一種靶向釋放微量元素的藥物組合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種靶向釋放微量元素的藥物組合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種定向控釋微量元素的藥物組合物，特別是能被超聲定向控釋， 可誘導(dǎo)組織再生、抗腫瘤的藥物組合物。
背景技術(shù)：
微量元素在維持人類健康中起基礎(chǔ)性的作用，主要生理功能是在各種酶系統(tǒng)中起 催化作用，以激素或維生素的必需成分或輔助因子而發(fā)揮作用，形成具有特殊功能的金屬 蛋白等。微量元素生理作用的意義可以和維生素相比，但機(jī)體可以自行合成一些維生素而 無(wú)法合成任何元素，從這點(diǎn)看，必需微量元素對(duì)人體較維生素更為重要。必需微量元素的基 本定義是指那些具有明顯營(yíng)養(yǎng)作用及生理功能，對(duì)維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、生命活動(dòng)及繁衍等 必不可少的元素。所謂“必需”即①機(jī)體必須從外界飲食中攝取這種元素，當(dāng)從飲食中去 除這一元素后，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)這種元素的生理性缺乏狀態(tài)。②補(bǔ)充這一特定元素后，機(jī)體的 這種缺乏狀態(tài)將得到緩解。③這種特殊的元素對(duì)機(jī)體總具有某種特異的生化功能，這種作 用不能被其他任何元素完全代替。當(dāng)這種元素?cái)z入不足會(huì)引起機(jī)體生物學(xué)功能障礙，而恢 復(fù)這種元素的生理水平后又能緩解或預(yù)防這種功能障礙。機(jī)體一旦離開(kāi)這種元素，既不能 生長(zhǎng)，又不能完成其應(yīng)具有的生命周期。另外，必需微量元素還有以下特點(diǎn)①這種元素以 相似的濃度存在于不同動(dòng)物的組織中。②不論動(dòng)物的種類如何，去除這種元素后會(huì)出現(xiàn)相 似的生理、生化異常。③有這種元素存在時(shí)能減輕或預(yù)防上述異常。④這種異常改變?cè)谌?乏得到控制時(shí)也能被治愈。目前，微量元素中的碘、硒、鋅、鐵、銅、錳、鉻等已被國(guó)際上確認(rèn)為“維持機(jī)體正常 生命活動(dòng)不可缺少的必需微量元素”。隨著科學(xué)的發(fā)展，人類越來(lái)越認(rèn)識(shí)到必需微量元素在 維持健康中的基礎(chǔ)性作用。有些元素不僅僅可以抗感染，而且與許多慢性、流行性、地方性、 甚至惡性病變有關(guān)聯(lián)。大量流行病學(xué)調(diào)查指出，機(jī)體若缺乏必需微量元素，可能會(huì)使人群對(duì) 疾病的敏感度增高，導(dǎo)致亞健康狀態(tài)或疾病的發(fā)生和發(fā)展。微量元素雖然在人體內(nèi)的含量不多，但與人的生存和健康息息相關(guān)。多年來(lái)，微量 元素在人體中的重要性越來(lái)越得到重視。硒、鋅、鐵、銅等微量元素已被證明具有多種有益 的的生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)科學(xué)研究，到目前為止，已被確認(rèn)與人體健康和生命有關(guān)的必需微量 元素有18種，即有鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣、砷等。這每 種微量元素都有其特殊的生理功能。盡管它們?cè)谌梭w內(nèi)含量極小，但它們對(duì)維持人體中的 一些決定性的新陳代謝卻是十分必要的。一旦缺少了這些必需的微量元素，人體就會(huì)出現(xiàn) 疾病，甚至危及生命。如缺鋅可引起口、眼、肛門或外陰部發(fā)紅、丘疹、溫疹。又如鐵是構(gòu)成 血紅蛋白的主要成分之一，缺鐵可引起缺鐵性貧血。國(guó)外曾有報(bào)道機(jī)體內(nèi)含鐵、銅、鋅總量 減少，均可減弱機(jī)體抗病能力，助長(zhǎng)細(xì)菌感染，而且感染后的死亡率亦較高。它們的攝入過(guò) 量、不足或缺乏都會(huì)不同程度地引起人體生理的異?；虬l(fā)生疾病。雖然微量元素的重要性已獲得公認(rèn)，但是微量元素的攝入和作用效應(yīng)目前被廣泛 認(rèn)可的主要局限于膳食添加和保健應(yīng)用。這主要受制于微量元素的生物學(xué)效應(yīng)具有兩種矛
4盾性1.效能和劑量的矛盾。任何一種微量元素，對(duì)于機(jī)體而言，都必須服從于“微量”的 要求，雖然這類金屬元素對(duì)機(jī)體而言是至關(guān)重要，但機(jī)體含量和攝取量都要求極低，這就往 往導(dǎo)致機(jī)體對(duì)此類元素的攝取和利用缺乏效率，并易發(fā)生微量金屬元素中毒。2.常規(guī)攝取 和體內(nèi)分布的非特異性和疾患部位的特異性濃聚需求的矛盾。特別是當(dāng)機(jī)體處于疾患狀態(tài) 時(shí)，對(duì)微量元素的利用就更為困難。如心梗患者的心肌組織對(duì)銅離子的攝取大量降低，引起 缺血修飾蛋白反應(yīng)，造成銅離子從心臟中丟失。早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如將大鼠心臟分離出來(lái) 并在體外灌注，當(dāng)灌注停止45分鐘后再重新灌注，心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，心臟中銅離子大量 的釋放。從心肌缺血的病人的尸檢結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在心肌缺血及周圍的部位，銅離子的濃度明 顯下降。又如在肝炎或肝纖維等病理狀態(tài)，肝病患者體內(nèi)普遍缺硒、鋅，并且病情越嚴(yán)重，血 液中的硒、鋅水平越低。在這種肝病狀態(tài)，肝臟難以充分利用食物的硒、鋅，從而造成膳食補(bǔ) 充的效率低下即使正常劑量的膳食補(bǔ)充，也難以達(dá)到靶向器官的有效需求，如加大劑量又 易產(chǎn)生金屬毒性。諸如此類情況，機(jī)體普遍存在這種困境即受損傷組織越需要的微量元素 在病理狀態(tài)下越難以靶向的、高效的獲取。目前情況下，微量元素的攝取必須直接或間接由土壤供給，即通過(guò)口服相關(guān)含量 的各種食物或類似善純之類的復(fù)合性的口服保健藥物攝取。雖然已創(chuàng)造出不同方法提高對(duì) 微量元素膳食補(bǔ)充效率，比如采用納米級(jí)別的微量元素?；蛘卟捎蒙锔患姆椒蠢?海藻類具有優(yōu)良生物富集作用的食品原料，富集更多量的微量元素，以提高微量元素的口 服攝取效率。但這類方法仍然受制于特定器官的功能狀態(tài)，如相關(guān)器官功能已經(jīng)受損，微量 元素即使通過(guò)膳食大量補(bǔ)充仍然難以達(dá)到其治療濃度和生物生理效果。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種具有超聲靶向釋放微量元素作用的藥 物組合物，其包含濃度大于IX IO6個(gè)/ml，粒徑小于IOym的空心微球，和至少一種小于或 等于人體十倍生理劑量的微量元素，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料；其中微量元素與空 心微球以結(jié)合或游離的形式存在，所述空心微球由藥學(xué)上可接受的成膜材料制備而成。進(jìn)一步的，所述空心微球粒徑為1 5μπι;所述空心微球內(nèi)含氣體是空氣、氮?dú)狻?氟化硫氣、氟代烷烴類氣體或其他無(wú)毒性氣體或上述一種或一種以上氣體成分的任意組合 的混合氣體。所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣或砷 離子中的一種或一種以上的任意組合，優(yōu)選為銅、鋅、硒、鐵中一種或一種以上的任意組合。一方面，所述結(jié)合形式的微量元素與空心微球通過(guò)化學(xué)作用或物理作用相互結(jié) 合，優(yōu)選的，結(jié)合形式的微量元素與空心微球是由以下方法制備的1)按照摩爾濃度比為 1 0.05到1 500將微量元素離子與成膜材料溶于水或有機(jī)溶劑中，使微量元素離子通 過(guò)物理或化學(xué)作用與膜材結(jié)合形成微量元素復(fù)合膜材；2)用常規(guī)方法將步驟1)得到的復(fù) 合膜材，制備成粒徑小于10 μ m的空心微球。另一方面，所述游離形式的微量元素是指沒(méi)有與空心微囊結(jié)合的、以微量元素離 子與蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖或其他可結(jié)合微量元素的化合物形成復(fù)合物存在于載體或 輔料中，優(yōu)選的，所述微量元素與蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖、其他可結(jié)合微量元素的化合 物的摩爾濃度比為1 0.05到1 500。
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進(jìn)一步的，本發(fā)明所述成膜材料為人血白蛋白、磷脂或其他高分子聚合物。所述的載體或輔料為去離子水或生理鹽水或葡萄糖溶液或含微量元素離子復(fù)合 物的溶液，所述的微量元素離子復(fù)合物為微量元素離子與蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖或其 他可結(jié)合微量元素的化合物形成的復(fù)合物。本發(fā)明所述的藥物組合物，優(yōu)選為注射制劑，更加優(yōu)選為粉針劑。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的藥物組合物在制備促進(jìn)血管或組織再生以及抗腫瘤 的超聲靶向釋放藥物中的用途所述的藥物組合物經(jīng)靜脈注射入人體內(nèi)，利用超聲波對(duì)治療部位進(jìn)行輻照，利用 含氣空心微球與超聲波的相互作用達(dá)到局部釋放微量元素離子的目的。本發(fā)明所述的超聲靶向釋放是指一定能量的超聲波使微泡破裂或振蕩等空化效 應(yīng)而促使及強(qiáng)化相關(guān)金屬離子在超聲輻照局部釋放和/或促進(jìn)混懸液中的相應(yīng)金屬離子 組分進(jìn)入輻照組織，達(dá)到促進(jìn)血管、組織再生和/或抗腫瘤的臨床目的。超聲靶向釋放的微量元素可誘導(dǎo)超聲波輻照部位產(chǎn)生攜帶的微量元素離子相對(duì) 應(yīng)的生理功效。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明所述的藥物組合物的方法首先制備結(jié)合微量元素離子 的空心微球，制備方法包括1)按照摩爾濃度比為1 0.05到1 500將微量元素離子與成膜材料溶于水或 有機(jī)溶劑中，形成由一種或一種以上微量元素離子通過(guò)物理或化學(xué)作用結(jié)合形成微量元素 復(fù)合膜材；2)將步驟1)得到的復(fù)合膜材，制備成粒徑小于10 μ m的空心微球；3)將制備完成的結(jié)合微量元素離子的空心微球與權(quán)利要求1、7、10所述的載體或 輔料及復(fù)合物相混合形成混懸藥物組合物；4)直接冷藏保存作為混懸藥物注射劑或冷凍干燥制備粉針劑。步驟2)可利用以下任一一種藥學(xué)常用微球制備方法制備超聲波聲振法、冷凍干 燥法、噴霧干燥、活性/可控自由基聚合、沉淀聚合法、懸浮聚合，乳液聚合，種子聚合，分 散聚合以及沉淀聚合等異相聚合體系、離子交聯(lián)法、乳化離子凝膠法、離子沉淀_化學(xué)交聯(lián) 法、乳化_化學(xué)交聯(lián)法、復(fù)乳交聯(lián)法、熱交聯(lián)法、凝聚法、乳化_溶劑蒸發(fā)法?；蛘撸景l(fā)明藥物組合物還可以由以下方法制備，首先制備未結(jié)合微量元素離子 的空心微球，制備方法包括1)按前一方法的步驟2)所述的任一一種藥學(xué)常用微球制備方法，制備成粒徑小 于10 μ m的空心微球；2)將步驟1)得到的空心微球與結(jié)合了一種或一種以上微量元素離子的蛋白或多 肽或者氨基酸或葡萄糖或其他可結(jié)合微量元素的化合物形成的復(fù)合物溶液混合形成混懸 藥物組合物；3)直接冷藏保存作為組合藥物注射劑或經(jīng)冷凍干燥制備粉針劑。由于機(jī)體具有微量元素的非靶向性微量攝取和藥用生物學(xué)效應(yīng)器官的靶向性高 濃度需求之間的矛盾性，我們認(rèn)為微量元素的局部定向或靶向釋放具有重大的臨床意義。 但目前尚無(wú)法達(dá)到通過(guò)口服促成微量元素的定向釋放的目的，因?yàn)?，目前尚未?jiàn)能有效實(shí) 施靶向微量元素釋放的口服藥物面世?？诜奈⒘吭囟鄟?lái)源于食物或以無(wú)機(jī)、有機(jī)物的狀態(tài)通過(guò)腸壁吸收，經(jīng)肝臟處理后是以全身性非特異性分布為特點(diǎn)。因此，如需達(dá)到靶向釋 放微量元素的目的，從臨床角度考慮，以經(jīng)靜脈注射為可取途徑。然而水溶狀態(tài)的微量元素離子鹽，即使是局部涂抹亦有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激反 應(yīng)。因此如進(jìn)行金屬離子鹽溶液的直接靜脈注射，不但無(wú)法達(dá)到靶向器官的定向釋放和局 部濃聚的目的，反而有產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用的隱患。此外，這類微量元素離子的鹽離子狀態(tài)往 往不具備生物學(xué)活性，都需要以生物兼容方式結(jié)合和傳輸才能發(fā)揮生理作用，比如和多肽、 蛋白、葡萄糖等的結(jié)合。因此，要達(dá)到定向或靶向器官的微量元素釋放的目的，本發(fā)明的思 路是第一步必須考慮的是生成有效的蛋白或多肽的微量元素結(jié)合體或絡(luò)合體或締合物。 第二步考慮靶向釋放的方法和效率。鑒于此，我們首先考慮的是利用人體最為普遍的金屬 離子攜帶蛋白白蛋白作為優(yōu)選蛋白，因?yàn)榘椎鞍资侨梭w外周血中最主要的金屬離子結(jié)合 蛋白，它幾乎能和所有金屬離子有效結(jié)合，并且非特異性輸送至任何器官。白蛋白由585個(gè)氨基酸組成，氨基酸之間都以肽鏈相連，并且扭曲成蚯蚓狀或蜂 窩狀，具有無(wú)數(shù)的網(wǎng)狀空隙，為鑲嵌攜帶藥物創(chuàng)造了有利空間條件。第二步我們考慮的是如 何做到靶向釋放或定向組織器官釋放的方法選擇。靶向給藥系統(tǒng)是現(xiàn)代藥物研究的重點(diǎn)之 一。將藥物與特異的載體偶聯(lián)，把藥物選擇性導(dǎo)向病變部位，以達(dá)到增加藥物濃度、改善藥 代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、減少毒副作用的目的。迄今，所有這類白蛋白微球產(chǎn)品或?qū)嶒?yàn)，均局限于抗 腫瘤化療藥物的靶向釋放或抗生素的控釋。近年來(lái)有關(guān)白蛋白微球和白蛋白納米粒的應(yīng)用 研究逐漸增多，多是利用微球和納米粒的表面改性來(lái)獲得更好治療效果，如甘草酸表面修 飾白蛋白納米粒，葉酸偶聯(lián)米托蒽醌白蛋白納米粒、磁性阿霉素白蛋白納米粒等，但尚無(wú) 上市產(chǎn)品，僅有紫杉醇白蛋白納米粒進(jìn)入臨床階段(美國(guó))，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w內(nèi)受到多種因素 的影響[1-14]。理論上，存在有兩種靶向思路，第一主動(dòng)靶向。這類靶向的形成，必須首先合成針 對(duì)某一靶向器官或組織細(xì)胞的白蛋白。例如抗體-抗原介導(dǎo)的白蛋白微球。在微球表面結(jié) 合特定的抗體或多肽，這可以使微球?qū)δ撤N細(xì)胞具有特異的結(jié)合能力，從而將藥物導(dǎo)向該 細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特異性殺傷。李元春等[5]將人肝癌特異性單克隆抗體HAblS的F(ab' )2片段 偶聯(lián)到多柔比星白蛋白毫微球上，制成免疫毫微球。結(jié)果表明，免疫毫微球能結(jié)合并有效地 殺傷該細(xì)胞株，其效應(yīng)呈劑量依賴性，而對(duì)照的毫微球則不能結(jié)合和明顯地殺傷該細(xì)胞株。 或形成細(xì)胞特異性受體結(jié)合的白蛋白微球，如程耀等[6]用肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜上的去唾液酸糖 蛋白受體對(duì)非還原性半乳糖或IV-乙酰基半乳糖的特異性識(shí)別和攝取，制備了載藥的白蛋 白微球，再在其表面包裹一層半乳糖酰化殼聚糖衍生物，最終得到半乳糖酰化殼聚糖衍生 物包覆的5-氟尿嘧啶白蛋白微球，以期能特異性結(jié)合到細(xì)胞表面。第二種是所謂被動(dòng)靶向。即利用物理作用，使白蛋白微球局部釋放。例如，磁性白 蛋白微球?qū)⑺幬锖痛判晕镔|(zhì)共同包裹于白蛋白中形成磁性白蛋白微球。磁性藥物微粒經(jīng)血 管注入體內(nèi)后，利用體外磁場(chǎng)引導(dǎo)藥物微粒滯留于某一組織或病灶部位，延長(zhǎng)藥物釋放時(shí) 間，以達(dá)到提高療效和降低毒副作用的目的，為藥物靶向提供了一個(gè)新的途徑。Chatterjee 等[4]通過(guò)聚苯乙烯磁性微球與白蛋白磁性微球的比較，發(fā)現(xiàn)白蛋白磁性微球具有更高的 耦合蛋白質(zhì)的能力，蛋白質(zhì)(生物凝集素)修飾的白蛋白磁性微球與紅細(xì)胞結(jié)合的能力遠(yuǎn) 遠(yuǎn)超過(guò)聚苯乙烯磁性微球。所有上述白蛋白微球產(chǎn)品主要重點(diǎn)在于化療或抗炎治療，但至今，尚未見(jiàn)其對(duì)微
7量元素的定點(diǎn)靶向的釋放的上的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)。一則上述靶向修飾的產(chǎn)品或?qū)嶒?yàn)的作用目的 與本專利迥異，均未對(duì)微量元素的局部濃聚釋放產(chǎn)生發(fā)明思路。其二結(jié)合了微量元素后的 白蛋白如再次進(jìn)行靶向修飾，其生物活性、穩(wěn)定性以及機(jī)能難以預(yù)期和把握。因此本發(fā)明的思路是，欲達(dá)成第二步靶向定點(diǎn)釋放微量元素形成局部組織器官的 微量元素濃聚的效果，最理想的狀態(tài)應(yīng)是1.盡量減少對(duì)蛋白質(zhì)或多肽藥物分子的修飾或 改性。蛋白質(zhì)類藥物是由氨基酸組成的具有一定空間構(gòu)象的生物大分子，分子量常為數(shù)千 至幾十萬(wàn)，其活性有賴于其正確的結(jié)構(gòu)，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，而其結(jié)構(gòu)受各種因素的 影響，比如說(shuō)各種蛋白酶、重金屬、有機(jī)溶劑、溫度、PH值、抑制劑、機(jī)械力等。因此，在其制 劑制備、貯存和釋放過(guò)程中很容易受外界條件影響而失活，所以維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性十分 重要。因此無(wú)其他藥物的修飾，單純結(jié)合微量元素的白蛋白，可能是最大程度維持金屬結(jié)合 白蛋白生物活性的形式；2.類似抗原抗體修飾的主動(dòng)靶向蛋白以及磁性材料修飾的白蛋 白包囊，因?yàn)樘砑恿烁綄俚目乖蚩贵w蛋白或大分子物質(zhì)及其他磁性金屬元素，其潛在的 免疫原性和致病性是難以預(yù)測(cè)，而且不利于產(chǎn)品的臨床應(yīng)用批準(zhǔn)和推廣；3.由1，2，本發(fā)明 認(rèn)為被動(dòng)靶向是微量元素結(jié)合白蛋白或其他生物膜材是定向釋放的優(yōu)選途徑。依據(jù)前述思路，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一套生物膜_微量元素空心微囊-超聲給藥系統(tǒng)。本 發(fā)明所涉及到生物膜材優(yōu)選為白蛋白，制備白蛋白-微量元素空心微囊。其實(shí)質(zhì)是利用白 蛋白兩種特性1.高效率的微量元素的結(jié)合率；2.白蛋白自身的表面活性劑作用。本案的 創(chuàng)新在于白蛋白自身即作為微量元素的攜帶載體，又是微量元素的釋放載體。本發(fā)明的白 蛋白微囊實(shí)際是利用白蛋白表面活性劑特點(diǎn)形成的內(nèi)含氣體成分的微氣囊。它既不同于包 被含藥成分的液相核心的常用白蛋白微球制劑，也不同于單純用于超聲造影成像的白蛋白 微泡。因?yàn)槠淠康募炔辉谟诔Ｒ?guī)的白蛋白微囊制劑一利用白蛋白包囊輸送包被在內(nèi)的藥 物分子，也不在于超聲的造影對(duì)比成像。其主要目的在于利用超聲對(duì)微氣泡的破壞作用使 微量元素_白蛋白膜在局部破裂釋放，形成超聲輻照部位的微量元素的定點(diǎn)釋放和濃聚， 從而達(dá)到治療和期望的生理作用。大量物理研究顯示，超聲具有典型的空化作用，即較高能 量的超聲聲場(chǎng)局部可以產(chǎn)生瞬間的高壓和低壓交替，形成傳播局部的空腔化，伴隨這個(gè)過(guò) 程，會(huì)產(chǎn)生瞬間的高溫高壓。當(dāng)超聲聲場(chǎng)中存在微氣泡時(shí)候，這種空化作用更為強(qiáng)化，會(huì)使 局部的組織或血液產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的瞬間空化即高溫高壓。當(dāng)微氣泡破裂時(shí)候，此類作用達(dá) 到峰值，產(chǎn)生的局部瞬間能量，甚至可以使局部的微血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大。這種物理效應(yīng)將使 微泡和超聲作用局部形成有效的血液紊流和血管間隙擴(kuò)大，有助于微量元素在局部的快速 彌散和進(jìn)入組織間隙。因此實(shí)質(zhì)上本發(fā)明的這套系統(tǒng)具備典型的被動(dòng)靶向給藥的特點(diǎn)。我 們的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案證實(shí)即單純結(jié)合了微量元素的白蛋白是其生理結(jié)合形式，理論上最大 限度的保持了微量元素的本身的生理特性，而且被動(dòng)的超聲輻照靶向釋放不但結(jié)合了超聲 聲束的指向性而且結(jié)合了超聲聲場(chǎng)+微氣泡的空化效應(yīng)，使微量元素在局部的釋放和彌散 更為快速而直接。由于本發(fā)明以微囊氣泡對(duì)超聲聲場(chǎng)的空化作用的強(qiáng)化作為靶向釋放的主要投送 手段，因此本發(fā)明還包括如下次選劑型方案以微量元素多肽復(fù)合物作為制劑主劑，以膜包 裹微囊氣泡作為輔劑，形成微量元素_多肽復(fù)合物+微氣泡混懸液，注射入體內(nèi)，以超聲輻 照擊破為定點(diǎn)靶向釋放工具。同樣可達(dá)成類似的微量元素定點(diǎn)釋放的目的。次選方案所指 膜包裹微囊氣泡可是磷脂包裹微氣泡也可是白蛋白包裹微氣泡或聚合物所致微氣泡。
由于本發(fā)明以微囊氣泡對(duì)超聲聲場(chǎng)的空化作用的強(qiáng)化作為靶向釋放的主要投送 手段，因此本發(fā)明還包括如下次選劑型方案以微量元素多肽復(fù)合物作為制劑主劑，以膜包 裹微囊氣泡作為輔劑，形成微量元素_多肽復(fù)合物+微氣泡混懸液，注射入體內(nèi)，以超聲輻 照擊破為定點(diǎn)靶向釋放工具。同樣可達(dá)成類似的微量元素定點(diǎn)釋放的目的。次選方案所指 膜包裹微囊氣泡可是磷脂包裹微氣泡也可是白蛋白包裹微氣泡或聚合物所致微氣泡。水溶性的微量元素鹽一般在體內(nèi)或無(wú)法起作用或具有高度的毒性。微量元素離子 (比如銅、鋅、硒等)必須以生物兼容的方式投送。這種方式主要是微量元素和相應(yīng)多肽或 蛋白復(fù)合或葡萄糖締合物形成多肽或白蛋白復(fù)合物或葡萄糖混合液，才能有效對(duì)細(xì)胞和 組織產(chǎn)生生理生化作用。這里所指蛋白及多肽即可指白蛋白也可指其他金屬?gòu)?fù)合蛋白或多 肽。雖然載藥超聲微泡是進(jìn)行靶向釋放大分子藥物的已被研究用于溶栓、癌癥治療、 基因靶向輸送等。這類藥物制劑局限于大分子合成藥物釋放的研究和實(shí)驗(yàn)中，并且停留在 理論探討或?qū)嶒?yàn)研究中。這與本發(fā)明所涉及到的基礎(chǔ)微量元素離子的應(yīng)用截然不同。這是 因?yàn)榻饘匐x子是基礎(chǔ)離子，其毒性和藥用性劑量很難準(zhǔn)確把握，另一方面除本發(fā)明外，未見(jiàn) 超聲微泡的靶向制備思路和制備方法應(yīng)用于金屬離子釋放的藥物制劑出現(xiàn)。因此本發(fā)明的重要?jiǎng)?chuàng)新在于對(duì)微量元素體內(nèi)的靶向輸送的藥物組合物的發(fā)明和 思路應(yīng)用。人體所需微量元素是一類人體必不可少的特殊的制劑，人可耐受的生理劑量小， 過(guò)量游離的微量元素離子在體內(nèi)通常有毒，其并非如普通疾病治療藥物一樣，需要達(dá)到去 除病灶的目的，如何以注射形式直接給藥從而克服口服補(bǔ)充微量元素的缺陷，進(jìn)而達(dá)到良 好的治療和生理效果完全無(wú)法預(yù)料，也無(wú)現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明人正是創(chuàng)造了一種 特定的組合方式，使微量元素以體內(nèi)超聲定向釋放的方式，達(dá)到了滿意的治療和調(diào)節(jié)生理 作用的效果。如前述，水溶性的微量元素鹽一般在體內(nèi)或無(wú)法起作用或具有高度的毒性。微量 元素離子(比如銅、鋅、硒等)必須以生物兼容的方式投送。這種方式主要是微量元素和相 應(yīng)多肽或蛋白復(fù)合形成多肽或白蛋白復(fù)合物，才能有效對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生生理生化作用。 這里所指蛋白及多肽即可指白蛋白也可指其他金屬?gòu)?fù)合蛋白或多肽。特別的是，多肽微量元素復(fù)合物對(duì)局部組織涂抹或噴涂產(chǎn)生的治療作用已得到廣 泛認(rèn)可和接受，并有相關(guān)藥劑生產(chǎn)制備。例如銅多肽復(fù)合物對(duì)于皮膚及臟器淺表傷口的治 療和作用已為美國(guó)專利 U. S. Pat. Nos. 4，760，051 ；4，665，054 ；，877，770 ；5，135，913and 5, 348, 943.等確認(rèn)和公布。銅多肽復(fù)合物對(duì)胃潰瘍的防治和治療作用亦被美國(guó)專利 U. S. Pat. Nos. 5，145，838 ；4，767，753and 5，023，237所授權(quán)及確認(rèn)。但所有這些專利均只 涉及到微量元素的體表或空腔臟器表面的涂抹或貼膜治療作用。均未形成對(duì)體內(nèi)實(shí)質(zhì)性臟 器的微量元素的局部濃聚而致的治療作用。但這些均給予了本發(fā)明一個(gè)重要的邏輯性的推 理，局部的微量元素的釋放無(wú)論是對(duì)淺表組織還是對(duì)體內(nèi)的實(shí)質(zhì)性臟器組織的受損組織， 只要能在局部形成濃聚和定點(diǎn)控釋，就能產(chǎn)生有效的積極的療效。如前述，本專利所涉微量元素多肽復(fù)合物，意指以下多肽復(fù)合物(表1是各個(gè)氨基 酸的英語(yǔ)簡(jiǎn)稱和縮寫對(duì)應(yīng)表)。表1 氨基酸的英語(yǔ)簡(jiǎn)稱及縮寫對(duì)應(yīng)表 微量元素多肽可以是指以下復(fù)合物(M指微量元素)glycyl-L-histidyl-L-lysine :Μ(" GHKM“ ), L-alanyl-L-histidyl-L-lysine M(〃 AHK-M“ ), L-valyl-L-histidyl-L-lysine :Μ(" VHK-M“)，L-leucyl-L-histidyl-L-lysine :M( “ LHK-M “)， L-isoleucyl-L-histidyl-L-lysine:M( “ IHK-M “ ) , L-pheny lalanyl-L-histidyl-L-lysine :Μ(" FHK-M“)，L-prolyl-L-histidyl-L-lysine :M( “ PHK-M “)， L-seryl-Lhistidyl-L-lysine :M( " SHK-M " ), or L-threonyl-Lhistidyl-L-lysine M(" THK-M〃 )。在此，多肽微量元素復(fù)合物總體上是指一類配位化合物，其包括一多肽分子和微 量元素非共價(jià)復(fù)合于前述多肽上。多肽基團(tuán)是指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列或氨基酸衍生物序 列共價(jià)結(jié)合?？傮w而言，本專利所提氨基酸包含一個(gè)氨基，一個(gè)羧基，一個(gè)氫原子以及一個(gè) 氨基酸側(cè)鏈結(jié)合基團(tuán)。本專利所涉及的多肽氨基酸主要是指alpha，beta或gamma氨基酸，
例如
NH2NH2
h^Fc00h ^廠鞏一讀
XX
alpha-amino acidbets-amino acid
NH2
H—C— CE2-CH2-COOH X
gamma-ammo acid.上述結(jié)構(gòu)式中X代表氨基酸側(cè)鏈結(jié)合部位。本專利所提及氨基酸復(fù)合物可以是L型或D型或兩者混合。本專利所提及的氨基酸衍生物包括以下圖表所示的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所包含的組氨酸衍生物的結(jié)構(gòu)如下此結(jié)構(gòu)中η = 1-20 (排除η 二 3的情況)。
Ya本發(fā)明所提及的多肽微量元素復(fù)合物可依據(jù)以下通式描述[R1-R2-R3] :M，此處 M，至少是上述定義的一個(gè)氨基酸或氨基酸衍生物通過(guò)肽鍵連于R。此處的R單個(gè)氨基酸或 氨基酸衍生物，這樣的多肽微量元素復(fù)合物一般歸類于三肽。本專利涉及的另一多肽微量 元素復(fù)合物的通式描述亦可為[R，-R，_R，] :M。但在此類中R是化學(xué)基團(tuán)通過(guò)酰胺鍵連于 R。此處的化學(xué)基團(tuán)指的是包含氨基并能與任何含羧基末端的R形成酰胺鍵連接(比如組 氨酸的羧基末端，精氨酸的羧基末端或相關(guān)衍生物)。更進(jìn)一步闡述R是擁有1-20個(gè)碳原 子的-NH烷基，它與R通過(guò)酰胺鍵相連，或是擁有6-20個(gè)碳原子的芳氨基。此處所提及的 烷基不排除包含氨基，辛胺，或丙胺。類似的，芳氨基不排除包括芐胺或苯甲基。對(duì)于具有 能與R的羧基末端產(chǎn)生酰胺鍵連接的氨基，可包括多胺比如精胺及亞精胺。本發(fā)明涉及多種微量元素的結(jié)合和靶向輸送，以下實(shí)施實(shí)例以銅為主要實(shí)施目標(biāo) 以驗(yàn)證本專利所涵蓋的微量元素的定點(diǎn)輸送成效。生理劑量的銅離子具備很多生物學(xué)功 效，例如刺激傷口或損傷組織中的膠原及彈性蛋白堆積(參考，Maquart et al.，J.Clin. Invest. 92 2368-2376(1993) ；Maquart et al. , FEBS Lett. 238(2) :343_346(1988)及 Wegrowski et al.，Life Sci. 51 (13) 1049-1056 (1992))。調(diào)節(jié)金屬蛋白酶基質(zhì)的活 性(參考，Simeon et al.，J. Invest. Dermatol. 112(6) :957_964 (1999))。提高血管 生成活性(參考，Ahmed et al.，Biomaterials 20 :201_209 (1999) ；Hu, G. F.，J. Cell. Biochem. 69 326-35 (1998) ； Lane et al.，J.Cell. Biol. 125(4) :929_943(1994) ；and Raju et al. , JNCI69(5) 1183-1188 (1982)) 0提高創(chuàng)傷修復(fù)的速度和程度(參考， Counts et al,Federation of American Societies for Experimental Biology Journal 6[5], A1636(1992) ；Downey et al.，Surgical Forum 36:573-575(1985) ；Fish et al.， Wounds3 171-177(1991) ；MuIder et al. , Wound Repair and Regeneration 139(1993)； Swaim et al. , Am. J. VetRes. 57 394~399 (1996) ；and Swaim et al. , J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 29 :519-525(1993))。然而如前述，水溶性的銅鹽離子是沒(méi)有生理活性甚至有相當(dāng)?shù)亩拘院痛碳ば?，?禁止直接作用于傷口或疤痕區(qū)域。銅離子必須以生物兼容方式被投遞。因而，本發(fā)明微量元素離子也可以用葡萄糖與微量元素的復(fù)合物方式輸送，其結(jié) 構(gòu)通式如下(X代表微量元素)
a-L-葡萄糖P-L葡萄糖因此，本發(fā)明公開(kāi)了一種能用于與超聲相互作用定向釋放微量元素離子進(jìn)而促進(jìn) 超聲輻照局部的促進(jìn)疤痕活化、血管、組織再生、抗腫瘤的目的的被相應(yīng)金屬離子修飾或結(jié) 合的膜包裹含氣微囊及其與結(jié)合了微量元素離子的膜材溶液或多肽結(jié)合微量元素離子的 藥物組合物。這也包括了單純膜包裹微囊與相應(yīng)微量元素離子溶液或結(jié)合了相應(yīng)微量元素 離子的膜材混懸藥液。這種復(fù)合藥液能在超聲的輻照作用下，定向?qū)胛⒘吭仉x子進(jìn)入體內(nèi)。從而能 有效使超聲輻照到的部位的組織血管再生、組織再生或抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)。其廣泛的臨 床前景包括梗死心肌的血管再生、冠脈狹窄后的血管再生、各種臟器血管狹窄性或梗死性 病變的促血管生成(諸如肢體動(dòng)脈狹窄或梗死后的促血管生成)。潛在的應(yīng)用主要是相 應(yīng)微量元素離子已證明的生理生物學(xué)效應(yīng)，例如包括體內(nèi)臟器術(shù)后的疤痕內(nèi)的血管再生， 如各種實(shí)質(zhì)臟器后的疤痕或促進(jìn)組織再生，例如肝臟術(shù)后、胃腸術(shù)后、食道術(shù)后、子宮術(shù)后 等，肝纖維化的治療，也包括諸如對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制等。本發(fā)明所提及的再生包括多方面的含義1、疤痕組織的血管化和彈性恢復(fù)；2、疤 痕所在部位的實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生；3、壞死部位的血管及實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生；4、狹窄缺血部位的血管 再生；5、組織纖維化逆轉(zhuǎn)等。本發(fā)明的超聲靶向釋放微量元素的藥物組合物制劑具有極好的臨床應(yīng)用前景，為 各種病變組織的血管、組織及抗腫瘤治療等提供了一種安全有效的治療新途徑。


圖1不同濃度Cu2+對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用圖2銅離子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增值促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組圖3瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)A組熒光定量RT-PCR產(chǎn)物圖4三組細(xì)胞eNOS和Tie-I表達(dá)差異圖5A為假手術(shù)組，B為對(duì)照組(未加入海藻酸鈣+CuSO4貼膜)梗塞局部可見(jiàn)大量的脂肪組織和纖維化組織堆積(箭頭示)。C為貼膜后梗塞區(qū)域的血管再生顯示，梗死組織 出現(xiàn)了明顯的心肌再生和心臟結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，其形態(tài)更接近假手術(shù)的心臟?？梢?jiàn)明顯的微血 管網(wǎng)形成。圖6是上述心梗病理切片結(jié)果的對(duì)比。組織學(xué)(HE染色、Masson三色法)觀察Cu 貼膜處理的心肌出現(xiàn)較多的新生血管，并有大量的單核細(xì)胞以及心肌纖維化的恢復(fù)。CuSO4 貼膜使局部心梗壞死組織內(nèi)見(jiàn)顯著的小血管及膠質(zhì)增生。Masson是膠原染色。圖7人血白蛋白與銅離子結(jié)合的熒光淬滅圖8未螯合Cu2+人血白蛋白微球的熒光峰圖9加入50 μ 1 CuSO4后螯合Cu2+微球的熒光吸收峰10加入100 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球的熒光吸收峰圖11加入200 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球的熒光吸收峰圖12加入300 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球的熒光吸收峰圖13加入400 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球熒光吸收峰圖14加入500 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球熒光吸收峰圖15加入600 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球的熒光吸收峰
圖16加入700 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球熒光吸收峰圖17加入1000 μ 1 CuSO4螯合Cu2+微球熒光吸收峰圖18單純白蛋白微泡隨加入的銅離子的量的增多，其熒光淬滅逐漸增多圖19螯合銅離子白蛋白膜包裹微球粒徑分布圖20

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示微泡結(jié)合銅后，靜置2個(gè)月后，粒徑分布穩(wěn)定 在1. 5 μ m的正態(tài)峰值，平均粒徑1. 95 μ m ；粒徑0_3 μ m的微泡占所有微泡范圍的90%，微 泡濃度3X IO8個(gè)/ml。與2月前制備初期相比沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明螯合銅微泡穩(wěn)定可靠。圖21采用高能量彩色多普勒模式連續(xù)擊破白蛋白微球，形成對(duì)心梗局部的銅離 子被動(dòng)靶向釋放。圖22A為對(duì)照組，未注射螯合白蛋白微泡的心梗模型兔4周后的大體病理圖片。 左心前表面可見(jiàn)大量的脂肪堆積，呈典型的心梗疤痕區(qū)域脂肪變性、脂肪堆積的表現(xiàn)(箭 頭)。B為實(shí)驗(yàn)組，注射螯合白蛋白微泡后4周，心梗疤痕區(qū)明顯活化，表面見(jiàn)大量新生的毛 細(xì)血管生成(箭頭)圖23A，B為對(duì)照組，未進(jìn)行超聲輻照靶向輸送螯合銅離子。A :X400Masson染色 梗死區(qū)大量脂肪變性及脂肪空泡形成，無(wú)血管增生。B :X lOOMasson染色心肌梗死與正常 交界區(qū)域仍見(jiàn)大量脂肪變性和脂肪空泡形成，無(wú)明顯血管增生。C，D為實(shí)驗(yàn)組，行超聲輻照 靶向輸送螯合銅離子產(chǎn)生明顯膠原和血管再生。C :X400MaSSOn染色梗死區(qū)可見(jiàn)明顯的 膠原纖維增生伴小血管增生。D 梗死與正常交界區(qū)域X IOOMasson染色見(jiàn)明顯的膠原纖 維增生伴小血管增生。圖2
靜置2月后，流式細(xì)胞儀器顯示結(jié)合鋅離子后微泡粒徑分布和濃 度變化與初制備時(shí)沒(méi)有明顯差異，粒徑分布正態(tài)分布峰值在1. 5 μ m，粒徑0-3恤的微泡占 所有微泡范圍的90. 5%，平均粒徑2. 5 μ m。微泡濃度3. 4X IO8個(gè)/ml。結(jié)合鋅的微泡具備
穩(wěn)定可靠性。圖2
靜置2月后，顯示微泡結(jié)合硒后，粒徑分布穩(wěn)定在1. 5μπι的正態(tài)峰值，平均粒徑2. 1 μ m，粒徑0-3 μ m的微泡占所有微泡范圍的91 %，微泡濃度3 X IO8個(gè)/ ml。與兩月前微泡粒徑分布和濃度相比沒(méi)有明顯變化。結(jié)合硒的微泡具備穩(wěn)定可靠的特 性。圖26心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅白蛋白的心梗區(qū)域與僅僅注射磷 脂微球?qū)φ战M心梗區(qū)域內(nèi)的微血管密度對(duì)比顯示，含螯合銅白蛋白的實(shí)驗(yàn)組的心梗區(qū)域的 微血管密度顯著高于對(duì)照組。圖27心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅葡萄糖的心梗區(qū)域內(nèi)見(jiàn)明顯的小
血管再生。圖28心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅葡萄糖的心梗區(qū)域與僅僅注射磷 脂微球?qū)φ战M心梗區(qū)域內(nèi)的微血管密度對(duì)比顯示，含螯合銅葡萄糖溶液的實(shí)驗(yàn)組的心梗區(qū) 域的微血管密度顯著高于對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是并非對(duì)本發(fā)明的限制。以 下各個(gè)實(shí)施例中，我們?cè)谖⒘吭刂袃?yōu)選了銅離子進(jìn)行離體細(xì)胞生理效應(yīng)的確定、動(dòng)物在 體實(shí)驗(yàn)局部貼膜控釋確認(rèn)離體細(xì)胞的生理效應(yīng)的發(fā)生、螯合銅微泡在體控釋微量元素對(duì)心 肌產(chǎn)生離體細(xì)胞和在體貼膜實(shí)驗(yàn)相類似的生理效應(yīng)等實(shí)驗(yàn)，以證明微泡聯(lián)合超聲局部控釋 微量元素產(chǎn)生局部治療和相對(duì)應(yīng)生理效應(yīng)的科學(xué)性和可行性。實(shí)施例1確認(rèn)銅離子體外的刺激細(xì)胞再生及干細(xì)胞動(dòng)員實(shí)驗(yàn)和在體局部貼膜控 釋銅離子的生理學(xué)效果體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)微量元素-銅離子對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)能有效增強(qiáng)增殖與分化。體外培養(yǎng)并傳代HUVEC。將 HUVEC以5X IO3個(gè)/孔密度接種于96孔板，根據(jù)向孔板中加入溶液濃度的不同將細(xì)胞隨 機(jī)分成3組，A組5ymol/L CuSO4, B組25ymol/L CuSO4, C組為空白對(duì)照，每組4個(gè)復(fù)孔， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MCDB131，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制生長(zhǎng)曲線。另取HUVEC以2X105 個(gè)/孔密度接種于6孔板，分組同前，熒光定量RT-PCR檢測(cè)3組HUVEC的內(nèi)皮型一氧化氮 合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)基因和 Tie-1 基因表達(dá)。結(jié)果生長(zhǎng)曲 線示前3d為指數(shù)增長(zhǎng)期，第4天開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期。A組細(xì)胞增殖能力從第3天開(kāi)始明顯高 于B、C組，B組在2d內(nèi)高于C組，但從第4天開(kāi)始顯著低于C組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(P <0.05)見(jiàn)圖1，2，銅離子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增值促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組。熒光定量 RT-PCR檢測(cè)示作用48h后，A、B、C組eNOS基因表達(dá)分別為7. 294 土 1. 488,0. 149士0. 044 和 1. 000士0. 253，Tie-l 基因的表達(dá)分別為 1. 481 士0. 137,1. 131 士0. 191 和 1. 000士0. 177。 A組與B、C組比較，2個(gè)基因的表達(dá)均有上調(diào)(P <0.05) ；B、C組比較，eNOS基因表達(dá)下調(diào) (P < 0. 05)，Tie-I基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)(圖3，4，表1)。結(jié)論5 μ mol/ L Cu2+能有效促進(jìn)HUVEC的增殖與分化。表1三組細(xì)胞eNOS和Tie-Ι的表達(dá)情況( 士S ) *A組與C組比較P < 0. 05 ;#B組與C組比較P < 0. 05實(shí)施例2確認(rèn)銅離子體外的刺激細(xì)胞再生及干細(xì)胞動(dòng)員實(shí)驗(yàn)和在體局部貼膜控 釋銅離子的生理學(xué)效果。為確定銅離子在損傷疤痕的活化和刺激疤痕內(nèi)血管再生的局部效果，對(duì)局部心梗 動(dòng)物模型進(jìn)行貼銅離子凝膠，以驗(yàn)證局部緩釋銅離子的生理學(xué)作用。1、制備海藻酸鈣+CuSO4貼膜。以2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻酸鈉溶液10毫升與含IOmg CuSO4溶液充分混合，滴加5ml CaCl2溶液后成膜。2、制備心梗模型麻醉狀態(tài)下，開(kāi)胸游離并結(jié)扎兔心左前降支冠脈，制備兔左心心 梗模型。開(kāi)胸狀態(tài)下，將前步所成膜貼附于左心前表面。關(guān)胸。穩(wěn)定4周后，再次開(kāi)胸觀察 大體標(biāo)本及病理切片差異。結(jié)果顯示，局部緩釋的銅離子形成顯著的促進(jìn)血管再生和疤痕活化的生理效果。 在兔的心肌缺血模型上，我們用前步所成膜貼附于心肌缺血手術(shù)4周后的梗死心肌組織， 治療2周后，每周動(dòng)態(tài)心臟彩超及心肌灌注造影，證實(shí)銅離子局部補(bǔ)充后可有效改善心肌 缺血及心功能，病理檢查發(fā)現(xiàn)梗死心肌組織內(nèi)出現(xiàn)大量新生血管(見(jiàn)圖5，6)。圖中顯示圖5A為假手術(shù)組，B為對(duì)照組(未加入海藻酸鈣+CuSO4貼膜)梗塞局 部可見(jiàn)大量的脂肪組織和纖維化組織堆積(箭頭示)。C為貼膜后梗塞區(qū)域的血管再生顯 示，梗死組織出現(xiàn)了明顯的心肌再生和心臟結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，其形態(tài)更接近假手術(shù)的心臟?？梢?jiàn) 明顯的微血管網(wǎng)形成。圖6是上述心梗病理切片結(jié)果的對(duì)比。組織學(xué)(HE染色、Masson三色法)觀察Cu 貼膜處理的心肌出現(xiàn)較多的新生血管，并有大量的單核細(xì)胞以及心肌纖維化的恢復(fù)。CuSO4 貼膜使局部心梗壞死組織內(nèi)見(jiàn)顯著的小血管及膠質(zhì)增生Masson是膠原染色。實(shí)施例3銅離子和白蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)(銅離子螯合白蛋白微泡的制備)實(shí)驗(yàn)中所用溶液用去離子水配制，使用0. Imol · L—1的NaCl保持離子強(qiáng)度，用 Tris-HCl作為緩沖液，pH值為7. 4，配制HSA及硫酸銅溶液，濃度依次為8. 76X10"6mol -L-I 和6.48X10_4mol噸-1。使用Icm比色皿，測(cè)定了 (1)固定激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，硫酸銅對(duì)HSA 進(jìn)行滴定，觀察HSA的熒光發(fā)射峰的變化。圖中可看出，Cu2+的加入并未明顯改變的激發(fā)峰、 最大熒光峰的位置，但熒光強(qiáng)度卻隨硫酸銅的量的增加而不同程度的減弱。由于HSA溶液 的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于所滴加的金屬離子溶液的體積，因此可忽略稀釋效應(yīng)。蛋白質(zhì)能夠發(fā)出熒光，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中存在三種芳香族氨基酸殘基Trp、Tyr和 Phe殘基，由于這些氨基酸殘基不同的結(jié)構(gòu)，通常三者的熒光強(qiáng)度比為100 9 0.5。根 據(jù)蛋白質(zhì)是否含有色氨酸可將其分為兩類A類蛋白，指不含Trp殘基只含Tyr和Phe殘基 的蛋白質(zhì)；B類蛋白指既含Trp殘基又含Tyr和Phe殘基的蛋白質(zhì)。血清白蛋白屬于B類 蛋白，有較強(qiáng)的熒光。雖然三種生色基團(tuán)都有自己的特征熒光峰(Trp、Tyr和Phe的熒光峰位分別位于348、303和282nm)，但由于在蛋白質(zhì)大分子內(nèi)，由Phe到Tyr或rrrp的能量轉(zhuǎn) 移非常有效的，因此整個(gè)分子的吸收和發(fā)射也不是這些單體組分光學(xué)性質(zhì)的簡(jiǎn)單加和減， 往往Trp殘基的熒光占優(yōu)勢(shì)地位。當(dāng)在270 290nm激發(fā)蛋白質(zhì)時(shí)，不能忽略Tyr殘基的 貢獻(xiàn)，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)大于290nm時(shí)，可認(rèn)為熒光都來(lái)自Trp殘基。HSA中只含有一個(gè)214位的 Trp殘基，熒光發(fā)射峰在350nm附近。一般認(rèn)為，熒光主要是從212位Trp殘基發(fā)出的，在 342nm左右。二者的最大激發(fā)峰都約為280nm。Trp殘基可以用作局部構(gòu)象變化或芳香族氨 基酸殘基微環(huán)境變化的探針，當(dāng)加入金屬離子等物質(zhì)后，利用血清白蛋白內(nèi)源熒光的變化， 可以對(duì)結(jié)合進(jìn)行定性和定量研究。本實(shí)驗(yàn)實(shí)例顯示，隨著銅離子的加入，更多的銅離子與人血白蛋白螯合，使白蛋白 的熒光發(fā)生淬滅。實(shí)例4銅離子與白蛋白微泡的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，包括熒光分析結(jié)果(銅離子螯合白蛋白 微泡的制備)1.白蛋白微泡的制備移取20ml 5%人血白蛋白溶液至連接三通的20ml—次性 注射器內(nèi)，將超聲儀探頭插入液面下2cm處，以一定超聲強(qiáng)度，聲振20ml 人血白蛋白溶 液，預(yù)聲振10s，再在聲振的同時(shí)于5秒內(nèi)通入一定量的C3F8，繼續(xù)聲振，到終點(diǎn)溫度后停止 聲振，得C3F8白蛋白微球混懸液，混懸液立即轉(zhuǎn)移至50ml藥瓶?jī)?nèi)，藥瓶上端空氣用C3F8充分 置換，藥瓶用膠塞嚴(yán)封，于室溫下靜置24h。搖勻后對(duì)微球進(jìn)行粒徑分析如下表2，微球平均 直徑 2. 15 μ m。表2 白蛋白微球的粒徑分布 表2顯示微泡平均粒徑為2. 15 μ m，平均濃度為3. 7X IO8個(gè)/ml。2.微泡膜與銅離子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)精密吸取5 % HSA微泡溶液Iml稀釋到250ml的容量瓶中，移液管各取IOml至9個(gè)玻璃試管中，依次分別滴加Cu2+(1/50稀釋的飽和銅溶液)溶液待測(cè)。以下表3為各個(gè)不 同濃度銅離子與HSA微泡的結(jié)合的量。見(jiàn)圖8-17，為白蛋白微泡加入不同濃度的硫酸銅后， 銅離子與白蛋白微泡膜螯合后發(fā)生的熒光淬滅反應(yīng)。圖8-17均可見(jiàn)兩個(gè)吸收峰，前者為加 銅后的特征峰(激發(fā)波長(zhǎng)為332nm左右)；后一個(gè)峰是未螯合銅離子的空白白蛋白微球本 身的吸收峰(發(fā)射波長(zhǎng)為408nm)；數(shù)據(jù)讀取方法每個(gè)峰有兩個(gè)表示值，從下到上讀取，兩 個(gè)數(shù)據(jù)用.隔開(kāi)，后者為熒光光譜吸收強(qiáng)度。該實(shí)驗(yàn)證明銅離子與白蛋白微泡膜結(jié)合，導(dǎo)致白蛋白的熒光強(qiáng)度漸小。表3 加入的不同濃度硫酸銅 實(shí)例5銅離子結(jié)合白蛋白微泡的制備銅離子與白蛋白結(jié)合后超聲波分散制備白蛋白銅微泡實(shí)驗(yàn)，包括熒光分析結(jié)果及 微泡計(jì)量結(jié)果。1.首先制備結(jié)合銅離子的白蛋白溶液按硫酸銅白蛋白溶液=1 Imol進(jìn)行 加樣。此實(shí)例對(duì)應(yīng)比例如下=Img HSA加入4. 35X 10_6molCu2+。2.移取20ml 5%螯合銅-人血白蛋白溶液至連接三通的20ml —次性注射器內(nèi)， 將超聲儀探頭插入液面下2cm處，以一定超聲強(qiáng)度，聲振20ml 5%人血白蛋白溶液，預(yù)聲振 10s，再在聲振的同時(shí)于5秒內(nèi)通入一定量的C3F8，繼續(xù)聲振，到終點(diǎn)溫度后停止聲振，得C3F8 白蛋白微球混懸液，混懸液立即轉(zhuǎn)移至50ml藥瓶?jī)?nèi)，藥瓶上端空氣用C3F8充分置換，藥瓶用 膠塞嚴(yán)封，于室溫下靜置24h。搖勻后對(duì)微球進(jìn)行粒徑分析，粒徑分布如圖19。顯示螯合銅 離子后微泡的平均粒徑為2 μ m,濃度是3. 1 X IO8個(gè)/ml3.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將前述結(jié)合銅離子的微泡注入20ml玻璃瓶?jī)?nèi)，密封，5度冰箱內(nèi)保 存。至2月后，重新取樣測(cè)量，微泡濃度與粒徑分布與剛制備出的微泡沒(méi)有明顯改變。下圖 20是流式細(xì)胞儀對(duì)微泡粒徑變化的檢測(cè)，檢測(cè)說(shuō)明，微泡濃度和粒徑穩(wěn)定. 圖20流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示微泡結(jié)合銅后，靜置2個(gè)月后，粒徑分布穩(wěn)定在1. 5 μ m 的正態(tài)峰值，平均粒徑1. 95 μ m ；粒徑0-3 μ m的微泡占所有微泡范圍的90 %，微泡濃度 3X IO8個(gè)/ml。與2月前制備初期相比沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明螯合銅微泡穩(wěn)定可靠。
實(shí)例6白蛋白銅離子微泡超聲輻照心肌梗塞動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)及結(jié)果以實(shí)例5方法制備15ml白蛋白C3F8，其中共螯合IOmg銅離子。麻醉狀態(tài)下，開(kāi)胸 游離并結(jié)扎兔心左前降支冠脈，制備兔左心心梗模型，穩(wěn)定4周后。行耳緣靜脈連續(xù)以Iml/ min的速度推注螯合銅離子白蛋白微泡，以超聲波連續(xù)輻照左心前區(qū)，由心底向心尖做來(lái)回 連續(xù)扇形掃查，超聲波輸出能量調(diào)至最大并啟用彩色多普勒模式(圖21)。每2周重復(fù)一 次注射和輻照，每次劑量相同。至4周后，處死實(shí)驗(yàn)兔，觀察實(shí)驗(yàn)兔大體心臟形態(tài)和心梗病 理切片，對(duì)比分析對(duì)照組的心梗疤痕組織內(nèi)血管再生和活化情況。結(jié)果顯示，注射螯合銅離 子白蛋白微球在超聲的輻照下，使心梗局部組織內(nèi)產(chǎn)生大量而明顯的血管再生以及活化， 見(jiàn)圖22，23。圖21為采用高能量彩色多普勒模式連續(xù)擊破白蛋白微球，形成對(duì)心梗局部的銅 離子被動(dòng)靶向釋放。圖22 :A為對(duì)照組，未注射螯合白蛋白微泡的心梗模型兔4周后的大體病理圖片。 左心前表面可見(jiàn)大量的脂肪堆積，呈典型的心梗疤痕區(qū)域脂肪變性、脂肪堆積的表現(xiàn)(箭 頭)。B為實(shí)驗(yàn)組，注射螯合白蛋白微泡后4周，心梗疤痕區(qū)明顯活化，表面見(jiàn)大量新生的毛 細(xì)血管生成(箭頭)。圖23 :A, B為對(duì)照組，未進(jìn)行超聲輻照靶向輸送螯合銅離子。A :X400MaSSOn染 色梗死區(qū)大量脂肪變性及脂肪空泡形成，無(wú)血管增生。B :X lOOMasson染色心肌梗死與 正常交界區(qū)域仍見(jiàn)大量脂肪變性和脂肪空泡形成，無(wú)明顯血管增生。C，D為實(shí)驗(yàn)組，行超聲 輻照靶向輸送螯合銅離子產(chǎn)生明顯膠原和血管再生。C :X400MaSSOn染色梗死區(qū)可見(jiàn)明 顯的膠原纖維增生伴小血管增生。D 梗死與正常交界區(qū)域X lOOMasson染色見(jiàn)明顯的膠 原纖維增生伴小血管增生。實(shí)例7白蛋白與鋅離子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)及螯合鋅白蛋白微球的制備(確認(rèn)鋅離子螯合 白蛋白微泡的實(shí)驗(yàn))1.按氯化鋅白蛋白=1 1摩爾比進(jìn)行。精密吸取5% HSA微泡溶液15ml，滴 加等摩爾濃度的氯化鋅溶液。熒光分析顯示，白蛋白溶液加入氯化鋅后，鋅離子與白蛋白同 樣發(fā)生的熒光淬滅反應(yīng)，證實(shí)鋅離子與白蛋白發(fā)生螯合。根據(jù)摩爾比，共配制15ml 5 %螯合 鋅人血白蛋白。2.移取步驟1制取的螯合鋅_人血白蛋白溶液至連接三通的20ml —次性注射器 內(nèi)，將超聲儀探頭插入液面下2cm處，以一定超聲強(qiáng)度，聲振人血白蛋白溶液，預(yù)聲振10秒， 再在聲振的同時(shí)于5秒內(nèi)通入一定量的C3F8，繼續(xù)聲振，到終點(diǎn)溫度后停止聲振，得C3F8白 蛋白微球混懸液，混懸液立即轉(zhuǎn)移至30ml藥瓶?jī)?nèi)，藥瓶上端空氣用C3F8充分置換，藥瓶用膠 塞嚴(yán)封，于室溫下靜置24h。搖勻后對(duì)微球進(jìn)行粒徑分析，粒徑分布與實(shí)例5相同，微球平均 直徑 2. 5-3. 0 μ mo3.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將前述結(jié)合鋅離子的微泡注入20ml玻璃瓶?jī)?nèi)，密封，4°C冰箱內(nèi)保 存。至2月后，重新取樣測(cè)量，微泡濃度與粒徑分布與剛制備出的微泡沒(méi)有明顯改變。圖24是流式細(xì)胞儀對(duì)微泡進(jìn)行的粒徑分析 圖24顯示靜置2月后，流式細(xì)胞儀器顯示結(jié)合鋅離子后微泡粒徑分布和濃度變化 與初制備時(shí)沒(méi)有明顯差異，粒徑分布正態(tài)分布峰值在1. 5 μ m，粒徑0-3 μ m的微泡占所有微 泡范圍的90. 5%，平均粒徑2.5 μ m。微泡濃度3. 4X IO8個(gè)/ml。結(jié)合鋅的微泡具備穩(wěn)定可靠性。實(shí)例8白蛋白與硒醚的結(jié)合實(shí)驗(yàn)(確認(rèn)硒離子螯合白蛋白微泡的實(shí)驗(yàn))1.制備20ml結(jié)合硒的HSA 三硫化硒青霉胺(4mM)與HSA(40mg/mL)在0. OlM的 磷酸鹽緩沖液(PH7.4)中混合，混合液孵育10分鐘。未反應(yīng)的PenSePen通過(guò)透析移除。得 到結(jié)合硒的HSA。2.硒-人血白蛋白溶液至連接三通的20ml —次性注射器內(nèi)，將超聲儀探頭插入液 面下2cm處，以一定超聲強(qiáng)度，聲振人血白蛋白溶液，預(yù)聲振10s，再在聲振的同時(shí)于5秒內(nèi) 通入一定量的C3F8，繼續(xù)聲振，到終點(diǎn)溫度后停止聲振，得C3F8白蛋白微球混懸液，混懸液立 即轉(zhuǎn)移至30ml藥瓶?jī)?nèi)，藥瓶上端空氣用C3F8充分置換，藥瓶用膠塞嚴(yán)封，于室溫下靜置24h。 搖勻后對(duì)微球進(jìn)行粒徑分析，粒徑分布與實(shí)例5相同，微球平均直徑2. 5-3. 0 μ m。3.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將前述結(jié)合硒離子的微泡注入20ml玻璃瓶?jī)?nèi)，密封，5度冰箱內(nèi)保 存。至2月后，重新取樣測(cè)量，微泡濃度與粒徑分布與剛制備出的微泡沒(méi)有明顯改變。下圖 25是流式細(xì)胞儀進(jìn)行的粒徑分析。 圖25顯示靜置2月后，顯示微泡結(jié)合硒后，粒徑分布穩(wěn)定在1. 5μπι的正態(tài)峰值， 平均粒徑2. 1 μ m，粒徑0-3 μ m的微泡占所有微泡范圍的91 %，微泡濃度3 X IO8個(gè)/ml。與 兩月前微泡粒徑分布和濃度相比沒(méi)有明顯變化。結(jié)合硒的微泡具備穩(wěn)定可靠的特性。實(shí)例9白蛋白結(jié)合銅+磷脂微泡混合實(shí)驗(yàn)1.按實(shí)例3配制螯合銅的白蛋白0. IM的NaCl保持離子強(qiáng)度，用Tris-HCl作為 緩沖液，PH值為7. 4，配制HSA及硫酸銅溶液，濃度依次為8. 76 X ICT6M和6. 48 X 10_4M。2.注入 9.6ml S0N0VUE 磷脂 SF6 微泡。3.將1和2的溶液混合，形成白蛋白多肽螯合銅與磷脂微泡的混懸液。實(shí)例10白蛋白結(jié)合銅+磷脂微泡心梗動(dòng)物模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及結(jié)果1.按實(shí)例2和6制備兔心梗模型。
2.將實(shí)例9所制磷脂微球與螯合銅的白蛋白多肽混懸液經(jīng)耳緣靜脈連續(xù)以Iml/ min的速度推注，輸注同時(shí)以超聲波連續(xù)輻照左心前區(qū)，由心底向心尖做來(lái)回連續(xù)扇形掃 查，超聲波輸出能量調(diào)至最大并啟用彩色多普勒模式。每2周重復(fù)一次注射和輻照，每次劑 量相同。至4周后，處死實(shí)驗(yàn)兔，觀察實(shí)驗(yàn)兔大體心臟形態(tài)和心梗病理切片，對(duì)比分析對(duì)照 組的心梗疤痕組織內(nèi)血管再生和活化情況。結(jié)果顯示，注射脂微球與螯合銅的白蛋白多肽 混懸液，在超聲的輻照下，使心梗局部組織內(nèi)產(chǎn)生明顯的血管再生以及活化。通過(guò)微血管密 度計(jì)數(shù)的方法，對(duì)心梗疤痕組織進(jìn)行病理取片。取每切片隨機(jī)抽樣5個(gè)區(qū)域，10 X 40倍鏡下 計(jì)數(shù)。所取血管直徑均在20 μ m以內(nèi)，統(tǒng)計(jì)上述視野內(nèi)的微血管數(shù)量。圖26顯示心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅白蛋白的心梗區(qū)域與僅僅 注射磷脂微球?qū)φ战M心梗區(qū)域內(nèi)的微血管密度對(duì)比顯示，含螯合銅白蛋白的實(shí)驗(yàn)組的心梗 區(qū)域的微血管密度顯著高于對(duì)照組。實(shí)例11葡萄糖結(jié)合銅+磷脂微球心梗動(dòng)物模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及結(jié)果1.按實(shí)例2和6制備兔心梗模型。2.將實(shí)例9所制磷脂微球與螯合銅的葡萄糖混懸液經(jīng)耳緣靜脈連續(xù)以lml/min的 速度推注，輸注同時(shí)以超聲波連續(xù)輻照左心前區(qū)，由心底向心尖做來(lái)回連續(xù)扇形掃查，超聲 波輸出能量調(diào)至最大并啟用彩色多普勒模式。每2周重復(fù)一次注射和輻照，每次劑量相同。 至4周后，處死實(shí)驗(yàn)兔，觀察實(shí)驗(yàn)兔大體心臟形態(tài)和心梗病理切片，對(duì)比分析對(duì)照組的心梗 疤痕組織內(nèi)血管再生和活化情況。結(jié)果顯示，注射脂微球與螯合銅的葡萄糖混懸液，在超聲 的輻照下，使心梗局部組織內(nèi)產(chǎn)生明顯的血管再生以及活化。通過(guò)微血管密度計(jì)數(shù)的方法， 對(duì)心梗疤痕組織進(jìn)行病理取片。取每切片隨機(jī)抽樣5個(gè)區(qū)域，10X40倍鏡下計(jì)數(shù)。所取血 管直徑均在20 μ m以內(nèi)，統(tǒng)計(jì)上述視野內(nèi)的微血管數(shù)量。圖27顯示心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅葡萄糖的心梗區(qū)域內(nèi)見(jiàn)明 顯的小血管再生。圖28顯示心梗區(qū)域內(nèi)經(jīng)超聲輻照磷脂微球及螯合銅葡萄糖的心梗區(qū)域與僅僅 注射磷脂微球?qū)φ战M心梗區(qū)域內(nèi)的微血管密度對(duì)比顯示，含螯合銅葡萄糖溶液的實(shí)驗(yàn)組的 心梗區(qū)域的微血管密度顯著高于對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備得到的在超聲作用下可以靶向釋放微量元素制劑，達(dá) 到了在局部組織釋放微量元素并產(chǎn)生與此微量元素相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，本發(fā)明的超聲靶向 藥物組合物療效確切，穩(wěn)定性好，安全，是一種新的藥物制劑，具有極好的臨床應(yīng)用和工業(yè) 化前景。參考文獻(xiàn)[1]Coombes A G,Breeze V,Lin W,et al. Lactic acid-stabilised albumin for microsphere formulation and biomedical coatings[J]. Biomaterials,2001,22(1) 1-8.[2] Almond B A, Hadba A R, Freeman S T，et al. Efficacy of mitoxantrone—loaded albumin microspheres for intratumoral chemotherapy of breast cancer[J]. J Control led Release,2003,91(1-2) :147-155.[3]Sahin S, Selek H, Ponchel G, et al. Preparation, characterization and in vivo distribution of terbutaline sulfate loaded albumin microspheres[J]. JControl led Release，2002，82 :345_358·[4]Chatterjee J, Haik Y, Chen C J. Modification and characterization of polystyrene-based magnetic microspheres and comparison with albumin-based magnetic microspheres[J]. Magnetism Magnetic Materials,2001,225(1) :21~29.[5]李元春，蔡美英，王仲瓊，等.單抗F(ab' ) 2段導(dǎo)向抗肝癌阿霉素免疫毫微球 的制備及其體外殺傷癌細(xì)胞作用[J].華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33(1) 8-11.[6]程耀，張燦，平其能，等.半乳糖?；瘹ぞ厶茄苌锇鼜?fù)的5-氟尿嘧啶白蛋白 微球的制備[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35 (6) 517-520.[7]Amedo A,Espuelas S,Irache J M. Albumin nanoparticles as carriers for a phosphodiester oligonucleotide[J]. Int J Pharm,2002,244(1-2) :59-67.[8]Arnedo A, Irache J M,Merodio M, et al. Albumin nanoparticles improved the stability， nuclear accumulation and anticytomegaloviral activity of aphosphodiester oligonucleotide[J]. J Control led Release，2004，94(1) :217~227.[9] Lin W, Garnett M C，Schacht E，et al. Preparation and in vitro characterization of HAS-mPEG nanoparticles[J]. Int J Pharm,1999,189(2) :161_170.[10]龔連生，張陽(yáng)德，劉恕.磁性阿霉素白蛋白納米粒在移植性肝癌模型中的磁 靶向性[J].中華肝膽外科雜志，2003，9 (9) 543-546.[11]劉曉波，蔡美英.抗人肝癌免疫毫微粒的制備及體外免疫學(xué)性質(zhì)的鑒定[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2000，16 =262-265.[12]張良珂，侯世祥，毛聲俊，等.受體介導(dǎo)米托葸醌白蛋白納米粒腫瘤細(xì)胞靶向 性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，37(1) -.77-79.[13]張陽(yáng)德，黃林，張蕾，等.半乳糖化磁性阿霉素白蛋白納米粒對(duì)大鼠移植性肝 癌模型bcl-2/bax蛋白表達(dá)的研究[J],中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21 (11) :1298_1299.[14]楊莉，侯連兵，王新亞，等.新型超聲造影劑全氟丙烷白蛋白微囊的制備[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，49 (21) 1637-1640.
權(quán)利要求
一種具有超聲靶向釋放微量元素作用的藥物組合物，其特征在于包含濃度大于1×106個(gè)/ml，粒徑小于10μm的空心微球，和至少一種小于或等于人體十倍生理劑量的微量元素，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料；其中微量元素與空心微球以結(jié)合或游離的形式存在，所述空心微球由藥學(xué)上可接受的成膜材料制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述空心微球粒徑為1 5μ m ；所 述空心微球內(nèi)含氣體是空氣、氮?dú)狻⒎驓?、氟代烷烴類氣體或其他無(wú)毒性氣體或上述一 種或一種以上氣體成分的任意組合的混合氣體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、 鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣或砷離子中的一種或一種以上的任意組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述微量元素為銅、鋅、硒、鐵中一 種或一種以上的任意組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述結(jié)合形式的微量元素與空心 微球通過(guò)化學(xué)作用或物理作用相互結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于結(jié)合形式的微量元素與空心微球 是由以下方法制備的1)按照摩爾濃度比為1 0.05到1 500將成膜材料與微量元素 離子溶于水或有機(jī)溶劑中，使微量元素離子通過(guò)物理或化學(xué)作用與膜材結(jié)合形成微量元素 復(fù)合膜材；2)用常規(guī)方法將步驟1)得到的復(fù)合膜材，制備成粒徑小于10 μ m的空心微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述游離形式的微量元素是指沒(méi) 有與空心微囊結(jié)合的、以微量元素離子與蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖或其他可結(jié)合微量元 素的化合物形成復(fù)合物存在于載體或輔料中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于所述微量元素與蛋白、多肽、氨基 酸、葡萄糖、其他可結(jié)合微量元素的化合物的摩爾濃度比為1 0.05到1 500。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述成膜材料為人血白蛋白、磷脂 或其他高分子聚合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的藥物組合物，其特征在于所述的載體或輔料為去離子 水或生理鹽水或葡萄糖溶液或含微量元素離子復(fù)合物的溶液，所述的微量元素離子復(fù)合物 為微量元素離子與蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖或其他可結(jié)合微量元素的化合物形成的復(fù)合 物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10任一一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于其為注射制劑，優(yōu) 選為針劑或粉針劑。
12.權(quán)利要求1 11任意一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備促進(jìn)血管或組織再生以及抗腫 瘤的超聲靶向釋放藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于所述藥物組合物經(jīng)靜脈注射入人體內(nèi)， 利用超聲波對(duì)治療部位進(jìn)行輻照，利用含氣空心微球與超聲波的相互作用達(dá)到局部釋放微 量元素離子的目的。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于所述超聲靶向釋放是指一定能量的超 聲波使微泡破裂或振蕩等空化效應(yīng)而促使及強(qiáng)化相關(guān)金屬離子在超聲輻照局部釋放和/ 或促進(jìn)混懸液中的相應(yīng)微量元素離子組分進(jìn)入輻照組織，達(dá)到促進(jìn)血管、組織再生和/或抗腫瘤的臨床目的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于所述超聲靶向釋放藥物誘導(dǎo)超聲波輻 照部位產(chǎn)生攜帶的微量元素離子相對(duì)應(yīng)的生理功效。
16.制備權(quán)利要求1所述的藥物組合物的方法，其特征在于首先制備結(jié)合微量元素離子的空心微球，制備方法包括1)按照摩爾濃度比為1 0.05到1 500將成膜材料與微量元素離子溶于水或有機(jī) 溶劑中，形成由一種或一種以上微量元素離子通過(guò)物理或化學(xué)作用結(jié)合形成微量元素復(fù)合 膜材；2)將步驟1)得到的復(fù)合膜材，制備成粒徑小于10μ m的空心微球；3)將制備完成的結(jié)合微量元素離子的空心微球與權(quán)利要求1、7、10所述的載體或輔料 及復(fù)合物相混合形成混懸藥物組合物；4)直接冷藏保存作為混懸藥物注射劑或冷凍干燥制備粉針劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述制備方法，其特征在于步驟2)中空心微球可利用以下任 一一種藥學(xué)常用微球制備方法制備超聲波聲振法、冷凍干燥法、噴霧干燥、活性/可控自 由基聚合、沉淀聚合法、懸浮聚合，乳液聚合，種子聚合，分散聚合以及沉淀聚合等異相聚合 體系、離子交聯(lián)法、乳化離子凝膠法、離子沉淀_化學(xué)交聯(lián)法、乳化_化學(xué)交聯(lián)法、復(fù)乳交聯(lián) 法、熱交聯(lián)法、凝聚法、乳化_溶劑蒸發(fā)法。
18.制備權(quán)利要求1所述的藥物組合物的方法，其特征在于首先制備未結(jié)合微量元素離子的空心微球，制備方法包括1)按權(quán)利要求17所述任一方法，制備成粒徑小于10μ m的空心微球；2)將步驟1)得到的空心微球與結(jié)合了一種或一種以上微量元素離子的蛋白或多肽或 者氨基酸或葡萄糖或其他可結(jié)合微量元素的化合物形成的復(fù)合物溶液混合形成混懸藥物 組合物；3)直接冷藏保存作為組合藥物注射劑或經(jīng)冷凍干燥制備粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有超聲靶向釋放微量元素作用的藥物組合物，其包含濃度大于1×106個(gè)/ml，粒徑小于10μm的空心微球，和至少一種小于或等于人體十倍生理劑量的微量元素，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料；其中微量元素與空心微球以結(jié)合或游離的形式存在，所述空心微球由藥學(xué)上可接受的成膜材料制備而成。本發(fā)明的藥物組合物穩(wěn)定、安全，能在超聲的輻照作用下，定向?qū)胛⒘吭仉x子進(jìn)入體內(nèi)，從而能有效使超聲輻照到的部位的組織血管再生、組織再生或抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)，臨床前景廣泛。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101926821SQ20101022328
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者周翔, 康裕建, 解慧琪 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院