專利名稱：水貂出血性肺炎二價滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種疫苗及其制備方法。
背景技術：
水貂出血性肺炎又稱水貂假單胞菌性肺炎，是主要發生在每年9 11月份水貂換毛季節的一種急性傳染病，以出血性肺炎、急性死亡為特征，死前出現呼吸困難、鼻孔流出紅色帶泡沫液體等癥狀，死后剖檢可見整個肺葉彌漫性出血和敗血癥變化。本病世界各地均有發生，每年可造成養殖場10% 50%的死亡率，是危害水貂養殖業的重要細菌性傳染病。該病病原為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseud-omonas)中的銅 IixIfilif (Pseudomonas aeruginolsa)，#禾爾為t錄月農If lif (Bacterium pyocyaneum)，為胃
蘭氏陰性桿菌，長1. 5 3. O μ m，寬0. 5 0. 7 μ m，兩端鈍圓，一端有一根鞭毛，能運動。不能形成芽胞及莢膜。在普通瓊脂培養基上生長良好，形成大小不一的菌落。多數能產生藍綠色水溶性色素，使菌落周圍瓊脂培養基著色。綠膿桿菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，在正常人與動物腸道和皮膚上亦有存在， 也易從外傷、燒傷及尿道感染等發現，能引起人的燒傷感染和患囊性纖維化病人的肺部感染，具有多種致病因子而且有強侵襲力，因此認為本菌并非潛在致病菌而是完全致病菌。水貂出血性肺炎發病急，死亡快，發病時往往來不及治療，常用藥物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治療效果不顯著，而且抗生素的濫用導致綠膿桿菌已產生極強的耐藥性， 因此需要有效的疫苗來預防，國內尚無商品化的疫苗來預防水貂出血性肺炎，國外有報道將細菌細胞壁提取物(JAMES Ε. PENNINGTON，1979)，和從菌體內提取的共同保護性抗原 OEP(common protective antigen) (ABEC, 1975 ；Ε. HONDA, 1976)加類毒素成分彈性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制備過程復雜，成本高，不適合大量生產使用，而且免疫次數多，免疫期短，不適合臨床應用，綠膿桿菌抗原型繁多，單一成分的細胞提取物往往很難達到很好的保護效果。
發明內容
本發明的目的是提供兩種血清型銅綠假單胞菌強毒株以及由該兩種強毒株制備的水貂出血性肺炎二價滅活疫苗，所述水貂出血性肺炎二價滅活疫苗預防水貂出血性肺炎，預防免疫效果佳，安全性好。本發明提供的一種銅綠假單胞菌菌株DL15，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3811。本發明提供的另一種銅綠假單胞菌菌株幾08，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3812。用Reed-Muench法測定這兩株毒株對小白鼠的半數致死量(LD50)，菌株DL15的 LD50為250萬CFU，菌株JL08的LD50為2000萬CFU ；菌株DL15對水貂的半數致死量(LD50)為 100 萬 CFU,菌株 JL08 的 LD50 為 250 萬 CFU。本發明還提供由上述銅綠假單胞菌菌株制備的水貂出血性肺炎疫苗。所述的水貂出血性肺炎疫苗，作為優選，為二價滅活疫苗。本發明還提供一種水貂出血性肺炎二價滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟1 將銅綠假單胞菌菌株DL15和銅綠假單胞菌菌株幾08分別接種于PYG培養基培養，調整菌數為80-100億CFU/mL按比例1-2 1混合；步驟2 滅活步驟1所得混合培養物；步驟3 在步驟2所得培養物中添加防腐劑和佐劑，即得所述水貂出血性肺炎二價滅活疫苗。作為優選，步驟1所述接種為按PYG培養基體積的3-4%接種菌株。作為優選，步驟1所述培養為在37°C通氣培養12-1 ，控制綠膿桿菌的培養時間在15h以內，防止培養時間過長導致綠膿桿菌外毒素的產生，更好地保障疫苗安全性。作為優選，步驟2所述滅活為用終濃度0. 15%的甲醛滅活。更優選地，于37°C滅活Mh，期間振搖2 3次。作為優選，步驟3所述防腐劑為疊氮鈉，優選終質量濃度為0. 01%。作為優選，步驟3所述佐劑為氫氧化鋁溶液，優選氫氧化鋁溶液體積為培養液的4%。本發明所述銅綠假單胞菌菌株DL15和菌株JL08混合制成的水貂出血性肺炎二價滅活疫苗，一次可達到80%以上保護率，免疫期可達到五個月，可有效預防目前國內流行的水貂出血性肺炎，其制備工藝簡單，適合商品化生產，具有良好的應用前景。生物保藏信息菌株DL15 分類命名銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3811。菌株JL08 分類命名銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3812。
圖1示為本發明所述銅綠假單胞菌菌株幾08、菌株DL15的顯微鏡下形態；圖2示本發明所述二價滅活疫苗免疫水貂的保護效率。
具體實施例方式本發明公開了銅綠假單胞菌菌株幾08、菌株DL15及用所述兩種菌株制備的水貂出血性肺炎二價滅活疫苗及其制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品、方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
試驗材料PYG培養基成份蛋白胨2%，葡萄糖1%，氯化鈉0.5%，酵母粉0.3%，用去離子水配制，配完調 pH 值 7. 2-7. 4，116°C 30min。綠膿桿菌分型用標準血清購自日本生研株式會社；細菌鑒定微量生化反應管購自杭州天和微生物試劑公司；18 22g小白鼠購自吉林正業生物制品有限公司；甲醛，疊氮鈉購自北京化學試劑廠。實施例1 強力毒株的篩選從山東、河北、大連、內蒙古、吉林等地的各個貂場患出血性肺炎的水貂肺中分離出67株綠膿桿菌，經生物學特性觀察、生化試驗鑒定為綠膿桿菌。采用日本生研株式會社的標準血清通過玻片凝集試驗進行分型，確定分離株的血清型。通過小鼠攻毒實驗確定強毒力菌株，將菌株接種在PYG液體培養基中，37°C振搖 12h，液體均勻混濁，呈黃綠色或白色，形成菌膜。做細菌計數后將菌數調整到20億CFU/mL， 將菌液分別稀釋10倍、100倍，即菌量分別為2000萬CFU/mL和200萬CFU/mL，并用這兩個濃度攻小鼠，每株菌每個濃度攻三只小鼠，每只小鼠攻0. anl，一種血清型攻100倍稀釋度死亡小鼠的菌株共一株，另一種血清型攻10倍稀釋度死亡小鼠的菌株共一株。將這兩株毒力較強的菌株作為備選疫苗株，分別命名為菌株幾08、菌株DL15。菌株幾08、菌株DL15均為革蘭氏陰性桿菌，單個或成雙存在，兩端鈍圓，不形成芽胞及莢膜。用Reed-Muench法測定這兩株毒力株對小白鼠的半數致死量(LD50)，分別為菌株 DL15的LD50為250萬CFU，菌株JL08的LD50為2000萬CFU ；對水貂的半數致死量(LD50)， 菌株DL15的LD50為100萬CFU，菌株JL08的LD50為250萬CFU。將上述兩種強力菌株菌株幾08、菌株DL15進行生物保藏，其相關信息如下菌株DL15 分類命名銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3811。菌株JL08 分類命名銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3812。實施例2 本發明所述二價滅活疫苗的制備(1)疫苗制備將菌株DL15、菌株JL08劃線接種于PYG瓊脂培養基中于37°C培養 18h，之后挑單菌落接種于5mlPYG肉湯培養基中37°C振搖1 作為一代種子液，再按3%比例接種于300mlPYG肉湯中37°C振搖1 作為二代種子液，將二代種子液按4%比例接種于 6000mLPYG液體的10立升瓶里37°C通氣12h，即為培養好的疫苗菌液，通過細菌平板計數對菌液進行計數，并通過計數結果將這兩株的菌數均調整為80億CFU/mL，之后將菌液按菌株 DL15、菌株JL08比例為1 1混合，混合后加甲醛滅活，按甲醛終濃度為0. 15%滅活，37°C 滅活Mh，期間震蕩2-3次。(2)疫苗的滅活檢驗將甲醛滅活后的菌液取200微升接于5mL液體培養基中，一次培養取三次樣，每個樣品接種于三個試管中觀察五天進行滅活安全檢驗，五天后接種的液體培養基仍澄清無混濁則安全檢驗合格。(3)成品疫苗制備將滅活檢驗通過的菌液按菌液與鋁膠4 1的比例加入20%的氫氧化鋁膠溶液，充分混勻后加入0. 01%濃度的疊氮鈉，混勻。實施例3 本發明所述二價滅活疫苗的安全檢驗將實施例2制備好的三批疫苗單劑量、單劑量重復和超劑量注射健康水貂，后肢內側肌肉接種。通過14d觀察，接種水貂體溫和食欲正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現局部和全身反應；每批疫苗選擇3只，剖殺后切開注射部位皮膚觀察注射局部病理變化，水貂接種部位皮下無異常變化，后肢內側肌肉接種部位肌肉組織正常，僅見到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，與周圍紅褐色肌肉相區別，注射部位未見炎癥反應。60-70日齡幼貂繼續觀察至接種后30d，幼貂發育良好。說明疫苗對不同年齡的水貂具有較好的安全性。實施例4 本發明所述二價滅活疫苗對水貂的效力試驗測定三批水貂出血性肺炎二價滅活疫苗分別免疫16 18g小白鼠20只，實驗組和對照組各10只，0. 2ml/只，免疫后21日連同對照組小白鼠20只分別用IOLD5tl的DL15、JL08 強毒攻毒，觀察7日，三批疫苗免疫組小白鼠均100%獲得保護，對照組小白鼠均100%發病。三批水貂出血性肺炎二價滅活疫苗分別免疫2-10月齡的健康水貂，每批疫苗肌肉接種水貂10只，Iml/只，免疫后21日連同對照組水貂10只分別用含IOLD5tl的DL15、JL08 株強毒通過氣管內滴入攻毒(每個組別5只)，觀察7日，三批疫苗免疫組水貂均100%獲得保護，對照組水貂均100%發病。實施例5 本發明所述二價滅活疫苗對水貂的免疫保護期測定采用三批二價滅活疫苗進行免疫保護期測定。分為實驗組和對照組，實驗組分成六組，每組30只水貂，用本發明所述三批二價滅活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每只后肢內側肌肉注射ImL ；對照組分為六組，每組10只水貂，后肢內側肌肉注射生理鹽水對照 ImL,免疫后的第1 6個月每月用10倍量LD50的菌株JL08和菌株DL15分別攻毒(每批每株接種5只水貂)，分別測定疫苗對這兩種毒株的保護力。疫苗對水貂的免疫保護性折線圖如圖2所示，實驗結果表明，本發明所述二價滅活疫苗對水貂抗綠膿桿菌強毒菌株DL15 的保護期為6個月，免疫保護率在80%以上，對水貂抗綠膿桿菌強毒菌株JL08的保護期為 5個月，免疫保護率在80 %以上。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種銅綠假單胞菌菌株DL15，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3811。
2.—種銅綠假單胞菌菌株幾08，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3812。
3.由權利要求1和權利要求2所述銅綠假單胞菌菌株制備的水貂出血性肺炎疫苗。
4.如權利要求3所述的水貂出血性肺炎疫苗，其特征在于，所述疫苗為二價滅活疫苗。
5.一種水貂出血性肺炎二價滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟1 將銅綠假單胞菌菌株DL15和銅綠假單胞菌菌株幾08分別接種于PYG培養基培養，調整菌數為80-100億CFU/mL，按比例1_2 1混合； 步驟2 滅活步驟1所得混合培養物；步驟3 在步驟2所得培養物中添加防腐劑和佐劑，即得所述水貂出血性肺炎二價滅活疫苗。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1所述接種為按PYG培養基體積的 3% -4%接種菌株。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟1所述培養為在37°C通氣培養 12-15h。
8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2所述滅活為用終濃度0.15%的甲醛滅活。
9.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟3所述防腐劑為疊氮鈉。
10.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟3所述佐劑為氫氧化鋁膠溶液。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了兩種銅綠假單胞菌強毒菌株以及由該兩種菌株制備的水貂出血性肺炎二價滅活疫苗。將所述銅綠假單胞菌強毒菌株接種培養基通氣擴增培養，收獲培養物滅活后按1-2∶1比例混合，加佐劑制備水貂出血性肺炎二價滅活疫苗。本發明所述二價滅活疫苗用于預防水貂出血性肺炎免疫效果好，可獲得至少五個月的保護期，保護率在80％以上，可有效防止水貂出血性肺炎的發生，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K39/116GK102286391SQ201010203879
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月21日 優先權日2010年6月21日
發明者張海玲, 張蕾, 柴秀麗, 白雪, 羅國良, 趙建軍, 邵西群, 閆喜軍, 高晗 申請人:中國農業科學院特產研究所, 閆喜軍