Leachii支原體中國分離株及其分離培養基和用途的制作方法

專利名稱：Leachii支原體中國分離株及其分離培養基和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株支原體(Mycoplasma)分離株，尤其涉及Leachii支原體中國分離 株以及適合于該分離株分離和傳代培養的培養基，本發明還涉及該分離株在研制防制或檢 測由Leachii支原體所致疾病的生物制品中的用途，屬于支原體的分離和應用領域。
背景技術：
支原體(Mycoplasma)是一類缺乏細胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無 生命培養基中生長繁殖的最小原核細胞型微生物。支原體于1898年由Nocard等首次 分離，1956年正式命名為支原體，在微生物分類中建立了一個新的獨立的綱-柔膜體綱 (Mollicutes)，并成為一門獨立的學科，即支原體學。支原體在分類上屬于柔壁菌門(Tenericutes)，柔膜體綱(Mollicutes)，支原體 目(Mycoplasmatales)，支原體科(Mycoplasmataceae)成員。支原體科包含4個屬，即支原 體屬(Mycoplasma),附紅細胞體屬(Eperythrozoon),血巴爾通體屬(Haemobartonella)禾口 脲原體屬(Ureaplasma)。支原體屬包含絲狀支原體族(Mycoplasma mycoides)等共約119 種支原體。在以前的分類中，絲狀支原體族包含2個群，分別為絲狀支原體群 (M. mycoidesgroup)和山羊支原體群(M. capricolum group)。絲狀支原體群包含絲狀支 原體絲狀亞種小菌落型(M. mycoides subsp. mycoides Small Colony，MmmSC)、絲狀支原體 絲狀亞種大菌落型(M. mycoides subsp. mycoides Large Colony, MmmLC)禾口絲狀支原體山 羊亞種(M. mycoides subsp. capricolum, Mmc) 3個種；山羊支原體群包含山羊支原體山羊 亞禾中(M. capricolum subsp. capricolum, Mcc)、山羊支原體山羊月市炎亞禾中(M. capricolum subsp. capripneumoniae,Mccp)禾口牛 7 型支原體(Mycoplasma sp. bovine group 7,MBG7) 3 個種。由于在分析MBG7與絲狀支原體族中其他5個種的關系時，用不同的方法得出相互矛 盾的結果。16S rRNA基因序列同源性分析、血清學交叉反應試驗以及一維和二維SDS-PAGE 蛋白特性分析結果顯示，MBG7與山羊支原體的關系更近，尤其是16S rRNA基因序列同源 性分析結果顯示，MBG7與山羊支原體之間具有高度同源性，MBG7菌株PG50和Mcc菌株 California kid的16SrRNA基因序列僅有4個核苷酸變異。但是，DNA雜交試驗以及LppA 基因、gtsABS基因和rpoB基因的序列同源性分析卻顯示，MBG7與MmmSC具有非常近的進 化關系。由于血清學試驗顯示MBG7與Mcc的關系更近，所以以往的研究一直將MBG7作為 一個獨立的種隸屬于山羊支原體群。2009年，Manso-Silvan L等提出絲狀支原體新的分類 方法，將絲狀支原體分成3個群，包括絲狀支原體群、山羊支原體群及Leachii支原體新種 群(Mycoplasma Leachii sp. nov.)。絲狀支原體群包括MmmSC和Mmc 2個種，由于MmmLC 與Mmc的親緣關系非常近，所以將MmmLC作為Mmc的一個血清型歸屬于Mmc ；山羊支原體群 包括Mcc和Mccp 2個種；Leachii支原體新種群包含1個種，即MBG7，新的命名為Leachii 支原體新種(Mycoplasma leachii sp. nov. ) 0這樣，新的命名分類將絲狀支原體分成3個 群、5個種。
Leachii支原體最初是由Simmons G C等于1963年在澳大利亞患多發性關節炎犢 牛的關節液內分離獲得，典型代表菌株為PG50。之后，該病原菌陸續從患乳房炎的母牛、患 關節炎和肺炎的犢牛以及流產胎兒的體內獲得分離。目前全世界大約有60個Leachii支 原體分離株，除6株分離于德國、葡萄牙、尼日利亞和法國外，其余所有菌株均分離自澳大 利亞。Simmons G C等通過關節內注射Leachii支原體分離培養物能夠復制出犢牛的多 發性關節炎，Cormole M D等通過乳頭管內灌注Leachii支原體能夠復制出輕度乳房炎，證 明Leachii支原體能夠直接引起犢牛多發性關節炎和泌乳母牛乳房炎。盡管Leachii支原 體也從患肺炎犢牛和流產胎兒的體內分離獲得，但是其能否直接引起犢牛肺炎和懷孕母牛 流產的致病性試驗還未見報道。有關Leachii支原體的致病性，目前的研究認為，Leachii 支原體能夠直接引起犢牛關節炎以及泌乳母牛乳房炎，與犢牛肺炎及母牛流產有關。Leachii支原體的確切來源以及傳播途徑目前尚不清楚。Alexander及Hum等認 為，犢牛關節炎可能是由于飼喂被Leachii支原體污染的乳汁而引起。本發明人通過大量 的調查結果顯示，同一批精液配種母牛生產的犢牛多發性關節炎的發生率為100%，而另外 來源精液配種的母牛所產的犢牛則不發生這種多發性關節炎。據此認為精液傳播至少是本 病的傳播途徑之一。有的犢牛在出生時關節即腫大，這一點也佐證了精液傳播的可能性。本 發明人對該發病牛場進行追蹤性流行病學調查，對患有嚴重乳房炎的母牛采集鼻拭子、乳 汁樣品及乳房破潰面拭子，在這些樣品中均檢測并分離出Leachii支原體。因此推測，該病 的垂直傳播途徑為精液傳播，水平傳播途徑主要是在犢牛出生時經臍帶創口直接接觸而感
^fe ο迄今為止，在中國尚未分離得到Leachii支原體分離株，因此，分離獲得一株 Leachii支原體中國分離株，這對于研究Leachii支原體的傳播途徑以及研制預防或治療 由Leachii支原體所致疾病的生物制品具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的之一是提供一株Leachii支原體中國分離株；本發明目的之二是提供一種適合于該Leachii支原體中國分離株的分離和傳代
培養的培養基；本發明目的之三是將所分離的Leachii支原體中國分離株應用于預防或治療由 Leachii支原體所致的疾病。本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的一株Leachii支原體(Mycoplasma)中國分離株(GN408)，其微生物保藏號是 CGMCC No. 3808 ；分類命名是Mycoplasma Leachii ；保藏時間是2010年5月6日；保藏單 位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區北辰 西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。2009年2月 6月，中國北方一奶牛場300余頭母犢牛全部發生嚴重的多發性關 節炎，大部分在出生3 5天后發病，少數在出生時關節即腫大。發病初期，犢牛呈現輕微 的四肢僵硬和跛行，發病2 3天后病情迅速惡化，腕關節和跗關節迅速腫大，內有積液，觸 摸有波動感，后期關節腔內產生大量干酪樣纖維素性滲出物，填充整個關節腔，觸摸有實質
4感，常規抗生素治療沒有效果。部分犢牛因多種并發癥而死亡，沒有死亡的犢牛由于造成了 關節的永久損傷、肢體變形，導致臥地不起和生長遲緩，最終被淘汰。為鑒定病原，本發明人 無菌采集2份早期發病并具有典型癥狀犢牛的關節液樣品，經常規細菌學檢查，均為陰性。 然后將病料直接接種于支原體液體培養基，待顏色變黃后將培養物接種下一代。原始樣品 接種在液體培養基上，2 3天培養基開始變黃，傳至2 3代10倍稀釋接種24h后開始變 黃，并呈輕微渾濁狀。之后轉到固體培養基上培養，48h開始出現針尖大小的菌落，至96h在 普通光學顯微鏡下可看到圓形、邊緣整齊、具有典型的“油煎蛋”形態的菌落(圖1)。將在 固體瓊脂培養基上生長的單菌落經3次克隆進行純化，作為后續鑒定及其它研究的菌種。 根據分離培養物的培養特性以及在固體瓊脂培養基上形成的典型菌落形態特征，初步確定 本發明從患病犢牛關節液中分離的病原為支原體。本發明從患病犢牛關節液中分離的病原純培養物經負染在電子顯微鏡下觀察，可 見典型的支原體菌體，呈棒狀、絲狀等多形性形態。對本發明從患病犢牛關節液中分離的病原培養物進行16S rRNA基因和LppA基因 的PCR擴增，結果均擴增出與預期大小相符的目的條帶，16S rRNA基因約為1.5kb (圖4)， LppA基因約為1. 4kb (圖5)。由于擴增LppA基因的引物是Leachii支原體特異性引物， 該引物能夠對分離菌株進行特異性擴增，由此確定本發明所分離的支原體為Leachii支原 體。生化試驗結果顯示，本發明從患病犢牛關節液中分離的病原能發酵葡萄糖、需要 膽固醇、不水解精氨酸、不分解尿素，這些結果也均符合Leachii支原體的特征。為進一步確定本研究分離菌株與其它支原體的親緣關系，對分離株的16S rRNA基 因和LppA基因進行遺傳進化分析。結果顯示，就16S rRNA基因而言，本發明分離株(GN408) 與絲狀支原體族中的成員親緣關系較近(圖6)，同源性介于97. 4% 99. 9%之間，與其中 的Leachii支原體代表株PG50和山羊支原體山羊亞種(Mcc)同源性最高，達99. 9% ；與絲 狀支原體絲狀亞種大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，為97. 4%。就LppA基因而言，本發 明支原體分離株也與PG50的親緣關系最近(圖7)，同源性高達99. 6%，而與絲狀支原體 族中其它成員的同源性在56. 3% 95. 之間；與絲狀支原體絲狀亞種小菌落型(MmmSC) 菌株的親緣關系較近，同源性為95. 1%，而與其他幾種支原體的親緣關系則較遠，同源性在 56. 3% 69. 6%之間。序列分析結果確定，本發明所分離的支原體與最初分離的澳大利亞 Leachii支原體具有非常近的進化關系，屬于同一來源。現有技術中，常用于支原體的分離及傳代培養的培養基多為改良Hayflick培養 基(配方1)，其配方組成見表1。用該培養基分離和傳代培養Leachii支原體多存在培養 周期長、生產成本高等缺陷，有待改進。為此，本發明人對改良Hayflick培養基的組成和 用量進行了優化和篩選，在培養基中添加了終濃度為0. 4%的丙酮酸鈉，將馬血清的濃度由 20%降為15%，得到了改進后的配方(配方2)。改進后的配方組成為按g/ml計，PPLO肉湯2. 1%，水解乳蛋白0. 5%，葡萄糖 1 %，酵母浸出物0. 5%，醋酸鉈0. 01 %，青霉素0. 01 %，酚紅0. 002%，胸腺DNA 0. 002%， β NAD 0.009%，丙酮酸鈉0.4%，馬血清15%，余量為水。本發明將本發明所分離的支原體菌株(GN408)同時以相同濃度接種兩種不同的 培養基，進行傳代培養，不同時間收獲培養物，對每個收獲樣品測定ecu。試驗結果顯示，配方1達到最高滴度時的C⑶為1 X 10_8，而配方2達到最高滴度時的C⑶為1 X 10_9 (圖2)； 并且配方2的傳代培養物達到最高滴度所需的時間比較短，這在實際應用過程中可以大大 縮短培養周期，從而降低生產成本。本發明也對不同的馬血清濃度進行了摸索，結果顯示， 在其他條件不變的情況下，馬血清的最小添加量為15%，所以改進的培養基減少了馬血清 的含量，不但可以降低生產成本，而且還可以降低在疫苗應用過程中可能出現的副作用。致病性試驗結果表明，本發明支原體分離株的傳代培養物關節內接種1 2月齡 健康犢牛，可復制出典型的多發性關節炎，并能引起一定的死亡，死亡犢牛具有明顯的全身 癥狀，多組織器官具有明顯的病理變化。結合臨床發病和人工感染犢牛的臨床癥狀和病理 變化、疾病的流行特點、隨后的追蹤性流行病學調查以及分離病原的特異性PCR鑒定和遺 傳進化分析，認定引起該次疫情的病原為Leachii支原體。


圖1普通光學顯微鏡下可看到菌落呈圓形，邊緣整齊，大小不一，典型的“油煎蛋” 形態(40X)。圖2同一菌株以相同濃度接種不同培養基的生長曲線。圖3分離菌株不同濃度接種相同培養基的一步生長曲線。圖4關節液原始樣品及純培養物16S rRNA基因PCR擴增結果；1 :GN407原始樣品； 2 :GN408 原始樣品；3 :GN407 純培養物；4 :GN408 純培養物；M :250bp DNA Iaddermarker0圖5關節液原始樣品及純培養物LppA基因PCR擴增結果；M :250bp DNA Iaddermarker ；1 :GN407原始樣品；2 :GN408原始樣品；3 :GN407純培養物；4 :GN408純培養 物·圖6GN407和GN40816S rRNA基因的遺傳進化分析。圖7GN407和GN408 LppA基因的遺傳進化分析。圖8分離培養物的電子顯微鏡形態學觀察。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例一、試驗材料和方法1.樣品來源2009年2月 6月，中國北方一奶牛場300余頭母犢牛全部發生嚴重的多發性關 節炎，從中無菌采集了 2份早期發病并具有典型癥狀的犢牛的關節液，_70°C凍存備用。2.試驗材料DNA凝膠回收試劑盒，柱式小量組織/細胞基因組DNA抽提試劑盒；Ex Taq DNA聚 合酶；Hyclone供體馬血清；PPLO肉湯(BD-Difco)；酵母浸液(BD-Bacto)；實驗中所用其它 化學試劑均為分析純級別。
3.主要儀器設備各種規格移液器及5415R、5810R高速臺式低溫離心機(德國印pendorf公司)； MC0-15AC 二氧化碳培養箱、MDF-U32V超低溫冰箱(日本SANYO公司)；1X51倒置顯微鏡 (OLYMPUS公司)；生物二級安全柜(美國LABC0NC0公司)；DK-8D電熱恒溫水槽(上海精 宏)；空氣浴恒溫搖床(KYC 100B，上海福瑪實驗設備有限公司)；旋渦混合器(QL-901，江 蘇海門麒麟醫用儀器廠)；PCR儀(MyCycler 型，美國Bio-Rad公司)；GIS-2020全自動凝 膠成像系統(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新鄉豫新航空低溫容器)；ASTA⑶S小型超純 水儀(德國MEMBRAPURE公司)。4.常規細菌學檢查將無菌采集的關節液樣品直接接種在普通肉湯、腦心浸湯、厭氧肉肝湯、血瓊脂培 養基上，均置于37°C培養箱內培養，2 3天后觀察生長情況。5.支原體分離培養(1)支原體培養基成份溶液I 基礎肉湯乳清蛋白水解物，5g ；PPLO肉湯，21g ；溶于700ml超純水，調pH 7. 8，高壓滅菌4°C保存備用。溶液II 50% (W/V)葡萄糖溶液，過濾除菌4°C保存備用。溶液III 5% (W/V)酵母浸液，過濾除菌4°C保存備用。溶液IV 5% (W/V)醋酸鉈溶液，過濾除菌_20°C保存備用。溶液V :100mg/ml青霉素，過濾除菌，_20°C保存備用。溶液VI 酚紅溶液Ig酚紅置于研缽中，慢慢滴加0. 025mol/L NaOH溶液，邊加 邊研磨，直到完全溶解，將溶液傾入IOOmL量瓶中，以超純水洗滌研缽數次，洗滌液均傾入 量瓶內，加水到100mL，116°C 20min高壓滅菌，4°C保存備用。溶液Vn 0.2%小牛胸腺DNA，現用現配，無菌操作。溶液VDI 0.9% β NAD，現用現配，無菌操作。溶液IX :50%丙酮酸鈉溶液，過濾除菌，4°C保存備用。馬血清。(2)支原體培養基配方配方 1 改良 Hayflick 培養基配方見表 1。(PPLO(pleuropneumoniae-likeorgan isms)，胸膜肺炎類微生物)。表 1 配方2本發明對改良Hayflick培養基進行改進，添加了終濃度為0.4%的丙酮酸鈉，馬血清的濃度降為15%，其配方見表2。
表2 L0060」 在基礎肉湯中添加約1. 4%的瓊脂糖，高壓滅菌后冷卻至60°C左右再添加液體培 養基的其他成份，制備成含瓊脂糖的固體培養基，倒平板，待冷卻后置4°C保存備用。(3)支原體分離培養將無菌采集的關節液樣品直接接種到液體培養基內，置37°C培養箱內靜置培養， 待培養基顏色變黃后將培養物接種下一代。將穩定傳代的培養物接種到支原體固體培養基 上，置37°C含有5% CO2的培養箱內培養，2 3天后在固體培養基上肉眼可見針尖大小的 菌落，在普通光學顯微鏡下呈現支原體菌落典型的“油煎蛋”形態。挑取1個單菌落克隆3 次進行純化。6.顏色變化單位(CXU)的測定將液體培養基分裝于小管中，每管0. 9ml，于第1管加備檢液0. 1ml，吹吸混勻后取 0. Iml至第2管，依次作10倍梯度稀釋8 10管，最后1管不加被檢液作為陰性對照。置 37°C溫箱孵育，以培養基不發生顏色改變為陰性，發生顏色改變的最后一管的稀釋倍數即 為 CCU。7. PCR 檢測(1)引物設計針對支原體16S rRNA基因全長序列(U26053. 1)設計一對引
8物(16S-U 5 ‘ AAAATGAGAGTTTGATCCTGG 3 ‘和 16S-L 5 ‘ AGAAAGGAGGTGATCCATCCG 3')，用于16S rRNA基因全序列的擴增。應用Frey等研究設計的針對LppA基因的 Leachii 支原體特異性引物(P67BG7-L 5 ‘ GGTAATTCGAATAATGATCCT 3 ‘和 P67BG7-R 5 ‘ TAAGTTTATTGAATTAAAGCG3 ‘)對LppA基因全序列進行擴增。引物均由上海生物工程技 術服務有限公司合成。(2) DNA提取應用上海華舜生物工程公司的柱式小量組織/細胞基因組DNA抽提 試劑盒提取病料或純培養物的DNA，操作按說明書進行，簡述如下a.取待檢測樣品或純培養物300 μ 1，加入200 μ 1 DS液和25 μ 1 proteinase K， 溫和地來回顛倒離心管徹底混勻，置50°C溫育lOmin，期間來回顛倒離心管數次；b.加入200 μ 1 DLT液和8ul RNase Α,迅速來回顛倒離心管徹底混勻，置65°C溫 育15min，期間來回顛倒離心管數次，12000Xg離心2min，將上清全部移入干凈的離心管 中；c.加入200μ 1無水乙醇，混勻后全部移入吸附柱中，9000Xg離心30S，倒掉收集 管內液體，將吸附柱放回收集管中；d.加入500μ1 WGP液，靜置lmin，9000Xg離心30S，倒掉收集管內液體，將吸附
柱放回收集管中；e.加入500 μ 1 WGP液，9000Xg離心30S，倒掉收集管內液體，將吸附柱放回收集
管中；f.空柱離心 Imin ；g.將吸附柱移入一個新的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入50 μ 1 65°C預熱的 超純水，靜置5min，9000Xg離心2min，將DNA輕微混勻后，_20°C保存備用。(3)PCR 擴增25μ1 反應體系水 16μ1，Ex-Taq Buffer 2. 5μ 1, dNTPs (2. 5mM)2y 1，上、下游引物(10ρΜ/μ 1)各 1· 5 μ 1，Ex-Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ 1，DNA 模板 2. 5 μ 1。反應條件為94°C 預變性 4min，94°C 45S，55°C 45S，72°C 1. 5min 30 個循環， 最后72°C延伸lOmin。16S rRNA基因預計擴增片段長度約為1. 5kb，LppA基因預計擴增片 段長度約為1.4kb。8.序列測定與分析PCR擴增產物用上海華舜生物工程公司生產的凝膠回收試劑盒回收純化，純化產 物直接送上海生物工程公司進行測序，用MegAlign軟件將測序結果與國際已知菌株的相 應基因序列進行比對分析。9.生化實驗使用北京陸橋技術有限責任公司生產的生化鑒定管對純培養物進行生化指標鑒 定，按說明書進行操作，主要步驟如下(1)實驗準備從包裝盒中取出安瓿瓶，朝易折點(瓶頸上方藍點)反方向用力折 開安瓿瓶，插入安瓿瓶架中；(2)接種方法用接種針從平板上挑取已分離的單一菌落分別接種于需要試驗的 安瓿瓶中；(3)培養及判定將接種好的安瓿瓶置適宜溫度下培養，培養24 48h觀察結果， 按說明書的判定標準進行判定。
10.電鏡觀察取Iml本發明所分離的純培養物，12000r/min離心10分鐘，棄去上清液。用 50 μ IPBS緩沖液(ρΗ7. 4)重懸沉淀，取混懸液一滴滴在蠟板上，將200目有膜的銅網翻扣插 入懸液中，靜置20min。用濾紙吸干銅網周圍水分，用2%磷鎢酸(pH7. 0)固定2 5min，將 載樣銅網進行電子顯微鏡觀察。11.犢牛接種4頭1月齡健康犢牛，分別編號為1 4號。1、2號牛左趾關節和左腕關節內接種 Iml本發明所分離的支原體培養物；3、4號牛左趾關節和左腕關節內接種Iml支原體液體培 養基(表3)。4頭犢牛飼養在同一個牛舍內，接種后逐日觀察每頭犢牛身體狀況。(接種分 離株的CCU為1 X IO"8)。表3接種犢牛分組 二、試驗結果(一)支原體分離培養1、支原體的分離及傳代培養2009年2月 6月，中國北方一奶牛場300余頭母犢牛全部發生嚴重的多發性關 節炎，大部分在出生3 5天后發病，少數在出生時關節即腫大。發病初期，犢牛呈現輕微 的四肢僵硬和跛行，發病2 3天后病情迅速惡化，腕關節和跗關節迅速腫大，內有積液，觸 摸有波動感，后期關節腔內產生大量干酪樣纖維素性滲出物，填充整個關節腔，觸摸有實質 感，常規抗生素治療沒有效果。部分犢牛因多種并發癥而死亡，沒有死亡的犢牛由于造成了 關節的永久損傷、肢體變形，導致臥地不起和生長遲緩，最終被淘汰。為鑒定病原，本發明無菌采集2份早期發病并具有典型癥狀犢牛的關節液樣品， 經常規細菌學檢查，均為陰性。然后將病料直接接種于支原體液體培養基，待顏色變黃后將 培養物接種下一代。原始樣品接種在液體培養基上，2 3天培養基開始變黃，傳至2 3 代10倍稀釋接種24h后開始變黃，并呈輕微渾濁狀。之后轉到固體培養基上培養，48h開始 出現針尖大小的菌落，至96h在普通光學顯微鏡下可看到圓形、邊緣整齊、具有典型的“油 煎蛋”形態的菌落(圖1)。將在固體瓊脂培養基上生長的單菌落經3次克隆進行純化，作 為后續鑒定及其它研究的菌種。根據分離培養物的培養特性以及在固體瓊脂培養基上形成 的典型菌落形態特征，初步確定本發明從患病犢牛關節液中分離的病原為支原體。2、本發明改進的培養基配方對Leachii支原體培養的影響配方1(改良Hayflick培養基配方)和配方2 (本發明改進的培養基配方)均可以 用于支原體的分離及傳代培養。為了比較兩種培養基之間的差別，本試驗將本發明所分離 得支原體菌株(GN408)同時以相同濃度接種兩種不同的培養基，進行傳代培養，不同時間 收獲培養物，對每個收獲樣品測定(XU。結果顯示，配方1達到最高滴度時的C⑶為IX 10_8，而配方2達到最高滴度時的C⑶為1 X ΙΟ"9 (圖2)；并且配方2的傳代培養物達到最高滴度 所需的時間比較短，這在實際應用過程中可以大大縮短培養周期，從而降低生產成本。本研 究也對不同的馬血清濃度進行了摸索，結果顯示，在其他條件不變的情況下，馬血清的最小 添加量為15%，所以改進的培養基減少了馬血清的含量不但可以降低生產成本，而且還可 以降低在疫苗應用過程中可能出現的副作用。( 二)分離菌株的培養特性為確定本發明分離的支原體的體外培養特性，將已經適應傳代的分離菌株分別以 1 X 106(XU、1 X IO5CCU和1 X IO4CCU的濃度接種液體培養基。結果顯示，適應傳代的分離菌 株在液體培養基中達到最高生長滴度時的c⑶為IX10Λ初始接種濃度越低，達到最高 滴度的速度就越慢，并且最高滴度的維持時間也越短，但不同接種濃度均能夠達到CCU為 1X10_9的生長滴度(圖3)。(三)分離物的鑒定1、PCR 鑒定對關節液病料及其純培養物進行16S rRNA基因和LppA基因的PCR擴增，結果 均擴增出與預期大小相符的目的條帶，16S rRNA基因約為1.5kb (圖4)，LppA基因約為 1.4kb (圖5)。由于擴增LppA基因的引物是Leachii支原體特異性引物，該引物能夠對分 離菌株進行特異性擴增，由此確定本發明分離的支原體為Leachii支原體。2、序列分析為進一步確定本發明分離菌株(GN408)與其他支原體的親緣關系，對分離株的 16S rRNA基因和LppA基因進行遺傳進化分析。結果顯示，就16S rRNA基因而言，本發明 分離菌株(GN408)與絲狀支原體族中的成員親緣關系較近(圖6)，同源性介于97. 4% 99. 9%之間，與其中的Leachii支原體代表株PG50和山羊支原體山羊亞種(Mcc)同源性最 高，達99. 9% ；與絲狀支原體絲狀亞種大菌落型菌株(MmmLC)同源性最低，為97. 4%。就 LppA基因而言，本發明分離菌株(GN408)與PG50的親緣關系最近(圖7)，同源性達99. 6%, 與絲狀支原體族中其它成員的同源性在56. 3% 95. 之間，與其中的絲狀支原體絲狀 亞種小菌落型(MmmSC)菌株的親緣關系較近，同源性為95. 1 %，而與其他幾種支原體的親 緣關系則較遠，同源性在56. 3% 69. 6%之間。序列分析結果確定，本發明所分離的支原 體與最初分離與澳大利亞的Leachii支原體具有非常近的進化關系。3、生化實驗生化試驗結果顯示，本發明分離株(GN408)能發酵葡萄糖、需要膽固醇、不水解精 氨酸、不分解尿素，這些結果均符合Leachii支原體的特征。4、電鏡觀察純培養物經負染在電子顯微鏡下觀察，可見典型的支原體菌體，呈棒狀、絲狀等多 形性形態(圖8)。(四)致病性試驗關節內接種支原體分離物的2頭犢牛先后發生了多發性關節炎，并伴有體溫升高 (39. 8°C )、呼吸困難及食欲減退等癥狀。行走呈緩慢姿態，強行驅趕時出現跛行癥狀。到病 程后期1、2號犢牛不能自行站立，機體極度消瘦，四肢所有關節全部明顯腫脹，腕關節和跗 關節最嚴重。其中2號犢牛于接種后第21天死亡。關節內接種支原體培養基的犢牛(即3、4號犢牛)在接種后均未發生多發性關節炎及其它臨床病理變化，至試驗結束(接種1個 月后)健康狀況一直良好。對死亡犢牛進行剖檢，關節腔內有半透明狀關節積液，腔內充滿 大量的干酪樣纖維素性滲出物，關節滑膜囊腫。肺臟、肝臟、脾臟以及腎臟也具有明顯的病 理變化。在無菌采集的關節液中再次檢測并分離到Leachii支原體，再次分離菌株的16S rRNA基因和LppA基因的核苷酸序列與接種株的同源性為100%。
權利要求
一株Leachii支原體(Mycoplasma)中國分離株，其微生物保藏號是CGMCCNo.3808。
2.用于分離或傳代培養權利要求1所述Leachii支原體中國分離株的培養基，包 括按g/ml計，胸膜肺炎類微生物肉湯2. 1%，水解乳蛋白0. 5%，葡萄糖1%，酵母浸出物 0. 5%，醋酸鉈 0. 01%，青霉素 0. 01%，酚紅0. 002%，胸腺 DNA 0. 002%, β-NADO. 009%，丙 酮酸鈉0.4%，馬血清15%，余量為水。
3.權利要求1所述Leachii支原體中國分離株在制備預防或治療由Leachii支原體所 引起的疾病的生物制品中的用途。
4.權利要求1所述Leachii支原體中國分離株在制備診斷或檢測由Leachii支原體所 引起的疾病的試劑中的用途。
5.按照權利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的由Leachii支原體所引起的 疾病包括犢牛多發性關節炎或犢牛肺炎。
全文摘要
本發明公開了一株Leachii支原體中國分離株及其分離培養基和用途。本發明所分離的Leachii支原體中國分離株的微生物保藏號是CGMCC No.3808。本發明還公開了適合于所述Leachii支原體中國分離株的分離或傳代培養用的培養基。致病性試驗結果表明，本發明支原體分離株的傳代培養物關節內接種1～2月齡健康犢牛，可復制出典型的多發性關節炎，并能引起一定的死亡，死亡犢牛具有明顯的全身癥狀，多組織器官具有明顯的病理變化。結合臨床發病和人工接種犢牛的臨床癥狀和病理變化、疾病的流行特點、追蹤性流行病學調查以及分離病原的特異性PCR鑒定和遺傳進化分析，確證本發明所分離的支原體為Leachii支原體。
文檔編號A61P31/04GK101880646SQ20101019772
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月11日 優先權日2010年6月11日
發明者于力, 劉海軍, 常繼濤 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所