專利名稱：一種治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，具體涉及包括在細胞內阻斷病毒mRNA翻譯、抑制病毒核酸合成的第一作用劑和通過調節機體免疫應答以獲得細胞免疫的第二作用劑組成的藥用組合物，屬于生物制藥領域。
背景技術：
手足口病(Hand-food-mouth disease，HFMD)是全球性傳染病，全世界大部分地區均有該病流行的文獻報道。1957年，新西蘭首次報道該病，從該病中分離出柯薩奇 (coxsackie，Cox)病毒。發現的HFMD病原體主要為Cox A 16型，1972年美國確認HFMD病原體為腸道病毒(enteric virus, EV) 71。此后，EV71感染與CoxA16感染交替出現，成為 HFMD的主要病原體。對HFMD的流行病學研究顯示，球流行間隔期為2_3年，20世紀90年代后期，EV71開始在東亞地區流行，其中，1997年在馬來西亞和1998年在臺灣爆發的HFMD， 合并中樞神經系統癥狀發生率較高。HFMD傳染性強、傳播途徑復雜、流行強度大、傳播快，短時間內可大面積流行，HFMD傳染源為病毒，大量病毒存在于患者和健康者咽部、糞便和皰液中，通過飛沫、唾液、糞便、污染的水和食物，經呼吸道和消化道傳染。HFMD急性期，病毒在咽部可持續存活1-2周，糞便中持續存活3-5周，最長可達11周，通常以發病后1周內傳染性最強。各年齡組雖均可感染HFMD，但常在嬰幼兒中造成爆發性流行，多發生于5歲以下小兒，且3歲以下嬰兒發病率最高。EV71感染的HFMD臨床癥狀，往往終于CoxA16感染，但EV71感染的臨床表現變化大，輕者可無明顯全身癥狀(約71%)，嚴重者可致死亡(約0.05% )，其中，HFMD合并肺水腫時，死亡率最高，臨床預后與EV71病毒毒力、病毒載量及計提免疫功能相關，目前認為，HFMD與病毒的基因型無關。EV71感染造成計提損害，是細胞免疫反應而非體液免疫反應，研究顯示，合并肺水腫的HFMD患兒中，反映細胞免疫反應的細胞因子輔助T淋巴細胞 (helper T lymph0Cyte，TH) ( γ-干擾素、白細胞介素1、白細胞介素6和腫瘤壞死因子)等， 明顯低于無肺水腫的 HFMD 患兒(Chang LY,Hsiung CA,Lu CY，et al. Status of cellular rather than humoral immunity is correlated with clinical outcome of enterovirus 71. Pediat r Res, 2006,60 (4) :466-471)。細胞免疫功能低下，可延遲病毒清除，導致病毒擴散，造成持續驗證反應，最后導致肺水腫，機體免疫功能也發揮重要作用，在細胞免疫發育尚不成熟的HFMD患兒中，若自身細胞免疫弱于體液免疫，感染EV71后有進展為重癥HFMD 的傾向。T淋巴細胞亞群是構成機體免疫防疫系統的重要細胞，T淋巴細胞中包括輔助性T 淋巴細胞CD4+和抑制性T細胞⑶8+2個主要亞群，這2類細胞相互變化、調節，可以維持機體內的免疫平衡。CD4+具有調節免疫反應活性、輔助B細胞產生抗體、分泌細胞因子的作用； 而CD8+有免疫抑制和細胞毒性的作用。CD4+、CD8+分別成為MHCII類分子和I類分子的受體，CD4+、CD8+分別出現在具有不同功能亞群的T細胞表面。在同一個T細胞表面只表達其中過一種，⑶4+與⑶8+合適的比例是維持機體將抗的重要因素，而且⑶4+與⑶8+比值是一重要的評估機體免疫狀態的依據。⑶4VtD8+比值減少是imianyi缺陷的重要指標。HFMD對絕大多數輕癥患兒為自限性疾病，目前，HFMD的治療主要以對癥支持為主，病毒DNA聚合酶抑制劑更昔洛韋、阿昔洛韋、利巴韋林也常用于HFMD患者的治療，也取得了一定的療效，但容易產生耐藥性，使其臨床受到限制。根據患兒血壓、循環變化，也可選用米力農增強心肌收縮力，降低后負荷，從而降低HFMD死亡率。此外，靜脈注射丙種球蛋白(IG)能有效地一直炎癥的發生，對EV71引起的中樞神經系統感染有一定的療效。近期國外報道一種新藥Pleconaril (普來可那利)，其口服吸收好，對校RNA病毒科的病毒，特別是腸道病毒引起的腦膜炎等有較好的療效，可緩解癥狀， 縮短病禾呈持續時間(Romero JR. Pleconaril :a novel antipicornaviral drug [J]. Exper opin Investing Drugs, 2001,10 (2) :369-379)，Pleconaril 作用機制可能通過阻止病毒與宿主細胞受體結合而抑制病毒復制。干擾素作為一種有效的抗病毒制劑，已廣泛應用于臨床，足量應用IFN能提高機體的細胞免疫力，達到抑制病毒、促進機體康復目的。干擾素局部皮膚外用能直接作用域被病毒侵襲的靶細胞，迅速控制皮疹的發展，對皰疹病毒感染具有明顯的治療效果，目前臨床常用的是rIFNa -Ib軟膏制劑，最新研究表明，rIFNα -Ib殼聚糖涂膜劑對豚鼠皮膚皰疹病毒感染具有較好的治療效果(陳勇，陳妍.重組干擾素α-Ib殼聚糖涂膜劑對豚鼠皮膚皰疹病毒感染的治療作用.中國藥師，2006,9(10) =901-902) Arya (Arya SC. Antiviral therapy for neurological manifestations of enterovirus 71infection[J]. Clin Infect Dis，2000，30 :988-992)嘗試用IFN-α治療EV71引起的中樞神經系統感染，結果表明，早期應用可逆轉病毒對神經系統的損傷。由于手足口病常造成機體細胞免疫反應損害，足量的干擾素使用能提高機體的細胞免疫力，已知干擾素影響各種細胞功能，包括在正常和異常細胞中的DNA復制以及RNA和蛋白質合成，因而，干擾素的細胞毒性效應并不限于病毒感染細胞也呈現在正常健康的細胞中，因此，在干擾素治療期間，尤其需要高劑量時，會產生不期望的副作用。使用干擾素可導致骨髓抑制，以致降低紅細胞、白細胞、以及血小板水平，更高劑量的干擾素通常引起流感樣癥狀、胃腸紊亂、頭暈以及咳嗽。
發明內容
本發明的目的在于提供一種治療手足口病的藥物組合物，本發明所述治療手足口病的藥物組合物，包括一類具有抗病毒作用的第一作用劑，和一類具有調節機體免疫作用的第二作用劑。本發明中一類具有抗病毒作用的第一作用劑，可以是病毒DNA聚合酶抑制劑，比如核苷類抗病毒藥阿昔洛韋、更昔洛韋或利巴韋林，也可以是其它類的病毒DNA聚合酶抑制劑。或者，本發明中的具有抗病毒作用的第一作用劑，也可以是阻斷病毒mRNA翻譯、 抑制病毒核酸合成的作用劑，如可以是干擾素，比如I型干擾素(干擾素α lb、干擾素 α lb、干擾素β，干擾素ω)。本發明中，所述的具有調節機體免疫應答以獲取機體免疫反應的第二作用劑，可以是通過提高機體體液免疫應答，以獲取機體免疫增強反應，如可以是疫苗制劑，或質粒。
本發明中，所述的具有調節機體免疫應答以獲取機體免疫反應的第二作用劑，是一種通過刺激機體免疫應答獲取機體細胞免疫反應的作用劑。細胞免疫是T細胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉化為致敏T細胞，當相同抗原再次進入機體，致敏T細胞對抗原的直接上上作用及致敏T細胞所釋放的淋巴因子的協同殺傷作用。比如，這種獲取刺激機體免疫應答以獲取機體細胞免疫反應的作用劑，比如說可以是一種τ細胞生長因子，在體內促進B細胞、T細胞、自然殺傷細胞以及淋巴細胞活化殺傷細胞等增值和分化這種作用劑，可以是協同刺激APC和T細胞活化，促進B細胞增殖和分泌抗體以產生細胞免疫調節，比如白細胞介素1 ；也可以使通過活化T細胞，促進細胞因子產生，刺激NK 細胞增殖，增強NK殺傷活性劑產生細胞因子，誘導LAK細胞產生，并促進B細胞增殖和分泌抗體、激活巨噬細胞以獲取細胞免疫調劑的作用劑，比如白細胞介素2，白細胞介素15 ；或者是通過激活和增強NK細胞殺傷活性劑誘導IFN-的產生，促進ThO向Thl細胞分化，增強CD8+CTL細胞殺傷活性，誘導LAK細胞產生以獲取細胞免疫調劑的作用劑，如白細胞介素 12。也可以是通過其它途徑獲取細胞免疫調節白細胞介素細胞因子。本發明中，第二作用劑除了白細胞介素這一些列的細胞因子外，還可以是其它具有調節機體細胞免疫活性的細胞因子，比如IFN- γ，γ干擾素通過增加細胞表面MHC II類分子的表達，調節巨噬細胞、T細胞、B細胞之間的關系，增強免疫應答能力。本發明中，優選的第一作用劑為IFN-alb、IFN_a2b、IFN-；更優選為IFN_a2b。優選的第二作用劑為IFN-Y或白介素15。本發明中，通過將第一作用劑I型干擾素與具有免疫調節作用的第二作用劑細胞因子結合使用，在治療病毒感染引起的疾病時，可以降低I型干擾素的用量，減輕由于需要高劑量使用I型干擾素以獲取較好的抗病毒效果而產生的一系列副作用的風險。本發明中，所述的通過增強機體免疫應答以獲得細胞免疫的第二作用劑，還可以是植物提取物，比如一些多糖類的提取物(包括香菇多糖、靈芝多糖、黃芪多糖等)，或者明顯提示具有免疫調節作用的天然植物，比如人參、黃芪、靈芝等；或者是通過發酵而獲得的菌絲體(如杏鮑菇菌絲體)，或者是海洋藻類、深海動植物類的具有免疫調節作用的有效成分。本發明中，所述的腸道病毒引起的疾病，包括手足口病，其中腸道病毒為柯薩奇病毒或腸道EV71病毒。
具體實施例本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的范圍或實施方式的限制。本發明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的范圍內。實施例一病毒增殖將IXlO5PFU的EV71病毒接種于單層橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)上，加維持液置37°C、5% C02培養箱中培養7 后出現90%以上的病變，凍融3次后吹打離心，定量分裝，-80°C冰箱凍存備用。將IXlO5PFU的CoxA16病毒接種于單層宮頸癌細胞(Hela細胞)培養瓶中，37°C、 5% C02培養箱中培養7 后出現90%以上的病變，凍融3次后吹打離心，定量分裝，-80°C 冰箱凍存備用實施例二毒力測定分別將備用的EV71病毒和CoxAie病毒用維持液(含2%新生胎牛血清)做10 倍比系列稀釋，縱向重復3孔，分別橫向接種在96孔板內的單層RD細胞上和96孔板內的單層Hela細胞上，37°C、5% C02培養，每日觀察病變，96h后將板孔內液體吸棄，加1 %中性紅100μ 1置37°C染色2h，棄染液，用洗液將多余染料充分洗脫，加脫色液100 μ 1，室溫脫色lOmin，用酶標儀在540nm波長測定OD值，通過計算得到EV71病毒TCID50為10-5. 2， CoxA 16 病毒 TCID50 為 10-4. 8。實施例三病毒檢測使用Trizol法提取病毒RNA，并及時分裝保存于_80 °C，用RT-PCR擴增病毒 VPl基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR結果。根據國際標準株的全基因序列，并且參考亞洲的地方株基因序列，利用軟件DNASTAR和Primer premier 5. O設計如下引物EV71 病毒的上游引物GCA GCC CAA AAG AAC TTC，下游引物ATT TCAGCA GCT TGG AGTG,目的片段22^p。CoxA 16病毒的上游引物CCTATTGCAGACATGATTGAC，下游引物 TGTTGTTATCTTGTCTCTAC,目的片段 900bp。實施例四干擾素a2b抑制EV71病毒增殖試驗將Iml 干擾素 a2b(lX108IU/mg)稀釋為 lX107IU/ml、lX105IU/ml、lX103IU/ml 后， 分別縱向重復3孔，依次橫向96孔板EV71感染的RD單層細胞加入10 μ 1干擾素a2b，同時設陰性對照。37°C、5%C02培養，每日觀察病變，5天后終止。結果表明，干擾素a2b處理組的細胞CPE為31. 2士2. 1%，顯著低于陰性對照細胞組69. 1 士5. 1%，說明干擾素a2b能夠有效的抑制EV71病毒引起的細胞病變和凋亡。實施例五建立手足口病小鼠動物模型通過給7日鼠齡的Balb/C小鼠分別進行腹腔注射EV71和CoxA16病毒，建立EV71 和CoxA16動物模型，EV71病毒和CoxA16病毒的感染劑量TCID50均為1X107，接種1周后， 小鼠出現精神萎靡不振、活動減少、弓背、食欲不振、反應遲鈍等癥狀，隨機抽取部分小鼠安樂死，分別取血液、肌肉、腦、腸進行RT-PCR檢測，結果表明，腹腔注射病毒1周后，模型組小鼠在血液、肌肉和腸道中均能檢測到病毒，但是在腦中沒有檢測到病毒的存在，初步評價已經建立了手足口病的實驗動物模型。實施例六干擾素a2b和干擾素a2b+白介素2的體內抑制病毒效果取40只EV71病毒的實驗模型小鼠，分為4組B :pBS陰性處理組；C 干擾素a2b處理組IXlO5IU ；C =IXlO4IU白介素2處理組； D =IXlO5IU干擾素a2b+lX104IU白介素2處理組，每天給藥1次，連續2周，另設正常對照組 A (未接種病毒的Balb/C鼠10只)，給予等量的pBS溶液。1、組織中病毒存在情況檢測給藥2周后，小鼠猝死，分別取血液、肌肉、腦、腸組織，-70°C冷凍備用，然后進行RT-PCR檢測，檢測給藥處理組小鼠和對照組小鼠各組織和器官內的EV71病毒存在情況，結果見表1 表1各模型組小鼠組織、器官內的病毒檢測情況
權利要求
1.一種治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，包括在細胞內阻斷病毒HiRNA翻譯、抑制病毒核酸合成的第一作用劑；和通過調節機體免疫應答以獲得細胞免疫的第二作用劑。
2.根據權利要求1所述的治療腸道病毒引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的在細胞內阻斷mRNA翻譯、抑制病毒核酸合成的第一作用劑為I型干擾素。
3.根據權利要求2所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的I型干擾素為α、β或ω中的任意一種。
4.根據權利要求2所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的I型干擾素為α干擾素。
5.根據權利要求2所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的I型干擾素為干擾素α Ib或α 2b。
6.根據權利要求1所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的第二作用劑可以是選自干擾素Y或白細胞介素。
7.根據權利要求6所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征是所述的白細胞介素為白細胞介素2、白細胞介素12或白細胞介素15中的任意一種。
8.根據權利要求6所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征在于， 所述的白細胞介素為白細胞介素15。
9.根據權利要求1至8任意一權利要求所述的治療腸道病毒感染引起的疾病的藥物組合物，其特征在于所述的腸道病毒為柯薩奇病毒或腸道EV71病毒。
全文摘要
本發明涉及一種藥物組合物，具體是由一種抗病毒藥物——通過在細胞內阻斷病毒mRNA翻譯、抑制病毒核酸合成-的第一作用劑；和一種免疫調節的第二作用劑組成，本發明藥物組合物可用于治療由腸道病毒感染引起的機體病變，如手足口病。
文檔編號A61K38/21GK102309758SQ20101021594
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者侯建華, 周德勝, 張春麗, 熊國裕 申請人:北京凱因生物技術有限公司, 北京凱因科技股份有限公司