專利名稱：一種多能免疫殺傷轉基因細胞、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和細胞生物學領域，涉及一種多能免疫殺傷轉基因細胞，具體而言，本發明涉及一種能高水平表達含有人恒定區抗體且具有細胞殺傷毒性的轉基因免疫細胞，由于這種轉基因免疫細胞既具有細胞毒性作用即細胞免疫作用，又能高水平分泌抗體即具有體液免疫作用，我們將這種細胞命名為多能免疫殺傷轉基因細胞 (pluripotent immune killer Cell，簡稱為PIK)。本發明還涉及所述多能免疫殺傷轉基因細胞的制備方法和用途。
背景技術：
“免疫作用”可分為細胞免疫及體液免疫，細胞免疫是以細胞直接發揮效應來清除異物，參與的細胞稱為細胞免疫效應細胞；而體液免疫是由抗體所介導產生作用，人體內的抗體是由B淋巴細胞產生，兩者是截然不同兩種殺滅腫瘤或病毒的形式。細胞免疫效應細胞主要包括細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineactivated killer cells, CIK)、樹突狀細胞刺激的細胞因子誘導的殺傷細胞(DC-CIK)、細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)、γ δ T細胞、自然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、CD3AK細胞(抗CD3單抗的殺傷細胞)等，這些細胞都不表達抗體， 它們直接殺滅或通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性細胞效應(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)起作用。在趨化因子作用下，細胞免疫效應細胞可通過細胞變型主動進入腫瘤組織內部，發揮治療作用。然而，盡管已有不少關于這些細胞進入腫瘤及病毒治療的臨床試驗的報道(1-13)，但是由于缺乏特異性抗體存在，其殺傷活性有限，其臨床療效并不顯著。抗體由漿細胞產生。1975，年Kohler和Milstein創立單克隆抗體制備技術，從而建立了抗體的基因工程，為腫瘤及病毒的治療提供一種新的方法_抗體治療法。抗體針對腫瘤及病毒的治療作用主要通過ADCC、吞噬作用、補體依賴的細胞毒作用(Complementd印 endentcytotoxicity,⑶C)而起效應，部分還通過抑制細胞生長、誘導細胞凋亡及阻制新生血管形成而起作用。早年的抗體的臨床試驗中應用的是鼠源性抗體，在人體內會產生針對鼠源性抗體的抗抗體(HAMA)，它會中和治療性的鼠源性抗體，使其被快速清除，因此鼠源性抗體在人體內半衰期很短，故療效不確切，同時鼠源性抗體會導致人體過敏反應，從而產生毒副作用。 隨著分子生物技術的發展，人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體技術及制備技術的成熟，基本上可以克服鼠源性抗體在人用時產生抗抗體的問題；同時由于在人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中采用人的Fc片段，在人體內的半衰期從鼠源性抗體小于20小時到人源化抗體和人抗體的半衰期為數天、甚至到21天之久。從而使抗體在臨床上產生明顯抗腫瘤及抗病毒療效，目前已有幾十個抗體藥物上市銷售。然而，由于治療腫瘤的抗體需要量極多， 目前的生物工程生產比較困難；同時由于需要量極多，要求其產品純度極高，因此其產品生產成本及價格均非常昂貴，限制了抗體治療的臨床應 用。
近幾年，有應用腺病毒載體及腺相關病毒載體將含人恒定區的全長基因抗體(包括人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人的抗體)轉染肝臟及肌肉，產生明顯抗腫瘤及病毒的報道(14-18)。然而，由于實體腫瘤的細胞被致密的基質包裹，抗體難以穿透這一屏障而到達腫瘤內部；大多數實體腫瘤有淋巴回流障礙，導致間質內壓力升高，因而阻止了抗體由血液中進入腫瘤實質；小部分進入腫瘤內部的抗體，首先遇到血管周圍的腫瘤細胞而被結合，使得抗體無法到達距離血管較遠的腫瘤細胞。故目前應用抗體治療大體積的實體腫瘤的療效仍不理想，很多研究建議對于實體腫瘤的抗體治療主要應用于腫瘤的微小殘留或微轉移灶中，但這種疾病的治療需要長時間及大規模的多中心臨床試 驗才能評估其療效，這也對抗體在實體瘤的臨床應用及推廣產生一定的限制作用。因此，總體來說，細胞免疫效應細胞(如CIK、T細胞、細胞毒殺傷細胞、γ δΤ細胞、 NK細胞等)本身具有殺滅腫瘤細胞及病毒的效應，且能有效進入腫瘤組織內部，但并不表達任何全長抗體，其臨床治療效果有限；而抗體本身具有抗病毒與腫瘤的作用，且能引導細胞免疫效應細胞，發揮ADCC、CDC效應，但大分子抗體對實體瘤的穿透力不足，對大實體瘤的治療效果不佳。因而，如果在細胞免疫效應細胞保持細胞殺傷毒性的前提下，能由其高效表達含有表達人恒定區抗體，將同時克服細胞免疫治療作用不足與大分子抗體難以進入實體瘤內部的困難。這些既具有細胞殺傷毒性、又能高水平表達含人恒定區抗體細胞，在趨化因子作用下，經過細胞變型主動進入腫瘤組織內部，從而在腫瘤組織內部高水平表達抗體， 同時抗體與細胞殺傷毒性免疫細胞雙重存在，可產生強烈的ADCC效應及其它效應，高效殺滅腫瘤細胞及病毒。盡管已經有將外源基因轉導入例如T細胞的報導(CN1732267、CN1629285、以及 CN1705739)，但目前常用基因轉染載體系統對具有細胞殺傷毒性的細胞免疫效應細胞轉染率低，難以使外源基因在其細胞內高水平地表達，而且迄今為止，尚未見任何在細胞免疫效應細胞內表達含有人恒定區的抗體基因的報道。因而在此之前，尚無具有細胞殺傷毒性并且能高水平地表達含有人恒定區的抗體的轉基因細胞的報道。
發明內容
本發明的一個方面涉及一種多能免疫殺傷轉基因細胞，所述細胞具有細胞殺傷毒性，并且能夠表達人抗體的恒定區的部分或者全長。所述人抗體的恒定區的部分或者全長在抗體本身信號肽作用下，可分泌到細胞外。這種細胞具有細胞免疫與體液免疫的雙重功能，在本發明中將其命名為多能免疫殺傷細胞(Pluripotent Immune KillerCells，PIK)。在本發明的一個實施方案中，所述細胞表達人抗體的恒定區的全長。在本發明的一個實施方案中，所述多能免疫殺傷轉基因細胞為細胞免疫效應細胞。在本發明的一個實施方案中，所述多能免疫殺傷轉基因細胞的表面CD3呈陽性。在本發明的一個實施方案中，所述多能免疫殺傷轉基因細胞為選自如下細胞中的一種或多種細胞細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine activated killer cells，CIK)、樹突狀細胞刺激的細胞因子誘導的殺傷細胞(DC-CIK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、γ δ T細胞、自然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、CD3AK細胞(抗 ⑶3單抗的殺傷細胞)。
在本發明的一個實施方案中，所述人抗體的恒定區為選自如下抗體中的一種的恒定區的全長人鼠嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。在本發明的一個實施方案中，所述人抗體的恒定區是通過轉染病毒載體實現的。在本發明的一個實施方案中，所述病毒載體為選自如下病毒載體中的一種或多種病毒載體非復制型病毒載體、復制型病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、 逆轉錄病毒載體。在本發明的一個實施方案中，所述含有人恒定區的抗體是通過轉染非病毒載體實現的。在本發明的一個實施方案中，所述抗體為抗腫瘤或抗病毒的抗體，并且具體地，選自如下抗體中的一種或多種抗體
抗新生血管生成的抗體、抗腫瘤細胞生長因子受體的抗體、抗腫瘤細胞膜抗原的抗體、抗腫瘤抗原的獨特型單克隆的抗體。其中，所述腫瘤包括但不限于肝癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤。在本發明的一個實施方案中，所述抗體為選自如下抗體中的一種或多種抗體抗血管內皮生長因子的抗體、抗血管內皮生長因子受體2的抗體、抗整合素的 avb3的抗體、抑制新生血管內皮生成的抗體、抗表皮生長因子受體1的抗體、抗表皮生長因子受體2的抗體、抗17-1A的抗體、抗⑶20的抗體、抗⑶52的抗體、抗MUCl的抗體、抗17-1A 的獨特型單克隆抗體、抗癌胚抗原的獨特型單克隆抗體、抗GD3的獨特型單克隆抗體、抗 MUCl的獨特型單克隆抗體、抗乙肝病毒的抗體、抗愛滋病毒的抗體。在本發明的一個實施方案中，所述人抗體恒定區的核苷酸序列可與外源基因的核苷酸序列形成融合基因。在本發明的一個實施方案中，所述外源基因是抗癌基因，并且具體地，選自如下抗癌基因中的一種或多種抗癌基因血管抑制基因、細胞因子基因、前藥轉換酶基因及細胞毒性基因之一種；其中所述的血管抑制基因可以是內皮抑素基因，血管生成抑素基因，血漿纖維蛋白溶酶原中Kringlel-4結構、Kringlel_5結構、Kringlel_3結構、Kringlel_3加上 Kringle5結構、血小板反應蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑PAI基因及纖維結合素基因；所述的細胞因子基因可以是白細胞介素2、白細胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素_ α、干擾素_ β、干擾素_ Y、Light及Flt3配體；所述的前藥轉換酶基因可以是單純皰疹重組病毒胸腺嘧啶激酶、細菌β -內酰胺酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶；所述的細胞毒性基因可以是綠膿桿菌外毒片段。本發明的另一個方面涉及一種多能免疫殺傷轉基因細胞的制備方法，包括將人抗體的恒定區的部分或者全長轉入具有細胞殺傷毒性的細胞并表達的步驟。本發明的另一個方面涉及上述的多能免疫殺傷轉基因細胞在用于如下六個方面之一的用途抑制腫瘤細胞生長、抑制病毒生長、制備用于治療腫瘤的藥物、制備用于治療病毒感染性疾病的藥物、制備用于治療細菌感染性疾病的藥物、或制備用于治療自身免疫疾病的藥物。其中，所述腫瘤包括但不限于肝癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤。本發明的另一個方面涉及一種藥物組合物，其包含上述的多能免疫殺傷轉基因細胞，以及藥學上可接受的輔料。本發明的另一個方面涉及一種治療哺乳動物腫瘤的方法，包括如下步驟用上述的多能免疫殺傷轉基因細胞體外或體內治療腫瘤細胞，從而抑制腫瘤形成、生長及轉移；在本發明的一個實施方案中，所述哺乳動物為靈長類，具體地，為人類。在本發明的一個實施方案中，所述方法還包括在施用前述的多能免疫殺傷轉基因細胞在治療腫瘤細胞之前、同時或之后，施用化學抗腫瘤藥物的步驟。發明的有益效果本發明克服了目前常用基因轉染載體系統對具有細胞殺傷毒性的免疫細胞轉染率低的缺陷，使含有人恒定區的抗體的基因高水平地表達，制得的多能免疫殺傷轉基因細胞具有細胞免疫與體液免疫雙重功能，能夠有效地抑制腫瘤及病毒的增殖。
圖1 :pDC339質粒圖譜。圖2 :pDC359質粒圖譜。圖3 :pDC639質粒圖譜。圖4 :pDC659質粒圖譜。圖5 :PClon9載體的構建流程圖。圖6 :pPE3載體的構建流程圖。圖7 φΡΕΙΙ載體的構建流程圖。圖8 :pPE35載體的構建流程圖。圖9 :ρΡΕ0載體的構建流程圖。圖10 pNFO載體的構建流程圖。圖11 :pNF5、pNFll、pNF35載體的構建流程圖。圖12 :PIK細胞表達的全長抗體Western blot圖。圖13 :PIK細胞小鼠體內治療實驗結果圖。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1 腺病毒穿梭質粒pDC339與pDC359及含AAV ITR的腺病 毒穿梭質粒 PDC639與pDC659的構建1. pDC339載體的構建第一步構建pDC315_LinkerlSEQ ID NO :1 :5’ -AGCTCGAATTCGTCGACAAGCTTGGATCCCTCGAGGCTAGCACTAGTCATATGC-3'SEQ ID NO :2 :5’ -TCGAGCATATGACTAGTGCTAGCCTCGAGGGATCCAAGCTTGTCGACGAATTC G-3'將IOOnmol SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2單鏈DNA混在一起，通過高溫變性 (950C 10分鐘)，緩慢退火復性(逐漸冷卻至室溫)過程，合成雙鏈DNA接頭，并在兩端分別形成EcoRI和XhoI粘性末端。以 EcoRI 和 SalI 雙酶切載體 pDC315 (購自 Microbix Biosystem Inc. Toronto)， 電泳回收載體片段(具體步驟參見回收試劑盒NucleospinExtract II)，并與Iinkerl連接，獲得 pDC315-linkerl，包含多克隆位點(multiple clone site, MCS)EcoRI-SalI-HindIII-BamHl-XhoI-NheI-SpeI-NdeI (Sail 與 XhoI 為同尾酶，連接后載體原有SalI位點被破壞)。pDC315載體含有5型腺病毒左臂El區1417至2344bp序列片段，反向末端重復序列(ITR)，mCMV啟動子，SV40PolyA，以及LoxP。酶切體系如下pDC315 質粒 2μ1EcoRI (NEB) 0. 5 μ 1SalI(NEB) 0. 5 μ 1Buffer (NEB) 2 μ 1ddH2015 μ 1_總體系20 μ 1連接體系如下pDC315 質粒 /EcoRI+Sall 6 μ 1Linkerl/EcoRI+XhoI4μ 1Solution I(TAKARA)IΟμ 1_總體系20 μ 1第二步構建pDC339合成EFl α啟動子-內含子序列(TAKARA)(序列見SEQ ID NO 3) SEQ ID NO 3 =EFl α啟動子-內含子序列，如下 |tctaga[ gctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaa (Xbai) GTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTC TTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGT TATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAG TGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCT GGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAAT TTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTAT TTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAG CGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGT ATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGG CCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCG AGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGA GACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCA TTCTCMGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATAC GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTC |gaattc| (ECORI)用XbaI和EcoRI分別雙酶切EFl α啟動子-內含子序列和pDC315_Linkerl載體， 連接獲得PDC339載體(酶切、回收、連接的方法同步驟一)。構建好的PDC339載體含有5 型腺病毒左臂El區1417至2344bp序列片段，反向末端重復序列(ITR)，EFl α啟動子-內含子，SV40PolyA,以及LoxP(參見圖1)。2. pDC359載體的構建合成mCMV 啟動子-Intron 序列(TAKARA)(序列見 SEQ ID NO 4)。SEQ ID NO 4 :mCMV 啟動子-Intron 序列，如下|tctaga1 gatatactgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataagg (Xbai)TCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCAT TGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTC AATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGG CTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGC CAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTG GCACTCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTC GGTCTGACCACCGTAGAACGCAGATCGAATTGGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGC GGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGA GACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACT TTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACC |gaattc| (EcoRI)用XbaI和EcoRI分別雙酶切mCMV啟動子-Intron序列和pDC339，連接后獲得 PDC359載體(酶切、回收、連接的方法同步驟一)。構建好的PDC339載體含有5型腺病毒左臂El區1417至2344bp序列片段，反向末端重復序列(ITR)，mCMV啟動子-Intron， SV40PolyA,以及 LoxP (參見圖 2)。3. pDC639載體的構建第一步構建pDC311_Linker2合成如下序列SEQ ID NO 5 5' -CTAGGTTAATTAATCTAGACATATGGCGGCCGCC-3，；SEQ ID NO 6 :5’ -TCGAGGCGGCCGCCATATGTCTAGATTAATTAAC-3，經變性、退火合成Linker2，其依次包含PacI，XbaI，NdeI和NotI四個酶切位點。 pDC311(購自 Microbix Biosystem Inc. Toronto)載體經XbaI 和 Sail 雙酶切，回收大片段產物，與Linker2連接，得到pDC311-Linker2 (酶切、回收、連接方法同上)。第二步合成ITR-EFl α啟動子-內含子-MCS-SV40PolyA_ITR序列(序列見SEQ ID NO 7)，
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SEQ ID NO 7 JTR-EFl α 啟動子-內含子-MCS-SV40PolyA_ITR 序列，如下[TTAATTAAl ACAGAGGAGCTTCCTGGGGATCTGTTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTC (PacI)GCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG(AAVITR)GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT |TCTAGA[ G CTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGA (XbaI)AGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTG ATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTT CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAA GTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGC TGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGC(EFl α )GCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTT TTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGG GCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAAT CGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCT GGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGG GAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTC CGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAG CTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTG GAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTT GGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTT GGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTC lGAATTCGTCGACGGATCCGCTAGC TTCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTA(MCS)SV40PolyATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCClCATATG|:AGGAACC CCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTG(NdeI)(AAV ITR)CGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAGTAGATCCCCAGGAAGCTCCTCTGT|GCGGCCGC| (NotI)PacI和NotI分別雙酶切合成的ITR-EFl α啟動子-內含子-MCS-SV40PolyA_ITR 基因序列和載體pDC311-Linker2，連接獲得pDC639。構建好的pDC639載體含有5型腺病毒左臂El區1417至2344bp序列片段，反向末端重復序列(ITR)，EFl α啟動子-內含子， SV40PolyA, LoxP以及腺相關病毒(AAV)的ITR序列(參見圖3)。4. pDC659載體的構建合成mCMV 啟動子-Intron 序列(TAKARA)(序列見:SEQ ID NO 4) ,XbaI 和 EcoRI 分別雙酶切mCMV啟動子-Intron序列和pDC639載體，經連接獲得pDC659載體。構建好的PDC659載體含有5型腺病毒左臂El區1417至2344bp序列片段，反向末端重復序列(ITR)， mCMV啟動子-Intron，SV40PolyA, LoxP以及腺相關病毒(AAV)的ITR序列(參見圖4)。實施例1構建的4個載體如表1所概括。表1 實施例 1 中構建的 pDC339、pDC359、pDC639、pDC659 載體
權利要求
1.一種多能免疫殺傷轉基因細胞，所述細胞具有細胞殺傷毒性，并且能夠表達人抗體的恒定區的部分或者全長。
2.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其為細胞免疫效應細胞。
3.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其為選自如下細胞中的一種或多種細胞細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、T細胞、細胞毒殺傷細胞、γ δ T細胞、自然殺傷細胞 (NK細胞)。
4.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述人抗體的恒定區為選自如下抗體中的一種的恒定區的全長人鼠嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。
5.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述人抗體的恒定區是通過轉染病毒載體實現的。
6.根據權利要求5所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述病毒載體為選自如下病毒載體中的一種或多種病毒載體非復制型病毒載體、復制型病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體。
7.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述含有人恒定區的抗體是通過轉染非病毒載體實現的。
8.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述抗體為抗腫瘤或抗病毒的抗體，并且具體地，選自如下抗體中的一種或多種抗體抗新生血管生成的抗體、抗腫瘤細胞生長因子受體的抗體、抗腫瘤細胞膜抗原的抗體、 抗腫瘤抗原的獨特型單克隆的抗體。
9.根據權利要求8所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述抗體為選自如下抗體中的一種或多種抗體抗血管內皮生長因子的抗體、抗血管內皮生長因子受體2的抗體、抗整合素的avb3的抗體、抑制新生血管內皮生成的抗體、抗表皮生長因子受體1的抗體、抗表皮生長因子受體 2的抗體、抗17-1A的抗體、抗⑶20的抗體、抗⑶52的抗體、抗MUCl的抗體、抗17-1A的獨特型單克隆抗體、抗癌胚抗原的獨特型單克隆抗體、抗GD3的獨特型單克隆抗體、抗MUCl的獨特型單克隆抗體、抗乙肝病毒的抗體、抗愛滋病毒的抗體。
10.根據權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于，所述人抗體恒定區的核苷酸序列可與外源基因的核苷酸序列形成融合基因。
11.根據權利要求10所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，其特征在于所述外源基因是抗癌基因，并且具體地，選自如下抗癌基因中的一種或多種抗癌基因血管抑制基因、細胞因子基因、前藥轉換酶基因及細胞毒性基因之一種；其中所述的血管抑制基因可以是內皮抑素基因，血管生成抑素基因，血漿纖維蛋白溶酶原中Kringlel-4結構、Kringlel-5結構、 Kringlel-3結構、Kringlel-3加上Kringle5結構、血小板反應蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑PAI基因及纖維結合素基因；所述的細胞因子基因可以是白細胞介素2、白細胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素_ α、干擾素-β、 干擾素_ Y、Light及Flt3配體；所述的前藥轉換酶基因可以是單純皰疹重組病毒胸腺嘧啶激酶、細菌β “內酰胺酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶；所述的細胞毒性基因可以是綠膿桿菌外毒片段。
12.權利要求1所述的多能免疫殺傷轉基因細胞的制備方法，包括將人抗體的恒定區的部分或者全長轉入具有細胞殺傷毒性的細胞并表達的步驟。
13.權利要求1-11中任一項所述的多能免疫殺傷轉基因細胞在用于如下六個方面之一的用途抑制腫瘤細胞生長、抑制病毒生長、制備用于治療腫瘤的藥物、制備用于治療病毒感染性疾病的藥物、制備用于治療細菌感染性疾病的藥物、或制備用于治療自身免疫疾病的藥物。
14.一種藥物組合物，其包含權利要求1-11中任一項所述的多能免疫殺傷轉基因細胞，以及藥學上可接受的輔料。
全文摘要
本發明涉及一種多能免疫殺傷轉基因細胞，特別是涉及一種具有細胞殺傷毒性并且表達含有人恒定區的抗體的多能免疫殺傷轉基因細胞。通過將編碼含有人恒定區的抗體的基因轉染至具有細胞殺傷毒性的細胞中并在該細胞中高水平表達該基因，發揮細胞免疫以及抗體的雙重作用，抑制腫瘤及病毒的增殖。本發明還涉及所述多能免疫殺傷轉基因細胞的制備方法以及用途。
文檔編號A61P31/04GK102220283SQ20101014968
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月19日 優先權日2010年4月19日
發明者丁娜, 吳孟超, 吳紅平, 孫艷, 徐鳳青, 李琳芳, 金華君, 錢其軍 申請人:錢其軍