表達prrsv免疫原基因的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及其制備方法

專利名稱：表達prrsv免疫原基因的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種表達PRRSV免疫原基因的重組減毒 鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及其制備方法。
背景技術：
PRRS (豬繁殖與呼吸綜合癥)是由PRRSV (豬繁殖與呼吸綜合癥病毒)引起的豬的 烈性傳染病之一。被國際獸醫局列為B類動物傳染病，主要引起母豬繁殖障礙(如流產、早 產、死胎、木乃伊胎)和仔豬呼吸道癥狀。目前世界上發生的PRRS有兩個血清型歐洲型和美洲型。到目前為止我國流行的 只有美洲型。由于PRRS主要是引起母豬的繁殖障礙，從而給我國養豬業造成了巨大的經濟 損失。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，是不分節段的單股正鏈RNA病毒。基因組 長約15Kb，具有感染性，含有8個開放閱讀框(ORF)，其中GP5是PRRSV主要的結構蛋白，也 是中和抗體識別的主要靶蛋白，既可誘導體液免疫，又可誘導細胞免疫。免疫接種是防控PRRS的主要措施，目前PRRS商品化疫苗主要是滅活苗和弱毒苗 兩種傳統常規疫苗。PRRSV弱毒苗具有免疫效果較好、免疫力較堅強、免疫期長等優點，但弱 毒苗對變異較大的異源毒株的攻擊所產生的保護非常有限，不能阻止強毒感染，并且存在 散毒及潛在的毒力返強的可能性。許多國家已禁止使用弱毒苗，轉而使用滅活苗。但更多 的研究報道結果表明，滅活疫苗雖然安全但是產生的保護力不強，僅有部分保護或完全無 保護作用。同時滅活苗需反復多次的免疫接種，免疫劑量大，成本較高，且滅活苗產生的保 護力多不適應PRRSV很強的變異性，對異源株免疫效果不理想。因此，研制更安全、高效、廉 價的新型疫苗已成為當今PRRS研究領域的熱點和重要方向。在現有技術中，已有構建PRRSV GP5基因疫苗的報道(參見1.《吉林農業大學學 報》，2007，29(1) :91-94頁；2. “由減毒沙門氏菌介導的豬繁殖與呼吸綜合征病毒_PRRSV_ DNA疫苗的口服免疫應答”，《2005中國畜牧獸醫學會學術年會論文集》，2005)，上述疫苗均 屬于核酸疫苗，需要先將GP5基因克隆到真核表達載體例如Pires-neo內。然而，真核表達 載體系統存在操作繁復以及表達水平較低等缺陷，難以大規模應用。實際上，上述基因疫苗 更大的問題是，初次免疫產生的抗體水平比較低，需要進行2次免疫，但是即使進行2次免 疫，總抗體水平仍然要低于普通的滅活苗免疫水平。另外，根據上述文獻“由減毒沙門氏菌 介導的豬繁殖與呼吸綜合征病毒_PRRSV_DNA疫苗的口服免疫應答”的報道，口服PRRSV DNA 疫苗是否能夠誘導黏膜免疫尚難確定。因此，開發一種更加安全、有效、廉價的高效新型PRRSV疫苗以及易于表達、操作 簡便的制備方法在I3RRS研究領域具有迫切需求。減毒鼠傷寒沙門氏菌能通過粘附、侵襲、定居在腸道相關淋巴組織，有效地刺激機 體產生粘膜、細胞和體液免疫應答，是攜帶抗原的良好載體和天然粘膜免疫佐劑，越來越廣 泛地應用于疫苗接種。根據共同粘膜免疫理論，以減毒傷寒沙門氏菌為載體制成的口服疫苗可在口腔、乳腺、生殖道、淚腺等粘膜部位誘發較強的粘膜免疫，且口服接種的方式安全。 特別是近來利用不以抗生素作為選擇壓力的載體-宿主平衡致死系統構建的減毒鼠傷寒 沙門氏菌載體疫苗已顯示出良好的應用前景。

發明內容
本發明提供一種以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的PRRSV 口服減毒鼠傷寒沙門氏 菌活載體疫苗，可作為預防PRRS感染的口服活載體亞單位疫苗。本發明的提供的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其包含I3RRSV結構蛋白GP5， 其中，上述的抗原亞單位GP5來源于PRRSV陜西分離株。本發明還提供一種上述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的制備方法，步驟包 括1)制備0RF5基因。制備方法為用PCR方法擴增了 PRRSV陜西株0RF5基因，并 將其克隆到pGEM-T easy載體，構建了 pGEM-T_0RF5質粒；2)將上述的0RF5基因，插入到原核表達載體pYA3341的Ptrc啟動子下游，構建含 PRRSV的0RF5基因的重組表達質粒pYA3341_0RF5 ；3)將上述重組表達質粒PYA3341-0RF5轉入第一中間宿主菌內進擴增，所述的第 一中間宿主菌株優選為大腸桿菌X6212 ；4)將上述重組表達質粒PYA3341-0RF5轉入第二中間宿主菌內進行甲基化修飾， 獲得經甲基化修飾的重組質粒DNA。作為優選，所述第二中間宿主菌株優選為減毒鼠傷寒沙 門氏菌X3730 ；5)步驟4)中鑒定正確的甲基化修飾的重組質粒DNA轉化終宿主菌株。將步驟4 得到的甲基化修飾的重組質粒DNA通過電轉化方法轉化終宿主菌株中，誘導表達，得到重 組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗。終宿主菌株優選為減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550，其中所述 的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550優選為asd基因缺陷型菌株。此外，上述制備方法還包括如下鑒定步驟6)鑒定步驟5)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗中GP5的表達；7)通過Western免疫印跡檢測，檢測步驟5)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載 體疫苗中GP5的免疫原性；8)重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗攻毒保護實驗；9)在有、無選擇壓力的情況下進行體外傳代培養，鑒定重組減毒鼠傷寒沙門氏菌 載體疫苗穩定性。具體地說，本發明提供一種制備豬繁殖與呼吸綜合癥病毒重組活載體疫苗的方 法重組表達質粒轉化終末宿主菌X4550后，培養18h，離心收集菌體，測定重組菌的CFU，調 整重組菌的濃度使其達到101(lCFU/ml。可通過口服免疫或加強免疫，口服免疫具體可為約 1 X IO10CFU/只/次，每次間隔1 2周；加強免疫具體可為口服免疫2 4次后間隔一定 時間口服加強免疫一次，這里所述的一定時問視生物體的情況而定，可以為一周或一個月 等。上述的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550優選為asd基因缺陷型菌株。綜上所述，本發明采用平衡_致死系統構建了表達PRRSV GP5蛋白的重組減毒鼠 傷寒沙門氏菌載體疫苗株，并且構建的疫苗株無論有無選擇壓力均能穩定地在體外傳代培養，通過口服疫苗菌株免疫方案免疫小鼠和豬后證明該疫苗具有良好的免疫原性和免疫保 護效果。本發明的優點和積極效果為1)成功構建了重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體PYA3341-0RF5，可在宿主菌中表達 PRRSV含有病毒中和表位的主要結構蛋白GP5。本發明的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體 疫苗具有下述優點可以口服，免疫者易于接受；能夠快速產生抗體，且產生的抗體水平較 高；所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護試驗，免去了蛋白質后處理的復雜工 序；價格低廉；易于生產、儲存和運輸；可以避免現有技術中表達系統表達目的蛋白分離純 化的繁瑣過程和缺陷例如費時費力，代價昂貴，不能大規模應用于目的蛋白的規模化生產寸。2)本發明利用鼠傷寒沙門氏菌是腸道菌得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌可刺激 小鼠產生有效的體液免疫和細胞免疫，尤其有效地激發粘膜免疫應答；3)該載體-宿主平衡致死系統表達的GP5蛋白可與PRRSV抗體發生特異性反應。4)本發明得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌對實驗動物是安全的，無任何病理現象 出現。5)本發明得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌具有很好的體外遺傳穩定性，經多次傳 代后外源基因不丟失。6)本發明所使用的目的基因為PRRSV(美洲株，自陜西分離)國內分離株，從而構 建的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌可作為我國預防PRRS的口服活載體疫苗。7)將GP5基因克隆入原核表達載體而不是真核表達載體，降低了操作難度，提高 了表達水平，制備方法易于大規模生產。


圖1是重組表達質粒pYA3341-0RF5構建流程圖；圖2是PRRSV 0RF5基因的克隆；圖2中標號說明M為DNA分子量標準(Marker)， 泳道1為PRRSV 0RF5基因PCR結果(大約507bp)。圖3是重組表達質粒pYA3341-0RF5經雙酶切獲得目的基因，表明重組表達質粒構 建成功；圖3中標號說明M為DNA分子量標準(Marker)，泳道1為PRRSV 0RF5基因PCR結 果，泳道2為重組重組表達質粒pYA3341-0RF5經雙酶切獲得目的基因-0RF5經雙酶切鑒定 結果，泳道3為表達質粒pYA3341經雙酶切鑒定結果；圖4是重組表達質粒pYA3341-0RF5PCR鑒定；圖4中標號說明M為DNA分子量標 準(Marker)泳道1為重組質粒pYA3341_0RF5PCR鑒定結果；圖5是重組蛋白GP5的表達的SDS-PAGE分析；圖5中標號說明M為蛋白分子量 標準；泳道1為重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341蛋白分析，無21ku的GP5蛋白表達；泳道2為 重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341-0RF5蛋白分析，表達了 21ku的GP5蛋白；圖6是重組GP5蛋白的Western blot分析；圖6中標號說明泳道1為同PRRSV 陽性血清反應的重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341-0RF5表達的GP5蛋白，2為重組鼠傷寒沙門 氏菌pYA3341表達的蛋白與PRRSV陽性血清不反應(負對照)；圖7為小鼠脾臟、腸系膜淋巴結、回腸末端免疫熒光檢測結果，其中7A為小鼠脾臟陰性對照(X200)，7B為免疫后小鼠脾臟免疫熒光檢測(X200)，7C為小鼠腸系膜淋巴結陰 性對照(X200)，7D為免疫后小鼠腸系膜淋巴結免疫熒光檢測(X200)，7E為小鼠回腸末端 陰性對照(X200)，7F為免疫后小鼠回腸末端免疫熒光檢測(X200)；圖8為重組菌的生長曲線；圖9為免疫小鼠血清中抗PRRSV IgG抗體水平的測定結果；圖10為豬口服免疫后各組抗體水平結果統計分析圖。
具體實施例方式本發明利用pYA3341的載體-宿主平衡致死系統表達PRRSV GP5保護性抗原，構 建以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的PRRSV疫苗，并通過動物實驗觀察重組載體疫苗的免疫 原性及免疫保護性，為發展新型的PRRSV疫苗提供實驗依據。本發明用PCR方法擴增了 PRRSV陜西株0RF5基因(具體序列見SEQID NO. 1)，并 將其克隆到pGEM-T easy載體，構建了 pGEM_T_0RF5質粒。酶切pGEM_T_0RF5質粒，回收 0RF5基因。將回收的0RF5插入到表達載體pYA3341的Ptrc啟動子下游，構建含PRRSV的 0RF5的重組表達質粒pYA3341-0RF5 ；將構建的重組表達質粒轉入宿主-載體平衡致死表達 系統感受態大腸桿菌X6212內，使其進行大量克隆，并用萘啶酮酸進行營養篩選。篩選后的 重組質粒再次轉入宿主-載體平衡致死表達系統的中間宿主菌沙門氏菌X3730甲基化修 飾，同樣用萘啶酮酸進行營養篩選。篩選的經甲基化修飾的重組質粒最后轉入宿主-載體 平衡致死表達系統的終末宿主菌沙門氏菌X4550，萘啶酮酸進行營養篩選。重組表達質粒分 別經聚合酶鏈式反應(PCR)、酶切鑒定、免疫蛋白印記(western blot)試驗進行檢測，篩選 獲得陽性重組表達質粒菌株；將篩選的陽性重組表達質粒菌株分別免疫BALB/c小鼠和豬 并進行了免疫學指標的檢測。本發明所用的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550具有如下特征其為asd基因缺陷型細 菌，由于asd基因是DAP ( 二氨基庚二酸，革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分)生物合成途徑 中必需的酶，該基因的缺失可導致該突變株在無外源性DAP存在的條件下溶菌死亡，從而 高效減毒。減毒鼠傷寒沙門氏菌能表達外源抗原，在哺乳動物中經口、鼻、直腸等粘膜途徑 免疫能誘導強大而特異的免疫反應。能夠定居在宿主小腸和腸相關淋巴組織，不致病并且 能穩定表達外源基因。所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護試驗，免去了蛋白質 后處理的復雜工序。下面結合具體實施例進一步闡述本發明，這些實施例僅以舉例的方式提供，用于 對本發明中的制備方法進行詳細描述，以便更容易地理解本發明，應理解的是，這些實施例 僅用于說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備方法的 簡單改進，都屬于本發明要求保護的范圍。下面敘述本發明的具體實施方法實施例1、PRRSV陜西株0RF5基因的克隆1. 1引物的設計根據發表的PRRSV CH-Ia株(GenBank :AY032626)的基因組序列，設計1對特異性 引物(P1/P2)。上游引物 Pl 5' -CCG GAATTCGC AGCAAC AAC AGC AGC TCTCA-3‘ 5'端加 上EcoR I 酶切位點，下游引物P2 5' -ACG GTCGAC CTA GAG ACG ACC CCA TTGTT-3‘ ,5'
6端加上SalI酶切位點。預期擴增片斷為507bp，含有去掉信號肽基因的完整0RF5基因。1. 2病毒基因組的提取取出-80°C保存的PRRSV SX株(陜西分離株)細胞毒，按照Trizol提取試劑盒提 取病毒 RNA。取 RNA 作模板 3μ L，加入 0RF5 下游引物 P2 1 μ L、dNTP 4 μ L,RNase-Inhibitor 0. 5 μ L.AMV 0. 5 μ L,5 X AMV Buffer 4 μ L，力口 DEPC H20 至 20 μ L，42°C lh，即得 cDNA 模板；PCR 反應體系如下10 X PCR Buffer 5 μ L、dNTPs 4 μ L、P1/P2 各 1 μ L、TaqDNA 多聚酶 1 μ L、cDNA 6 μ L、加水至 50 μ L。反應程序95°C變性 5min ；94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin，共30個循環；最后72°C延伸lOmin。反應結束后取10 μ L PCR產物加入IyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產物。1.3 PCR產物的純化與回收參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因。2.大腸桿菌DH5 α感受態細胞的制備(氯化鈣法)以無菌接種環刮取凍存于-80°C冰箱的大腸桿菌DH5ci菌種，劃線接種于不含氨 芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37°C培養16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養 基中，37°C、250r/min振搖培養到0D600 = 0. 4 0. 6，在無菌條件下將細菌培養液轉移到 兩個無菌并以冰預冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴lOmin，使培養物冷卻 到 0°C ；4°C、2000r/min 離心 lOmin，棄上清，以 IOml 用冰預冷的 75mmol/L CaC12、IOmmol/ L(pH6. 5)溶液重懸沉淀，冰浴10min,4°C,2000r/min離心lOmin，棄上清，以2ml用冰預冷 的，含 15% ν/ν、)甘油的 75mmol/L CaC12、10mmol/L Tris .Cl(pH6· 5)溶液重懸每管沉淀， 用無菌吸頭將感受態細胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μ 1 ；標明菌株、體積和日期， 置-80°C冰箱凍存備用。3. 0RF5基因片段與pGEM-T easy載體的連接反應取0. 5 μ g pGEM-T載體，力Π 3 5倍摩爾量的0RFOTNA片段，2 μ 1 5 X連接緩沖液 加水定容至10 μ 1，最后加入IWeiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16°C連接1 4h，取 7 μ 1連接反應液轉化上述Ε. coli DH5 α感受態細胞。4.轉化將適量連接產物DNA (體積質粒< 1 μ 1，連接產物< 10 μ 1，DNA < 50ng)加入 200 μ 1上述感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ； 加入200 μ 1 37°C預熱的LB培養基，37°C 150r/min振搖培養50min ；取培養液涂布于含 Amp (50 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養14 16h后，得到轉化菌落。5.質粒的提取(堿裂解法)挑取單個上述轉化菌落，接種到2ml含50 μ g/ml Amp的LB培養液(下同)中， 370C 250r/min振搖培養12 16h ；將1. 5ml轉入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄 上清。以 200 μ 1 冰預冷的溶液 I (50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris · Cl，pH8. O ； 10mmol/L EDTA，pH8. 0)重懸沉淀，加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，顛倒數次 混勻，加入200 μ 1用冰預冷的溶液III (3molKAc, 5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000" min離心lOmin，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，氯仿/異戊醇 (24 1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置_20°C 30min,4°C 12000r/min 離心lOmin，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 μ 1含終濃度20 μ g/ml RNA酶(無DNA 酶)的 TE(10mmol/L Tri s · HC1，ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0，下同)溶解沉淀，并于 37°C水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20°C保存。6.重組質粒pGEMT-0RF5的酶切鑒定將1. 0 μ g質粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 μ 1，分別加入2 3單位 EcoRI和Sal I限制性內切酶及1 μ 1相應的IOX限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混 勻并離心，置最適反應溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結果均與預計完全相同 者，即為目的重組質粒。完全酶切后，-20°C保存，以備進一步鑒定或回收片段之用。7.攜帶PRRSV 0RF5基因重組表達載體質粒的構建用EcoRI和Sal I雙酶切pGEMT_0RF5質粒，回收0RF5基因，將其插入到同樣經過 EcoRI和Sal I雙酶切的表達載體pYA3341，進行連接反應，構建含有0RF5基因的表達載體 PYA3341-0RF5。具體構建過程如下7. 1 制備 “NA” LB 平板將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養基(含1. 5%瓊脂粉)置超凈臺內，待其溫度冷 卻至50°C左右時加入萘啶酮酸(NA)至終濃度為20 μ g/mL混勻后立即鋪制平板。7. 2大腸桿菌X6212感受態細胞的制備(氯化鈣法)同大腸桿菌DH5ci感受態細胞的制備方法。7. 3 0RF5基因片段與pYA3341載體的連接反應取0. 5μ g pYA3341載體，加3 5倍摩爾量的0RFOTNA片段，2 μ 1 5 X連接緩沖 液加水定容至10 μ 1，最后加入IWeiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16°C連接1 4h， 取7 μ 1連接反應液轉化上述大腸桿菌Χ6212感受態細胞。7. 4 轉化過程與步驟4相同。取培養液涂布于含NA(20 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養 14 16h后，得到轉化菌落。7. 5質粒的提取(堿裂解法)同步驟5方法7. 6重組質粒pYA3341-0RF5的酶切鑒定將1. 0μ g質粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 μ 1，分別加入2 3單位 EcoRI和SalI限制性內切酶及1 μ 1相應的IOX限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻 并離心，置最適反應溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結果均與預計完全相同 者，即為目的重組質粒。完全酶切后，-20°C保存，備用。8.甲基化修飾8. 1中間宿主菌X3730感受態的制備采用電轉化法制備減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730感受態細胞，整個過程要求在無菌 條件下完成。具體實驗步驟如下(1)從-80°C冰箱取出減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730，手握解凍，用無菌鉬絲直接蘸 取X3730菌種在LB平板(含50 μ g/ml DAP)表面劃線接種，37°C恒溫倒置培養16 18h ；(2)挑取1個直徑約為2 3mm的單菌落接種至4ml LB培養液(含50 μ g/ml DAP) 中，37°C，230r/min恒溫振蕩培養過夜；(3)按1 100比例將培養物接種至50ml LB培養液(含50 μ g/ml DAP)中，37°C、230r/min恒溫振蕩培養2 3h ；(4)取出100 200 μ 1培養物檢測0D600,當0D600介于0. 8 1. 0之間時，將培 養物置于冰浴中lOmin，使培養物冷卻到0°C ；(5) 40C，5000r/min離心IOmin收集菌體，棄去培養液；(6)用2 5ml 10%的滅菌甘油洗滌后離心，重復3次，用10%的滅菌甘油懸浮細 菌，使細菌數約2X 1010個/ml，100 150 μ 1/管分裝，標明菌株、體積和日期，置_80°C冰 箱凍存備用。8. 2pYA3341-0RF5 轉化 X3730 感受態(1)取2 3 μ 1 pYA3341-0RF5加入到Χ3730感受態細菌中，混勻；(2)將混合液立即轉移到預冷的0. 2cm電轉化杯中，吸干電轉杯外面水跡，然后放 入電轉儀樣品槽中；(3)轉化條件Cuvette Gap 0. 2cm, Voltage 2. 5kV, Field Strengh 12. 5kV/cm, Capacitor 25Uf, Resistor 200 Ω , Time Constant 4. 5 5. Omsec ；(4)電擊后，馬上取出電轉杯，迅速加入37°C預熱的SOC培養基中(含50 μ g/ml DAP)，并將菌液轉移到無菌的印pendorf管中；(5) 370C、120r/min振搖培養45 60min，取100 150 μ 1菌液涂布于LB固體培 養基(含20μ g/ml ΝΑ)表面，將平板正放于37°C培養箱中，待培養液完全被吸收后，倒置培 養16 18h ；(6)從篩選出的含有重組質粒PYA3341-0RF5的陽性菌X3730中提取出質粒。8. 3獲得甲基化的重組質粒PYA3341-0RF5陽性重組菌的鑒定因重組沙門菌中質粒拷貝數較低，利用PCR法進行鑒定，將PCR鑒定正確的重組子 電轉入終宿主菌X4550中，方法同前，并經PCR方法和雙酶切鑒定，具體方法同前述方法。9.構建口服活載體疫苗菌株9. 1終末宿主菌X4550感受態細胞的制備(電轉化法)同8. 1方法中間宿主菌X3730制備方法9. 2甲基化重組質粒pYA3341-0RF5轉化X4550中間宿主菌X3730的轉化方法同8. 2方法。同法構建空質粒菌X4550 (pYA3341) 作為陰性對照。9. 3陽性重組菌的鑒定因重組沙門菌中質粒拷貝數較低，利用PCR法進行鑒定，將PCR鑒定正確的重組子 電轉入終宿主菌X4550中，方法同前，并經PCR方法和雙酶切鑒定，具體方法同前述方法。10.重組工程菌的誘導將重組工程菌接種于3ml LB培養液中，37°C搖床培養過夜。次日將過夜培養的重 組工程菌按的比例轉種于20ml LB培養液中，37°C搖床培養(200r/分鐘)待0D_ = 0. 8時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L開始誘導，于誘導后4小時取樣并測定其0D600值， 同時作空載體菌誘導對照。實施例2、SDS-PAGE檢測PRRSV GP5蛋白的表達重組菌X4550 (pYA3341-0RF5)和空質粒菌 X4550 (pYA3341)分別接種于含 20 μ g/ ml NA的LB液體培養基中37°C振搖18h后，離心棄上清，收集菌體，加0. OlM(pH7. 2)PBS溶液重懸菌體后，加5X蛋白上樣Buffer，煮沸15min，離心收集上清，于12 %凝膠進行 SDS-PAGE電泳。配制SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，待凝膠完全聚合后，拔出上樣梳，用陰級 緩沖液清洗上樣孔并用濾紙吸干孔內水分。待測樣本與蛋白分子量標準同時上樣，當考馬 斯亮藍到達凝膠底部時停止電泳。凝膠于固定液中固定30 60分鐘，考馬斯亮藍加熱至 60°C染色20分鐘，脫色液脫色至背景無色。UVP掃描分析電泳結果。實驗結果發現，SDS-PAGE電泳顯示0RF5基因在重組沙門氏菌X4550中有較高 水平的表達，有分子質量約為21ku的目的蛋白條帶出現，與預期的去掉信號肽GP5蛋白 分子量一致，而對照組菌未出現該蛋白條帶(圖5)。該實驗結果證明了重組沙門氏菌 X4550(pYA3341-0RF5)中能夠表達 GP5 蛋白。實施例3、Western免疫印跡檢測GP5蛋白的免疫反應性按照上述方法先進行SDS-PAGE電泳，經SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白緩沖液(lOmmol/L Tri s Cl, pH7. 5,150mmol/ LNaCl，0. 05% Tween20)37°C 封閉 2h，洗滌緩沖液(lOmmol/L Tris · Cl ρΗ7· 5，150mmol/ L NaCl，0. 05% Tween20)洗滌3次，每次10 15min，將豬抗PRRSV陽性血清用封閉緩沖 液稀釋(1 300)覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過氧化物酶標記的羊抗豬 IgG(l 2000)室溫感作2h，洗滌3 5次后，每次10 15min，最后用蒸餾水清洗一次，夾 出PVDF膜稍晾干，配制ECL (enhanced chemiluminescence)工作液，在可見光下室溫孵育 膜數分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉入暗室將X光膠片 壓在膜上曝光數秒到數分鐘，顯影定影后蛋白質條帶可清晰顯示在X光膠片上。Western blot結果顯示，在21ku處位置上有相應的蛋白條帶(圖6)，證明了重組 沙門氏菌X4550(pYA3341-0RF5)中表達的GP5蛋白能很好地與PRRSV陽性血清特異性結
口 O實施例4、重組菌體外穩定性試驗將37°C振蕩培養過夜的菌體按10%接種于含50μ g/ml DAP的LB培養基中，繼 續培養12h，將上述培養物再按10%量接種于含50 μ g/ml DAP的LB液體中培養12h，如此 連續培養四代至50h，相當于菌體傳代100代。將培養物稀釋IO6倍，取1001稀釋液涂含 50 μ g/ml DAP的LB瓊脂平板，過夜培養后，隨機挑選100個單菌落，轉種在DAP-的LB瓊脂 平板上，如果質粒丟失，細菌不會在DAP-的LB瓊脂平板上生長，以此測定重組質粒的穩定 性。隨機挑取20個菌落重培養，且進行PCR和酶切鑒定，以確定外源基因在鼠傷寒沙門氏 菌宿主表達的穩定性。穩定性分析結果顯示，兩種重組菌中有選擇壓力組的各100個菌株，在不含DAP的 平皿上生長的菌落數都為100個。各隨機挑取20個菌落提取質粒，顯示100%含有重組質 粒。在無選擇壓力組，重組X4550(pYA3341-0RF5)和X4550 (pYA3341)菌傳代后所挑取的100 個菌落，在不含DAP的平皿上僅分別生長88和85個菌落，表明DAP非依賴性細菌占88% 和85%。從中隨機挑取20個菌落提取質粒，顯示分別有16和15個含有重組質粒，DAP非 依賴性細菌重組質粒的陽性率分別為80%和75%。上述實驗結果說明依賴asd基因的宿主質粒平衡致死系統保護的重組減毒沙門 氏菌質粒在體外不丟失，在體外能穩定傳代。
實施例5、重組菌生長曲線的測定挑取單克隆X4550(pYA3341-0RF5)和 X4550 (pYA3341)分別接種于含 20 μ g/ml NA 的LB液體培養基中，37°C振蕩培養IOh后，取50 μ 1接種于5ml含20 μ g/ml LB液體培養 基中，37°C振蕩培養，每隔Ih測定0D600值，繪制兩種菌的生長曲線。重組菌生長曲線的測定結果如圖8，從圖8可以看出兩種重組菌在接種3h后細菌 呈對數生長，在12h以后0D600nm值開始穩定。重組菌生長曲線的測定結果表明，兩種菌的生長狀態基本一致，即表示在減毒鼠 傷寒沙門氏菌中轉入重組質粒，不影響該菌的生長。實施例6、重組菌的安全性試驗 重組菌的安全性，通過BALB/c小鼠口服不同劑量來確定。取BALB/c小鼠各27只， 分為3組，其中2組分別口服兩種重組菌1 X IO12Cfu/只，陰性對照組口服等體積PBS溶液， 觀察小鼠口服菌株后的反應及成活率。試驗結果，BALB/c小鼠 口服重組菌X4550 (pYA3341_0RF5)和 X4550(pYA3341) 1.0 X IO12Cfu 30d后，存活率仍為100%。與PBS對照組相比較，體重變化 無明顯差別，且無活動異常等不良反應。由此可見，重組菌株對小鼠是安全的。實施例7、重組疫苗株口服免疫后在小鼠脾、腸系膜淋巴結、回腸末端定植的檢測重組菌經LB培養液培養后，用滅菌生理鹽水洗滌1次，重懸于滅菌生理鹽水中，以 每只5 X IO9CFU活菌液口服免疫BALB/c雌性小鼠。免疫后隨機分為6組，每組5只，于免 疫后第2、7、14、21、28和35日各取1組，無菌取小腸、腸系膜淋巴結和脾臟，研磨后分別涂 于含20 μ g/ml萘啶酮酸的LB平板上，37°C培養18h，菌落計數，統計分析。取疫苗免疫后的 小鼠脾、腸系膜淋巴結和回腸末端進行沙門氏菌免疫熒光檢測。實驗結果表明，口服免疫后第2日，腸系膜淋巴結和脾臟定居的重組菌尚較少，隨 后漸增多，至第28日腸系膜淋巴結測不到定居的重組疫苗菌，脾臟于第35日也測不到重組 疫苗菌(參見表1)。由此可見，該重組疫苗能較持續在體內存活28天左右，這有利于持久 刺激機體的免疫應答。免疫熒光染色結果表明，重組菌X4550(pYA3341-0RF5)免疫組小 鼠脾臟、腸系膜淋巴結和小腸可以看到較強的熒光，重組菌X4550(pYA3341)免疫組小鼠脾 臟、腸系膜淋巴結和小腸切片沒有熒光(圖7)，該現象證明重組菌定居在小鼠脾臟、腸系膜 淋巴結和小腸中，并表達出GP5蛋白。表1重組菌X4550(pYA3341_GP5) 口服免疫后在不同組織內的定居 實施例8、重組減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550 (pYA3341_0RF5)小鼠免疫試驗1、免疫小鼠BALB/c雌性小鼠15只，體重18 20g，隨機分3組，采取口服免疫方式。小鼠 口服接種前，禁食過夜，禁水4 6h。先用10 %的NaHC03溶液100 μ 1灌胃以中和胃 酸，30min 后分別灌胃免疫 X4550(pYA3341-0RF5)菌液、X4550 (pYA3341)菌液及 PBS 各 100 μ KlX 109cfu/100 μ 1菌液)，上述3組均免疫二次，間隔14天。2、T淋巴細胞增值試驗(1)脾細胞的制備頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI1640 培養基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龍網過濾制成單細胞懸液，1500r/min，離心5min， 棄上清。用Hank，s液離心洗細胞兩次，重懸于含10% NBS的RPMI 1640培養液中，計數， 調至2 X IO6個/ml備用。(2)在96孔板中每孔加入淋巴細胞懸液100 μ 1，對應孔中分別加入特異性刺激 原ConAdO μ g/ml) 100 μ 1作為陽性對照組、20 μ g/ml重組桿狀病毒特異性刺激原100 μ 1 為試驗組以及1640培養基100μ 1為非刺激抗原孔，不同刺激原重復3個孔；一只加 200 μ 11640培養基無淋巴細胞的孔作為本底。(3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20l·! 1，避光培養4h ；每孔吸棄100 μ 1培養液， 再加入DMSO 100 μ 1, IOmin內用酶聯免疫檢測儀630nm測定個孔OD值。(4)結果計算SI =(特異刺激原的平均OD值-本底值)/(非刺激原的平均OD 值_本底值)實驗結果，以刺激組A值/未刺激組A值表示各組的刺激指數(Si，表3)，將平 均值記入表2，SPSS軟件分析結果顯示，X4550(pYA3341-GP5)免疫組的SI值與PBS組和 X4550(pYA3341)免疫組均有顯著性差異(P < 0. 05)。該結果證明X4550(pYA3341_0RF5)疫苗株能誘導動物體產生細胞免疫應答，具有 良好的細胞免疫效果。表2T淋巴細胞增殖反應刺激指數 3、ELISA測定免疫小鼠血清中抗PRRSV IgG抗體ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的PRRSV全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標記 的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯免疫儀492nm/630nm測量各孔OD值，以P/N > 2. 1判為陽性。小鼠口服免疫后各組抗體水平結果統計分析見圖9。結果顯示，口服免疫 X4550(pYA3341-Tsoll8)小鼠在免疫后產生抗GP5特異抗體，且抗體水平逐步上升，在二免 后4周抗體水平達到最高，抗體效價可達到1 1250左右，二免后6周抗體水有所下降。 X4550(pYA3341)免疫對照組和PBS非免疫對照組的抗體水平沒有明顯的變化(參見附圖 9)。上述結果證明X4550 (pYA3341_0RF5)疫苗株能誘導動物體產生相應的抗體，具有 非常好的免疫效果。4、血清中和試驗采用固定病毒稀釋血清的方法，PRRSV用200個TCID5Q/50 μ L，血清作連續2倍倍 比稀釋。同時設定陰性、陽性血清以及正常細胞對照。中和試驗的結果以不產生細胞病變 的血清最高稀釋度作為該份血清的中和抗體效價。試驗結果表明，重組菌X4550(pYA3341_GP5)免疫小鼠的血清中和滴度為1 16， 重組菌X4550 (pYA3341)免疫組和PBS空白組小鼠血清沒有中和活性，各個血清中和活性結 果見表3。表3血清抗體的中和活性檢測結果 實施例9、重組減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550(pYA3341_0RF5)免疫豬試驗1重組菌 X4550(pYA3341-0RF5)和 X4550 (pYA3341)的大量制備挑取1個的單菌落接種至4ml LB液體培養基(含20 μ g/ml ΝΑ)中，37°C、230r/ min恒溫振蕩培養過夜；各按1 100比例將培養物接種至50mlLB液體培養基(含20 μ g/ ml ΝΑ)中，37°C、230r/min恒溫振蕩培養3 4h ；各按1 100比例將培養物接種至IOOOml LB液體培養基(含20 μ g/ml ΝΑ)中，37°C、230r/min恒溫振蕩培養15 16h ；4°C，5000" min離心IOmin收集菌體，棄去培養液；用IOOml滅菌PBS重懸沉淀，使細菌數約IOltlCfu/
13ml ο2實驗動物的分組與口服接種將試驗豬隨機分為三組，每組5頭，各組實驗豬口服免疫，免疫方法如下豬口服 接種前，禁食過夜，禁水4 6h，免疫前先用10 %的NaHC03溶液IOOml灌胃以中和胃酸， 30min后分別灌胃免疫大量制備的X4550(pYA3341-GP5)菌液、X4550 (pYA3341)菌液和PBS 各50ml (1 2X10ncfu/50ml菌液)，2次免疫時間間隔14天。18. 3實驗豬血清中抗PRRSV GP5抗體水平的檢測間接ELISA法測定血清抗體的OD49tl值。ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的PRRSV 全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體(1 3000稀釋)。分別于每次免疫 后2周自前腔靜脈采血并分離血清。用間接ELISA方法檢測實驗豬血清抗GP5抗體效價， 以待檢豬血清OD49c/陰性血清OD49tl平均值彡2. 1(P/N> 2. 1)判定為陽性，同組不同個體之 間取幾何均數為本組實驗豬抗體的平均效價。豬口服免疫后各組抗體水平結果統計分析見圖10。結果顯示，口服免疫 X4550(pYA3341-0RF5)豬在免疫后產生抗GP5特異抗體，且抗體水平逐步上升，在二免 后4周抗體水平達到最高，抗體效價可達到1 250左右，二免后6周抗體水有所下降。 X4550(pYA3341)免疫對照組和PBS非免疫對照組的抗體水平沒有明顯的變化。該實驗結果證明X4550(pYA3341-0RF5)疫苗株能有效刺激誘導豬體產生相應的 抗體，具有良好的免疫效果。3試驗豬攻毒途徑和劑量及攻毒后體溫變化于二免后6周對豬鼻內接種PRRSV SX株(1 X 105_5TCID5(1/0. ImL)，劑量為每頭豬 5mL。攻毒后每天觀察豬的食欲、精神、消化、呼吸等臨床表現，每兩天測量直腸溫度，觀察攻 毒后動物體溫的變化。攻毒結果表明，攻毒7天后，PBS免疫對照組有4頭對照豬的體溫升到41 °C 以上，分別達到 41. 5 0C >41. 4 0C >41. 2 V 和 41. 7 V，X4550 (pYA3341)組有 3 頭豬體溫 達到41. 4 V ,41. 7 41. 6 °C和41. 5 °C，14天以后兩組豬的體溫都消退到40°C以下。 X4550 (pYA3341-0RF5)免疫組的豬整個過程中體溫變化幅度不大。試驗動物中偶爾有咳嗽、 打噴嚏者，但都沒有發生呼吸困難等明顯的呼吸道癥狀，試驗動物中也無耳朵發藍的癥狀。結論X4550 (pYA3341-0RF5)免疫組豬能抵抗PRRSV野毒的攻擊，體溫表現正常。4攻毒后免疫豬病毒血癥的檢測于攻毒前0天及攻毒后1、2、3、4、5、6周，采集各組豬的前腔靜脈血，分離血清，按 照1. 2所述方法提取病毒RNA，用1. 2所述方法針對PRRSV SX株0RF5的引物對進行RT-PCR， 檢測血清中的PRRSV核酸。試驗結果見表4，RT-PCR檢測血清中的病毒血癥，攻毒后1周在各免疫組和 對照組的血清中皆可檢到PRRSV核酸，X4550 (pYA3341_0RF5)免疫組PRRSV檢出率 為30 %，X4550 (pYA3341)免疫組和PBS免疫組PRRSV檢出率分別為80 %和80 %， X4550 (pYA3341-0RF5)免疫組的PRRSV檢出率明顯低于這兩個對照組。結論X4550(pYA3341)免疫組攻毒后病毒血癥陽性率滴于對照組，說明病毒在這 些免疫動物體內存活數量少，表明X4550 (pYA3341-0RF5)沙門氏菌具有良好的免疫保護作 用。
表4染豬病毒血癥的PCR檢測結果 總結獲得的重組菌X4550 (pYA3341_0RF5)提取基因組后進行PCR擴增，得預期大小的 目的片段。酶切鑒定和測序確證及Western blot檢測均為陽性結果，說明構建的重組表達 載體pYA3341-0RF5可表達PRRSV糖蛋白GP5囊膜蛋白。重組表達載體pYA3341_0RF5可 在減毒鼠傷寒沙門氏菌的終末宿主菌X4550中表達，且經體外特性試驗證實重組表達質粒 PYA3341-0RF5具有良好的體外遺傳穩定性；重組菌X4550 (pYA3341_0RF5)具有良好的生長 特性及安全性。將重組菌X4550(pYA3341-0RF5)大量擴增后進行小鼠免疫實驗，可在免疫 小鼠血清中檢測到抗PRRSV的抗體，表明重組菌X4550 (pYA3341_0RF5)刺激小鼠機體產生 了特異性體液免疫。免疫小鼠淋巴細胞增殖試驗結果均顯示小鼠產生了特異性細胞免疫。 在本屬動物豬體內檢測的各種免疫學指標和小鼠檢測指標相似。研究結果表明，本發明所 構建的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌是一種安全、有效的口服活載體疫苗，具有開發成為用于 預防PRRS的疫苗的良好前景。以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，本發明的保護范 圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明 的保護范圍之內。
權利要求
一種重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其特征在于包含PRRSVGP5抗原亞單位，且所述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌帶有如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根據權利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其特征在于所述的抗原 亞單位來源于分離美洲株PRRSV。
3.—種在動物體內產生PRRS免疫應答的方法，所述方法包括將權利要求1-2中任一項 所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗以口服接種的方式給予動物。
4.根據權利要求3所述的在動物體內產生PRRS免疫應答的方法，其特征在于所述的動 物為人工養殖豬或野豬。
5.根據權利要求4所述的在動物體內產生PRRS免疫應答的方法，其特征在于所述的人 工養殖豬或野豬為母豬或仔豬。
6.權利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗在制備預防或治療豬繁殖與 呼吸綜合癥(PRRS)疾病的藥物中的應用。
7.—種權利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的制備方法，其特征在于 包括以下步驟1)通過PCR方法獲得PRRSVGP5基因；2)GP5基因與原核表達載體pYA3341連接，得到重組表達質粒pYA3341_0RF5。3)重組表達質粒轉化第一中間宿主菌株，獲得重組子；4)重組子轉化第二中間宿主菌株，鑒定陽性重組子；5)步驟4)中鑒定正確的陽性重組子轉化終宿主菌株；6)誘導表達，得到重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟5)中所述的終宿主菌株為asd基 因缺陷型減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550。
全文摘要
本發明公開了一種表達PRRSV免疫原基因的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗及其制備方法和應用。具體地說涉及一種口服減毒鼠傷寒沙門氏菌，所述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌帶有SEQ ID NO.1所示的序列，該重組細菌能表達PRRSV囊膜蛋白GP5。將所述減毒鼠傷寒沙門氏菌接種LB培養基中培養18h，調整細菌濃度為1010CFU/ml，制得一種安全、有效的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體疫苗，用于預防PRRS。
文檔編號A61P31/14GK101920010SQ20101021111
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者張琪, 童德文, 許信剛 申請人:西北農林科技大學