專利名稱：一種苦楝皮有效組分的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬中藥提取物，具體地說涉及從苦楝皮中提取有效組分的制備方法，以及 該有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤是一種常見病、多發病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾 病。目前業內對惡性腫瘤的治療主要還是以手術、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在 作用于靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥 在抗癌抗突變方面有獨特的優勢和廣闊的應用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起 到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物， 現已開發為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大 腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發生率近年來有所增加。值 得重視，這些腫瘤的病因學、發病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的 抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開 發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用于開發成治療腫瘤疾病、 安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗腫瘤療效的新 藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種苦楝皮有效組分的制備方法，通過以下步驟實現將苦 楝皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅 膠柱對其進行分離，首先用低濃度乙醇作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換高濃度乙醇 作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到 的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液， 溶液經濃縮干燥后得到有效組分。優選的苦楝皮有效組分制備方法，包括下列步驟將苦楝皮藥材粉碎后加入 1 0.8 1.2(體積比)的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8 1.2小時，提取1 3次， 合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(0DS)對其進行分離，首先用 20% -40% (體積比)的乙醇溶液作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用90%-100% (體 積比)的乙醇溶液作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相 色譜繼續分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18 ； 21. 2mmX 250mm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9 llml/min，柱溫為室溫，收集溶 液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。最佳的苦楝皮有效組分制備方法，包括下列步驟將苦楝皮藥材粉碎后加入 1 1(體積比)的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱(0DS)對其進行分離，首先用30% (體積比)的乙醇溶液 作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用95% (體積比)的乙醇溶液作為流動相，得洗脫液II， 將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的目的物；制備色譜的分 離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18 ；21. 2mmX 250mm)，流動相為水和乙腈，梯度洗 脫，流速為lOml/min，柱溫為室溫。梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為80%的水溶液 和20%的乙腈溶液；4分鐘時，流動相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時，流動 相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶 液；64分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。在時間段56. 0 60. Omin收集 溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。本發明的再一個目的是提供該苦楝皮有效組分在制備治療、預防肝臟腫瘤藥物中 的應用。本發明的苦楝皮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或 載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。所制備的藥物的制劑形式為液體制劑、固體制 劑、膠囊劑或膠丸劑，給藥方式為口服給藥或注射給藥。本發明的苦楝皮有效組分還可以作為活性成分之一，加入其他抗腫瘤藥物，加入 藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。本發明的有益之處是通過本方法制得苦楝皮有效組分方法簡便，質量穩定。且現 有技術中尚未有苦楝皮抗肝臟腫瘤活性的報道，本發明為研發苦楝皮抗腫瘤新藥提供一定 ■石出。
具體實施例方式本發明結合下面實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用于說明 本發明而并非對本發明的限制。實施例一苦楝皮有效組分的制備將200g苦楝皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 0.8)(體積比)1500ml，加 熱提取1次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱對其進行分離，首先用20% (體 積比)乙醇溶液作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換90% (體積比)乙醇溶液作為流 動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品， 制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序如下 0分鐘時，流動相為80 %的水溶液和20 %的乙腈溶液；4分鐘時，流動相為80 %的水溶液和 20%的乙腈溶液；19分鐘時，流動相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時，流動 相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶 液。在時間段56. 0 60. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實施例二苦楝皮有效組分的制備將500g苦楝皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1.2)(體積比)5000ml，加 熱提取3次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱對其進行分離，首先用40 % (體 積比)乙醇溶液作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換100% (體積比)乙醇溶液作為流 動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品， 制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序如下 0分鐘時，流動相為80 %的水溶液和20 %的乙腈溶液；4分鐘時，流動相為80 %的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時，流動相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時，流動 相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶 液。在時間段56. 0 60. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實施例三苦楝皮有效組分的制備將250g苦楝皮藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1 1)(體積比)2000ml，加熱 提取2次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱對其進行分離，首先用30% (體積 比)乙醇溶液作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換95% (體積比)乙醇溶液作為流動 相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品，制 備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。梯度洗脫程序如下0 分鐘時，流動相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；4分鐘時，流動相為80%的水溶液和 20%的乙腈溶液；19分鐘時，流動相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；54分鐘時，流動 相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶 液。在時間段56. 0 60. Omin收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。實施例四苦楝皮有效組分制劑取實施例三的苦楝皮有效組分0. 5g與10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔 融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例五苦楝皮有效組分制劑取實施例三的苦楝皮有效組分0. 5g、葡萄糖4. 5g、硫代硫酸鈉0. 9g和蒸餾水1ml， 上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。 實施例六苦楝皮有效組分制劑取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基0 -環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低 溫干燥，得降香油和羥丙基環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基環糊精 的包合物粉末外，再取實施例三的苦楝皮提取物0. 5g、甘露醇5. 5g、依地酸鈣鈉0. 9g和蒸 餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例七苦楝皮有效組分制劑取實施例三的苦楝皮有效組分適量用40°C注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲 劑，調節溶液的PH值為7. 0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測定pH值后，用 膜過濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗、包裝，即得。實施例八苦楝皮有效組分制劑取實施例三的苦楝皮有效組分與花生油按2 18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中， 同時加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥液；將甘 油與蒸餾水在40-50°C溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取明膠加入其中混合攪 拌，直至全部溶化成膠液，然后在60°C溫度下使膠液靜置4小時，用制板機制成膠板供制丸 工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓丸機制丸，然后在22-25°C溫度下吹風4小時作 滾筒定型，又在25-30°C溫度下吹風干燥16-20小時，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在 25-30°C下吹風干燥4小時，即得。實施例九苦楝皮有效組分制劑取實施例三的苦楝皮有效組分適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮乙醇溶 液制軟材，過18目篩制顆粒，60°C干燥1小時，整粒，加入滑石粉適量，混勻，壓片，即得。
實施例十苦楝皮有效組分的藥理實驗陰性對照組正常培養條件的等量細胞
陽性對照組D0X (阿霉素4 ii M)細胞株IfepG-2(人肝癌細胞株)，貼壁細胞；培養液90% DMEM(高糖)+10% CS+1 %非必須氨基酸+100U/ml青霉素及鏈霉素樣品配制取實施例三苦楝皮有效組分用二甲基亞砜(DMS0)配置成50iig/ ml, -20°C保存測試步驟96孔板，藥物作用(48h)結束后，吸去上清培養液，MTT儲備液和完全 培養液以1 10稀釋，每孔加入100 iiL。37°C培養箱里孵育4h。去上清培養液，每孔加入 150 uL DMS0溶解結晶，500rpm振蕩lOmin，使結晶充分溶解。550nm測定吸光度，結果見表 1。表 1 計算方法抑制率(％ ) = 100_(篩選組吸光度-空白對照組吸光度)/(陰性對照組吸光 度-空白對照組吸光度)X100結果表明該苦楝皮有效組分的抑制率為91. 68%。
權利要求
一種苦楝皮有效組分的制備方法，通過以下步驟實現將苦楝皮藥材粉碎后加入體積比為1∶0.8～1.2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用反相硅膠柱對其進行分離，首先用體積比20％-40％的乙醇溶液作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用體積比為90％-100％的乙醇溶液作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9～11ml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。
2.根據權利要求1所述的一種苦楝皮有效組分的制備方法，其特征在于，色譜分離后， 在時間段56. 0 60. Omin收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。
3.根據權利要求1方法制備獲得的苦楝皮有效組分在制備治療、預防肝臟腫瘤藥物中 的應用。
4.根據權利要求3所述的一種苦楝皮有效組分的應用，其特征在于，所制備的藥物還 含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
5.根據權利要求3所述的一種苦楝皮有效組分的應用，其特征在于所制備的藥物還 含有其他抗腫瘤藥物。
6.根據權利要求3所述的一種苦楝皮有效組分的應用，其特征在于所述藥物的制劑 形式為液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑。
7.根據權利要求3所述的一種苦楝皮有效組分的應用，其特征在于所述藥物的給藥 方式為口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發明提供一種苦楝皮有效組分的制備方法，將藥材通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用制備液相色譜繼續分離，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。本發明的苦楝皮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。所制備的藥物的制劑形式為液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑，給藥方式為口服給藥或注射給藥。本發明提供的苦楝皮有效組分可在制備治療、預防腫瘤藥物中應用。本發明制備方法，操作簡便，質量穩定。且現有技術中尚未有苦楝皮抗肝臟腫瘤活性的報道，為研發苦楝皮抗腫瘤新藥提供研究基礎。
文檔編號A61P35/00GK101869604SQ20101021478
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者吳斌, 瞿海斌, 程翼宇 申請人:浙江大學