專利名稱：一種復方益肝靈組合物在腫瘤化療輔助治療方面的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物的用途，具體涉及復方益肝靈組合物的新用途。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病。目前，惡性腫瘤的治療以化學療 法為主的綜合治療為主要手段。并在手術前后，化療亦被廣泛應用。然而，隨著化療藥物的 應用，人們對化療不良反應的認識和防護意識的不斷深入。對化療輔助藥物的研制及應用 有了強烈的社會需要，因其對改善化療效果、減輕化療不良反應從而提高惡性腫瘤患者生 存率或生存質量。但是，往往由于其價格昂貴，限制了其在臨床上的廣泛運用。因此尋找價 廉易得的中藥中作為腫瘤化療輔助藥物具有現實意義。復方益肝靈組合物是指水飛薊素30g與五仁醇浸膏80g，可制成片劑、膠囊或軟膠 囊。該組合物現用于肝腎陰虛，濕度未清引起的脅痛、納差、腹脹、腰酸乏力，尿黃；或慢性肝 炎轉氨酶增高者。水飛薊素中水飛薊賓能夠穩定肝細胞膜，保護肝細胞的酶系統，清除肝細 胞內的活性氧自由基，從而提高肝臟的解毒能力，避免肝細胞在長期接觸毒物、服用肝毒性 藥物、吸煙，飲酒等情況下受到損傷。水飛薊賓膠囊(水林佳)具有極佳的耐受性，具有直 接修復、穩定肝細胞膜，調節肝脂肪代謝，減輕有毒物質引起的脂質過氧化反應的作用，適 合于慢性肝炎及脂肪肝的長期治療。
發明內容
多藥耐藥腫瘤是腫瘤化療的主要障礙，因此需要尋找低毒副作用且逆轉效果確切 的多藥耐藥逆轉劑或化療增敏劑，來提高腫瘤化療的成功率。有學者以轉染人MDR1的人乳 腺癌耐藥細胞株MCF27/MDR1為模型，研究了 4種不同抗癌機制的化療藥物紫杉醇、長春新 堿、阿霉素和高三尖杉酯堿單獨應用或與五味子乙素聯合應用時對耐藥細胞的效果比較， 結果發現，五味子乙素對4種藥物均有增敏作用，說明其五味子乙素一種多藥耐藥逆轉劑。 并認為其機制可能是抑制了 P-糖蛋白泵的生物學活性，或與相關蛋白(caspase)的激活有 關。隨著人們對菊科水飛薊屬植物水飛薊及對木蘭科植物五味子基礎研究的深入，以 及化療輔助藥物臨床使用經驗的積累，復方益肝靈組合物在制備具有腫瘤化療輔助治療作 用藥物中的應用成為可能。本發明的目的在于公開復方益肝靈組合物制藥的新用途。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指對腫瘤的化療具有增效減毒的作用。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝靈組合物對化療藥物引起的骨 髓抑制有緩解作用。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝靈組合物對化療藥物引起的白 細胞減少癥有緩解作用。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝靈組合物對化療藥物引起的白細胞減少癥有緩解作用。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝靈組合物對化療藥物引起的肝 腎組織損傷有緩解作用，減輕肝、腎組織病理損傷，促進干細胞再生。所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝靈組合物對化療藥物引起的多 要耐藥具有增敏作用。本發明的突出技術特點在水飛薊素應用治療領域，人們對其治療肝纖維化、酒精肝的療效具有信心，五味 子常規作為保肝、中樞系統興奮、呼吸系統藥物使用，如《神農本草經》記載其功能藥證為 “主益氣，咳逆上氣，勞傷羸瘦，補不足，強陰，益男子精”，至今仍是指導中醫藥使用五味子 及其制劑的主要參考依據。而復方益肝靈組合物，用于肝腎陰虛，濕度未清引起的脅痛、納差、腹脹、腰酸乏 力，尿黃；或慢性肝炎轉氨酶增高者的功能主治，原該組合物制劑復方益肝靈膠囊的法定功 能主治限制了該組合物突出使用價值的認識，本發明克服了這種技術偏見。本發明中，五仁醇浸膏一方面與水飛薊素作用相協同，另一方面，發揮其逆轉多要 耐藥的獨特作用，因而使復方益肝靈組合物成為效果突出的腫瘤化療輔助藥物。本發明的復方益肝靈藥物組合物；可以被制成臨床可接受的劑型，包括但不限于 復方益肝靈膠囊、復方益肝靈片劑、復方益肝靈顆粒、復方益肝靈軟膠囊、復方益肝靈口服 液、復方益肝靈滴丸、復方益肝靈分散片等。以下用實驗說明但不限于本發明實驗例1 本實驗采用順鉬建立小鼠腎臟損害的動物模型，用以探究復方益肝靈組合物對化 療小鼠腎損害的影響。材料與方法實驗動物昆明種雄性小鼠，5周齡，體重(20. 16 士 0. 54) g,由廣東省實驗動物飼養 中心提供，清潔III級。昆明種雄性sl80荷瘤小鼠，5周齡，體重(20. 28士0. 43) g，由廣州 中醫藥大學新藥研究開發中心提供。實驗藥物復方益肝靈組合物干浸膏(每g含水飛薊素0. 15g與五仁醇浸膏0. 40g)(廣東羅 浮山國藥股份有限公司提供)。注射用順鉬10mg/瓶(國藥準字H37020524)。實驗設計所有實驗小鼠實驗前均采用隨機數字表隨機分組。S180荷瘤小鼠實驗前均同時 在身體相同部位(右腋下)接種等量sl80腫瘤細胞(106/只)，接種后24h開始給藥觀察， 7-10d作為一個療程。觀察復方益肝靈組合物干浸膏對小鼠腎損害的血清學及病理學指標的影響取100只小鼠隨機分為5組。分別為生理鹽水(空白對照)組、單用順鉬組、順鉬 加復方益肝靈組合物60、120、240mg kg—1組。空白對照組每只每日給予0. 3ml生理鹽水灌胃，共7天；單用順鉬組第1天給予順 鉬7mg kg"1腹腔注射1次，第2 7天各給予0. 3ml生理鹽水灌胃，qd ；順鉬加復方益肝 靈組合物各組第1天給予順鉬7mg kg"1腹腔注射1次，第1 7天按組分別給予60、120、240 mg kg"1復方益肝靈組合物灌胃。所有小鼠于第4天刺眼球取血0. 5ml，測血尿素氨(BUN)、血清肌酐(Cr)、N_乙 酰氨基葡糖苷酶(NAG)。于第8天將全部小鼠脫頸椎處死，立即解剖取腎，20%甲醛溶 液固定，共得腎臟標本100份作病理檢查。所有實驗數據經標準化處理后，用SASS13進行統計學分析，計算相應的t值，并比 較P值。結果按照注射生理鹽水到注射順鉬劑量漸增的順序，小鼠腎臟形態結構也出現相應的 改變。注射順鉬7mg kg—1的實驗組腎間質充血明顯，腎小管(尤其近曲小管)水變性明 顯，嚴重者出現腎小管點片狀壞死。順鉬劑量大于7mg -kg"1實驗組呈現典型腎小管片狀壞 死、腎小管內管型、管周炎性細胞浸潤。空白對照組為正常腎臟結構。順鉬加復方益肝靈3個劑量組，無論復方益肝靈劑 量大小，腎小管僅輕度水變性，在復方益肝靈10、30mg kg"1組分別有一例存在點狀壞死。 而單用順鉬組小鼠腎臟病變相對嚴重，全部出現較明顯的腎小管水變性，14例出現灶狀、片 狀腎小管出血壞死。各組生化指標改變見表 實驗例2 復方益肝靈對化療小鼠骨髓⑶34+造血干/祖細胞凋亡的影響。方法小鼠采用腹腔注射環磷酰胺(CTX)造模，分組處理，9天后處死。流式細胞 儀檢測骨髓CD34+細胞凋亡；RT-PCR法檢測其Cyt_C、bcl-2mRNA的表達。結果CTX組FITC+/PI-細胞比例較鹽水組明顯升高(P<0.05)；而高、中、低3個 劑量組及單純中藥組FITC~+/Pr-細胞比例明顯降低，與單純CTX組比較，差異有顯著性(P < 0. 01)。單純CTX組Cyt-CmlLNA表達較鹽水組升高(P < 0. 05)，而中、低2個劑量組及單 純中藥組表達較單純CTX組降低(P < 0. 05)；單純CTX組bCl-2mRNA表達較鹽水組減少； 而高、中、低3個劑量組及單純中藥組bel-2mRNA表達較單純CTX組明顯升高，差異有顯著 性(P < 0. 01)。
復方益肝靈對骨髓⑶34+細胞凋亡的影響 復方益肝靈對骨髓CD34+細胞Cyt-CmRNA、bcl_2mRNA的影響 結論復方益肝靈能有效抑制化療小鼠骨髓⑶34+造血干/祖細胞凋亡，上調 bcl-2mRNA表達可能是其機理之一。實驗例3 復方益肝靈組合物對環磷酰胺(Cy)抑制S 180生長的增效作用方法將18-21g昆明小鼠70只隨機分為7組，第1組作為正常組，另6組將S180 瘤細胞懸液接種于小鼠右前肢腋皮下制備荷瘤小鼠動物模型，分為復方益肝靈低、中、高劑 量組(eOmg.kg-^UOmg.kg-id^mg.kg-1)和環磷酰胺(Cy)組、腫瘤對照組及復方益肝靈 聯合Cy治療組，灌胃第7d接種S180瘤，第19d后測定小鼠肝勻漿中丙二醛(MDA)含量、谷 胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力，評價復方益肝靈對小鼠抗氧化能 力的作用，觀察治療前后體重、瘤重、抑瘤率。
采用逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測IL-2、TNF- a、TGF_ ^ lmRNA的表達，評 價復方益肝靈對小鼠免疫功能的影響。結果復方益肝靈各劑量組均能提高肝臟中GSH-Px活性和SOD活力，但復方益 肝靈高劑量組顯著降低MDA水平(P<0.01)。復方益肝靈各劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織內 TNF- a、IL-2mRNA相對表達量明顯高于Cy組和腫瘤對照組(P < 0. 01)，同時下調TGF-旦1 水平。復方益肝靈高劑量對小鼠S180瘤有明顯抑制作用，且與Cy合用后有協同作用，并 提高了小鼠的TNF-a、IL-2mRNA的表達。復方益肝靈對S180荷瘤小鼠的腫瘤重量和抑制率的影響(X士s，n = 10) 結論復方益肝靈的抑瘤機制可能主要是抗氧化作用和免疫調節作用，且作用與 劑量有關。 結果分析研究表明，復方益肝靈對腫瘤細胞無直接抑制作用，大多是通過提高宿 主的免疫功能而發揮作用。TNF-1和IL-2是宿主BRM(biological responsemodifiers, BRM)系統中具有抗腫瘤作用的細胞因子，具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。TNF-1在腫瘤機 體免疫功能中是非常重要的細胞因子，由單核一巨噬細胞產生，其可以直接殺傷腫瘤細胞， 如通過作用于胞膜磷脂酶、蛋白酶和核酸酶途徑殺傷腫瘤細胞；還可以通過間接途徑殺傷 腫瘤細胞，如阻斷腫瘤細胞血液供應，增加腫瘤血管內皮細胞的凝血活性，使血管內皮細胞 受損，以及抑制血管內皮細胞遷移等。IL-2是T細胞分泌的，是T細胞增殖的信號，可以促 進T細胞大量增殖，此外還可促使自然殺傷(NK)細胞的活化增殖，也可促使B細胞的增殖、 分化和合成抗體。因此，TNF-l、IL-2是目前公認的兩種重要的抗腫瘤作用細胞因子。本試 驗結果也表明酵母多糖不僅有明顯抗腫瘤作用，且在體內抗腫瘤有效劑量下，明顯增強荷 瘤小鼠腫瘤組織中TNF-1、IL-2mRNA的表達，這可能是復方益肝靈抗腫瘤作用的機制之一。
實驗例4 復方益肝靈組合物對環磷酰胺(Cy)抑制U14生長的增效作用取小鼠70只，雌性，19_24g，第1組作為正常組，其余分為復方益肝靈低、中、高劑 量組(eOmg.kg-^UOmg.kg-id^mg.kg-1)和環磷酰胺(Cy)組、腫瘤對照組及復方益肝靈 聯合Cy治療組，同實驗3接種U14瘤塊，治療第12d后處死小鼠，剝離瘤塊，清除周圍組織， 觀察治療前后體重、瘤重、抑瘤率。復方益肝靈對U14荷瘤小鼠的腫瘤重量和抑制率的影響(X士 s，n = 10) 實驗例5 復方益肝靈對放化療引起白細胞減少癥的影響55例患者中胃癌9例、食管癌5例、乳腺癌18例，宮頸癌4例、卵巢癌3例、結腸 癌7例、肺癌3例、肝癌2例，胰腺癌2例、膀胱癌2例。年齡最小45歲，最大71歲。術后 放化療者50例，非術后放化療者5例。全部病例隨機分為治療組30例和對照組25例。治療方法治療組復方益肝靈膠囊(廣東羅浮山國藥股份有限公司)每日3次， 每次4-6粒。對照組阿膠補血顆粒，每次10g，每日2次；維生素c片每次200mg，每日3次； 維生素B6片每次20mg，每日3次。均口服。每周1次復查血常規。治療2周為1療程。治療結果治療組16例白細胞總數大/于4*109/L，8例大于3. 5*109/L ；總有效 率80% ；對照組13例白細胞總數大/于4*109/L，4例大于3. 5*109/L ；總有效率68%。實驗例6復方益肝靈逆轉肝癌細胞耐藥的初步研究方法應用MTT法測定應用復方益肝靈前后5-氟尿嘧啶(5_Fu)對Bel/Fu耐藥細 胞株的IC50，計算其逆轉倍數；濃度依賴試驗確定復方益肝靈逆轉濃度；耐藥性的集落形 成實驗初步確定復方益肝靈逆轉Bel/Fu的作用。結果復方益肝靈對Bel/Fu細胞IC50，是 2040 u g/mL,其濃度為490 u g/mL時對細胞無明顯的殺傷作用，與抗癌藥物5_Fu有協同作用，⑶I為0. 89。集落形成實驗從形態上證實復方益肝靈逆轉MDR作用，隨復方益肝靈濃度 的加大集落逐漸變小。結論復方益肝靈對肝癌耐藥細胞株Bel/Fu細胞多藥耐藥有逆轉作 用。實驗步驟1、肝癌細胞株Bel/Fu復蘇、培養、傳代和凍存從液氮中取出凍存細胞，立即置于42°C水溶液中，使細胞快速解凍，室溫1000r/ min離心5min，棄上清，加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，移至培養瓶中， 37°C,5% C02孵箱中培養，以后每2 3d換1次培養液，待細胞長滿后傳代。當細胞長滿 后，傾去培養液，加入0. 25%胰酶消化適當時間后，棄去消化液，加入RPMI1640培養液，用 吸管反復吹打，使其成單個細胞懸液，即可繼續傳代培養或將細胞加入凍存管中置于液氮 中凍存備用。2、復方益肝靈IC50測定用0. 25%胰酶消化處于對數生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養 液配成單細胞懸液，3X 10細胞/mL，接種于96孔培養板中，每孔體積200，待細胞貼壁 后，每孔加入5uLBCDC，藥物終濃度分別為50、100、200、300、400、800ii g/mL，每個濃度3 個孔，同時設不加藥對照孔、培養液空白孔、對照孔各3孔，37°C、5%°C培養4d后，每孔 加入50 u lMTT(5mg/mL)，繼續培養4h后，移去上清并用吸水紙吸于培養液，每孔再加入 150 u LDMS0,振蕩至結晶完全溶解后，用酶標儀測定490nm的A值。3、復方益肝靈逆轉Bel/Fu耐藥性的濃度依賴實驗用0. 25%胰酶消化處于對數生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液 配成單細胞懸液，3 X 10細胞/mE，接種于96孔培養板中，每孔體積200，待細胞貼壁后，每孔 加藥。實驗分組如下復方益肝靈組加5 u L復方益肝靈，使其終濃度為400、420、440、450、 460、480、490、500g/mL，共8個組；復方益肝靈+5_Fu組加5 u 1復方益肝靈，使其終濃度為 320、340、360、380、400、460、490、540 ii g/mL，共 8 個組，每組每孔均加入 5 iU5-Fu (終濃度 為0. 02pg/mL)；細胞對照組不加藥物。5-Fu組每孔僅75 u l_Fu (終濃度為0. 02pg/mL)。 同時設培養液空白對照。所有實驗各設3個平行孔，37°C、5% cOz培養4d后，每孔加入 50MTT (lmg/mL)，繼續培養4h后，移去上清并用吸水紙吸干培養液，每孔再加入150gLDMS0， 振蕩至結晶完全溶解后，用酶標儀測定490nm的A值。結果細胞對照組與5-Fu組比無顯著差異，證明為5-Fu耐藥細胞株；400 490 u g/mL復方益肝靈與細胞對照組比無差異，沒顯示抑瘤作用，但500 u g/mL與細胞對照 組比有差異，表現出抑瘤作用；5-Fu+復方益肝靈490、500 u g/mL與5_Fu組比有顯著差異。
具體實施例方式實施例1 復方益肝靈膠囊，每粒裝0.2g每粒含水飛薊素以水飛薊賓計為標示含 量21mg的90% -110%，含五仁醇浸膏以五味子乙素計不少于0.6mg。用于腫瘤化療藥物 的輔助治療，每次4粒。一日3次，飯后服用。實施例2 復方益肝靈膠囊，每粒裝0. 2g每粒含水飛薊素以水飛薊賓計為標示含 量21mg的90% -110%，含五仁醇浸膏以五味子乙素計不少于0.6mg。用于腫瘤化療引起 的白細胞減少癥，每次4粒。一日3次，飯后服用。
實施例3 復方益肝靈膠囊，每粒裝0. 2g每粒含水飛薊素以水飛薊賓計為標示含 量21mg的90% -110%，含五仁醇浸膏以五味子乙素計不少于0.6mg。用于腫瘤化療引起 的肝腎組織損傷，每次4粒。一日3次，飯后服用。實施例4 復方益肝靈膠囊，每粒裝0. 2g每粒含水飛薊素以水飛薊賓計為標示含 量21mg的90% -110%，含五仁醇浸膏以五味子乙素計不少于0.6mg。用于腫瘤化療引起 的骨髓抑制，每次4粒。一日3次，飯后服用。實施例5 復方益肝靈膠囊，每粒裝0. 2g每粒含水飛薊素以水飛薊賓計為標示含 量21mg的90% -110%，含五仁醇浸膏以五味子乙素計不少于0. 6mg。用于肝癌、乳腺癌 化療耐藥的逆轉，藥物增敏，每次4-6粒。一日3次，飯后服用。
權利要求
復方益肝靈組合物在制備具有腫瘤化療輔助治療作用藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指對腫瘤的 化療具有增效減毒的作用。
3.根據權利要求1所述的應用，其中所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝 靈組合物對化療藥物引起的骨髓抑制有緩解作用。
4.根據權利要求1所述的應用，其中所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝 靈組合物對化療藥物引起的白細胞減少癥有緩解作用。
5.根據權利要求1所述的應用，其中所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝 靈組合物對化療藥物引起的肝、腎組織損傷有緩解作用，減輕肝、腎組織病理損傷，促進干 細胞再生。
6.根據權利要求1所述的應用，其中所述具有腫瘤放化療輔助治療作用是指復方益肝 靈組合物對化療藥物引起的多要耐藥具有增敏作用。
全文摘要
本發明公開了一種復方益肝靈組合物在腫瘤化療輔助治療方面的用途。所述作用是指對腫瘤的化療具有增效減毒的作用、對化療藥物引起的骨髓抑制有緩解作用、對化療藥物引起的白細胞減少癥有緩解作用、減輕肝、腎組織病理損傷，促進干細胞再生、對化療藥物引起的多要耐藥具有增敏作用。
文檔編號A61P13/12GK101856393SQ20101020230
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月6日 優先權日2010年6月6日
發明者宋春光, 廖志鐘, 林秀連 申請人:林秀連