專利名稱：一種冬凌草二萜提取物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種冬凌草提取物及其制備方法和藥物組合物，具體涉及一種冬凌草 二萜提取物及其制備方法和藥物組合物。
背景技術：
冬凌草[Rabdosia rubescens (Hems 1.) Hara.]，別名碎米椏，為唇形科香茶菜屬植 物，產于我國河南、河北、山西等地，冬凌草主要的化學成分是貝殼杉烯類二萜，另外還含有 一些三萜成分和揮發性成分。大量的研究表明，冬凌草的主要有效成分存在于二萜類化合 物中，其中又以冬凌草甲素、冬凌草乙素為主要成分，在抗菌、消炎、抗腫瘤等方面表現出明 顯的藥理活性。現有冬凌草制劑均采用傳統的中藥制備方法，以冬凌草的粗提物入藥，服用劑量 大，質量和療效不穩定。因此，從冬凌草中提取出療效確切、毒副作用小，質量可控，使用方便、工藝簡單、 適于大規模工業生產的冬凌草二萜提取物，對于提高冬凌草制劑產品質量，減小劑量，提高 療效是很有意義的。
發明內容
本發明提供了 一種冬凌草二萜提取物。本發明提供了 一種冬凌草二萜提取物的制備方法。本發明提供的冬凌草二萜提取物的制備方法為(1)冬凌草葉或地上部分用醇提取或用超臨界萃取法提取；(2)提取液用水或含一定濃度離子的水或石灰乳沉淀得上清液；(3)靜置過濾后的上清液回收醇至無醇味，調PH至堿性或直接使用；(4)有機溶劑萃取或上柱層析。其中，萃取所用有機溶劑可以是乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等，優選乙酸乙酯；柱層析 可以是硅膠柱、氧化鋁柱、聚酰胺柱、離子交換樹脂柱或大孔吸附樹脂柱，優選為大孔吸附 樹脂柱。本發明提供的冬凌草二萜提取物優選的制備方法為(1)干燥冬凌草葉用超臨界萃取法提取，萃取物用乙醇調節至藥材重的2 20倍 體積；(2)提取液加入水或一定濃度的鹽溶液至醇濃度為30-70% ；(3)靜置沉淀12 48小時，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味；(4)上大孔樹脂柱先用水洗脫，再10 40%濃度的乙醇洗脫，再用50 90%的 乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，干燥即得。本發明提供的冬凌草二萜提取物更優選的制備方法為取干燥冬凌草葉用超臨界CO2萃取，用一定濃度的乙醇作為夾帶劑，夾帶劑用量為藥材重的2 10倍，合并萃取液；(1)加入0. 5%的無機鹽水溶液至醇濃度為40-60% ；(2)靜置沉淀12 24小時，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味；(3)上DlOl或AB-8大孔樹脂柱先用水洗脫，再30 40%濃度的乙醇洗脫，再用 60 80%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，干燥即得。本發明所述的冬凌草二萜提取物為上述任一制備方法制備得到的提取物。本發明所述的冬凌草二萜提取物可以單獨使用或以藥物組合物形式使用。藥物組 合物包括有效劑量的本發明提取物及藥用載體，該藥物組合物包含劑量為I-IOOOmg的冬 凌草二萜提取物，優選劑量為5-500mg，更優選劑量為20 — 200mg。可通過靜脈、口服、舌下、 經肌肉或皮下等途徑給藥，可以以口服乳、滴丸、軟膠囊、片劑、膠囊、含片、顆粒、注射液、靜 脈乳等形式存在，其中優選為口服乳、滴丸、注射液、靜脈乳。
具體實施例方式制備例1冬凌草二萜提取物的制備取干燥冬凌草地上部分2kg用95%的乙醇提取2次，用醇量為8倍，每次提取的 時間為60分鐘，合并濾液，濾液減壓濃縮至藥材重量的8倍體積，加入水溶液至醇濃度為 40%,靜置沉淀12小時，過濾；濾液減壓回收乙醇至無醇味，加Na2CO3至5%，用乙酸乙酯 等量萃取2次，減壓回收溶劑，干燥得到冬凌草提取物12g，經HPLC檢測，總二萜的含量為 50.2%，其中冬凌草甲素含量為25.8%。制備例2冬凌草二萜提取物的制備取干燥冬凌草葉2kg用90%的乙醇提取4次，用醇量為9倍，每次提取的時間為 120分鐘，合并濾液，濾液減壓濃縮至藥材重量的10倍體積，加入的AlCl3水溶液至醇 濃度為50%，靜置沉淀24小時，過濾；濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱，先 用水洗脫，再用20 %乙醇洗脫，再用95 %的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，干燥得到 冬凌草提取物15g，經HPLC檢測，總二萜的含量為61.2%，其中冬凌草甲素含量為32. 1%.制備例3冬凌草二萜提取物的制備取干燥冬凌草葉2kg用超臨界CO2萃取，用95 %乙醇作為夾帶劑，夾帶劑用量為 4000mL,合并萃取液，加入0. 5%的明礬水溶液至醇濃度為60%，靜置沉淀36小時，過濾；濾 液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱，先用水洗脫，再用30%乙醇洗脫，再用90% 的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，干燥得到冬凌草提取物13g，經HPLC檢測，總二萜的 含量為82. 2%，其中冬凌草甲素含量為50. 8%。制備例4冬凌草二萜提取物口服乳的制備將5g制備例2制備得到的冬凌草提取物、200g大豆油、IOOg大豆磷脂、2g甘油混 合，加熱至60 80°C，全部溶融，加入高速搗碎機中，同時加入適量的水，高速攪拌3分鐘以 上，反復3次以上，直到得到均勻的乳劑。制備例5冬凌草二萜提取物滴丸的制備稱取處方量的880g聚乙二醇-6000在85°C 95°C下熔融，緩慢加入制備例2制 備得到的冬凌草提取物IOOg攪拌，依次加入15g硬脂酸、4. 5g吐溫-80、0. 5g亞硫酸鈉、充 分攪拌均勻后，將混合在75 85°C恒溫條件下滴入液體石蠟冷卻液中冷凝成丸，再用毛邊
4紙吸去多余的石蠟即得。制備例6冬凌草二萜提取物軟膠囊的制備稱取200g氫化棕櫚油，加入到1200g藥用豆油中，加熱混勻，制得軟膠囊基質，將 500g制備例2制備得到的冬凌草提取物加入到基質中，攪拌均勻，膠體磨研磨，制得軟膠囊 內容物。按明膠甘油水(1 0.3 1)制膠，采用軟膠囊機壓丸，制得1000粒軟膠囊。制備例7冬凌草二萜提取物片劑的制備稱取制備例2制備得到的冬凌草提取物100g，IOOg淀粉，40g預膠化淀粉、IOg羧 甲基淀粉鈉，充分混合均勻，過80目篩，加入95%乙醇適量制成軟材，12目制粒，60°C干燥3 小時，12目篩整粒，加入顆粒總重0. 3%的硬脂酸鎂，調整片重約250mg，壓片，共制得1000片。制備例8冬凌草二萜提取物膠囊的制備稱取制備例2制備得到的冬凌草提取物100g，淀粉50g，糊精50g，充分混合均勻， 過80目篩，用95%乙醇制粒，過12目篩，填充于1號膠囊中，共制得1000粒。 制備例9冬凌草二萜提取物含片的制備稱取制備例1制備得到的冬凌草提取物200g，淀粉500g，糊精295g，5g蛋白糖，過 120目篩后充分混合，用80-90%乙醇制粒，40°C下干燥，干燥后的顆粒用12目篩網整粒，壓 片，共制得1000片。制備例10冬凌草二萜提取物顆粒的制備稱取制備例1制備得到的冬凌草提取物500g，糊精500g，1500g蔗糖，過120目篩 后充分混合，用蒸餾水制成適宜的軟材，用18目篩網制粒，于40°C下干燥，干燥后的顆粒用 12目篩網整粒，分裝為2. 5g/袋，共制得1000袋。制備例11冬凌草二萜提取物注射液的制備稱取制備例3制備得到的冬凌草提取物10g，溶于適量的50%丙二醇中，加適量活 性炭攪勻，用雙層濾紙抽濾，加50%丙二醇全量。最后將冬凌草溶液通過0. 65pm濾膜灌裝、 封口，流通蒸汽100°C滅菌30min，每支為2ml，含冬凌草二萜100mg。制備例12冬凌草二萜提取物靜脈乳的制備將制備例3制備得到的冬凌草提取物5g，200g注射用大豆油、IOOg大豆磷脂、2g 丙二醇等混合，加熱至60 80°C，全部溶融，加入高速搗碎機中，同時加入適量的注射用 7jC,高速攪拌3分鐘以上，反復3次以上，得到初乳。初乳以超聲波細胞粉碎儀超聲5min，再 以濾膜濾過，罐封于安剖即得。實驗例1.冬凌草二萜提取物的細胞毒作用材料冬凌草提取物根據制備例3制備得到的人宮頸癌細胞Hela株引自中國醫學科學院北京藥物研究所注射用鹽酸阿霉素浙江海門制藥廠，批號135501本實驗選用人宮頸癌細胞Hela，采用噻唑藍還原法(MTT)，對冬凌草提取物的細 胞毒活性進行了研究。按文獻方法沈玲玲，等.貝葉多孔菌提取物對小鼠移植現代應用藥學，1994， 11(4) :9-10，取對數生長的細胞2-2. 5\105/11^，放入96孔板，每孔0. 2mL，設鹽水對照組， 溶劑對照組和不同濃度的實驗組，以及阿霉素(ADM)陽性對照組，每組設3 5個平行孔。實驗組分別加入不同濃度的藥物2 μ L，對照組和溶劑對照組分別加入等量的生理鹽水和 DMS0,而陽性對照組加入不同濃度的ADM 2 μ L。37°C溫箱孵育45h后，各孔加入10 μ L的 MTT液(lOmg/mL)，繼續培養至48h，吸去上清后加入DMSO 100 μ L，待結晶溶解后，即用酶標 儀在570nm波長測量各孔的OD值，計算細胞生長抑制率。結果見表1，利用學生t測驗進行 組間比較。結果表明，凌草提取物對Hela細胞生長有一定的抑制作用，IC50為27 μ g/mL。表1.冬凌草提取物對Hela細胞生長的影響(7 土s) 實驗例2.冬凌草二萜提取物對腫瘤的抑制作用材料NIH小鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供制備例3制 備得到的冬凌草提取物，制備例11制備得到的冬凌草注射液注射用環磷酰胺江蘇恒瑞醫 藥股份有限公司產品，200mg/支，批號03042521瘤株小鼠U14宮頸癌引自中國醫學科學 院北京藥物研究所本實驗選用NIH小鼠，采用經典的抗腫瘤藥物初篩模型，對冬凌草提取物對小鼠 移植肉瘤S180生長的抑制作用及其對荷瘤小鼠壽命的影響進行了研究。NIH性成熟雄性小鼠120只，分別按常規方法接種S180肉瘤細胞徐叔云，等。藥 理實驗方法學(第二版)北京人民衛生出版社，1991，1423。瘤齡IOd的瘤源小鼠拉斷脊 椎處死，無菌剖取瘤塊，取粉紅色瘤組織部位，用滅菌生理鹽水滅菌制成勻漿，調成1 X IO7 個/mL濃度的瘤細胞懸液，拌種于實驗小鼠右前肢腋下皮下，0. 2mL/只。NIH小鼠分別按體 重隨機分組。按劑量給藥。第1批小鼠于實驗結束時拉斷脊椎處死，完整剝離瘤體，觀察瘤 體形態及出血壞死情況，稱量瘤重，計算各組平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接種后按 同樣方法給藥，標準條件喂養，任其生長，記錄每只小鼠的死亡時間，計算存活時間和壽命 延長率。結果見表2，表3，利用學生t測驗進行組間比較。結果表明，5 200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射給藥，對小鼠移植肉瘤S180有 顯著抑制作用，能夠延長S180荷瘤小鼠的壽命，且有一定的量效關系。表2.冬凌草提取物對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用(；±s, η = 10) 表3.冬凌草提取物對小鼠壽命的影響(7 士s，η = 12) 實驗例3.冬凌草提取物對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性升高的治療作用材 料昆明種小鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供制備例3制備得到 的冬凌草提取物，制備例U制備得到的冬凌草注射液本實驗選用雄性昆明種小鼠，采用醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性升高的急性炎 癥模型，對冬凌草提取物的抗炎活性進行了研究。昆明種小鼠50只，隨機分為5組，分別為模型組、陽性藥對照組(氫化可的松 25mg/kg)、冬凌草提取物高(200mg/Kg)、中(50mg/Kg)、低(5mg/Kg)劑量組。每組10只。 冬凌草提取物用0. 5%羧甲基纖維素鈉混懸，配成相應濃度，灌胃給藥。氫化可的松用注射 用生理鹽水配成相應濃度，造模前尾靜脈給藥一次。每日按體重給予相應藥物，給藥體積 0.2ml/10g體重。連續給藥3天，末次給藥后1小時，按文獻朱社敏，等。雙黃連滴丸的主 要藥效學研究。中國現代應用藥學雜志。2001,18:120方法，每只小鼠尾靜脈注射0.5% 伊文斯藍0. lml/10g體重，并立即腹腔注射0. 6 %醋酸生理鹽水溶液0. 2ml/只，20min后脫 頸椎處死，打開腹腔，用6ml生理鹽水洗滌腹腔，收集洗滌液并離心，取上清液于590nm處測 光吸收。結果見表4。利用學生t測驗進行組間比較。結果表明，5 200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射給藥，均對醋酸所致小鼠腹腔
7毛細血管通透性升高具有一定的抑制作用，且有一定的量效關系。表4.冬凌草提取物對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性升高的影響(F 土s, η = 10) 與模型組比較*，P< 0. 05 ；**，P < 0.01實驗例4.冬凌草提取物對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的治療作用材料=Wistar大鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供制備例3制備得到的冬凌草提取物，制備例11制備得到的冬凌草注射液本實驗選用雄性Wistar大鼠，采用角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的的亞急性炎癥 模型，對冬凌草提取物的抗炎活性進行了研究。Wistar大鼠5只，體重130 150g，按體重隨機分為5組，分別為模型組、陽性藥對 照組(氫化可的松15mg/kg)、冬凌草提取物高(200mg/Kg)、中(50mg/Kg)、低(5mg/Kg)劑量 組。每組10只。冬凌草提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉混懸，配成相應濃度。每日按體重 灌胃給予相應藥物，給藥體積0.4ml/100g體重。連續給藥3天，按文獻徐叔云，等。解熱、 抗炎藥物實驗法。藥理實驗方法學。2002，911方法用角叉菜膠造模。每只大鼠末次用藥 前用軟皮尺測量右后足跖部位周徑，然后各組給予相應藥物后，立即給大鼠右后肢足跖皮 下注射角叉菜膠混懸液0. Iml/只，于注射后3h，在同一位置同法測量右后足跖部位周 徑，以致炎后足跖周徑減去致炎前足跖周徑作腫脹度，計算各組腫脹度并比較組間的差異。結果表明，5 200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射給藥，均對角叉菜膠所致大鼠 足跖腫脹具有一定的抑制作用，且有一定的量效關系。表5.冬凌草提取物對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響(F ±s，η = 10)
實驗例5. 口服冬凌草提取物對腹腔注射金黃色葡萄球菌引起小鼠死亡的保護作
材料昆明種小鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供 制備例3制備得到的冬凌草提取物
雄性昆明種小鼠按體重隨機分組，每組12只，灌胃給予冬凌草提取物，劑量如表3 所示。每天給藥一次，連續給藥7d，在最后一次給藥30min后，腹腔注射金黃色葡萄球菌的 硫乙醇酸鹽培養液(37°C 士 l°C，24h，細菌數約108/ml)，0. 5ml/只，即刻觀察，并連續觀察 7d，記錄每天小鼠死亡情況，存活小鼠用Bliss's法計算出半數有效量(ED5CI)。結果見表6。結果表明，冬凌草提取物對腹腔注射金黃色葡萄球菌引起的小鼠死亡有一定的保 護作用，ED5tl 為 42. 68mg/kg。表6. 口服冬凌草提取物對腹腔注射金黃色葡萄球菌引起小鼠死亡的影響(7，n =12) 實驗例6.冬凌草提取物體外抗菌試驗材料制備例3制備得到的冬凌草提取物金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、流桿桿菌、B型鏈球菌、大腸桿 菌、綠膿桿菌均由衛生部北京生物制品研究所提供。冬凌草提取物用肉膏湯配制成100、50、25、12· 5,6. 25,3. 12和1. 6mg/L的含藥培 養液，共7個藥物濃度，每管總量Iml，流通蒸汽滅菌。鏈球菌的試驗在滅菌藥液中添加1 %葡萄糖，空白對照為不含藥物的培養基。分別加入10-3試驗菌液(8小時培養物)0. Iml, 37°C培養18小時后觀察結果。判定最小抑菌濃度(MIC)，結果見表7。結果表明冬凌草提取物對多種細菌均的生長具有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度 在 1. 6 25mg/L 間。表7.冬凌草提取物體外抑菌作用(MIC，mg/L) 實驗例7.冬凌草提取物對小鼠流感性肺炎的治療作用材料昆明種小鼠，山東省天然藥物工程技術研究中心實驗動物中心提供制備例3制備得到的冬凌草提取物，制備例11制備得到的冬凌草注射液昆明種小 鼠按體重隨機分組，每組10只，灌胃給予不同劑量的冬凌草提取物，病毒感染對照組和正 常動物對照組均給相同藥液容積的蒸餾水。除正常對照組外，將小鼠用乙醚輕度麻醉，以 15個LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0. 05ml。從感染前一天開始給藥或水，每天1次，連 續6d，感染后第6天稱取小鼠體重后固定，放血、解剖，摘取全肺稱重，逐個計算肺指數值， 并求出肺指數抑制率。肺指數=肺重(g)/體重(g) XlOO ；肺指數值大，表示肺病變程度嚴 重。結果見表8。利用學生t測驗進行組間比較。結果表明，感染后小鼠肺指數值明顯增大，冬凌草提取物對流感病毒感染小鼠引 起的肺炎有明顯的抑制作用，肺指數值明顯降低。表明冬凌草提取物對流感病毒感染小鼠 所致肺病變有治療作用。表8.冬凌草提取物對流感病毒感染小鼠肺部炎癥(肺指數)的影響(F 士s，n = 10)
權利要求
一種冬凌草二萜提取物的制備方法，其特征為取干燥冬凌草地上部分用95％的乙醇提取2次，用醇量為8倍，每次提取的時間為60分鐘，合并濾液，濾液減壓濃縮至藥材重量的8倍體積，加入水溶液至醇濃度為40％，靜置沉淀12小時，過濾；濾液減壓回收乙醇至無醇味，加Na2CO3至5％，用乙酸乙酯等量萃取2次，減壓回收溶劑，干燥即得。
2.—種冬凌草二萜提取物的制備方法，其特征為取干燥冬凌草葉用90%的乙醇提取4次，用醇量為9倍，每次提取的時間為120分 鐘，合并濾液，濾液減壓濃縮至藥材重量的10倍體積，加入的AlCl3水溶液至醇濃度為 50%，靜置沉淀24小時，過濾；濾液減壓回收乙醇至無醇味，上AB-8大孔樹脂柱，先用水洗 脫，再用20%乙醇洗脫，再用95%的乙醇洗脫，收集后者，減壓回收溶劑，干燥即得。
全文摘要
本發明涉及一種冬凌草二萜提取物的制備方法，以及由該制備方法得到的冬凌草二萜提取物和含有該提取物的藥物組合物。本發明提供的冬凌草二萜提取物的制備方法為冬凌草葉或地上部分醇提或超臨界萃取后用水或含一定濃度離子的水或石灰乳沉淀，靜置過濾回收醇至無醇味，調pH至堿性或直接使用，有機溶劑萃取或上柱層析。
文檔編號A61P35/00GK101919903SQ20101017366
公開日2010年12月22日 申請日期2005年5月24日 優先權日2005年5月24日
發明者孫盛茂, 王振華, 高玉白 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發有限公司