專利名稱：一種重組抗栓肽突變體、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及具有抗血小板聚集功效的抗栓肽突變體，還 涉及它的克隆、表達以及分離純化。
背景技術：
心血管疾病已成為全球衛生保健和衛生資源的沉重負擔，是第二次衛生革命的頭 號敵人。發現新型特效、低毒、非靜脈注射類型的用于治療溶栓和抗栓藥物已成為國內外心 腦血管血栓治療藥物研究領域內的重點和熱點。Seymour等(J Bio Chem, 1990, 265 (17) 10143)首先從北美水蛭中發現抗栓肽是一種較好的血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa拮抗劑。 抗栓肽(decorsin)是一種由39個氨基酸組成的小肽，等電點4. 58，分子量為4384 (還原 型)。隨著分子生物學及基因工程技術的發展，人們對蛋白質及多肽類藥物的研究開發已經 逐步由克隆表達天然蛋白質發展到對天然蛋白質進行設計和修飾，以期達到提高天然蛋白 質藥物生理活性、穩定性，降低毒副作用的目的。文獻報道(J Bio Chem, 1990, 265 (17) 10143)的抗栓肽的半抑制濃度IC5tl為 500nmol/L,完全抑制濃度彡2. 5 μ mol/L。
發明內容
本發明公開了一種重組抗栓肽突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1所示序列，即 其氨基酸序列如下Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Gln-Cys-Gln-Gly-Asp-Asp-Gln-Glu-Lys-Cys-Leu-Cys-Asn-Lys-Asp-Glu-Cys-Pro-Pro-Gly-Gln-Cys-Arg-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Pro-Tyr-Cys-Glu它通過改變野生型抗栓肽(decorsin)第34位的丙氨酸為色氨酸、第35位的 天冬氨酸為精氨酸得到。本發明還公開了該突變體基因的獲得、原核表達載體的構建以及該重組多肽的分 離純化方法。本發明根據野生型抗栓肽的氨基酸序列，并結合大腸桿菌的偏好密碼子，設計了 將原來野生型抗栓肽第34位的丙氨酸為色氨酸，第35位的天冬氨酸為精氨酸，并設計了四 條引物，經重疊PCR的方法獲得目的編碼序列。然后將獲得的編碼序列進行HindIII和Kpn I雙酶切后克隆至大腸桿菌表達質粒pET32a，獲得重組表達質粒pET32a-Mutation然后轉 化至大腸桿菌BL21 (DE3)進行誘導表達，并經金屬螯合親和層析并結合蛋白酶酶切技術建 立了分離純化工藝。本發明的重組抗栓肽突變體的制備方法，依次包括下列步驟a、采用序列重疊的方法進行PCR擴增獲得抗栓肽突變體的基因，四個參與PCR的 序列分別為Pl 5' -AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAGTGC CAG GGT GA-3'
P3 5' -CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAAAAATGC CTG TGCAAC AAA GAC GAA TGC-3'P4 5' -AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGTCTT TGT TGC ACA-3'P2 5' -CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGGGAAACG G-3，b、突變體基因以限制性內切酶HindIII及Kpn I進行雙酶切后插入原核表達載體 pET32a形成的表達質粒，轉化大腸桿菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導基因表 達；C、工程菌發酵后離心收集菌體，超聲破碎細菌，離心，收集細菌裂解液，用M金屬 螯合層析柱純化產品，即得。藥理實驗證明，本發明的抗栓肽突變體具有優異的抑制血小板聚集功能，下面是 本發明的抗栓肽突變體的ADP誘導的抗血小板聚集抑制試驗精密稱取本發明的抗栓肽突變體，用50mmol/L，pH8. 0的Tris-Cl配制成 1000 μ mol/L儲液，倍比稀釋至 100，50，25，10，5，2. 5，1. 0，0. 5 μ mol/L待用。采用 Born 比濁 法測定抗栓肽突變體的ADP誘導的抗血小板聚集活性。自健康成年志愿者(試驗前IOd禁 服任何可引起血小板聚集活性改變的藥物)取血，然后制備富血小板血漿(PRP)和貧血小 板血漿(PPP)。使用LBY-NJ血液凝聚儀，以PRP調零點，PPP調100 %透光率，在180 μ IPRP 中放入小磁棒，然后加入10 μ 1待測樣品，置于凝聚儀上37°C預熱5min，最后加入ADP至終 濃度為15ymol/L(體系總體積為200μ 1)，檢測5min，記錄凝集曲線，得到5min內最大凝 集率。血小板凝集抑制率(％)=(對照血小板最大聚集率％—樣品管的最大聚集率％)/ 對照管血小板最大聚集率％ X 100%。結果見圖1。圖1中顯示抗栓肽突變體具有顯著的 抑制ADP誘導的血小板聚集的活性，而且抑制聚集程度呈現濃度依賴性，其半抑制濃度IC5tl 為140nmol/L，完全抑制濃度彡1. 25 μ mol/L。與文獻報道的抗栓肽的半抑制濃度IC5tl為 500nmol/L,完全抑制濃度< 2. 5 μ mol/L相比，本發明將抗栓肽34位的丙氨酸突變為色氨 酸及35位天冬氨酸突變為精氨酸后，其抗血小板聚集活性顯著增強。本發明的重組抗栓肽突變體可以和藥學上可接受的載體混合，制成藥學上常用的 劑型用于臨床。
圖1是ADP誘導的抗血小板聚集抑制試驗結果圖2是重疊PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖(1 :DNA markers 1500、1250、1042、900、 800、700、600、500、400、300、200、IOObp ；2 重疊 PCR 產物)圖3是重組質粒pET32a-Mutati0n的構建圖(圖中詳細說明構建的方式方法)圖4是重組質粒pET32a-Mutati0n的測序結果圖(圖中附有序列兩端的限制性內 切酶切位點)圖5是重組質粒pET32a_Mutation誘導表達的SDS-PAGE電泳圖(1 蛋白質分子 量Markers ；2 未誘導的工程菌；3 誘導后的工程菌)圖6是親和層析分離后SDS-PAGE電泳圖(1 親和層析分離后的重組蛋白；2 蛋白質分子量Markers)圖7是重組蛋白經腸激酶酶解之后的SDS-PAGE電泳圖(1 蛋白質分子量 Markers ；2 腸激酶酶解之前的重組蛋白；3 腸激酶酶解之后的產物)
具體實施例方式菌株與質粒pET32a(+)為美國 Novagen公司產品；大腸桿菌Escherichia coli DH5 α ；大腸桿 菌 Escherichia coli BL21(DE3)由本實驗室保存。工具酶TaqplusDNA聚合酶、限制性內切酶購自上海生工生物工程技術服務有限公司； T4DNA連接酶購自美國Promega公司；腸激酶購自美國GeneLab公司。其他主要試材和儀器dNTPs、10XPCR反應緩沖液購自上海生工生物工程技術服務有限公司；HisTrap kit購自Amersham公司；PCR儀(Ampgene 4800) ；LBY-NJ血液凝聚儀(北京普利生)主要溶液親和色譜緩沖液20mmol/L pH 7. 4的磷酸鈉，0. 5mol/L NaCl (根據所需添加不同 濃度咪唑)平衡緩沖液I :20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，25mmol/L 咪唑實施例1抗栓肽突變體基因的克隆(1)設計合成引物，同時在引物中引入HindIII及Kpn I酶切位點。Pl 5' -AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAG TGC CAG GGT GA-3'P3 5' -CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAA AAA TGC CTG TGC AAC AAA GAC GAATGC-3'P4 5'—AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGT CTT TGT TGCACA-3，P2 5'—CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGG GAA ACG G-3，(2)以(1)中的四條引物進行重疊PCR反應，獲得突變體基因。PCR反應均采用TaqplusDNA聚合酶進行擴增，各個引物濃度為25 μ mol/L,取引物 P1，P2各5μ 1，引物P3，P4各1μ 1在50μ 1體系進行PCR反應，條件如下94°C變性Imin, 58°C退火lmin，72°C延伸lmin，共進行25個循環，重疊PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。(3)將⑵獲得的序列進行HindIII和Kpn I雙酶切反應后，定向插入表達載體 pET32a(+)，獲得表達載體pET32a-Mutation，重組質粒pET32a_Mutation的構建圖見圖3， 而重組質粒pET32a-Mutati0n的測序結果圖見圖4。(4)表達載體 pET32a-Mutation 轉化至大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3), 用含氨芐青霉素50 μ g/ml)的LB平板進行陽性克隆篩選，并將陽性轉化子進行測序驗證。測序結果表明，獲得的基因序列的對應的氨基酸序列為(從N端到C端)
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Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Gln-Cys-Gln-Gly-Asp-Asp-Gln-Glu-Lys-Cys-Leu-Cys-Asn-Lys-Asp-Glu-Cys-Pro-Pro-Gly-Gln-Cys-Arg-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Pro-Tyr-Cys-Glu實施例2抗栓肽突變體的表達及分離純化(1)抗栓肽突變體的表達 將克隆菌轉接入LB培養基，使用終濃度為lmmol/L的IPTG誘導表達4h，離心收集 菌體沉淀，使用12 % SDS-PAGE檢測目的蛋白，如圖5。(2)抗栓肽突變體的分離純化A.細胞破碎將收集菌體懸浮于 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、0. 5mmol/LEDTA 緩 沖液中。冰水浴上超聲裂菌。待菌液粘度下降后，lOOOOr/min離心IOmin收集菌液上清。B. HisTrap kit親和層析將細胞裂解液上清上樣于已用平衡緩沖液I (20mmol/ LTris-HCKpH 8. 0)，25mmol/L咪唑)預平衡過的HisTrap親和柱。上樣完畢后，先用10倍 柱體積的平衡緩沖液I充分洗柱，每一柱體積收集一管，然后10倍柱體積含lOOmmol/L咪 唑的20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)進行梯度洗脫，收集主要位于lOOmmol/L的咪唑洗脫峰 洗脫峰，親和層析分離后SDS-PAGE電泳圖見圖6。C.腸激酶酶切將B中獲得的蛋白用腸激酶酶切，根據IU的腸激酶可以有效剪切 25 μ g的目的蛋白的量，將B中獲得的蛋白在23°C孵育16h，經HisTrapTM-HP柱純化，收集 前流份，SDS-PAGE電泳圖見圖7。
權利要求
一種重組抗栓肽突變體，其特征是具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.權利要求1的重組抗栓肽突變體的制備方法，依次包括下列步驟a、采用序列重疊的方法進行聚合酶鏈式反應擴增獲得抗栓肽突變體的基因，四個參與 PCR的序列分別為Pl 5' -AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAGTGC CAG GGT GA-3，P3 5'-CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAAMA TGC CTG TGCAAC AM GAC GM TGC-3，P4 5'—AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGTCTT TGT TGC ACA-3，P2 5'—CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGGGAAACG G_3，b、突變體基因以限制性內切酶HindIII及KpnI進行雙酶切后插入原核表達載體 pET32a形成的表達質粒，轉化大腸桿菌，異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導基因表達；C、工程菌發酵后離心收集菌體，超聲破碎細菌，離心，收集細菌裂解液，用M金屬螯合 層析柱純化產品，即得。
3.權利要求1的重組抗栓肽突變體用于制備抑制血小板聚集的藥物的用途。
4.一種藥物組合物，其中含有權利要求1的重組抗栓肽突變體和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種重組抗栓肽突變體、制備方法及用途，本發明利用蛋白質工程技術對抗栓肽(decorsin)進行基因設計，將野生型的抗栓肽的第34位的丙氨酸突變為色氨酸，并同時將第35位的天冬氨酸突變為精氨酸，并利用基因工程技術進行生產，所獲的重組蛋白具有比野生型抗栓肽更強的抗血小板聚集功效。
文檔編號A61K38/17GK101921326SQ20101015596
公開日2010年12月22日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者勞興珍, 鄭珩, 高向東 申請人:中國藥科大學