專利名稱：腫瘤細胞疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬于腫瘤生物治療領域，具體涉及一種腫瘤細胞疫苗及其制備方法。
背景技術：
眾所周知，腫瘤抗原免疫原性弱，宿主難以產生特異性免疫反應，腫瘤細胞得以逃 避機體的免疫監視，是導致腫瘤細胞的增殖難以控制的主要原因之一。巨噬細胞廣泛分布 于機體各組織，是免疫應答起始階段的重要輔助細胞，也是機體處理外來抗原和機體免疫 的第一道屏障。但是如何發動吞噬細胞有效獲取腫瘤抗原，將大量的腫瘤抗原表位呈遞至 巨噬細胞表面并呈遞給T細胞，從而有效地激發機體的免疫反應，產生對腫瘤的防治效果， 是本領域長期以來想要解決的問題。腫瘤疫苗的研制是當今世界腫瘤免疫治療的重要熱點 課題。目前有很多腫瘤疫苗的研究報告在動物實驗中取得結果，但仍然存在很多問題。主 要是目前多數研究對腫瘤細胞中的某單一抗原分子，以及相應的基因靶點作為疫苗的研究 對象，但近年來腫瘤的發生已被認識到不是單一基因的變異所致，而是由多個靶點的基因 或蛋白分子變異導致的。本領域目前需要開發有效的防治腫瘤的疫苗。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知內 皮細胞最強的有絲分裂刺激因子，能刺激血管內皮細胞增殖，促進腫瘤生血管的形成，有利 于腫瘤的生長，在腫瘤新生血管生成和抗血管生成治療中研究最多。但是，VEGF還能通過 單核細胞表面的受體FLT-I的相互作用對單核具有趨化作用，但目前對VEGF的這一功能及 其在腫瘤發生發展中的意義研究較少。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種有效的防治腫瘤的疫苗。本發明解決技術 問題的技術方案是提供一種腫瘤細胞疫苗。該腫瘤細胞疫苗以經過滅活處理至失去分化、增生能力，但仍能表達血管內皮生 長因子的含有血管內皮生長因子表達載體的腫瘤細胞為主要活性成分。上述腫瘤細胞疫苗中所述的滅活處理為輻照滅活。上述腫瘤細胞疫苗中所述的腫瘤細胞為肺癌細胞。上述腫瘤細胞疫苗中所述的內皮生長因子表達載體為可表達VEGF的質粒 VEGF_pSectag20本發明還提供了制備上述腫瘤細胞疫苗的方法。上述方法包括以下步驟將VEGF 真核表達載體轉入腫瘤細胞內，篩選了VEGF穩定表達株；將VEGF穩定表達株用鈷60滅活 處理至其無法分化、增生，但還能表達分泌VEGF的狀態。上述制備腫瘤細胞疫苗方法中所述的腫瘤細胞為肺癌細胞。上述制備腫瘤細胞疫苗方法中所述的內皮生長因子表達載體為可表達VEGF的質 粒 VEGF-pSectag2。上述制備腫瘤細胞疫苗方法中所述的鈷60滅活條件為10 30GrayS的劑量照射10 30分鐘。上述制備腫瘤細胞疫苗方法中所述的鈷60滅活條件為20GrayS的劑量照射20分鐘。進一步的，進行上述鈷60滅活時的腫瘤細胞濃度為IX IO6 100X IO6個/ml。本發明還提供了上述腫瘤細胞疫苗在制備防治腫瘤的藥物中的用途。技術路線本發明腫瘤疫苗能利用其在體內分泌的VEGF對單核細胞的趨化作用， 將單核細胞吸引至腫瘤細胞周圍活化為巨噬細胞，以吞噬腫瘤細胞和提呈腫瘤抗原，誘導 機體產生特異性免疫反應，以達到防治腫瘤的目的。本發明技術方案較目前的樹突狀細胞疫苗具有明顯的優勢樹突狀細胞雖是目前 已知最強的抗原呈遞細胞，但其吞噬功能很弱或無，目前多采用體外培養擴增DC細胞后， 用腫瘤抗原肽、腫瘤抗原或與腫瘤細胞融合作為腫瘤疫苗，而巨噬細胞則同時具有強大的 吞噬功能和抗原呈遞功能，因此利用VEGF的趨化活性吸引激活單核吞噬細胞至滅活腫瘤 細胞的免疫局部，即可有效吞噬腫瘤細胞并處理腫瘤抗原，將大量的腫瘤抗原表位呈遞至 巨噬細胞表面并呈遞給T細胞，從而有效地激發機體的免疫反應。本發明疫苗制備工藝適用于臨床用腫瘤疫苗的制備。其基本技術路線有兩種一 是將VEGF基因導入體外已建系的腫瘤細胞系，使其過表達VEGF，構建出人體各系統轉VEG 基因腫瘤細胞系作通用型腫瘤疫苗；二是取術后病人的腫瘤組織，分離原代腫瘤細胞，用腺 病毒或慢病毒介導導入VEGF基因，使其過表達VEGF。VEGF過表達的腫瘤細胞再經r射線 照射滅活后，20GrayS左右的劑量照射20分鐘左右即得到本發明腫瘤疫苗。r射線照射滅 的要求為經過G。60滅活處理至其沒有分化、生長的活性，但還能存活，有分泌細胞因子的活 性，每種腫瘤細胞根據其自身的情況，照射時間和照射強度都有所不同，照射時候的細胞的 濃度也可以調整。將本發明腫瘤疫苗注入病人體內(皮下、腹腔或靜脈)，能增強機體對腫 瘤細胞免疫應答，有效清除機體殘余的腫瘤細胞，防治腫瘤的復發和轉移。在本發明的一個實例中，用VEGF真核表達載體轉染腫瘤細胞，篩選高表達的VEGF 的腫瘤細胞克隆，經Co60機r照射去分化，劑量為使之失去增殖能力，但保留腫瘤細胞一定 的活性，具有分泌VEGF能力，將這一程序處理的修飾的腫瘤細胞作為瘤苗，在LL/2肺癌小 鼠模型中取得了好的防治效果。腫瘤的治療包括手術、放療、化療和生物治療四個方面。臨床上利用本疫苗將這四 種治療手段結合在一起手術摘除腫瘤組織，分離制備修飾的腫瘤疫苗，選擇不同放療和化 療方案，甚至選擇低于常規劑量方案，對機體免疫系統影響小，對腫瘤的生長有一定的抑瘤 作用，再輔以本發明腫瘤疫苗，以激活機體產生特異的免疫應答，可有效防治腫瘤的復發和 轉移。本發明的有益效果為本發明腫瘤疫苗能吸引激活單核吞噬細胞至滅活腫瘤細胞 的部位，即可有效吞噬腫瘤細胞并處理腫瘤抗原，將大量的腫瘤抗原表位呈遞至巨噬細胞 表面并呈遞給T細胞，從而有效地激活機體產生特異的免疫應答，可有效防治腫瘤的發生、 復發和轉移。為本領域提供了一種新的有效的腫瘤疫苗。
圖1腫瘤預防試驗的的時間-腫瘤體積曲線圖。結果表明VEGF過表達LIV2腫瘤細胞免疫接種小鼠，能有效保護小鼠免受親代LL/2腫瘤細胞的攻擊。圖2腫瘤預防試驗的腫瘤照片，上排為LL/2MV組，中排為LL/2c_p組，下排為對照組。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
對本發明進行具體說明。實施例一本發明腫瘤疫苗的制備以小鼠LL/2肺癌細胞為模型為實例以LL/2小鼠肺癌為動物模型，將小鼠 VEGF164真核表達基因導入LL/2載腫瘤細胞內，篩選了 VEGF穩定高表達株(LL/2MV)；用 VEGF高表達的LL/2腫瘤細胞株，經過G。60滅活處理至其沒有分化、生長的活性，但還能存 活，有分泌細胞因子的活性。將這種滅活的腫瘤細胞接種C57小鼠后，再給小鼠接種親代 LL/2腫瘤細胞，觀察到這種滅活的腫瘤細胞疫苗親代LL/2腫瘤細胞的保護作用。具體操作過程1.轉染與篩選高表達mVEGF1640的LL/2細胞株將LL/2培養于含10%滅活胎牛血清的DMEM基質(含丁胺卡那霉素IOOu/ ml)，取對數生長的LL/2細胞1 X IO6個于六孔板培養，只加2孔培養。次日，用2ug的 mVEGF-pSectag2 質粒(hVEGF mRNA 的序列見 Gene Bank 序列號GI 3719221 ；mVEGF 蛋白 Gene Bank 序列號GI :346974ffei ；載體的構建參見 YQ，Huang MJ, Yang L, et al.，2001， Immunogene therapy oftumors with vaccine based on Xenopus homologous vascular endothelial growth factor as a modelantigen. PNAS 98:11545-11550.)或 2ug 空載 體pSectag2質粒，按照操作說明書，與5ul脂質體混勻，轉染LL/2細胞，轉染48小時后，用 100ug/ml的Zeocin (博來霉素)篩選，直至篩選時間達一個月。篩選出5個Zeocin抗性克 隆的血清，用mVEGF檢測試劑盒檢測，選擇一個高表達mVEGF的抗性Zeocin LL/2克隆，其 IO6個腫瘤細胞24小時內分泌mVEGF達80. 4ng ；而親代LL/2只有1. Ong,空載體轉染LL/2 為1. 2ng。將這株高表達mVEGF1640的LL/2稱為LL/2MV，空載體轉染的LL/2為LL/2C-P。 LL/2MV和LL/2C-P的體外倍增時間、形態與親代LL/2相一致，沒有明顯區別。實施例二使用本發明腫瘤疫苗進行腫瘤防治的試驗取15只8周齡雌性C57小鼠，隨機分為3組作預防試驗。將對數生長的LL/2MV 和LL/2C-P的腫瘤細胞收集，同樣用無血清基質離心洗滌3次，用血細胞計數尺計數，調細 胞數為20X IO6個/ml，用Q60機經20Grays的劑量照射20分鐘。將這種方法處理LL/2MV 和LL/2C-P分別于小鼠背部皮下注射IOOul (即每只小鼠注射2 X IO6個經放射線處理的腫 瘤細胞)各5只小鼠，另5只背部皮下注射IOOul天血清基質作對照。間隔15天，每組按 照以上方法再注射1次。再間隔15天，再收集對數生長的親代LL/2腫瘤細胞離心洗滌3 次，用無血清基質調腫瘤細胞濃度為4X IO6個/ml，給這3組小鼠右腋皮下接種50ul (即 2 X IO5個/只小鼠)，觀察親代LL/2腫瘤細胞的生長情況，同樣直至捫及皮下腫瘤包塊時，每3天測量腫瘤縱、橫徑，直到有荷瘤鼠瘤體過大，瀕臨死亡時，全部處死荷瘤鼠，并分別收 集3組的小鼠血清，稱瘤組織重量，并固定腫瘤組織，經石蠟包埋，切片作HE染色。實驗結果腫瘤保護試驗發現放射線滅活的LIV2MV腫瘤細胞保護小鼠受親代 LL/2腫瘤細胞攻擊。接種親本LL/2腫瘤細胞后18天，對照組和LL/2C-P組均可捫及3X4mm2左右的包塊， 而LL/2MV組未捫及。之后對照組和LL/2C-P兩組腫瘤組織，呈進 行性增長，2周后對照組5只小鼠均生長至11X11. 5mm2, LL/2L-P組5只小鼠均生長達 12 X 10. 5mm2而LL/2MV組有2只長至6 X 6. 5mm2，有3只未捫及(圖1)。接種親代LL/2腫 瘤細胞33天眼球取血并處死荷瘤鼠，稱瘤組織重量，LL/2MV組瘤組織重量明顯低于LL/2MV 組(圖2)。結果表明本發明腫瘤疫苗有明顯的功效，且有較好的安全性。
權利要求
腫瘤細胞疫苗，其特征在于以經過滅活處理至失去分化、增生能力，但仍能表達血管內皮生長因子的含有血管內皮生長因子表達載體的腫瘤細胞作為主要活性成分。
2.根據權利要求1所述的腫瘤細胞疫苗，其特征在于所述的滅活處理為輻照滅活。
3.根據權利要求1所述的腫瘤細胞疫苗，其特征在于所述的腫瘤細胞為肺癌細胞。
4.根據權利要求1所述的腫瘤細胞疫苗，其特征在于所述的內皮生長因子表達載體 為可表達VEGF的質粒VEGF-pSectag2。
5.制備權利要求1 4任一項所述腫瘤細胞疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟 將VEGF真核表達載體轉入腫瘤細胞內，篩選了 VEGF穩定表達株；將VEGF穩定表達株用鈷 60滅活處理至其無法分化、增生，但還能表達分泌VEGF的狀態。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的腫瘤細胞為肺癌細胞。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的內皮生長因子表達載體為可表達 VEGF 的質粒 VEGF-pSectag2。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的鈷60滅活條件為10 30GrayS的 劑量照射10 30分鐘。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述的鈷60滅活條件為20GrayS的劑量 照射20分鐘。
10.權利要求1 4任一項所述腫瘤細胞疫苗在制備防治腫瘤的藥物中的用途。
11.權利要求所有不同途徑導入VEGF基因、分子修飾腫瘤細胞而制備的腫瘤疫苗。
全文摘要
本發明屬于腫瘤生物治療領域，具體涉及一種腫瘤細胞疫苗及其制備方法。本發明所要解決的技術問題是提供一種有效的防治腫瘤的疫苗。本發明解決技術問題的技術方案是提供一種腫瘤細胞疫苗。該腫瘤細胞疫苗以經過滅活處理至失去分化、增生能力，但仍能表達血管內皮生長因子的含有血管內皮生長因子表達載體的腫瘤細胞作為主要活性成分。
文檔編號A61K39/00GK101837123SQ20101018485
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者楊莉, 王永生, 闞兵, 魏于全 申請人:四川大學