復方型雙重雙聯定位式胞內疫苗的設計方案的制作方法

專利名稱：復方型雙重雙聯定位式胞內疫苗的設計方案的制作方法
復方型雙重雙聯定位式胞內疫苗的設計方案本發明涉及一類關于應用基因蛋白工程技術，來制造《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的設計方案的技術方法發明。它是本發明人在2002年所提出的抗癌癥與抗愛滋病的方法發明專利《雙聯雙重定位式胞內疫苗》，以及于2007年為了對于上述專利進一步的改進與擴展，而提出的方法發明專利《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》的基礎上，所發明的一種具有具體實施性的技術設計方案。本發明人最早于2002年向中國國家專利局提出《雙聯雙重定位式胞內疫苗》專利申請，申請號為02100099. 9，于2003年發布在第19卷第32期中國發明專利公報，又于2007年向中國國家專利局提出《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》專利申請，申請號為200710086430. X，發表在2008年9月10日第對卷 (上)第37號中國發明專利公報中。經計算機檢索，還未發現國內外有與本發明專利相類似的生物導彈設計方案的技術方法發明，具有首創性，因此，本方法發明專利理應受到專利法的保護。首先，需要說明的是，復方型疫苗與傳統的疫苗治療復方型作用的基本機理或是基本方法是不一樣的。傳統疫苗，是利用人工培養的特異性抗原，啟動人體免疫系統產生免疫抗體來殺死病毒，或患病細胞的，而復方型疫苗則是一類靶向型的融合蛋白的生化藥物，它可以將生化藥物定向地送入細胞內調動或調節患病細胞內的生理代謝反應來治療患病細胞的，例如，復方型疫苗能夠將可以啟動癌細胞基因凋亡程序的生化藥物，送入到癌細胞中，啟動癌細胞的自毀程序，將癌細胞殺死，或是將能夠抑止逆轉錄酶的生化藥物送入到人體免疫細胞T4細胞內，阻遏T內的愛滋病的遺傳物質——逆轉錄酶。由此可見，復合型疫苗并不是傳統意義上的疫苗。那么，為什么又叫疫苗呢？這是因為在2002年發明雙重雙聯疫苗時，沒有可參照名稱，同時，作用于細胞外的融合蛋白的生物導彈的作用與傳統疫苗很相像，因此稱為疫苗，其實應稱為智能藥物或生物導彈更合適。導彈是現代化戰爭武器，具有強大的定向殺傷力。那么，什么是“生物導彈”呢？ “生物導彈”像導彈一樣也是由載體和彈頭組成，是用于治療腫瘤的一種新式武器。利用“生物導彈”治療腫瘤稱之為“導向療法”或“生物導彈”療法。隨著細胞雜交瘤技術的進展，現已能制備抗腫瘤的特異性單克隆抗體。人們以能與腫瘤細胞結合的單克隆抗體作為“導向系統”即載體，以抗癌的物質，如化療藥物、同位素或細胞溶素(Lysin)作為“彈頭”，制備成 “生物導彈”。通過載體(單克隆抗體)將彈頭(化療藥物、同位素或細胞溶素)運送到機體的腫瘤部位。它只殺傷腫瘤細胞，而不殺傷機體的正常組織細胞，具有很大的優越性。動物實驗研究證明，“生物導彈”具有較好的抗癌效應。生物導彈“融合蛋白”，其中“定向蛋白”被稱為“制導裝置”，而與“定向蛋白”相融合的“抗體蛋白”或限制性內切酶，可稱為“殺傷裝置”或“彈頭”。這種定向類融合蛋白，可由兩個區段或三個區段的蛋白質或是多肽短片構成，其中A區段是由可與某一類特定人體細胞，例如肝細胞的表面受體，或是人類細胞的“廣譜受體”，例如血球凝集素(hemgg Iutinin)，高度專一互補的抗體或是質白質，來作為“制導裝置”，負責將殺傷裝置或是彈頭的蛋白藥物，或是其他品種的化學藥物例如，將具有阻遏細胞質內的病毒遺傳物質，比如， 可阻遏愛滋病毒的逆轉錄酶藥物，還有各種具有阻遏已整合到人體細胞DNA的病毒DNA的阻遏物蛋白質，以及可阻遏細胞染色體中的致癌基因的阻遏物蛋白質，送入到人體細胞內。 這就是《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈。但是，普通的生物導彈一般只由具有“制導裝置”功能的抗體與具有殺傷功能的藥物彈頭構成，它們的缺點是無法將進入細胞內，因此，醫療作用小，并且可對機體內的其他健康細胞構成威脅，毒性較大。而《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈由于比普通的生物導彈多使用了一種雙重“導入裝置”，能夠將藥物彈頭直接送入到細胞質與細胞核內，因此克服了普通的生物導彈的不足之處，可以精確地作用于患病細胞質內的病毒遺傳物質或細胞核內DNA的靶點之上，因此，醫療作用大，并且不會對機體內的其他健康細胞構成威脅，毒性小。這是“雙重導入式”生物導彈。與此同時，《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈，還可以分別制造出只安裝一重“導入裝置”，僅可進入細胞質內的生物導彈，或者制造出安裝雙重“導入裝置”，可以進入細胞核內的生物導彈。它們屬于“雙聯式”生物導彈。這就是《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第一個特色，也是它的主要特色或本質特點。這也就是本專利稱為《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的根本原因，是本專利的創造性的發明的兩大特征(雙重與雙聯)。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈之所以具有雙重“導入裝置”的功能， 是與近年來對于TAT蛋白的研究進展密切相關的。人類免疫缺陷病毒1型(HIVl)基因能夠編碼一種被稱為反式轉錄激活因子(transactivator of transcription, TAT)的蛋白。它通過與反式激活應答 (transactivating response, TAR) RNA序列結合以起始基因轉錄。TAT蛋白和REV蛋白一起作為HIVl的調控因子，在HIV的基因表達中起著舉足輕重的作用。研究發現，TAT蛋白能夠穿過細胞膜[1，2]，到達細胞外，具有細胞膜穿透肽(cellmembrane penetrating peptide, CPP)活性，其穿膜序列由11個氨基酸組成。這一特性具有非常重要的應用價值，因為它提供了一條轉運其他蛋白或藥物穿過細胞膜，進入細胞的途徑。通過設計編碼穿膜序列和其他蛋白的融合基因，表達后獲得的融合蛋白，在TAT的引領下可以進入細胞。Vive等[3]發現，TAT蛋白中具有穿膜功能的序列是位于47 57的11個氨基酸(YGRKKRRQRRR)，富含堿性氨基酸(8個)，被稱為蛋白轉導域(protein transduction domain, PTD)。TAT蛋白具有穿膜功能，其PTD能夠與其他大分子物質，如蛋白等一起穿膜進入細胞。利用這一性質可以將體內不能正常合成的蛋白酶通過這一途徑轉導進入細胞， 使之發揮生物學作用。Delom等[14]首次發現TAT蛋白能夠轉導外源蛋白進入秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的腸上皮細胞。這說明PTD的跨膜功能不具有物種特異性。 近幾年來，TAT蛋白的PTD受到越來越廣泛的重視，許多科學家都在利用其穿膜功能從事相關研究。“HIV TAT蛋白研究進展”《江蘇大學學報(醫學版)))2008年第18卷第03期宗揚勇邵啟祥。此外已有研究證實，TAT除了向細胞內轉運蛋白外，還可攜帶核苷酸、脂質體、甚至金屬微粒進入幾乎所有的組織和細胞，而且具有速度快，不依賴于溫度、能量、細胞膜抗體，而且對細胞沒有損傷等特點，TAT被認為是一種很有前途的運載工具。“TAT □ EGFP融合蛋白的表汰及在PC12細胞的轉導活件”《第四軍醫大學學報》2007年第觀卷第10期作者王海珍許予明李增富楊靜張云漢。以上，就是可以將蛋白或多肽藥物，或是其他化學藥物導入細胞質的生物導彈的第一重“導入裝置” TAT蛋白或是PTD多肽。由于分子量高于15kd的大分子無法進入細胞核，這就需要第二重“導入裝置”-“核定位順序”(NLS).這是因為，真核細胞的核是由核被膜包圍著的，核被膜則由兩層膜——內核膜和外核膜——組成，期間為核周空間所隔開。外核膜與粗內質網是連續的，而核周空間則與 ER的空腔是連續的。細胞核中的所有蛋白質都是在細胞液中由游離的核糖體合成的。DNA 聚合酶類、RNA聚合酶類、組蛋白類和核中的其它蛋白質是怎樣越過核被膜的呢？這種有選擇性的障礙上有開口，稱為核孔，其直徑約70A。小的蛋白質( Mkd)如組蛋白可迅速進入，而大的蛋白質(> 90kd)則被排斥在外，除非它們有特殊的信號。這種信號也能加速小蛋白質進入。原來這種大蛋白質之轉運入細胞核決定于一種核定位順序的存在，此順序含有五個連續的帶正電荷的殘基——脯——賴——賴——精——賴——纈。將這種多肽順序連結到一種通常定位于細胞液中的蛋白質上，能使它進入細胞核嗎？曾以丙酮酸激酶作過試驗，這是由58kd的亞基組成的四聚體，通常定位于細胞漿中。通過重組DNA技術，將編碼到位順序的cDNA與編碼激酶的cDNA接在一起。然后用顯微注射法將含有此嵌合cDNA 的質粒注入哺乳動物的細胞中。含有這種sv40核定位順序的丙酮酸激酶幾乎僅僅存在于細胞核中。與此相反，帶有被改變的核定位順序(在位置1 上蘇氨酸取代了賴氨酸)的丙酮酸激酶則停留在細胞液中。這就證明了核定位順序的存在(《生物化學》[美]LVBER STRYER北京大學出版社1992年P871頁).需要指出，對于某些特定的細胞，還有一些特定的“導入裝置”，例如，愛滋病毒，就是依靠gp41蛋白(跨膜蛋白)，配合gpl20蛋白，把病毒的遺傳物質導入到人體免疫T細胞的細胞質中的，因此，相關的抗愛滋病生物導彈也可以應用gp41蛋白而不是TAT蛋白來作為一重“導入裝置”，但是，這屬于特別情況。以上是對《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第一個特色的說明。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第二個特色就是應用了“雞尾酒療法”來使用生物導彈，而且是雙聯并用。在這里，特別需要指出的是由于端粒酶也與愛滋病的逆轉錄酶一樣，也是一種逆轉錄酶，因此，完全可以應用逆轉錄酶抑制劑，來作為抗癌藥物，例如，應用端粒酶抑制劑疊氮胸苷(Azidothymidine，AZT)。同時，端粒酶抑制劑與癌癥標準治療藥物carboplatin (卡鉬)和cisplatin(順鉬)結合使用時，還有額外的抗增殖效果。這樣，就可以畢其功于一役，將抗愛滋病與抗癌藥物合而為一，從而大大減少了開發研制這兩中藥物的資金和時間。因此，可以同時聯合使用應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈與應用了癌癥標準治療藥物carboplatin(卡鉬)和cisplatin(順鉬)的生物導彈來共同治療癌癥，其中，應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈只使用一重“導入裝置”TAT或是PTD ；而應用了癌癥標準治療藥物carboplatin (卡鉬)和cisplatin (順鉬)的生物導彈，則同時使用 TAT或是NLS來作為兩重“導入裝置”。
這就是一種雙聯式生物導彈，其中，應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈 (一重“導入裝置”)只負責將彈頭送入細胞質內，作用于細胞質內的愛滋病毒的遺傳物質， 而應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈(兩重“導入裝置”)則負責將彈頭送入細胞核內，作用于DNA的靶點。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第三個特色，就是應用“黏合蛋白” 與“生物交聯劑”相互配合，來作為生物導彈的“聯合裝置”，以便把生物導彈的彈頭與制導裝置黏合在一起。在一般情況下，是使用“生物交聯劑”這種化學方法來把生物導彈的彈頭與制導裝置黏合在一起，但是，由于《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈有一重或兩重“制導裝置”，單純使用生物“交聯劑”這種化學方法，可能會使生物導彈的彈頭錯誤地聯結在生物導彈的“制導裝置”上，因此，有必要使用“黏合蛋白”來作為“聯合裝置”。“黏合蛋白”是本專利人在《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》中所提出的概念。所謂的“黏合蛋白”，就是應用一種被稱為“黏合蛋白”的蛋白質或是多肽(一般為抗體蛋白)， 一對一地首先與某一種“制導裝置”蛋白，共同結合成為“黏合型融合蛋白”，然后，再使這種 “黏合型融合蛋白”，來與核苷酸或是其它化學合成藥物，同樣也是一對一地自然粘合在一起，從而得到一種新型的“黏合型”生物導彈。在這里，首先需要先篩選出一種具有能黏合某一種核苷酸或是其它化學合成藥物的抗體蛋白。不過，這種“黏合型”生物導彈有兩種方式一種是“純黏合型”生物導彈，它的特點是先將可與生物導彈黏合的抗體與“制導裝置”蛋白，例如某種抗體與TAT聯合制成“抗體-TAT-抗體型”融合蛋白。然后，再將這種“抗體-TAT-抗體型”融合蛋白直接與生物導彈黏合在一起；另一種則是“間接黏合型”生物導彈。它是先應用“交聯劑”把生物導彈的彈頭與TAT聯結在一起。與此同時，又將某種“制導裝置”蛋白，例如某種激素一一LHRH， 即黃體生成素釋放激素與某種也能夠與TAT黏合的抗體聯合制作成“激素——抗體型”融合蛋白，然后，再將這種“激素——抗體型”融合蛋白直接與生物導彈彈頭中的TAT黏合在一起即可。當然，如果生物導彈彈頭是某種蛋白類藥物，例如P53蛋白，那么，就不需要使用 “黏合蛋白”，而直接將生物導彈的“制導裝置”抗體與TAT和P53蛋白聯合制成“抗體—— TAT——P53蛋白型”融合蛋白就可以了。生物交聯劑是一類小分子化合物，分子量一般在200-600之間，具有2個或者更多的針對特殊基團(氨基、巰基等)的反應性末端，可以和2個或者更多的分子分別偶聯從而使這些分子結合在一起。在生命科學研究中，巧妙地運用交聯劑可以使很多工作取得突破。生物交聯劑已經被廣泛地應用于細胞膜結構研究，蛋白質結構研究，蛋白質間相互作用研究，生物導彈研究，載體蛋白與半抗原的連接，蛋白質或其他分子的固相化，抗體的標記，標記轉移，蛋白質與核酸的連接。黏合蛋白的制作，使用的是抗體庫技術。抗體庫技術的主導思想是將某種動物的所有抗體可變區基因克隆在質粒或噬菌體中表達，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應的特異性抗體。從抗體庫中篩選多種重要的抗體，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗體。這些顯示出抗體庫技術的應用潛力。抗體庫技術不僅可以模擬動物免疫系統產生抗體的過程，還具有許多獨特的優點，令雜交瘤技術難以相比。抗體庫技術無需免疫，從理論上講，IO6 IO8的庫容就可能包容所有的抗體。利用抗原即可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，并能篩選到針對該物種自身抗原的抗體。從人的抗體庫中可以得到完全是人源的McAb，克服了難以用雜交瘤技術獲得人源McAb的障礙。此外，由于細菌細胞增殖快，培養成本低廉，利于大量制備高純度抗體，進行蛋白晶體結構研究和應用。因此，抗體庫技術將對生物學和醫學的發展起著重要的推動作用。抗體庫技術包括下述主要過程克隆出抗體全套可變區基因，與有關載體連接，導入受體菌系統，利用受體菌蛋白合成分泌等條件，將這些基因表達在細菌、噬菌體等表面， 進行篩選與擴增，建立抗體庫。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第四個特色，就是應用“原癌基因抗體”(proto-oncogene lg)，來作為生物導彈的“殺傷裝置”或“彈頭”。在腫瘤治療中的應用利用噬菌體抗體庫技術生產的scfv或Fab因分子量小，組織穿透性好，在腫瘤部位濃聚，的優勢，可以篩選出能夠組遏原癌基因的抗體，來作為生物導彈的彈頭。而全人源的scfv或Fab更是完全避免了人體產生人抗鼠免疫反應。但是，目前噬菌體抗體庫技術也存在一些問題如噬菌體抗體庫的篩選效率較低，一些高特異性的噬菌體在篩選過程中容易丟失；噬菌體抗體特別是scfv只含有十多個氨基酸，使一些放射性物質(如’ 9mTc)的標記困難，標記效率低；由于噬菌體抗體分子量小，在體內分解過快使其在腫瘤的放射免疫治療方面的應用受到了限制；一些噬菌體抗體的細胞內攝作用可能抑制腫瘤藥物的殺腫瘤細胞作用。抗體庫篩選技術主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術。噬菌體抗體庫技術 從免疫或未被免疫的B細胞中分離抗體可變區基因；PCR擴增抗體全套基因片段(如VH、 VL)，將體外擴增的VH、VL基因片段隨機克隆入相應載體，形成組合文庫；將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因III (g3)或基因VDI (g8)的先導系列的緊靠下游，使外源基因表達的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp III或-gp VDI的N端。用固相化抗原經“親和結合-洗脫-擴增”數個循環直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。核糖體展示技術將基因型和表型聯系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進行轉錄與翻譯，由于對DNA進行了特殊的加工與修飾，如，去掉3 ‘末端終止密碼子，核糖體翻譯到 mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA的3'末端不脫離，從而形成蛋白質-核糖-2mRNA三聚體，將目標蛋白特異性的配基固相化，如固定在ELISA微孔或磁珠表面，含有目標蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA板孔中或磁珠上被篩選出，對篩選分離得到的復合物進行分解，釋放出的mRNA進行逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR)，PCR產物進入下一輪循環，經過多次循環，最終可使目標蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。利用抗體庫篩選技術，可以篩選出能夠組遏原癌基因的抗體。所篩選的原癌基因抗體，可包括常見的原癌基因家族抗體，例如，src家族抗體，ras家族抗體，myc家族抗體，等等。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第五個特色，就是應用了“聚乙二醇修飾蛋白質藥物質和多肽藥物”包裝技術，以解決《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈在用藥時存在著問題，例如，因為蛋白質和多肽藥物的分子量不高，容易被腎小球過濾；血液內存在著很多蛋白酶，使蛋白質藥物分解而失去藥效。這些問題會造成藥物的半衰期短。另外，對于外源性蛋白質藥物，人體內會產生抗體，與蛋白質結合使其失去藥效，并引起副作用。由于蛋白質和多肽藥物的半衰期短，藥物剛進入體內時，濃度一度會過高，產生較強的副作用。但隨后藥物濃度又會立即下降到有效藥用濃度以下，而起不到治療作用，因此，必須頻繁給藥，例如rhG-CSF需要每天注射1次，為此，需要對其進行包裝，以避免發生這種情況，例如，可以利用聚乙二醇對蛋白質和多肽藥物進行修飾，制備長效蛋白質和多肽藥物的靜脈注射制劑。用聚乙二醇修飾蛋白質藥物具有很多優點(a)增大蛋白質藥物的分子量，減少被腎小球過濾的頻率，提高藥物在體內的半衰期；(b)保護蛋白質免受蛋白酶的降解；(c)屏蔽外源性蛋白質的免疫原性，減少副作用；(d)蛋白質被修飾后仍能保持一定的活性。聚乙二醇是經環氧乙烷聚合而成的，由重復的氧乙烯基組成。不僅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N、 二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有機溶劑，具有線性(相對分子量5000 30000)或支化(相對分子量力40000 60000)的鏈狀結構，線性PEG分子式為H-(0-CH2-CH2) n-OH。普通的聚乙二醇兩端各有一個羥基，若一端以甲基封閉則得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，線性mPEG的分子式為CH3-(0-CH2_CH2)n-0H，在多肽和蛋白質的聚乙二醇化修飾研究中應用最多的是mPEG的衍生物。藥物的聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯到蛋白、 多肽、小分子有機藥物和脂質體上。其中研究得最多的是蛋白質的PEG修飾，始于是20世紀70年代。藥物經PEG修飾后，往往會具有以下優點1、更長的半衰期2、較低的最大血藥濃度3、血藥濃度波動較小4、較少的酶降解作用5、較少的免疫原性及抗原性6、較小的毒性 7、更好的溶解性8、用藥頻率減少9、提高病人的依從性，提高生活質量，降低治療費用9、脂質體對腫瘤有更強的被動靶向作用。修飾途徑對蛋白和多肽主要有氨基修飾(包括N端氨基的酰化修飾、賴氨酸側鏈氨基的酰化修飾、N端氨基的烷基化修飾)、羧基修飾、巰基修飾，還有其它如控制pH實現SC-mPEG選擇性修飾蛋白質中的組氨酸側鏈的咪唑基團和用谷氨酰胺轉氨酶將mPEG-NH2轉移到蛋白質的谷氨酰胺側鏈上，實現對谷氨酰胺的選擇性修飾，其中主要是對N末端或賴氨酸側鏈氨基進行酰化修飾，因為蛋白或許多多肽結構中存在多個氨基，所以控制和確定修飾位點及修飾程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修飾中的難點，肽類化合物的合成中可以通過采用適當的保護策略來實現對氨基的定點修飾，而有機小分子藥物的PEG修飾途徑主要是將PEG與這些小分子藥物上的-0H，-NH2, -COOH相偶聯，如待修飾的小分子藥物不具備這些功能基團，可通過化學方法引入。“藥物的聚乙二醇修飾及研究和應用進展”。國人選康。Beijng Guoren Yechology Co.，LTD。如果在肽類化合物的合成中，可以通過采用適當的保護策略能夠控制和確定修飾位點及修飾程度，實現對氨基的定點修飾，那么，就可以不必再采用“蛋白黏合劑”了。《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的第六個特色，就是《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的設計方法中，或是制備方法中，在工程技術方面，完全采用已經成熟與完備的蛋白基因工程技術和抗體技術，在抗癌癥及抗愛滋病藥物方面，完全采用現有的，已經大量應用于臨床的抗癌癥與抗愛滋病的藥物，來制造《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的彈頭。這也是制造《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈所奉行的兩個基本原則。有了這兩個基本原則，就保證了《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》 生物導彈具有操作的可行性與使用的安全性。
首先，所謂基因工程(genetic engineering)是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質—— DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工^塵進行切割后，把它與作為載述的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中 “安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新的蛋白質的一種嶄新技術。蛋白質融合將編碼一種蛋白質的部分基因移植到另一種蛋白質基因上或將不同蛋白質基因的片段組合在一起，經基因克隆和表達，產生出新的融合蛋白質。這種方法可以將不同蛋白質的特性集中在一種蛋白質上，顯著地改變蛋白質的特性。融合蛋白的特點是表達不同蛋白的功能活性域，各組分的協同作用使融合蛋白性能被優化，甚至產生新的生物學活性.融合蛋白技術正在從基礎研究走向臨床應用，已經逐步成熟、完善并有所創新.新型多結構域的人工蛋白在諸多臨床領域有潛在應用價值.本文對融合蛋白技術的主要內容、發展情況以及在DNA疫苗、多功能酶、定向藥物、溶栓劑、抗菌肽、缺血-再灌注損傷的治療方面的應用作用。.融合蛋白技術也包括研究的較現在多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”技術。抗體技術包括鼠抗體人源化的構建方法與全人源化抗體技術。鼠抗體的人源化改造主要方法包括嵌合抗體、表面重塑抗體、重構抗體。嵌合抗體利用DNA重組技術將鼠單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達出人鼠嵌合抗體，其人源化程度達到70%左右， 完整地保留了異源單抗的可變區，最大限度地保持了其親和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗體仍然保留了 30 %的鼠源性，可誘發人抗小鼠反應HAMA。表面重塑抗體對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外，所替換的區段不應過多，對于影響側鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(CDR)構象的殘基盡量不替換。重構抗體由異源抗體中與抗原結合相關的殘基與人抗體重新拼接構建的，包括 ⑶R區移植，部分⑶R移植和特定決定區(SDR)轉移。全人源化抗體技術。完全人抗體的形成始于二十世紀九十年代，目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫篩選技術、基因工程小鼠制備全人抗體、轉染色體牛。它包括抗體庫篩選技術，噬菌體抗體庫技術，以及核糖體展示技術。其次，《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的彈頭，都使用常規的臨床藥物，以保證安全性，或是已被證明有效的抗癌藥物，例如本文第5頁所提出的卡鉬、順鉬，還有在后面第16頁所提出的可使人體癌細胞凋亡的P53蛋白，以及，具有抗愛滋病功能的《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的彈頭，使用的就是“雞尾酒療法”的藥物AZT和 IDV。下面是對生物導彈所使用常規的生化制品的相關參數的說明。AZT 的參數中文名稱齊多夫定[分子式]CltlH1J5O4 = 267. 242
[結構式]
權利要求
1.一應種用基因蛋白工程和抗體蛋白工程的常規技術，按照由專利發明人所自主開發的《復方型雙重雙聯定位式胞內疫苗》的基本方法，所發明的最新型的抗癌癥抗愛滋病生物導彈的設計方案。其特征為它相對于普通的生物導彈多采用了一種雙重“導入裝置”，是一種聯合使用導入蛋白TAT與核定位順序NLS的“雙重導入式”生物導彈的技術，能夠將抗癌癥與抗愛滋病藥物彈頭直接送入到細胞質與細胞核內，因此克服了普通的生物導彈的不足之處，可以精確地作用于患病細胞質內的病毒遺傳物質或細胞核內DNA的靶點之上，因此， 醫療作用大，毒性小，不會對機體內的其他健康細胞構成威脅，為此，在其中應用了一種聯合使用生物交聯劑與黏合蛋白新技術，以及同時應用了 “聚乙二醇修飾蛋白質藥物質和多肽藥物”包裝技術。與此同時，本專利在《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的設計方法中，或是制備方法中，在工程技術方面，完全采用已經成熟與完備的蛋白基因工程技術和抗體技術；在抗癌癥及抗癌癥及抗愛滋病藥物方面，完全采用現有的，已經大量應用于臨床的抗癌癥與抗愛滋病的藥物，來制造《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈，這兩個基本原則。有了這兩個基本原則，就保證了《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈具有操作的可行性與使用的安全性。在上述基礎上，本專利提出了《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的一般分子結構通式，以及抗癌癥與抗愛滋病生物導彈的具體的分子結構式。
2.根據權利1所述，本專利創造性地設計了一種雙重“導入裝置”，能夠將藥物彈頭直接送入到細胞質與細胞核內，因此克服了普通的生物導彈的不足之處，可以精確地作用于患病細胞質內的病毒遺傳物質或細胞核內DNA的靶點之上，因此，醫療作用大，并且不會對機體內的其他健康細胞構成威脅，毒性小，其特征為第一重“導入裝置”的TAT蛋白或是 PTD多肽。由于分子量高于15kd的大分子無法進入細胞核，這就需要第二重“導入裝置《‘核定位順序”(NLQ。這就是“雙重導入式”生物導彈。與此同時，《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈，還可以分別制造出只安裝一重“導入裝置”，僅可進入細胞質內的生物導彈，或者制造出安裝雙重“導入裝置”，可以進入細胞核內的生物導彈，是一種“雙聯式”生物導彈。
3.根據權利1所述，本專利創造性地應用了“雞尾酒療法”來使用生物導彈，而且是雙聯并用，其特征為應用端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈與應用了癌癥標準治療藥物 carboplatin(卡鉬)和cisplatin(順鉬)的生物導彈來共同治療癌癥，其中，應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈只使用一重“導入裝置” TAT或是PTD;而應用了癌癥標準治療藥物carboplatin (卡鉬)和cisplatin (順鉬)的生物導彈則，同時使用TAT或是NLS 來作為兩重“導入裝置”，與此同時，它還是一種雙聯式生物導彈，其中，應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈(一重“導入裝置”)只負責將彈頭送入細胞質內，作用于細胞質內的愛滋病毒的遺傳物質，而應用了端粒酶抑制劑作為彈頭的生物導彈(兩重“導入裝置”) 則負責將彈頭送入細胞核內，作用于DN中中A的靶點。
4.根據權利1所述，本專利創造性地應用“黏合蛋白”與“生物交聯劑”相互配合，來作為生物導彈的“聯合裝置”，以便把生物導彈的彈頭與制導裝置黏合在一起，其特征為在一般情況下，是使用“生物交聯劑”這種化學方法來把生物導彈的彈頭與制導裝置黏合在一起，但是，由于《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈有一重或兩重“制導裝置”，單純使用生物“交聯劑”這種化學方法可能會使生物導彈的彈頭錯誤地聯結在生物導彈的“制導裝置”上，因此，有必要使用“黏合蛋白”來作為“聯合裝置”。生物交聯劑是一類小分子化合物，分子量一般在200-600之間，具有2個或者更多的針對特殊基團(氨基、巰基等)的反應性末端，可以和2個或者更多的分子分別偶聯從而使這些分子結合在一起，生物交聯劑已經被廣泛地應用于細胞膜結構研究，蛋白質結構研究，蛋白質間相互作用研究，生物導彈研究，載體蛋白與半抗原的連接。
5.根據權利1所述，本專利創造性地應用“原癌基因抗體”(proto-oncogenelg)，來作為生物導彈的“殺傷裝置”或“彈頭”，其特征為利用抗體庫技術抗體庫篩選技術，篩選出能夠組遏原癌基因的抗體，來作為生物導彈的彈頭。例如，可以篩選出常見的原癌基因抗體 src家族抗體，ras家族抗體，myc家族抗體，等等。
6.根據權利1所述，本專利創造性地了應用了生物導彈保護性包裝技術，其特征為 采用了 “聚乙二醇修飾蛋白質藥物質和多肽藥物”包裝技術，以解決《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈在用藥時存在著問題，例如，因為蛋白質和多肽藥物的分子量不高， 容易被腎小球過濾；血液內存在著很多蛋白酶，使蛋白質藥物分解而失去藥效。這些問題會造成藥物的半衰期短。另外，對于外源性蛋白質藥物，人體內會產生抗體，與蛋白質結合使其失去藥效，并引起副作用。藥物的聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯到蛋白、多肽、小分子有機藥物和脂質體上。修飾途徑對蛋白和多肽主要有氨基修飾(包括N端氨基的酰化修飾、賴氨酸側鏈氨基的酰化修飾、N端氨基的烷基化修飾)、羧基修飾、巰基修飾，還有其它如控制PH實現SC-mPEG選擇性修飾蛋白質中的組氨酸側鏈的咪唑基團和用谷氨酰胺轉氨酶將mPEG-NH2轉移到蛋白質的谷氨酰胺側鏈上，實現對谷氨酰胺的選擇性修飾，其中主要是對N末端或賴氨酸側鏈氨基進行酰化修飾，因為蛋白或許多多肽結構中存在多個氨基，所以控制和確定修飾位點及修飾程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修飾中的難點，肽類化合物的合成中可以通過采用適當的保護策略來實現對氨基的定點修飾，而有機小分子藥物的PEG修飾途徑主要是將PEG與這些小分子藥物上的-0H，-NH2, -COOH相偶聯，如待修飾的小分子藥物不具備這些功能基團，可通過化學方法引入。
7.根據權利1所述，本專利創造性地提出了為使《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的設計方法具有可行性，所應該遵循的藥物安全與技術可靠這兩個基本原則，其特征為在制備方法中，在工程技術方面，完全采用已經成熟與完備的蛋白基因工程技術和抗體技術；在抗癌癥及抗愛滋病藥物方面，完全采用現有的，已經大量應用于臨床的抗癌癥與抗愛滋病的藥物，來制造《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的彈頭。這也是制造 《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈所奉行的兩個基本原則。有了這兩個基本原則，就保證了《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈具有操作的可行性與使用的安全性。
8.根據權利1所述，本專利創造性地設計了《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的分子結構的通式，以作為設計方案的模式，其特征為設以每種分子的漢字名稱的漢語拼音的首個大寫字母，來代表這個分子，例如“制導裝置(ZH_ZH)”，“黏合蛋白(N_D)”， “殺傷裝置或彈頭(SH_ZH)，以及用“ X ”來代表使用交聯劑，用《》表示以融合蛋白方式聯結。(一)抗愛滋病《復方型雙聯雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈分子結構通式《ZH_ZH+TAT+N_D》+SH_ZH通式單位分子。通式表示先由制導裝置和TAT，以及能夠與殺傷裝置(彈頭)黏合的蛋白抗體構成融合蛋白，然后，再自動與彈頭相黏合。(二)抗癌癥《復方型雙聯雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈分子結構通式(1)蛋白類抗癌癥《復方型雙聯雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈分子通式(a)《ZH_ZH+TAT+SH_ZH》(b)《ZH_ZH+TAT+N_D》+SH_ZHX NLS(2)生化類抗癌癥《復方型雙聯雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈分子通式《ZH_ZH+TAT+N_D》+SH_ZH通式單位分子。第(1)式的(a)的分子結構式，表示蛋白類抗癌癥生物導彈可以直接由制導裝置和 TAT，以及作為彈頭的蛋白類藥物，例如，P53蛋白構成融合蛋白.第(1)式的(b)的分子結構式，表示b型生物導彈表示先由制導裝置與TAT，以及能夠與殺傷裝置(彈頭)黏合的蛋白抗體構成融合蛋白，然后，再與已經使用生物交聯劑聯結在一起的NLS與蛋白類藥物彈頭的組合分子相黏合。這是因為，b型生物導彈所使用的蛋白類彈頭不包含核定位順序。第(2)式生化類生物導彈表示先由制導裝置和TAT，以及能夠與殺傷裝置(彈頭)黏合的蛋白抗體構成融合蛋白，然后，再自動與作為生化藥物的彈頭相黏合。
9.根據權利1所述，本專利創造性地設計根據《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的分子結構的通式，給出了抗愛滋病生物導彈具體的設計方案，其特征為(一)抗愛滋病生物導彈的裝置(1)抗愛滋病生物導彈的制導裝置gpl20蛋白.(2)抗愛滋病生物導彈的殺傷裝置抗愛滋病”雞尾酒”療法的藥物，AZT，IDV等等。(3)抗愛滋病生物導彈的導入裝置導入蛋白TAT.(4)抗愛滋病生物導彈的特異粘合抗體蛋白(BondingIg)N_D(二)抗愛滋病生物導彈的設計方案一融合蛋白區一I 分子/單位
10.根據權利1所述，本專利創造性地設計根據《復方型雙聯雙重定位式胞內疫苗》生物導彈的分子結構的通式，給出了抗癌生物導彈具體的設計方案，其特征為(一)抗癌生物導彈的裝置(1)抗癌生物導彈制導裝置(a)蛋白抗體類能夠與胚胎性抗原——甲胎蛋白(AFP)的受體相結合的抗體 (AFP-Ig)，抗CD20抗體，抗CD33抗體，等等·(b)激素類促黃體激素釋放激素(LHRH)(c)生長因子類人源化IgG2單克隆抗體ABX-EGF(2)抗癌生物導彈殺傷裝置的幾種類型(a)蛋白與多肽類P53蛋白，105蛋白，原癌基因抗體(proto-oncogenelg)，等等。(b)抗逆轉錄酶藥物類，目的是抗端粒酶逆轉抗愛滋病”雞尾酒”療法的藥物，AZT，IDV 以及抗癌癥藥物卡鉬carboplatin和順鉬cisplatin，等等.(3)抗癌生物導彈的導入裝置(a)細胞質傳導裝置導入蛋白TAT。(b)細胞核傳導裝置核定位順序NLS。(4)抗癌生物導彈的藥物載體裝置納米載體，樹狀聚合物0T-PEG-PAMAM).等等。(二)抗癌生物導彈的融合蛋白的設計方案(1)蛋白類或多肽類抗癌生物導彈的融合蛋白的設計方案|←融合蛋白區→| 分子/單位
全文摘要
一種應用基因蛋白工程和抗體蛋白工程的常規技術，所發明的《復方型雙重雙聯定位式胞內疫苗》抗癌癥抗愛滋病生物導彈的設計方案，其特征為它相對于普通的生物導彈，多采用了一種聯合使用導入蛋白TAT與核定位順序NLS的“雙重導入式”生物導彈技術，能夠將抗癌癥與抗愛滋病藥物彈頭直接送入到細胞質與細胞核內，又給出了這種生物導彈分子結構的通式，并在此通式基礎上建立了具體的抗癌癥與愛滋病生物導彈分子結構式。
文檔編號A61P31/18GK102309755SQ201010221580
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者白濤 申請人:白濤