質粒送檢DNA測序，測序結果與Seq ID No. 2 一致。相同方法構建原抗菌肽的基因Seq ID No. 3的表達載體pPICZ α Α-h印cidin，，PCR 引物為H3/H4，雙酶切酶為Xho I、Xba I。步驟3轉化酵母菌及鑒定材料宿主菌畢赤氏酵母菌X-33 (Pichiapastoris)，由發明人實驗室有保存，自 申請日起20年可向公眾發放用于驗證試驗。方法陽性重組質粒pPICZ α A_h印cidin及pPICZ α A_h印cidin，經Sac I線性化 后，分別電轉化畢赤氏酵母菌X-33。電擊條件電壓1800V，電阻200 Ω，電容25 μ F，電擊時 間5ms。在25 μ g/mLZeocin的YPDs固體培養基上篩選陽性轉化子，經YPD液體培養基增菌 后，提取YPD液體培養基中的重組酵母DNA，進行PCR鑒定，鑒定引物5' AOX 5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ‘3' AOX 5' -GGCAAATGGCATTCTGACAT-3 ‘PCR 反應程序為 940C Imin;② 94°C lmin，59°C lmin，72°C lmin，30 個循環； 72°C IOmin電泳結束后取5 μ L樣用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。轉化了 pPICZ α A-h印cidin，的重組酵母菌的PCR鑒定，引物同為5' A0X/3' AOX 程序同上。步驟4.篩選高拷貝重組酵母菌用無菌96孔板篩選pPICZ α A_h印cidin，、pPICZ α A-hepcidin轉化的高拷貝陽性 重組酵母菌，Zeocin (購于Invitrogen, Cat. No. :R250_0)抗性濃度為2、4、6mg/ml梯度上 升，篩選多拷貝整合轉化子。步驟5.誘導表達將篩選到重組酵母菌的YPD液體培養基培養物按1 50的比例轉接于IOOmL BMGY培養基，在30°C 250rpm培養至0D600達到3 6，離心收集菌體，并重懸于500mL BMMY 培養基，進行誘導表達28°C，250rpm培養96h，每24h補加甲醇至終濃度為1%。96h后 IOOOOrpm, 20min離心收集培養上清。測濃度，pPICZ α A-h印cidin轉化的重組酵母菌的抗菌肽表達量約214. 2mg/L, pPICZ α A-hepcidin'轉化的重組酵母菌的抗菌肽表達量為約127. 9mg/L。步驟6.步驟5所獲得的上清經SDS-PAGE電泳鑒定，結果如圖3所示。實施例2.抑菌試驗材料實驗菌菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CVCC1882、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CVCC717、無乳鏈球菌 CVCC586(Str印tococcus agalactiae)，第一發明人所在實 驗室有保存，保證自申請日起二十年內，可向公眾發放用于驗證試驗。方法用無菌棉拭子蘸取處于對數生長期的金黃色葡萄球、枯草芽孢桿菌、無乳鏈球菌 懸浮液，均勻涂布于LB固體培養基，室溫放置3min。無菌操作將無菌紙片貼在涂好菌的平 板上，滴加50 μ L待測的實施例1制備得到的上清樣品，37°C培養16h，以同體積pPICZ α A 空載體轉化X-33酵母的表達蛋白為陰性對照，5 μ L氨芐青霉素(AMP 50 μ g/mL)為陽性對照。測量抑菌直徑(抑菌直徑=抑菌圈直徑-無菌紙片直徑)。結果抑菌試驗結果顯示，2#和3#菌株對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、枯草芽孢桿菌 有較好的抑菌活性，而對大腸桿菌均無明顯作用。4#菌株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 有抑菌活性，對無乳鏈球菌無抑菌活性。5#菌株僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，對枯草芽 孢桿菌、無乳鏈球菌無抑菌活性。(見表1、圖4)。表1重組hepcidin不同酵母菌株抑菌試驗的抑菌環直徑結果(直徑cm)
權利要求
一種人工抗菌肽，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.—種人工抗菌肽，是通過對Seq ID No. 1所示的氨基酸序列進行取代、缺失、加入、環 化、L-型氨基酸變為D-型氨基酸而得到的與Seq ID No. 1所示的氨基酸序列所示的多肽 相同抗菌活性的氨基酸序列。
3.權利要求1或2所述人工抗菌肽在抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、無乳鏈球菌(Str印tococcus agalactiae)中的應用。
4.編碼權利要求1或2所述人工抗菌肽的基因。
5.權利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SeqID No. 2所示。
6.含有權利要求4或5所述基因的表達載體。
7.根據權利要求6所述的表達載體，指pPICZα A-h印cidin。
8.權利要求1或2所述人工抗菌肽的制備方法，指將權利要求6或7所述的表達載體 轉化到宿主菌中，培養宿主菌使其表達所述人工抗菌肽。
9.根據權利要求8所述的制備方法，所述宿主菌指大腸桿菌或酵母菌。
10.根據權利要求8所述的制備方法，所述酵母菌指畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。全文摘要
本發明“一種人工抗菌肽及其基因與制備方法”，屬于生物制藥領域。本發明的人工抗菌肽通過對Genbank中的hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank IDNP_001161799.1)進行了改造，獲得了活性高、抗菌譜更寬的新抗菌肽。本發明還根據畢赤氏酵母菌對氨基酸密碼子的偏好性，對編碼該多肽的核苷酸序列進行了優化，該核苷酸序列轉入畢赤氏酵母菌中，表達量、抗菌譜明顯高于原hepcidin抗菌肽的基因。
文檔編號A61P31/04GK101955525SQ201010224980
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者吳培星, 孫茜勝, 宋楠, 張繼瑜, 徐玲, 李純玲 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所;北京養元獸藥有限公司;北京天之泰生物科技有限公司