專利名稱：短棒狀桿菌或其組合物在制備治療乙型肝炎藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP)在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其涉及在制備治療乙型病毒性肝炎藥劑藥劑中的應(yīng)用，或聯(lián)合抗乙型肝炎免疫球蛋白在制備治療乙型病毒性肝炎藥劑中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2. 8億，我國約占1.3 億。多數(shù)無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬。乙肝的特點(diǎn)為起病較緩，以亞臨床型及慢性型較常見。無黃疸型HBsAg持續(xù)陽性者易慢性化。本病主要通過血液、母嬰和性接觸進(jìn)行傳播。注射乙肝疫苗是預(yù)防和控制乙型肝炎的有效措施。拉米夫定是近年上市的一種抗乙肝病毒藥，其英文名稱為Lamivudine，化學(xué)名為 2，3，-雙脫氧 _3，-硫代胞嘧啶(2，-3，deoxy-3，-thiocytidine)，又稱 3-TC。國內(nèi)外隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)表明，每日口服IOOmg可明顯抑制HBV DNA水平，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率隨治療時(shí)間延長而提高，治療1、2、3、4和5年后HBeAg血清轉(zhuǎn)換率分別為16%、17%、23%、28% 和35% ；治療前ALT水平較高者，一般HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率也較高。長期治療可以減輕炎癥，降低肝纖維化和肝硬化的發(fā)生率。隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)表明，本藥可降低肝功能失代償和 HCC (肝細(xì)胞癌)發(fā)生率。在失代償期肝硬化患者也能改善肝功能，延長生存期。國外研究結(jié)果顯示，拉米夫定治療兒童慢性乙型肝炎的療效與成人相似，安全性良好。對乙型肝炎肝移植患者，移植前用拉米夫定；移植后，拉米夫定與乙肝免疫球蛋白 (HBIG)聯(lián)用，可明顯降低肝移植后HBV再感染，并可減少HBIG劑量。拉米夫定的化學(xué)本質(zhì)是核苷類似物，而核苷酸則是合成人體遺傳物質(zhì)DNA和RNA 的原料。核苷類似物在結(jié)構(gòu)上模擬核苷酸的結(jié)構(gòu)，但卻不具有核苷酸的功能。因此在DNA 合成過程中，核苷類似物可以摻入進(jìn)去，但卻不能合成有正常功能的核酸鏈，從而終止病毒的復(fù)制。近幾年來，拉米夫定作為一種新的核苷類似物廣泛被醫(yī)患接受，其作用機(jī)制為抑制病毒DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性，并對病毒DNA鏈的合成和延長有競爭性抑制作用。拉米夫定可迅速有效降低血清HBV DNA水平，但是停藥后復(fù)發(fā)率高，長期應(yīng)用可導(dǎo)致病毒變異。拉米夫定是一個(gè)抑制病毒的藥物，并不能清除乙肝病毒，因?yàn)閷σ腋尾《綾ccDNA 沒有作用，cccDNA在人體內(nèi)的半衰期大約為3-4年，如果cccDNA持續(xù)存在，病毒就不會得到清除，停藥后必然復(fù)發(fā)。因此在應(yīng)用拉米夫定時(shí)，其療效并不完全取決于藥物本身，還和病人對HBV的特異性免疫反應(yīng)狀態(tài)及病毒毒力密切相關(guān)，對于特異性免疫反應(yīng)弱的病人單獨(dú)應(yīng)用拉米夫定很難達(dá)到清除病毒的目的，還要想辦法提高機(jī)體對HBV特異性免疫反應(yīng)， 可以考慮聯(lián)合應(yīng)用胸腺肽、治療性疫苗及高效價(jià)乙肝免疫球蛋白等。拉米夫定雖然見效快，但是1和2年之后的變異率很高(自身免疫力高低決定是否出現(xiàn)變異)。隨用藥時(shí)間的延長患者發(fā)生病毒耐藥變異的比例增高(第1、2、3、4年分別為14%、38%、49%和66% )，從而限制其長期應(yīng)用。另外，部分患者在停用本藥后，會出現(xiàn) HBV DNA和ALT水平升高，在發(fā)生病毒耐藥變異后會出現(xiàn)病情加重，個(gè)別患者甚至可發(fā)生肝功能失代償。因此，市場上迫切需要新的抗乙肝病毒藥藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑 (NCPP)在制藥中的新應(yīng)用，即在制備治療乙型病毒性肝炎感染中的應(yīng)用，以及短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑聯(lián)合乙肝免疫球蛋白或抗乙型肝炎免疫球蛋白在制備治療乙型病毒性肝炎感染藥劑中的應(yīng)用。所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的制劑，所述NCPP為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱原、無甲醛殘留，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，可減少CPP的發(fā)燒、注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用；短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP) 作為一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，均具有明顯的抗病毒的作用，可用于乙型病毒性肝炎感染的治療或輔助治療。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種短棒狀桿菌制劑在制備治療乙型病毒性肝炎藥劑中的應(yīng)用。一種無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療乙型病毒性肝炎藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的短棒狀桿菌制劑(CPP，2000版《中國生物制品規(guī)程》)是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的死菌苗，其制備過程公開在 1995版及2000版《中國生物制品規(guī)程》。目前應(yīng)用的CPP制劑還有法國Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；英國Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗等。CPP具有激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的能力。CPP對免疫系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在激活單核巨噬細(xì)胞、使NK細(xì)胞活性增強(qiáng)、促進(jìn)機(jī)體對多種抗原產(chǎn)生IgG和IgM、誘塵干擾素、白細(xì)胞介素-2等，因此具有抗腫瘤和抗感染作用。CPP的抗腫瘤作用已為許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究所證實(shí)。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種腫瘤前后應(yīng)用CPP，能顯著抑制某些實(shí)體瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型腫瘤及白血病的生長。腫瘤消退的動(dòng)物對于再次攻擊的腫瘤細(xì)胞有特異性的抵抗力。CPP對腫瘤轉(zhuǎn)移亦有抑制作用。CPP抗腫瘤及抗感染的核心是通過激活巨噬細(xì)胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高，激活的巨噬細(xì)胞可將腫瘤細(xì)胞及感染的微生物殺死。CPP作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤及其它疾病的治療已有數(shù)十年的歷史，其通過激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)抗腫瘤、抗感染的效果已被公認(rèn)。02123571. 6,02123570. 8和02123572. 4已經(jīng)申請了一種無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑、
其制備方法和在制備治療結(jié)核病藥物上的用途。本發(fā)明所述無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP)為由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，粒度小于lOOnm。其中所述的CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)菌號為 65101 (76-27 或 7627),65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。所述的NCPP的熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余為多糖。優(yōu)選本發(fā)明NCPP的熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余為多糖。本發(fā)明NCPP的粒度優(yōu)選為50 80nm。本發(fā)明所述的NCPP是通過下述步驟制備的1)CP工作種子批菌種連續(xù)2 4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 7天2)收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15 60分鐘得到菌液3)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液5)將懸液分裝后加熱滅菌，得到無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑。其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為65101 (76-27或7627)、 65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，且為低熱原
培養(yǎng)基。步驟1)中培養(yǎng)條件為36 37°C培養(yǎng)。優(yōu)選所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。其中步驟3)中所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為50 500億/ml。所述破碎裝置是將菌體破碎到小于lOOnm，優(yōu)選粒度為50 SOnm的超高壓射流對撞機(jī)。其中所述菌體破碎是在無菌條件下進(jìn)行。其中步驟幻中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次步驟 4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌O 5次。步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C 室溫、6000 12000rpm離心30 150分鐘。步驟5)中所述的加熱為在60 65°C加熱0. 5 2小時(shí)。本發(fā)明中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為經(jīng)過0. 22 μ m或0. 45 μ m膜過濾的低熱原培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的制備方法中，還包括將步驟5)得到的NCPP冷凍干燥，得到NCPP的凍干制劑。上述方法制備的NCPP熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10 40% (g/g)，核酸含量 3 25% (g/g)，其余為多糖。優(yōu)選上述方法制備的NCPP熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余為多糖。上述方法制備的NCPP粒度小于lOOnm，優(yōu)選粒度為10_50nm。本發(fā)明中所述的無菌檢驗(yàn)合格是指按照《中國生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢驗(yàn)不得有任何細(xì)菌生長。本發(fā)明中由于采用低熱原培養(yǎng)基，特別是硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)控， 以及整個(gè)生產(chǎn)過程中無菌低熱原操作，保證了最終產(chǎn)品低熱原和無雜菌的污染。本發(fā)明通過超高壓射流對撞機(jī)將CP破碎至納米級，通過選擇不同的離心力(轉(zhuǎn)速)，確定了離心提取條件，獲得的沉淀部分為NCPP，經(jīng)多次動(dòng)物試驗(yàn)證明，該制劑與全菌體具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，上清部分則無脾激活及抑瘤作用，表明本發(fā)明的NCPP具有良好的生物學(xué)活性。為了消除CPP中殘留甲醛對機(jī)體的刺激性，尤其是對敏感胸膜的刺激性，本發(fā)明中采用加熱滅活替代了甲醛滅活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，加熱滅活的NCPP、CPP較甲醛滅活的CPP 具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性。超高壓射流對撞機(jī)的工作原理是將混有被加工物的液體用高壓泵(工作壓力為 10-3000kgf/cm2)加壓后分成兩股，以高速射流進(jìn)入兩片直徑為8mm人造金剛石晶片組成的通道中，相向?qū)ψ埠罅鞒?。由于液體的速度很高，流體相向?qū)ψ矔r(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的沖擊波，使金剛石晶片產(chǎn)生高頻、高強(qiáng)超聲波。大功率高頻超聲波使被加工物顆粒瞬間粉碎、超微化。本發(fā)明的制備過程中，為更好地破碎菌體，采用超高壓射流對撞機(jī)，在菌體濃度為 50 500億/ml，工作壓力為800 1500kgf/cm2的條件下破碎，破碎后的菌體懸液在4°C 室溫下，6000 12000rpm離心30 150分鐘，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水溶液洗滌0 5次后制成懸液，經(jīng)配制、分裝，在60 65°C加溫0. 5 2小時(shí)，無菌試驗(yàn)合格后合并，得到高質(zhì)量、粒度和均一性良好的目的產(chǎn)品。本發(fā)明的NCPP是將CP的細(xì)胞破碎至納米級，經(jīng)離心去除無效的上清部分，收集沉淀部分制備的，產(chǎn)品具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效同時(shí)可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫制劑。根據(jù)需要，本發(fā)明的NCPP可以制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1. Omg/ml或2. Omg/ml，也可以制成凍干粉針或適合藥用的其他劑型本發(fā)明的CPP可為目前常用的劑型，如懸浮制劑、凍干粉針或適合藥用的其他劑型。本發(fā)明所用的CPP、NCPP均為非特異性免疫增強(qiáng)劑，NCPP是由CP經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱原、無甲醛殘留，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，可減少CPP的發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用，因此NCPP克服了 CPP的一些不足，可作為一種性能優(yōu)異的非特異性免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于抗腫瘤和抗感染等疾病的治療。本發(fā)明的CPP、NCPP均為非特異性免疫增強(qiáng)劑，主要作用于巨噬細(xì)胞，對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)具有強(qiáng)大而持久的刺激，且可通過促進(jìn)造血多能干細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞，調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏的潛力，發(fā)揮抗癌、殺微生物功能。CPP、NCPP抗乙型肝炎病毒作用主要是通過對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)強(qiáng)大而持久的刺激，引起單核巨噬細(xì)胞增生、活化、吞噬功能增強(qiáng)及誘導(dǎo)分泌干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素 (IL-2)活性氧(Η202、Ν0)等殺傷因子及增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性，達(dá)到抑制和殺傷乙型肝炎病毒的目的。本發(fā)明的一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在用于制備治療乙型肝炎病毒藥劑時(shí)，其用法為1 7次/周，每次0. 5 ％ig，肌肉注射或其他適宜途徑給藥， 1 4周為一個(gè)療程或遵醫(yī)囑?？砷g隔用或連續(xù)使用幾個(gè)療程。本發(fā)明的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)對乙型病毒性肝炎的感染具有很好的治療作用。本發(fā)明所用的CPP、NCPP為一種免疫調(diào)節(jié)劑，用于制備治療乙型病毒性肝炎藥劑，具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明提供了 CPP、NCPP新的醫(yī)藥用途，對治療乙型病毒性肝炎提供了新的途徑。2.本發(fā)明的NCPP制劑具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時(shí)可減少發(fā)燒、注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用，是一種有前途的免疫制劑，可作為用于制備治療乙型病毒性肝炎藥劑。3.本發(fā)明的制備工藝簡單，可制成口服液、注射液、片劑等劑型，使用方便。4.本發(fā)明的NCPP制劑克服了化學(xué)藥物治療乙型病毒性肝炎易產(chǎn)生耐藥性的缺
點(diǎn)ο本發(fā)明的制備方法、吸收性能及動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)施方式
同專利 ZL03157454. 8。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施方式
用于詳細(xì)描述本發(fā)明，并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)驗(yàn)例INCPP對北京麻鴨乙型病毒性肝炎感染的保護(hù)作用一、材料和方法1.材料1. 1動(dòng)物1日齡北京麻鴨，150只，雌雄不限，購自北京前進(jìn)種鴨廠。1. 2鴨乙型肝炎病毒陽性血清采自上海麻鴨，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所惠贈，_20°C保存。1. 3質(zhì)粒pUC18-DHBV-DNA(含有DHBV全基因組DNA)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所惠贈，_20°C保存。1.4 供試品供試品1 無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP)，性狀白色均一不透明液體，由中國藥品生物制品檢定所提供。供試品2 乙肝免疫球蛋白，由中國藥品生物制品檢定所提供。1. 5陽性藥物拉米夫定(3TC)，劑型片劑，規(guī)格100mg/片，葛蘭素史克制藥有限公
1. 6 試劑Dig標(biāo)記和檢測試劑盒=Boehringer公司產(chǎn)品，SDS 購自華美生物工程公司，Citric Acid(檸檬酸三鈉)Sigma公司產(chǎn)品，MALEIC ACID =Sigma 公司產(chǎn)品，Tris Amresco 公司產(chǎn)品氫氧化鈉北京化工廠生產(chǎn)，氯化鈉北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，1.7其他材料Hybond N+ / 月莫(0. 45 μ m) 自 Amersham Phamacia Biotech ^W]，
2.方法2. 1建立鴨乙型肝炎動(dòng)物模型1日齡北京麻鴨，經(jīng)脛靜脈注射麻鴨DHBV陽性鴨血清，每只0. 3ml,以構(gòu)建鴨乙型肝炎動(dòng)物模型。7天后取血，對每只模型麻鴨進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行real-time PCR及斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)，檢測血清中DHBV-DNA含量，篩選感染陽性麻鴨。2. 2實(shí)驗(yàn)分組及給藥本次試驗(yàn)共設(shè)置10組，其中正常對照組(1組)10只麻鴨(不接種鴨乙肝病毒DNA陽性血清，僅給予生理鹽水)，其余9組均選取經(jīng)過篩選確證為DHBV感染陽性的麻鴨進(jìn)行試驗(yàn)，除陽性藥物組為5只外，其余各組均為15只，分別為模型組(給予生理鹽水)、陽性藥組(拉米夫定50mg/kg，)、NCPP 組(0. 5mg/只)、聯(lián)合應(yīng)用(NCPP 0. 5mg/只+乙肝免疫球蛋白1 25，0. 5ml/只)，拉米夫定灌胃給藥，每日給藥1次；供試品NCPP經(jīng)肌肉注射給藥、乙肝免疫球蛋白靜脈注射給藥，每2天給藥一次，即分別在模型建成后的第1天、第3天、第5天、第7天和第9天給藥。各組分別在給藥前(Dtj)、給藥后第5天(D5)、給藥后第10天(Dltl)及停藥后第 3天(P3)取鴨血清測DHBV-DNA含量，ALT、AST (在P3時(shí)取血清檢測)含量，停藥3天后各組麻鴨處死，并取肝臟作病理組織學(xué)檢查。表1.實(shí)驗(yàn)分組
權(quán)利要求
1.一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療乙型病毒性肝炎感染藥劑中的應(yīng)用。
2.一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑聯(lián)合乙肝免疫球蛋白或人源化或人源性抗乙型肝炎免疫球蛋白在制備治療乙型病毒性肝炎感染藥劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)甲醛滅活后制成的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，粒度小于lOOnm，優(yōu)選50 80nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余為多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余為多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的短棒狀桿菌為粉刺丙酸桿菌， 菌號為 76-27、H-84 或 77-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑通過下述方法制備的1)短棒狀桿菌工作種子批菌種連續(xù)2 4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 7天2)收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15 60分鐘得到菌液；3)無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液5)將懸液分裝后加熱滅菌，得到無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的培養(yǎng)條件為36 37°C；所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；所述的菌體是滅活菌，所述破碎裝置是將菌體破碎到小于lOOnm，優(yōu)選粒度為50 SOnm的超高壓射流對撞機(jī)，破碎在無菌條件下進(jìn)行步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C 室溫下，6000 12000rpm離心30 150分鐘；步驟幻中所述的加熱為在60 65°C加熱0. 5 2小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將步驟幻得到的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑冷凍干燥，得到無細(xì)胞短棒狀桿菌的凍干制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP)在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其涉及在制備治療乙型病毒性肝炎感染藥劑中的應(yīng)用，以及CPP或NCPP聯(lián)合乙肝免疫球蛋白(HBIG)或抗乙型肝炎免疫球蛋白(人源化或人源性抗HBs)在制備治療乙型病毒性肝炎感染藥劑中的應(yīng)用。所述CPP是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制得的制劑，所述CPPP為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱源、無甲醛殘留；本發(fā)明的CPP具有一定的抗乙型病毒性肝炎感染的作用，NCPP的效果較為明顯，尤其以CPP甚或NCPP聯(lián)合抗HBIG或HBs效果更為顯著。
文檔編號A61K35/74GK102232971SQ20101015070
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者李守悌, 高尚先 申請人:中國藥品生物制品檢定所