一種高效表達(dá)抗菌肽餌料藻的構(gòu)建技術(shù)與應(yīng)用方法

專利名稱：一種高效表達(dá)抗菌肽餌料藻的構(gòu)建技術(shù)與應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請(qǐng)涉及一種能夠高效表達(dá)抗菌肽基因的載體的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體以及能夠高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antibacterial ρ印tide)最初是從免疫后的昆蟲血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類活性多肽，是一類由20 60個(gè)氨基酸組成的活性肽類物質(zhì)，通常含有2 3個(gè)帶正電荷的氨基酸，如精氨酸或賴氨酸，因此又稱陽(yáng)性抗菌肽。抗菌肽是一種具有雙親性質(zhì)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，分子中的疏水部分一般位于C端，而陽(yáng)離子氨基酸部分位于N端，而且所有抗菌肽的C 末端都是酰胺化的。它的分子量一般在幾千個(gè)道爾頓(Da)之間，具有水溶性好，不易被酶水解，熱穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。一般的抗菌肽都具有廣譜的抗菌性，對(duì)真菌、原生生物也能起一定的抵抗作用，有一些特殊的抗菌肽還能殺死病毒和腫瘤細(xì)胞?？咕臍⒕哂懈咝?，在濃度很低的情況下就可以發(fā)揮作用，其最小抑菌濃度一般為0. 25 4μ g/ml。1975年瑞典科學(xué)家G. Boman等將蠟狀芽孢桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶 (Hylophoracecropia)產(chǎn)生一種新的肽類物質(zhì)，命名為天蠶素(cecropins)，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。此后，人們又在細(xì)菌、真菌、兩棲類、哺乳動(dòng)物、植物和人類中相繼發(fā)現(xiàn)并分離得到了多種抗菌肽，迄今為止，已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)了 1700多種抗菌肽。近年來的研究表明，抗菌肽具有不同于一般抗生素的特殊作用機(jī)制，使細(xì)菌不容易產(chǎn)生耐藥性，有望成為新一代抗菌藥物。天蠶素Cecropin B是一種從家蠶中分離得到的昆蟲抗菌肽，具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、廣譜抗菌等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是Cecropin B對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒有作用，僅僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，是目前已知天然抗菌肽中活力最強(qiáng)的一種。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)屬于綠藻門、團(tuán)藻目、衣藻科，是一種單細(xì)胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(dòng)(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性和生理節(jié)律等) 的模式生物，與酵母細(xì)胞有許多共同的特征，素有“光合酵母”之稱。它的遺傳背景清楚，其基因組學(xué)研究已近完成，是目前唯一建立細(xì)胞核、葉綠體和線粒體三套遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的生物材料。由于其生長(zhǎng)速度快、光合效率高、可進(jìn)行基因定點(diǎn)整合，是最適合構(gòu)建轉(zhuǎn)基因光合生物反應(yīng)器的單細(xì)胞真核生物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑。抗菌肽具有抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變和對(duì)動(dòng)植物無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，其作為理想的抗生素替代品，正受到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景?？咕牡谋磉_(dá)在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中已經(jīng)存在， 特別是在酵母細(xì)胞中有較好的表達(dá)效果，但還未有在萊茵衣藻中表達(dá)抗菌肽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠在萊茵衣藻內(nèi)高效表達(dá)天蠶素B基因的表達(dá)載體，以及經(jīng)過該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子，由于經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻能夠高效表達(dá)天蠶素B，所以可以作為活體餌料，也可以應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑、生物制藥、保健品研制等領(lǐng)域。本發(fā)明是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的一種高效表達(dá)抗菌肽餌料藻的構(gòu)建技術(shù)，其特征在于將人工合成的含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因?qū)胧荏w藻株中，經(jīng)篩選得到能高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻，此方法包括以下步驟1)轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)選用餌料藻(如底棲硅藻、小球藻、萊茵衣藻等) 作為轉(zhuǎn)基因受體藻株，具有生長(zhǎng)迅速、易培養(yǎng)等特點(diǎn)。采用藻類特定培養(yǎng)基(如BBM、BG-11 和TAP等)，在光照90 200 μ E/m2. s的條件下通氣培養(yǎng)；2)抗菌肽基因的合成a、根據(jù)抗菌肽基因序列(如Cecropin B等)和受體藻基因組偏愛密碼子表，設(shè)計(jì)適合于藻類表達(dá)的抗菌肽序列，并通過人工合成的方法合成抗菌肽基因。b、利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)藻類抗菌肽表達(dá)載體的構(gòu)建將串聯(lián)抗菌肽基因(如串聯(lián)Cecr0pinB，4個(gè)串聯(lián))插入藻類表達(dá)載體(如萊茵衣藻PH105載體的Nhe I和Pmac I位點(diǎn))，獲得抗菌肽基因表達(dá)框架，然后分別將抗菌肽基因表達(dá)框架插入帶篩選標(biāo)記表達(dá)盒的載體(如萊茵衣藻 PSP124的EcoR I位點(diǎn))，獲得帶篩選標(biāo)記的抗菌肽基因衣藻核表達(dá)載體；4)抗菌肽基因表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因藻的篩選分別將抗菌肽基因表達(dá)載體，通過“珠磨法”、基因槍法或電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過抗性平板篩選或營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，獲得陽(yáng)性藻落，進(jìn)行分子檢測(cè)和表達(dá)產(chǎn)物分析，確定高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻。上述的連接抗菌肽單體成為串聯(lián)抗菌肽基因的連接肽編碼序列，其特征在于藻類細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物是6個(gè)氨基酸的肽段，且在細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行自剪切(如萊茵衣藻連接肽序列 LWMRFA等)，通過連接肽將抗菌肽單體基因連接起來，形成易于操作的串聯(lián)抗菌肽基因片段。上述的轉(zhuǎn)抗菌肽基因受體藻株，其特征在于能夠作為餌料或飼料的藍(lán)藻、綠藻、硅藻、甲藻等微藻。上述的抗菌肽基因，其特征包括能在藻類細(xì)胞中有效表達(dá)的不同來源和種類的抗菌肽基因，直接或經(jīng)過藻類優(yōu)先密碼子改造后，轉(zhuǎn)入受體藻株，獲得表達(dá)具有抗菌活性的轉(zhuǎn)基因藻。上述的高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻，其應(yīng)用方法包括1)直接作為水產(chǎn)動(dòng)物的活體餌料，或飼養(yǎng)動(dòng)物的活體飼料；2)大量培養(yǎng)后制成干藻粉，添加到水產(chǎn)動(dòng)物餌料或家養(yǎng)動(dòng)物飼料中，其添加比例根據(jù)需要可以達(dá)到-99% ；3)大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻后，從藻細(xì)胞中提取具有抗菌活性的重組抗菌肽，應(yīng)用于醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、動(dòng)物飼料和保健品等制品。


圖1目的基因序列設(shè)計(jì)圖2萊茵衣藻重組表達(dá)載體的構(gòu)建圖3菌落PCR鑒定圖4衣藻表達(dá)載體酶切鑒定圖5衣藻總DNA的PCR鑒定圖6轉(zhuǎn)基因衣藻的RT-PCR鑒定圖7轉(zhuǎn)基因衣藻Western Blot鑒定圖
圖8抑菌圈實(shí)驗(yàn)圖。
具體實(shí)施例方式1.材料與方法1. 1 材料質(zhì)粒pH105 (含衣藻hsp70-RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子)，質(zhì)粒pSP124 (帶有ble 基因，使宿主細(xì)胞具有腐草霉素和Zeomycin抗性)，大腸桿菌ToplO、JM109菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC-849)由美國(guó) Duke 大學(xué) Chlamydomonas 遺傳中心提供，打孔器、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Nhe I.Sal I和EcoR I購(gòu)自TaKaRa 生物(大連)有限公司，DNAExtraction kit購(gòu)自晶美生物工程有限公司，Ε. Ζ. N. A Plasmid Miniprep KitI 購(gòu)自 Promega 公司，DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0、 RNA PCRKit (AMV) ver 3· O購(gòu)自TaKaRa生物(大連)有限公司。1.2 方法1. 2. 1人工合成串聯(lián)CecropinB基因根據(jù)萊茵衣藻偏好的密碼子，由于萊茵衣藻細(xì)胞核內(nèi)基因?qū)τ贕、C兩種堿基有很強(qiáng)的偏愛性，因此我們依據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性特點(diǎn)結(jié)合萊茵衣藻偏愛密碼子表對(duì)原始的 CecropinB基因進(jìn)行了改造，改造后的基因序列在不改變?cè)邪被嵝蛄械幕A(chǔ)上，提高了基因編碼序列的GC含量。改造并化學(xué)合成CecropinB (Genebank登陸號(hào)為AAA29184)。 將四段相同的Cecropin B基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列 LWMRFA，末尾加上His6標(biāo)簽，兩端設(shè)計(jì)了 Nhe I.Sal I限制性內(nèi)切酶，總基因長(zhǎng)度為522bp， 由上海生工完成整個(gè)外源基因的合成工作。1. 2. 2萊茵衣藻重組表達(dá)載體的構(gòu)建先將外源基因連接到含有hsp70_RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子的pH105載體上，構(gòu)建載體PCB105，接著將pCB105上的表達(dá)框架切下連接到含有ble篩選基因的載體 PSP124上構(gòu)建最終的衣藻表達(dá)載體pCB124。載體構(gòu)建完成后進(jìn)行PCR、酶切鑒定以及基因測(cè)序來驗(yàn)證基因序列的正確性。1. 2. 3 “玻璃珠法”轉(zhuǎn)化萊茵衣藻并篩選陽(yáng)性克隆子對(duì)于經(jīng)Not I酶切的重組質(zhì)粒PCB124線性化后，采用“玻璃珠法”轉(zhuǎn)化萊茵衣藻細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后涂布在含 ο μ g/mL的Zeomycin TAP平板上，于22°C光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，觀察綠色單克隆藻落生長(zhǎng)情況。取20ml處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的萊茵衣藻培養(yǎng)液，于4°C 5000rpm離心5min，去上清， 收集藻細(xì)胞。提取萊茵衣藻CC-849和轉(zhuǎn)基因衣藻的基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，檢驗(yàn)有無(wú)基因整合入萊茵衣藻中。1. 2. 4轉(zhuǎn)基因衣藻的RT-PCR分析提取萊茵衣藻CC-849和轉(zhuǎn)基因衣藻的總RNA，取1 μ g作為模板，采用TaKaRa 生物(大連)有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver 3. 0進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以引物PI、P2 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增(弓丨物 Pl 序列為5，-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3, P2 序列為 5，-GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’ )。RT-PCR 條件30°C, IOmin ；50°C，40min ；99°C，5min ；5°C，5min。PCR 條件94°C變性 3min，94°C，30s ；60°C, Imin ；72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin01. 2. 5轉(zhuǎn)基因衣藻的Western blot分析由于衣藻表達(dá)載體pH105的啟動(dòng)子為HSP70A-RBCS2，串聯(lián)有熱休克蛋白HSP70A的啟動(dòng)子，此啟動(dòng)子具有熱激誘導(dǎo)的特性。分別將萊茵衣藻cc-849和轉(zhuǎn)基因衣藻接種于新鮮的TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，進(jìn)行二次熱激誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。先置于40°C培養(yǎng)箱下，光照熱激誘導(dǎo)30min，然后放回22°C光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)5h ；光照完畢后再次置于40°C培養(yǎng)箱下，進(jìn)行第二次熱激誘導(dǎo)30min，再放回22°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh。提取衣藻總蛋白，使用His6單克隆抗體作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 作為二抗，進(jìn)行免疫印記，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因衣藻中目的蛋白CecropinB的表達(dá)。1.2. 6抑菌圈法檢測(cè)蛋白抑菌活性在LB平板上涂布IOOul培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的JM109細(xì)菌，待菌液稍干后用滅菌的打孔器打孔，接著用液體的LB —滴封底，加入IOOul藻蛋白提取液，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h觀察抑菌圈形成情況。1. 2. 7比濁法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法在0. 5ml的Enppendorf管中按以下比例加樣JM109過夜培養(yǎng)物5 μ L(0D = 1)， LB培養(yǎng)液50 μ L，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻蛋白抽提上清液(蛋白濃度為0. 03mg/ ml)分別加75 μ L (對(duì)照組用等量LB補(bǔ)加)，混勻，于37°C水浴2. 5 3h，其間不斷搖勻，然后稀釋至3mL的LB液中，同樣輕搖溫育lh，取出在721分光光度計(jì)上測(cè)溶液在600nm處的 OD值。2、結(jié)果與分析2. 1串聯(lián)抗菌肽的設(shè)計(jì)與合成人工合成的基因序列設(shè)計(jì)如圖1所示，將上海生工合成的串聯(lián)CecropinB基因送與深圳欣海凌生物公司測(cè)序，測(cè)序報(bào)告顯示結(jié)果表明，串聯(lián)CecropinB基因序列與上海生工提供的合成報(bào)告單完全相符。基因設(shè)計(jì)序列如下GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGG
CGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGACpCB124載體測(cè)序序列如下GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGAC由于萊茵衣藻細(xì)胞核內(nèi)基因?qū)τ贕、C兩種堿基有很強(qiáng)的偏愛性，因此我們依據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性特點(diǎn)結(jié)合萊茵衣藻偏愛密碼子表對(duì)原始的CecropinB基因進(jìn)行了改造，改造后的基因序列在不改變?cè)邪被嵝蛄械幕A(chǔ)上，提高了基因編碼序列的GC含量，經(jīng)過改造后的串聯(lián)CecropinB基因全長(zhǎng)522bp，其中GC含量為64.2%，極大地滿足了萊茵衣藻基因組對(duì)于GC堿基的偏愛性，從而使得串聯(lián)CecropinB基因更易整合入萊茵衣藻基因組中并獲得穩(wěn)定表達(dá)。2. 2含串聯(lián)抗菌肽萊茵衣藻表達(dá)載體的構(gòu)建如圖2所示，將CecropinB基因克隆到含hsp70_RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子的 PH105載體上，再與攜帶ble篩選基因的表達(dá)框架連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體PCB124。載體構(gòu)建好后進(jìn)行菌落PCR以及酶切鑒定。2. 3萊茵衣藻重組表達(dá)載體的菌落PCR鑒定挑取轉(zhuǎn)化子單克隆劃線保種后，進(jìn)行菌落PCR鑒定。從圖3可以看到，在重組菌 CB-UCB-2與陽(yáng)性對(duì)照(含有目的基因的質(zhì)粒)的PCR圖譜上分別可看到一條522bp的條帶，與目的基因大小相同，據(jù)此，我們可以判斷目的基因已經(jīng)連接到了相應(yīng)的載體上。CB-I 菌落PCR結(jié)果圖出現(xiàn)目的條帶，說明目的基因已經(jīng)連接到了含有hsp70-RBCS2啟動(dòng)子和 RBCS2終止子的pH105載體上，具有了可以順利表達(dá)的表達(dá)初步框架，CB-2菌落PCR結(jié)果出現(xiàn)目的條帶，則說明了最終的表達(dá)載體上連接上了 ble篩選基因，ble篩選基因的存在是為了便于在轉(zhuǎn)化子平板上篩選出對(duì)Zeomycin具有抗性的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。2. 4萊茵衣藻重組表達(dá)載體PCB124的酶切鑒定如圖4所示，用Nhe I和Sal I限制性內(nèi)切酶酶切pCB57質(zhì)粒，切下含有522bp的目的基因CecropinB (泳道1)，將之連接至經(jīng)Nhe I和Sal I雙酶切后的pH105載體上。經(jīng)酶切鑒定結(jié)果顯示，獲得了插入目的基因的載體pCB105(泳道3)。將pCB105采用EcoR I 酶切，得到包含萊茵衣藻hsp70-RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子以及插入CecropinB基因的表達(dá)框架，全長(zhǎng)1300bp。再將CecropinB基因表達(dá)框架與經(jīng)EcoR I酶切后的pSP124載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO后經(jīng)酶切鑒定，篩選出正確的重組質(zhì)粒PCB124 (泳道5，亦可用 EcoR I酶切下一條長(zhǎng)1300bp的表達(dá)框架)。由此結(jié)果可以驗(yàn)證，衣藻表達(dá)載體PCB124已經(jīng)構(gòu)建成功。為了驗(yàn)證我們所構(gòu)建的表達(dá)載體基因是否有突變以及方向性的正確性，我們將重組載體送與深圳欣海凌生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示所構(gòu)建載體PCB124沒有發(fā)生基因突變，串聯(lián)CecropinB基因與合成序列同源性為100%，并且各個(gè)片段連接方向正確，含有ble 基因序列。至此，萊茵衣藻重組表達(dá)載體已經(jīng)完全被驗(yàn)證構(gòu)建成功。2. 5轉(zhuǎn)基因衣藻的PCR分析.如圖5所示，轉(zhuǎn)化子經(jīng)Zeomycin TAP平板抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆后，劃線保種陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型萊茵衣藻基因組DNA，以引物P1、P2進(jìn)行PCR。轉(zhuǎn)基因衣藻PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段。這表明CecropinB 基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻基因組中。由于串聯(lián)CecropinB基因整合進(jìn)入萊茵衣藻基因組中的方式是隨機(jī)進(jìn)行的，因此，采用相同的外源基因轉(zhuǎn)化萊茵衣藻，可以產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)化子， 它們可能都能夠在Zeomycin TAP抗性平板上生長(zhǎng)，但是卻可能整合到萊茵衣藻基因組的不同位置。2. 6轉(zhuǎn)基因衣藻的RT-PCR分析如圖6所示，提取轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型萊茵衣藻的總RNA，以TaKaRa PCR(AMV)Kit ver 3.0進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以轉(zhuǎn)基因衣藻cDNA為模板，引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過
瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段。這表明CecropinB基因在轉(zhuǎn)錄水平上已經(jīng)獲得了表達(dá)。轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)成功，說明了串聯(lián)CecropinB基因能夠成功進(jìn)行自我復(fù)制，并且CecropinB基因在萊茵衣藻的細(xì)胞中能夠轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的mRNA。2. 7轉(zhuǎn)基因衣藻的Western Blot分析如圖7所示，HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子是一個(gè)熱激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在40°C條件下熱激一定的時(shí)間，能顯著的提高外源基因的表達(dá)水平。將萊茵衣藻cc-849、轉(zhuǎn)CecropinB基因衣藻置于40°C下，進(jìn)行二次熱激誘導(dǎo)，以提高CecropinB基因在萊茵衣藻中的表達(dá)量。使用His6單克隆抗體作為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗與提取的衣藻總蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，以檢測(cè)萊茵衣藻中CecropinB的表達(dá)。與對(duì)照組相比，在14KD和20KD 附近各有一雜交信號(hào)帶，推測(cè)該條帶可能為不同數(shù)目的抗菌肽蛋白單體的表達(dá)產(chǎn)物。一個(gè) CecropinB抗菌肽單體含有36個(gè)氨基酸，由此可計(jì)算出一個(gè)抗菌肽單體蛋白的分子量為 4. 3KD，加上中間2個(gè)連接肽序列，一個(gè)連接肽含有6個(gè)氨基酸，那么兩個(gè)連接肽序列表達(dá)的蛋白分子量應(yīng)該為1. 4KD，因此三個(gè)多肽式抗菌肽單體和兩個(gè)連接肽序列的表達(dá)產(chǎn)物總分子量應(yīng)該為14. 3KD，這與我們從圖7上看到的蛋白分子量的位置是相吻合的。同理我們可以計(jì)算出四個(gè)多肽式抗菌肽單體加上三個(gè)連接肽序列以及6個(gè)His組氨酸標(biāo)簽蛋白的總分子量應(yīng)該為20. 08KD，這與我們圖7中反應(yīng)的條帶位置也是相一致的。此結(jié)果說明了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中確實(shí)可以獲得不同程度的表達(dá)。 從而從蛋白水平上印證了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中表達(dá)的可行性。2. 8抑菌圈法鑒定蛋白功能結(jié)果分析從圖8中我們可以看到，轉(zhuǎn)基因衣藻總蛋白抑菌效果圖中出現(xiàn)了明顯的抑菌圈， 而野生型衣藻總蛋白抑菌效果圖中則沒有出現(xiàn)抑菌圈，經(jīng)測(cè)量得知轉(zhuǎn)基因衣藻總蛋白抑菌圈半徑長(zhǎng)為0.2cm。由此我們可以推斷，轉(zhuǎn)基因衣藻總蛋白對(duì)細(xì)菌具有抑制作用，野生型衣藻總蛋白對(duì)細(xì)菌不具有抑菌作用。這說明，我們的串聯(lián)CecropinB基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入單細(xì)胞生物萊茵衣藻CC-849中，并且在萊茵衣藻中獲得了成功表達(dá)，更重要的是，串聯(lián) CecropinB基因所表達(dá)的目的基因具有蛋白活性即抗菌生物活性。因此當(dāng)具有抗菌生物活性的轉(zhuǎn)基因衣藻總蛋白提取物加入到孔洞內(nèi)時(shí)，就會(huì)在空洞的周圍出現(xiàn)顯著的抑菌透明圈，相反，野生型衣藻總蛋白則由于沒有外源抗菌肽基因的導(dǎo)入，不能表達(dá)抗菌活性的蛋白，所以就不能產(chǎn)生抑菌圈。2. 9比濁法測(cè)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析比濁法測(cè)量抑菌效果是將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)基因衣藻與野生型衣藻總蛋白提取物，對(duì)照組加入LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)一段時(shí)間后，測(cè)量培養(yǎng)液的OD值，將實(shí)驗(yàn)組 OD值與對(duì)照組OD值做比較，用實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組細(xì)菌OD值降低的程度來說明其抑菌效果，OD值降低越大，說明加入實(shí)驗(yàn)組蛋白后菌數(shù)量減少的越多，則該組蛋白具有越強(qiáng)的抑菌效果。表比濁法測(cè)量抑菌效果數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種在藻類中高效表達(dá)抗菌肽的載體構(gòu)建方法，其特征在于此方法包括以下步驟1)根據(jù)抗菌肽基因序列和受體藻基因組偏愛的密碼子表，設(shè)計(jì)合成適合于藻類表達(dá)的抗菌肽基因序列；2)利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)將串聯(lián)抗菌肽基因插入含有藻類啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)載體，獲得抗菌肽基因表達(dá)框架；4)將抗菌肽基因表達(dá)框架插入帶篩選標(biāo)記表達(dá)盒的載體中，獲得帶篩選標(biāo)記的抗菌肽基因的表達(dá)載體。
2.如權(quán)利要求1所述的在藻類中高效表達(dá)抗菌肽的載體構(gòu)建方法，其特征在于在萊茵衣藻中表達(dá)抗菌肽Cecropin B基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法包括以下步驟1)根據(jù)萊茵衣藻基因組偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)合成適合于萊茵衣藻表達(dá)的天蠶素 Cecropin B基因序列；1)將四段相同的CecropinB基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列LWMRFA，末尾加上His6標(biāo)簽，兩端設(shè)計(jì)了 Nhe I、Sal I限制性內(nèi)切酶，總基因長(zhǎng)度為 522bp ；2)將串聯(lián)CecropinB基因連接到含有hsp70_RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子的pH105載體上，構(gòu)建載體PCB105，獲得天蠶素CecropinB基因表達(dá)框架；3)用限制性內(nèi)切酶NheI.Sal I將pCB105上的天蠶素CecropinB基因表達(dá)框架切下， 連接到含有ble篩選基因的載體PSP124上，構(gòu)建最終的衣藻表達(dá)載體pCB124。
3.一種高效表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因藻的構(gòu)建技術(shù)，其特征在于將人工合成的含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因?qū)胧荏w藻株中，經(jīng)篩選得到能高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻，此方法包括以下步驟1)轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)選用餌料藻作為轉(zhuǎn)基因受體藻株，具有生長(zhǎng)迅速、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，采用藻類特定培養(yǎng)基，在光照90 200μ E/m2. s的條件下通氣培養(yǎng)；2)抗菌肽基因的合成a、根據(jù)抗菌肽基因序列和受體藻基因組偏愛密碼子表，設(shè)計(jì)適合于藻類表達(dá)的抗菌肽序列，并通過人工合成的方法合成抗菌肽基因；b、利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)藻類抗菌肽表達(dá)載體的構(gòu)建將串聯(lián)抗菌肽基因插入藻類表達(dá)載體，獲得抗菌肽基因表達(dá)框架，然后分別將抗菌肽基因表達(dá)框架插入帶篩選標(biāo)記表達(dá)盒的載體，獲得帶篩選標(biāo)記的抗菌肽基因表達(dá)載體；4)抗菌肽基因表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因藻的篩選分別將抗菌肽基因表達(dá)載體， 通過“珠磨法”、基因槍法或電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過抗性平板篩選或營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，獲得陽(yáng)性藻落，進(jìn)行分子檢測(cè)和表達(dá)產(chǎn)物分析，確定高效表達(dá)抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻。
4.如權(quán)利要求3所述的高效表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因藻的構(gòu)建技術(shù)，其特征在于采用萊茵衣藻作為受體藻株，構(gòu)建能表達(dá)天蠶素Cecropin B轉(zhuǎn)基因藻的方法，具體包括以下步驟1)轉(zhuǎn)基因受體萊茵衣藻的篩選與培養(yǎng)選擇細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii cc-849作為轉(zhuǎn)基因的受體藻株，使用TAP培養(yǎng)基作為萊茵衣藻的培養(yǎng)基，萊茵衣藻的培養(yǎng)條件包括在22-25°C，90 μ E/m2/s光照條件下連續(xù)培養(yǎng)，藻細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度達(dá)到l-2X106cellS/mL時(shí)，收集藻細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；2)串聯(lián)抗菌肽CecropinB基因的改造與合成根據(jù)萊茵衣藻偏好的密碼子，由于萊茵衣藻細(xì)胞核內(nèi)基因?qū)τ贕、C兩種堿基有很強(qiáng)的偏愛性，因此依據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性特點(diǎn)結(jié)合萊茵衣藻偏愛密碼子表，對(duì)原始的CecropinB基因進(jìn)行改造，改造后的基因序列在不改變?cè)邪被嵝蛄械幕A(chǔ)上，提高了基因編碼序列的GC含量；將四段改造后的Cecropin B基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列LWMRFA，末尾加上His6標(biāo)簽， 兩端設(shè)計(jì)了 Nhe I、Sal I限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)總基因長(zhǎng)度為522bp串聯(lián)CecropinB基因序列；3)抗菌肽CecropinB基因萊茵衣藻表達(dá)載體的構(gòu)建先將總長(zhǎng)度為522bp串聯(lián) CecropinB基因序列連接到含有hsp70_RBCS2啟動(dòng)子和RBCS2終止子的pH105載體上，構(gòu)建載體PCB105 ；接著將PCB105上的表達(dá)框架切下，連接到含有ble篩選基因的載體pSP124 上構(gòu)建最終的衣藻表達(dá)載體PCB124 ；4)表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化采用QIAGENePlasmidPurification Kit分別提取重組質(zhì)粒PCB124，經(jīng)Not I酶切的重組質(zhì)粒，使其線性化后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其遺傳轉(zhuǎn)化方法包括 “珠磨法”、“基因槍法”和“電擊轉(zhuǎn)化法”；5)能表達(dá)CecropinB轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻篩選鑒定，包括以下步驟(1)轉(zhuǎn)基因藻PCR檢測(cè)人工合成引物P1、P2，轉(zhuǎn)化子經(jīng)ZeomycinTAP平板抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆后，劃線保種陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；提取轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型萊茵衣藻基因組DNA ；利用引物 P1、P2 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 條件94°C變性 3min，94°C，30s ；60°C，lmin ；72°C，lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin ；轉(zhuǎn)基因衣藻PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 %瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段；這表明CecropinB基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻基因組中；(2)轉(zhuǎn)基因藻的RT-PCR檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因衣藻的總RNA，取1μ g作為模板，采用TaKaRa 生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver 3. O進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以引物P1、P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR 條件30°C, IOmin ；50°C，40min ；99°C，5min ；5°C，5min ；RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊 脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段，這表明CecropinB基因在轉(zhuǎn)錄水平上已經(jīng)獲得了表達(dá)，轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)成功，說明了串聯(lián)CecropinB基因能夠成功進(jìn)行自我復(fù)制，并且CecropinB基因在萊茵衣藻的細(xì)胞中能夠轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的mRNA ；(3)轉(zhuǎn)基因藻的Western-Blot檢測(cè)將萊茵衣藻cc_849、轉(zhuǎn)CecropinB基因衣藻置于40°C下，進(jìn)行熱激誘導(dǎo)以提高CecropinB基因在萊茵衣藻中的表達(dá)量，使用His6單克隆抗體作為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗與提取的衣藻總蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，以檢測(cè)萊茵衣藻中CecropinB的表達(dá)，此結(jié)果說明了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中確實(shí)可以獲得不同程度的表達(dá)，從而從蛋白水平上印證了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中表達(dá)的可行性。
5.如權(quán)利要求4所述的高效表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因藻的構(gòu)建技術(shù)，其特征在于所述的弓丨物Pl序列為5，-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3, P2序列為 5’ -GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’。
6.如權(quán)利要求1或2所述的在藻類中高效表達(dá)抗菌肽的載體構(gòu)建方法，其特征在于 所述的連接肽是藻類細(xì)胞中存在的6個(gè)氨基酸左右的肽，且在細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行自剪切，萊茵衣藻連接肽序列為L(zhǎng)WMRFA，通過連接肽將抗菌肽單體基因連接起來，形成易于操作的串聯(lián)抗菌肽基因片段，在藻類中表達(dá)后能利用藻細(xì)胞內(nèi)的自剪切機(jī)制將串聯(lián)肽切開成具有活性的單體抗菌肽。
7.如權(quán)利要求3或4所述的高效表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因藻的構(gòu)建技術(shù)，其特征在于能夠作為餌料或飼料的微藻包括藍(lán)藻、綠藻、硅藻和甲藻。
8.如權(quán)利要求1或2所述的在藻類中高效表達(dá)抗菌肽的載體構(gòu)建方法，其特征在于 所述的抗菌肽基因包括能在藻類細(xì)胞中有效表達(dá)的不同來源和種類的抗菌肽基因，直接或經(jīng)過藻類優(yōu)先密碼子改造后，轉(zhuǎn)入受體藻株，能獲得表達(dá)具有抗菌活性的轉(zhuǎn)基因藻。
9.權(quán)利要求3或4所述的高效表達(dá)抗菌肽轉(zhuǎn)基因藻的構(gòu)建技術(shù)所得到的轉(zhuǎn)基因藻的應(yīng)用包括以下方面1)直接作為水產(chǎn)動(dòng)物的活體餌料，或飼養(yǎng)動(dòng)物的活體飼料；2)大量培養(yǎng)后制成干藻粉，添加到水產(chǎn)動(dòng)物餌料或家養(yǎng)動(dòng)物飼料中，其添加比例根據(jù)需要可以達(dá)到-99% ；3)大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻后，從藻細(xì)胞中提取具有抗菌活性的重組抗菌肽，應(yīng)用于醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、動(dòng)物飼料和保健品領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明申請(qǐng)公開了一種高效表達(dá)抗菌肽的基因工程餌料微藻的構(gòu)建技術(shù)與應(yīng)用方法。根據(jù)藻類偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)改造并人工合成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因，將串聯(lián)抗菌肽基因克隆到含藻類高效啟動(dòng)子和終止子的載體上，再與攜帶篩選基因的表達(dá)框架連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。采用玻璃珠轉(zhuǎn)化法、基因搶法或電擊轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入微藻中，并篩選得到轉(zhuǎn)基因藻。本發(fā)明生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因藻具有高效表達(dá)抗菌肽的能力，其藻細(xì)胞或提取物均具有抗菌特性，可以作為活體餌料，也可以應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑、生物制藥、保健品研制等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P31/00GK102220362SQ20101014881
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者穆菲蕓, 胡章立 申請(qǐng)人:深圳大學(xué), 深圳市深博泰生物科技有限公司