專利名稱：胰高血糖素受體基因的rna干擾序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因技術領域的RNA干擾序列，具體涉及一種胰高血糖素受 體(GCGR)基因的RNA干擾序列。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物體內抑制特定基因表達的一種現象， 它是指當細胞內存在與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基 因表達沉默的現象，這種現象發生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默。RNA干擾作用是 通過一類較穩定的中間介質實現的。對植物的研究證明，雙鏈RNA復合體先降解成為35nt 左右的小RNA分子，然后他們通過序列互補與mRNA結合，從而導致mRNA降解。對果蠅的研 究證明，長度為21 23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現象的直接原因，這種小RNA分子 被稱之為小干擾RNA (small interfering RNA, si RNA) 小干擾RNA被認為是一種快捷、高 效的調控體內基因表達的方法，因而在基因治療方面具有極大的應用前景。臨床研究認為，對于胰島素抵抗為主，或胰島素分泌不足為主伴所致的II型糖尿 病病癥，可以通過調節胰高血糖素的作用來達到穩定患者體內血糖水平的目的。一方面，胰 高血糖素具有強烈的促進糖異生和糖原分解的作用，因此可以通過抑制胰高血糖素的升高 血糖作用來緩解癥狀；另一方面，對胰高血糖素激素的調節將會間接的影響到胰島素分泌 情況，達到緩解癥狀的目的。胰高血糖素受體分子GCGR是具有七次穿細胞膜結構的G蛋白 偶聯受體家族，主要分布于肝臟，腎臟，胰腺等器官。其中，肝臟器官分布的胰高血糖素受體 與胰高血糖素之間的互相作用對于血糖調節具有重要的意義。R. W. Gelling等發現GCGR的 基因敲除小鼠模型中血糖濃度明顯降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高。近年來小 分子藥物胰高血糖素受體(GCGR)拮抗劑被報道在糖尿病小鼠模型中等也有很好的降糖穩 定作用。而且GCGR的反義抑制核苷酸也被證實能夠有效的改善糖尿病小鼠模型中的高血 糖。這些研究揭示了肝臟GCGR基因是一個主要的糖尿病治療藥物靶點，抑制肝臟GCGR受 體的作用可以緩解血糖升高的癥狀，治療糖尿病。經對現有技術的文獻檢索發現，尚無胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列的有關 報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種胰高血糖素受體基因的RNA干 擾序列。本發明的RNA干擾序列可有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖濃度。本發明是通過以下的技術方案實現的本發明涉及的第一種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID N0:1所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :2所示的序 列。本發明涉及的第二種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分 子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO :3所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :4所示的序 列。本發明涉及的第三種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，該序列為雙鏈RNA分 子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO :5所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO :6所示的序 列。本發明具有如下的有益效果本發明的干擾RNA序列較為有效的降低糖尿病模型 小鼠的血糖濃度，通過對血糖_濃度曲線下面積AUC的分析，給藥后的模型小鼠在葡萄糖利 用能力方面得到了較大的提高。
圖1為給藥后糖尿病小鼠模型糖耐量測試血糖濃度_時間曲線示意圖；圖2為不同siRNA組給藥后糖尿病小鼠模型血糖含量變化示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用 于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例試劑四氧嘧啶Alloxan monohydrate (HPLC純試劑，購自美國sigma公司，產品編 號 A7413)；葡萄糖測定試劑盒——葡萄糖氧化酶_過氧化物酶法(購自上海榮盛生物技術有 限公司，產品編號361510，批號20030101)；實驗動物健康雄性$六周齡昆明鼠，由上海斯萊克試驗動物責任有限公司提供 (許可證號SCXK (滬)-2007-0005)，通過20°C明暗交替環境中適應性預培養一周后進行實驗。實驗過程包括如下步驟步驟一，siRNA設計合成 設計小鼠胰高血糖素受體(GCGR)的siRNA，根據GCGR的refseq序列NM_008101， 使用美國麻省Whitehead生物醫學研究所的siRNA設計軟件，設計格式為AA19NTT的 siRNA，挑選三條結果如下GCGRsiRNA_l 靶序列 AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT (1451-1473)，正義鏈5，-AGCUCUUCAGGAGGAAAG⑶U反義鏈3，-UUUCGAGAA⑶CCUCCUUUCC ；siRNA_2 靴序列 AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT (455-477)，
正義鏈5，-AGUGCAGCACCGCCUA⑶⑶U，反義鏈3，-UUUCACGUC⑶GGCGGAUCAC ；siRNA_3 靴序列 AACTACATCCATGGGAACCTGTT (707-729)，正義鏈5，-CUACAUCCAUGGGAACCU⑶U
反義鏈 3，-UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC。對照組非靶向性siRNA正義鏈5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT，反義鏈3，-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。siRNA的合成由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。步驟二，糖尿病小鼠模型的建立以及模型穩定性測試昆明鼠20只，適應飼養環境一周并測正常小鼠空腹4h后的體重以及血糖值；小 鼠禁食不禁水12h后，配制新鮮的四氧嘧啶誘導劑溶液，給藥方式為一次性小鼠腹腔注射 (ip)，劑量為200mg -Kg-1小鼠體重。注射完畢后為小鼠補充飲水以及食物，并且更換墊料。 注射誘導劑72h后，測量空腹4h以后的小鼠體重以及血糖，檢測建模成功率并且進行分組。 建模后16天內，檢測小鼠體重情況以了解模型健康狀態。步驟三，血糖檢測標準方法建立小鼠禁食不禁水空腹4h以后，盡量保持小鼠情緒平靜，迅速用毛細玻璃管于小鼠 眼底取血lOOul左右(3到4滴血)，置于0. 5ml離心管中。血液樣本于4°C冰箱中冷藏放 置至離心管底部出現血液凝結后，立即于4°C離心(3000rpm，5min)取上層血清作葡萄糖含 量檢測。將葡萄糖檢測試劑盒(上海榮盛生物技術有限公司，貨號361510)中R1與R2等 比例混合作為葡萄糖測試液。取測試樣本4ul加入lml的測試液中，充分混勻，置于37°C水 浴15min，使之顯色。在紫外波長505nm處，以空白測試液加蒸餾水調零，讀取樣本管的吸光 度值A。同時，制備5 30mmol L—1梯度濃度的葡萄糖標準液，制作標準曲線從而讀取樣 本的葡萄糖濃度，標準曲線R2 > 0. 99。步驟四，小鼠模型siRNA體內系統給藥將成模的小鼠根據血糖檢測情況進行分為4組，分別為siRNA_l，siRNA_2, siRNA_3組和對照組，給藥方式采用尾靜脈高壓快速推注法。將合成siRNA溶于DEPC處理 過的PBS中，按照0. lnmol/g老鼠體重進行給藥每只小鼠模型快速推注的溶液體積為小鼠 體重的8%，約為3ml左右的PBS-siRNA溶液。給藥完畢后密切觀察小鼠，及時補充飲水和 飼料。步驟五，糖耐量試驗糖耐量試驗在給藥后第2d，禁食4h取血(為零時)，然后腹腔注射葡萄糖(2g/ kg)，測定給糖后0. 5，1，1. 5，2小時的血糖值以及計算血糖曲線下面積。步驟六，小鼠模型血糖變化曲線分別于給藥后第ld，2d，4d，8d按照步驟三中的血糖檢測標準方法測量4組中各個 小鼠血糖值。得到給藥后8天內的小鼠模型血糖_時間曲線。試驗結果以及分析(1)糖尿病小鼠模型的建立
20只小鼠誘導前血糖均值7. 1 士3.0mmol .L—1，誘導后死亡兩只，血糖大于 15mmol L—1小鼠為12只(血糖均值34. 6士3. 9mmol L—1)；誘導建模成功率為60%。(2)siRNA給藥后糖耐量測試如附圖1 所示計算得出四個組別(l)siRNA-l，(2)siRNA-2, (3)siRNA_3，(4)非 靶向性對照siRNA血糖-時間曲線下面積(AUC)分別為964. 5 ；3216. 1 ；2606. 9以及 4173. 9min mmol L—1 ；AUC反映了動物對葡萄糖的利用程度，AUC的面積越小，證明其越能 有效地利用葡萄糖，其中(1)，(2)，(3)組的AUC面積分別為對照(4)組的23. 11%,77. 1% 和 62. 5%。(3) siRNA給藥后血糖-時間變化曲線如附圖2所示給藥后8天模型小鼠血糖_時間曲線12只誘導成功糖尿病小鼠模 型分為4組①siRNA-1片段組，給藥前血糖38. 4 士 3. 3mmol L—1，給藥后第一天血糖 5.4士1.511111101*171，相比于給藥前降低了86.0% ；此后的幾天內血糖含量有所回升，但第8 天血糖含量依然低于給藥前血糖，為11. 7士3. 5mmol 廠1，相比于給藥前降低了 69. 4% ；②siRNA-2片段組，給藥前血糖29. 2 士 4. 6mmol L—1，給藥后第一天血糖 17. 1 士 1.4mm0l L—1，血糖相比于給藥前降低了 41. 4%，此后的幾天血糖回升；③siRNA-3片段組，給藥前血糖34. 8 士 3. 8mmol L—1，給藥后第一天血糖 27. 1 士7. 8mmol L—1，血糖相比于給藥前降低了 22. 2% ；此后的幾天血糖回升；④非靶向性siRNA序列對照組，給藥前血糖36. 1 士2. lmmol L—1，給藥后第一天血 糖37. 8 士4. 2mmol .L—1，血糖相比于給藥前升高了 4. 7% ；此后的幾天血糖逐漸升高，第8天 時模型血糖相比于給藥前升高了 32%。
權利要求
一種胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，其特征在于，該序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈如SEQ ID NO5所示，反義鏈如SEQ ID NO6所示。
全文摘要
本發明涉及基因技術領域的胰高血糖素受體基因的RNA干擾序列，第一種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO1所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO2所示的序列；第二種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO3所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO4所示的序列；第三種RNA干擾序列為雙鏈RNA分子，該RNA分子的正義鏈具有SEQ ID NO5所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO6所示的序列。本發明的干擾RNA序列較為有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖濃度，提高小鼠利用葡萄糖的能力。
文檔編號A61P3/10GK101851624SQ20101021131
公開日2010年10月6日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者周潔, 彭金良, 徐宇虹 申請人:上海交通大學