半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用的制作方法

文檔序號：1182804閱讀：308來源：國知局

專利名稱：半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用。
背景技術：
化療是目前臨床治療癌癥非常有效和常用的方法。但嚴重的副作用和癌細胞的抗藥性往往會導致治療的中斷或者失敗。現在常用的化療藥物及相應的副作用有環磷酰胺 (CTX)副作用為骨髓抑制、出血性膀胱炎；異磷酰胺(IFO)副作用為出血性膀胱炎、骨髓抑制；順鉬(DDP)副作用為腎臟毒性、消化道反應、耳毒性、神經毒性；卡鉬(CARBO)副作用為骨髓抑制；米托蒽醌(Mx)副作用為心臟毒性、骨髓抑制；氨甲蝶呤(MT)副作用為腎毒性、肺纖維化、口腔潰瘍；阿糖胞苷(Ara-C)副作用為肝損害；博來霉素(BLM)副作用為肺纖維化；平陽霉素(PYM)肺纖維化；紫杉醇(TAXOL)副作用過敏、心臟傳導障礙、末梢神經炎；長春新堿(VCR)末梢神經炎，外滲皮膚損害；5-氟尿嘧啶(5-FU)副作用為腹瀉；鬼臼素(足葉乙甙，VP-16)副作用為骨髓抑制；和美新(TOPO)副作用為骨髓抑制；阿霉素(ADR)副作用為心臟毒性、骨髓抑制、消化道和腎臟毒性等。因此出現大量復合的抗癌藥物或者組合抗癌藥，其中專利有CN101040859A、 CN101495148A、CN101040959A、CN101273963A、CN101495148A 等；這些組合要的成分涉及到烷化劑、抗代謝物類藥物、抗生素類抗癌藥、植物生物堿類藥物、蒽二酮類藥物、天然產物、激素、激素拮抗劑和其它藥物放射增敏劑鉬配位復合物腎上腺皮質抑制劑免疫抑制劑功能性治療劑基因治療劑反義治療劑酪氨酸激酶抑制劑單克隆抗體免疫毒素放射性免疫綴合物癌癥疫苗干擾素白細胞介素取代脲類紫杉烷類C0X-2抑制劑。半胱胺又稱β —疏基乙胺(簡稱CS)，可從動物毛發中提取，也可化學合成，作為半胱氨酸的脫羧產物，半胱胺是輔酶A分子的組成成分及動物體內的生物活性物質，在體內具有重要的生理作用。半胱胺在家禽生產中的應用有調節激素水平，促進動物生長；提高營養物質的消化代謝；提高動物機體免疫力。半胱胺在現今臨床醫療中的應用有治療白內障和胱氨酸病，放射病綜合征，急性和慢性金屬中毒。

發明內容
本發明是針對化療效果和嚴重副作用，提供半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用。利用半胱胺添加到目前使用的化療藥物中可制成新的治療癌癥的組合藥劑。這種組合藥劑使用時可降低化療藥物的有效劑量即可達到治療效果，從而降低化療藥物產生的副作用。本發明還提供一種治療癌癥的組合藥劑，其有效成分包括半胱胺和化療藥物。所述治療癌癥的組合藥劑中還包括醫學上可接受的輔料。本發明組合藥物的兩種成分可以一起給藥或分開給藥，藥劑形式可以是，但不限于片劑、膏劑、膠囊、粉劑、注射劑、溶液劑等。
本發明制備出的抗癌組合藥劑可以通過以下方式給藥局部給藥(topical)直接用藥于要影響的身體部位，包括表皮給藥，吸入給藥，灌腸給藥。消化道給藥(enteral) 口服給藥，本技術中的增敏劑和化療藥物可以制成片劑、膠囊、藥水等，其他的還有插管、肛門給藥等。非消化道給藥(parenteral)靜脈注射，動脈注射，肌肉注射，皮下注射，骨髓注射，皮內注射，透皮給藥，粘膜給藥，吸入給藥等。其他給藥方式腹腔注射、硬膜外腔注射、脊髓注射、眼球玻璃體注射等。本治療癌癥的藥物可以分開給藥，組分半胱胺優選的給藥方式有靜脈注射、肌肉注射等常規給藥方式，因為在半胱胺治療急性金屬中毒(如四乙基鉛中毒)和防治放射病的臨床應用中，靜脈注射被認為是首選的可靠的給藥方式。而在臨床上治療慢性金屬中毒的給藥方式，首選為肌肉注射，所以這兩種注射方式是被臨床驗證的，半胱胺安全、可靠的給藥方式，只是根據吸收速率等的不同，需要依臨床實例進行選擇。另外高劑量半胱胺可能會引起胃潰瘍，所以在高劑量給藥的情況下盡量避免口服給藥。該治療癌癥的組合藥劑可以用于治療人體各種實體瘤包括起源于大腦、中樞神經系統、腎臟、肝、膽囊、頭頸部、口腔、甲狀腺、皮膚、黏膜、腺體、血管、骨組織、淋巴結、肺臟、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宮、卵巢、子宮內膜、子宮頸、前列腺、膀胱、結腸、直腸的原發或轉移的癌或肉瘤或癌肉瘤的藥物。本治療癌癥的組合藥劑雖沒有應用于臨床，但細胞實驗證明，在使用半胱胺和化療藥劑時，化療藥劑可比單使用化療藥劑是減量。醫生可根據具體對患者的病情了解和化療效果，在安全劑量下確定劑量。組分半胱胺臨床用于治療急性金屬中毒和防治放射病劑量，一般是靜脈注射，劑量是0.3g/次，一天1-2次。臨床使用本發明組合藥劑中的半胱胺時，可以參考其臨床使用安全劑量使用，在安全劑量下，使用劑量越高療效越好。建議臨床應用的劑量參考現有的臨床使用劑量。比如，單獨但其中組分阿霉素臨床使用的劑量一般在30-100mg/m2，高劑量會達到300mg/m2，在與半胱胺共同使用時可酌情減量。實驗證明半胱胺只需協同低劑量的化療藥物便可有效的殺死癌細胞及化療藥抗性癌細胞，即證明本發明的藥劑在癌細胞及抗性癌細胞的化療中大大降低抗癌藥物的使用量從而降低化療的副作用。本發明提供的半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用，通過低劑量的半胱胺增進癌細胞對化療藥物的敏感性，從而實現了通過低劑量的化療藥物有效殺死癌細胞。本發明大大提高化療藥物的藥效，降低了化療的副作用。利用該原理設計了本發明的抗癌藥物，它包含普通化療藥物和輔劑半胱胺。抗癌藥劑中半胱胺協助低劑量化療藥物殺傷腫瘤細胞和化療藥物抗性細胞，大大增強化療藥物的化療效果從而降低化療藥物的副作用。而由于半胱胺容易獲得、價格低廉，化學成分單一且生物毒性低，更使得半胱胺的這項臨床應用顯得意義非凡。半胱胺作為臨床藥物用于白內障和胱氨酸病的治療未發現其副作用，這也增強了此組合藥物的可實施性和成功率，使本組合抗癌藥物作為臨床藥物更具有實用性。

圖1 半胱胺引起HeLa細胞自噬(穩定表達eGFP_LC3細胞中的綠色點狀聚集)圖2 半胱胺引起293A細胞自噬(穩定表達eGFP_LC3細胞中的綠色點狀聚集)圖3 半胱胺引起B16，MCF細胞自噬(內源性的蛋白LC3I向LC3II型轉化)圖4 半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬的時間效應圖5 半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬的劑量效應圖6 半胱胺在HeLa細胞中，導致自噬相關蛋白P62的增多圖7 高劑量半胱胺能導致細胞死亡(MTT檢測法)圖8 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死HeLa細胞實驗(碘化丙啶，PI染色)。圖9 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死B16細胞的實驗(碘化丙啶，PI染色)。圖10 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死MCF-7細胞的實驗 (碘化丙啶，PI染色)。圖11 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死阿霉素抗性細胞 (MCF-7/ADR細胞)的實驗(碘化丙啶，PI染色)圖12 =HeLa細胞中轉染Atg5siRNA降低自噬水平，相應的降低自噬帶來的細胞殺傷(碘化丙啶，PI染色)圖13 不同濃度的半胱胺促進濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死癌細胞 (碘化丙啶，PI染色)
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、半胱胺可以HeLA癌細胞自噬在穩定表達LC3_eGFP的人宮頸癌HeLa 細胞中誘導細胞自噬，以自噬促進劑rapmycin作為陽性對照實驗方法1、篩選穩定表達LC3_eGFP的人宮頸癌細胞(LC3_eGFP/HeLa)方法如下(1)人宮頸癌細胞HeLa細胞(購自中科院上海細胞所)接種在裝有DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，密度約3-5X104/孔，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。(2)Lipofectamine2000每孔1. 5 μ 1，溶解在100 μ 1無血清無抗生的素DMEM培養基中，充分混合后室溫孵育5min，質粒LC3-eGFP (美國invitrogen公司)為每孔2 μ g，溶解在100 μ 1 DMEM無血清無抗生素的DMEM培養基(美國GIBCO公司)中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。(3)過夜培養的細胞用DMEM(無血清無抗生素)培養基洗滌2次后加入步驟(2) 孵育過的混合物，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養條件培養30min，每孔補充培養基 DMEM完全培養基300 μ 1，繼續培養。(4)轉染48hr后，細胞按1 15稀釋后轉接到裝有DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板，并加入0. 5mg/ml的G418抗生素篩選細胞(美國Sigma公司)，每三天換一次培養基。十天后在熒光顯微鏡下挑出穩定表達LC3-eGFP的綠色陽性克隆LC3_eGFP/ HeLa細胞，待用。2、將經步驟1篩選后獲得的LC3-eGFP/HeLa細胞接種在裝有DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，24孔板細胞密度約為3_5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。3、步驟2的24孔中加入終濃度為1. 5mM的半胱胺(圖1中半胱胺)，誘導細胞自噬，在培養24小時后進行熒光顯微鏡觀察拍照，以沒有任何處理的細胞作為陰性對照(圖1 中對照)，以自噬促進劑雷帕霉素(終濃度為200nM，美國Sigma公司)作為引起自噬的陽性對照(圖1中雷帕霉素)，同時用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA，終濃度為2mM)和1. 5mM 的半胱胺共同處理24小時來進一步證明半胱胺引起自噬的能力(圖1中半胱胺+3-甲基嘌呤)。細胞轉染eGFP-LC3質粒后，表達的eGFP_LC3蛋白在正常情況下均勻彌散于細胞質中，但在細胞發生自噬時，eGFP-LC3就會聚集在自噬泡的膜上形成點狀聚集。結果顯示結果如圖1所示，結果表明，1. 5mM半胱胺處理LC3-eGFP/HeLa后，均勻彌散于細胞質中GFP-LC3蛋白聚集在自噬小體的膜上形成綠色的點狀聚集，而且LC3點狀聚集可以被自噬特異的抑制劑3-甲基嘌呤抑制(圖1)，說明半胱胺引起LC3點狀聚集的是細胞自噬的表現。實施例2 半胱胺誘導293A細胞自噬在穩定表達LC3_eGFP的人胚腎細胞293A 中誘導細胞自噬，以自噬促進劑rapmycin作為陽性對照實驗方法1、篩選穩定表達LC3_eGFP的人胚腎細胞(LC3_eGFP/293A)方法如下(1)293A人胚腎細胞(購自中科院上海細胞所)接種在裝有DMEM培養基的(美國 GIBCO公司)24孔細胞培養板中，密度約3-5 X IO4/孔，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。(2)配制轉染復合物，方法如下Lipofectamine2000每孔1. 5 μ 1，溶解在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養基中，充分混合后室溫孵育5min，LC3_eGFP為每孔2 μ g，溶解在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。(3)過夜培養的細胞用DMEM(無血清無抗生素)培養基洗滌2次后加入步驟(2) 獲得的轉染復合物，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養條件培養30min，補充培養基DMEM 完全培養基300μ 1，37°C，繼續培養。(4)轉染48hr后，細胞按1 15稀釋后轉接DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24 孔細胞培養板，并加入0. 5mg/ml的G418篩選細胞，每三天換一次培養基。十天后在熒光顯微鏡下挑出穩定表達LC3-eGFP的綠色陽性克隆，待用。2、經篩選后的LC3_eGFP/293A細胞接種在24孔細胞培養板中，細胞密度約為 3-5 X IO4/孔，過夜培養，待用。3、步驟2的24孔中加入終濃度為1. 5mM的半胱胺(圖2中半胱胺)，誘導細胞自噬，在培養24小時后進行熒光顯微鏡觀察拍照。以沒有任何處理的細胞作為陰性對照(圖2 中對照)，以自噬促進劑雷帕霉素(終濃度為200nM，美國Sigma公司)作為引起自噬的陽性對照(圖1中雷帕霉素)，同時用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA，終濃度為2mM)和1. 5mM 的半胱胺共同處理24小時來進一步證明半胱胺引起自噬的能力(圖1中半胱胺+3-甲基腺嘌呤)。結果顯示1、HeLa細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，24孔板細胞密度約為3-5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2、分別加入終濃度為1.5mM半胱胺處理，分別在在37°C，5% (體積百分含量) CO2培養箱中培養0hr、5hr、12hr、18hr、24hr后收集，用細胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進行12% SDS-PAGE電泳后濕轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。用 anti_LC3 (Novus 公司)作為一抗，anti-rabbit (Promega 公司)為二抗，進行 Western blot。以anti-GAPDH(美國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶) 作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細胞內的組成型蛋白，在各個細胞內的水平一致)。結果顯示結果如圖4所示，結果表明，半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬效果是隨處理時間的延長而增強的(圖4)。實施例5 半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬的劑量效應內源性的蛋白LC3I向自噬標志蛋白LC3II型轉化實驗方法1、HeLa細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，24孔板細胞密度約為3-5 X IO4/孔，在37°C，5 % (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2、各孔分別加入終濃度為0. 5mM、1. OmM, 1. 5mM或2. OmM的半胱胺，無任何處理的細胞為對照組(圖5中的對照)，以自噬促進劑終濃度為200nM雷帕霉素處理(美國Sigma 公司)作為引起自噬的陽性對照(圖5中的雷帕霉素)，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱，細胞培養24hr后收集細胞，用細胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進行12% SDS-PAGE 電泳后濕轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。用anti-LC3 (Novus公司)作為一抗,anti-rabbit (Promega公司)為二抗，進行Western blot。以 anti-GAPDH(美國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細胞內的組成型蛋白，在各個細胞內的水平一致)結果如圖2所示，結果表明，在LC3_eGFP/293A中1. 5mM半胱胺就可以引起 eGFP-LC3綠色點狀聚集，eGFP_LC3點狀聚集可以被自噬特異的抑制劑3-MA抑制(圖2)，說明半胱胺引起eGFP-LC3點狀聚集的是細胞自噬的表現。實施例3 半胱胺引起黑色素瘤細胞B16和人乳腺癌MCF-7細胞自噬內源性的蛋白LC3I (微管相關蛋白LC3I)向自噬標志蛋白LC3II型轉化黑色素瘤細胞B16和人乳腺癌MCF-7細胞自噬時，內源性的蛋白LC3I向自噬標志蛋白LC3II型轉化，因此下述通過檢測內源性的蛋白LC3I向自噬標志蛋白LC3II型轉化來確定黑色素瘤細胞B16和人乳腺癌MCF-7細胞是否發生自噬。
實驗方法1、分別將黑色素瘤細胞B16 (購自中科院上海細胞所)或人乳腺癌MCF-7細胞分別接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，24孔板細胞密度約為 3-5 X IO4/孔，370C，過夜培養，待用。2、分別加入終濃度為1.5mM半胱胺處理，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中培養24小時后收集，用細胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進行12% SDS-PAGE電泳后濕轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)，以無任何處理的黑色素瘤細胞B16做為對照組。用anti-LC3 (Novus公司)作為一抗，anti-rabbit (Promega公司)為二抗，進行Western blot。以anti_GAPDH(美國密理博公司)作為一抗檢測GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細胞內的組成型蛋白，在各個細胞內的水平一致)。結果顯示結果如圖3所示，結果表明，在黑色素瘤細胞B16和人乳腺癌MCF-7中，相對于對照，半胱胺處理后LC3II蛋白量大大增加，說明半胱胺在黑色素瘤細胞B16，人乳腺癌MCF-7 中也能引起細胞自噬，因為增強內源性的蛋白LC3I向蛋白LC3II型轉化是發生細胞自噬的標志(圖3)。實施例4 半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬的時間效應內源性的蛋白LC3I向自噬標志蛋白LC3II型轉化實驗方法結果顯示結果如圖5所示，結果表明，半胱胺在HeLa細胞中引起細胞自噬效果是隨半胱胺濃度的增加而增強的(圖5)。實施例6 半胱胺在HeLa細胞中，導致自噬底物蛋白p62的增多以自噬抑制劑 3-MA作為陰性對照細胞自噬能降解細胞內的錯誤折疊的蛋白或者受損傷的細胞器，P62蛋白也是細胞自噬的底物，細胞發生完整的自噬時會降解細胞內的P62蛋白，如果細胞自噬的下游被阻斷就會阻斷P62的降解，所以p62蛋白的增多可以間接的說明自噬的非完整性。實驗方法1. HeLa細胞接種在裝有DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中， 24孔板細胞密度約為3-5X IO4/孔，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2.各孔處理分別為加入終濃度1. 5mM半胱胺、2mM 3-甲基腺嘌呤、1. 5mM半胱胺和2mM 3-甲基腺嘌呤的組合，將未做任何處理的細胞做為對照，分別于37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中培養24hr后收集細胞，用細胞裂解液(購自碧云天公司)裂解細胞，再加入電泳上樣緩沖液(購自碧云天公司)沸水煮IOmin后，制成電泳樣品。然后進行12% SDS-PAGE電泳后濕轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(購自美國Amersham公司)。用 anti-p62 (BIOMOL^W]) ^l, anti-rabbit (Promega ) ^J—^l, ii^T Western blot,以anti-GAPDH作為一抗檢測GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為參考來定量對照組與實驗組的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細胞內的組成型蛋白，在各個細胞內的水平一致)結果顯示結果如圖6所示，結果表明半胱胺處理組與對照組比較自噬底物p62增多(見圖 6)，說明細胞自噬的下游通路可能被阻斷，這對細胞的生存是有害的。實施例7 半胱胺對細胞活力的影響噻唑藍法(MTT)法檢測細胞死亡實驗方法1、HeLa細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)96孔細胞培養板中，96孔板細胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2、細胞培養板各孔中分別加入終濃度為0mM、0. 5mM、lmM、l. 5mM、2. OmM,2. 5mM、 3. 0mM、4. OmM的半胱胺。37°C,5% (體積百分含量)CO2培養箱中培養24hr后，按照步驟3 的方法檢測細胞死亡率。3、96孔細胞經上述處理后，每孔加入5mg/ml MTT (噻唑藍)10 μ 1，在37°C，5% CO2 培養箱中培養孵育約2-4小時后，當細胞內出現紫色晶體后，小心吸去上清液后，每孔加入 100 μ 1 DMSO(二甲基亞砜)，放于暗處2小時。搖勻后，酶標儀檢測其570nm處的紫外吸收。隨著細胞死亡越多在570nm處的吸收值就越小，將OmM半胱胺處理的細胞的吸收值設為100%活細胞，然后按比例計算細胞存活力。結果顯示結果如圖7所示，結果表明，低濃度半胱胺對細胞活力沒有影響，高濃度的半胱胺可以導致細胞死亡(圖7)。實施例8 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死癌HeLa細胞的實驗用碘化丙碇(PI)染色法檢測實驗方法1、HeLa細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)96孔細胞培養板中，96孔板細胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2、細胞培養板中各孔處理分別為終濃度為1. 5mM半胱胺(圖8中的CS)、0. 75 μ g/ ml阿霉素(圖8中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和0. 75 μ g/ml阿霉素的組合(圖8中的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖8中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 8中的D0X)為對照。培養24hr后，按照步驟3的方法檢測細胞死亡率。3、細胞用2 μ g/ml赫斯特(Hochest33342，購自碧云天公司)和5 μ g/ml碘化丙碇 (PI)染色15分鐘，然后在顯微鏡下拍照。Hochest33342專門用來染細胞核，用來計數總細胞數量，PI染死細胞，它能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜插入雙鏈DNA中，不能進入活細胞，死細胞占所有細胞的百分比為細胞的死亡率。結果顯示結果如圖8所示，結果表明，低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細胞死亡，而二者協同作用則引起HeLa細胞大量的死亡65. 5士2. 6% (圖8)。實施例9 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死黑色素瘤癌細胞B16的實驗
實驗方法1、黑色素瘤癌細胞B16細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)96孔細胞培養板中，96孔板細胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中過
夜培養，待用。2、細胞培養板中各孔處理分別為終濃度為1.5mM半胱胺(圖9中的CS)、0. 8 μ g/ ml阿霉素(圖9中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和0. 8 μ g/ml阿霉素的組合(圖9中的 D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖9中的CS)和不加1.5mM(終濃度)半胱胺(圖9 中的D0X)為對照。培養24hr后，按照實施例8的方法檢測細胞死亡率結果顯示結果如圖9所示，結果表明低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細胞死亡，而二者協同作用則加大B16細胞的死亡21. 892士 1.053% (圖9)。實施例10 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死人乳腺癌 MCF-7的實驗實驗方法1、人乳腺癌MCF-7細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)96孔細胞培養板中，96孔板細胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培
養，待用。2、細胞培養板中各孔處理分別為終濃度為1. 5mM半胱胺(圖10中的CS)、0. 8μ g/ ml阿霉素(圖10中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和1. 0 μ g/ml阿霉素的組合(圖9中的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖10中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 10中的D0X)為對照。培養24hr后，按照實施例8的方法檢測細胞死亡率結果顯示結果如圖10所示，結果表明，低濃度的半胱胺和低劑量的阿霉素幾乎不引起癌細胞死亡，而二者協同作用則加大MCF-7細胞的死亡54. 23士2. 146% (圖10)。實施例11 半胱胺促進低濃度化療藥物阿霉素(doxorubicin)殺死耐藥性人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR的實驗實驗方法1、篩選阿霉素耐藥性人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR細胞方法如下人乳腺癌細胞系 MCF-7接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)24孔細胞培養板中，加入終濃度0. 01 μ M 的阿霉素，37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱培養兩個月后，再加入0. 1 μ M的阿霉素，經第二輪篩選培養兩個月后，提高藥物濃度至1 μ Μ，篩選培養3個月后得到穩定的阿霉素耐藥性人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR細胞。2、將耐藥性人乳腺癌細胞系MCF-7/ADR細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO 公司)96孔細胞培養板中，96孔板細胞密度約0. 8-1 X IO4/孔，37°C,5% (體積百分含量) CO2培養箱中過夜培養，待用。3、細胞培養板中各孔處理分別為終濃度為1.5mM半胱胺(圖11中的CS)、20yg/ ml阿霉素(圖11中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和20 μ g/ml阿霉素的組合(圖11中的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖11中的CS)和不加1. 5mM(終濃度)半胱胺(圖 11中的D0X)為對照。培養24hr后，按照實施例8的方法檢測細胞死亡率結果顯示
結果如圖11所示，結果表明，低劑量半胱胺和阿霉素幾乎不引起耐藥性細胞死亡，而二者協同作用則引起癌細胞大量的死亡44. 23士 1.8%。實施例12 =HeLa細胞中轉染Atg5siRNA降低自噬水平，相應的降低自噬帶來的細胞殺傷實驗方法l、HeLa細胞接種在DMEM培養基的(美國GIBCO公司)2個60mm的細胞培養板中，細胞密度約為2 X IO5/孔，37°C,5% (體積百分含量)CO2培養箱中過夜培養，待用。2、siRNA 轉染Lipofectamine2000 每孔 1. 5μ 1，溶解在 100μ 1 DMEM(無血清無抗生素)培養基中，充分混合后室溫孵育5min，與哺乳細胞無同源性的陰性對照siRNA(購于上海吉瑪制藥技術有限公司)和Atg5siRNA(購于上海吉瑪制藥技術有限公司)各2yg 分別溶解在100 μ 1 DMEM (無血清無抗生素)培養基中，充分混合后室溫孵育5min后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。3、過夜培養的細胞用DMEM(無血清無抗生素)培養基洗滌2次后，分別加入孵育過對照siRNA和Atg5siRNA，在37°C，5% (體積百分含量)CO2培養箱中培養30min，補充培養基DMEM完全培養基300 μ 1，繼續培養。4、轉染對照siRNA的細胞培養液中和Atg5siRNA的細胞培養液中分別加入1. 5mM 半胱胺處理，未做任何處理的細胞作為對照。5、半胱胺處理24hr后收集細胞，用細胞裂解液(碧云天公司)裂解細胞，沸水煮 IOmin后，12% SDS-PAGE電泳后濕轉法將蛋白轉移到尼龍膜上(Amersham公司)。用抗體 anti_Atg5 (santa 公司)禾口 anti_LC3 (Novus 公司)為一抗 anti-rabbit (Promega 公司)為二抗，進行Western blot。相對于對照siRNA處理的細胞(圖12右圖中consiRNA)，在轉染Atg5siRNA的細胞中自噬的水平降低了(圖12右圖中Atg5siRNA)。6、轉染對照siRNA的細胞培養液中和轉染Atg5siRNA的細胞培養液中分別加入終濃度為1. 5mM半胱胺(圖12左圖中的CS)、20 μ g/ml阿霉素(圖12左圖中的Dox)、終濃度為1. 5mM半胱胺和20 μ g/ml阿霉素的組合(圖12左圖中的D0X+CS)，其中以不加低劑量阿霉素(圖12左圖中的CS)和不加1.5mM(終濃度)半胱胺(圖12左圖中的D0X)為對照。培養24hr后，按照實施例8的方法檢測細胞死亡率。結果顯示結果如圖12所示，結果表明，轉染Atg5siRNA的細胞，半胱胺引起自噬的能力減弱 (圖12右圖)，相應的半胱胺促進阿霉素引起細胞死亡的能力也減弱(圖12左圖，圖12左圖中control siRNA為轉染對照siRNA的細胞，Atg5siRNA為轉染Atg5siRNA的細胞)。實施例13 半胱胺協同阿霉素殺傷腫瘤實驗方法1、B16細胞接種在有DMEM培養基的(美國GIBCO公司)細胞培養瓶中，37°C，5% (體積百分含量)C02培養箱中培養，待長滿培養瓶將細胞消化并離心下來。2、將1x106個細胞接種于C57小鼠(購自于上海史萊克公司)，待腫瘤長一周達到時0. 5mm3給藥，老鼠隨機分成四組，對照組給生理鹽水，半胱胺組500mg/kg(相對于老鼠體重)的劑量給藥，阿霉素組5mg/kg(相對于老鼠體重)的劑量給藥，組合藥組500mg/kg 半胱胺和5mg/kg阿霉素(相對于老鼠體重)共同給藥，每隔一天給藥一次。
3、兩周以后將老鼠段頸處死，將腫瘤剝離下來稱重，統計腫瘤大小來衡量半胱胺協同阿霉素殺傷腫瘤的作用(圖13)結果顯示結果如圖13所示，結果表明，半胱胺能大大加強阿霉素殺傷癌細胞的能力(圖 13)。上述實施例1-13的實驗說明，通過低劑量的半胱胺增進癌細胞對化療藥物的敏感性，從而實現了通過低劑量的化療藥物有效殺死癌細胞。實驗證明半胱胺只需協同低劑量的化療藥物便可有效的殺死癌細胞及化療藥抗性癌細胞，即證明本發明的藥劑在癌細胞及抗性癌細胞的化療中大大降低抗癌藥物的使用量從而降低化療的副作用。因此可以利用該原理設計本發明的抗癌藥物，它包含普通化療藥物和輔劑半胱胺。抗癌藥劑中半胱胺協助低劑量化療藥物殺傷腫瘤細胞和化療藥物抗性細胞，大大增強化療藥物的化療效果從而降低化療藥物的副作用。本治療癌癥的組合藥劑雖沒有應用于臨床，但細胞實驗證明，在使用半胱胺和化療藥劑時，化療藥劑可比單使用化療藥劑是減量。醫生可根據具體對患者的病情了解和化療效果，在安全劑量下確定劑量。組分半胱胺臨床用于治療急性金屬中毒和防治放射病劑量，一般是靜脈注射，劑量是0. 3g/次，一天1-2次。臨床使用本發明組合藥劑中的半胱胺時，可以參考其臨床使用安全劑量使用，在安全劑量下，使用劑量越高療效越好。建議臨床應用的劑量參考現有的臨床使用劑量。比如，單獨但其中組分阿霉素臨床使用的劑量一般在30-100mg/m2，高劑量會達到300mg/m2，在與半胱胺共同使用時可酌情減量。
權利要求
半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用。
2.一種治療癌癥的組合藥劑，其活性成分為半胱胺和化療藥物。
3.根據權利要求2所述的組合藥劑，其特征在于所述治療癌癥的組合藥劑中還包括醫學上可接受的輔料。
4.根據權利要求2或3所述組合藥劑，其特征在于所述化療藥物為阿霉素。
5.根據權利要求2-4中任意一項所述的組合藥劑，其特征在于所述癌癥包括起源于大腦、中樞神經系統、腎臟、肝、膽囊、頭頸部、口腔、甲狀腺、皮膚、黏膜、腺體、血管、骨組織、淋巴結、肺臟、食管、胃、乳腺、胰腺、目艮睛、鼻咽部、子宮、卵巢、子宮內膜、子宮頸、前列腺、膀胱、結腸或直腸的原發或轉移的癌或肉瘤或癌肉瘤。
6.根據權利要求5所述的組合藥劑，其特征在于所述癌癥為宮頸癌、乳腺癌、黑色素瘤或腎癌。
7.半胱胺在提高癌細胞對化療藥物的敏感性中的應用。
8.半胱胺在制備腫瘤細胞抑制劑中的應用。
9.半胱胺和化療藥物在制備腫瘤細胞抑制劑中的應用。
10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于所述腫瘤細胞為人宮頸癌細胞HeLa 細胞、人乳腺癌細胞系MCF-7或黑色素瘤癌細胞B16細胞；所述化療藥物為為阿霉素。
全文摘要
本發明公開了半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用。本發明提供的半胱胺在制備治療癌癥的藥物中的應用，通過低劑量的半胱胺增進癌細胞對化療藥物的敏感性，從而實現了通過低劑量的化療藥物有效殺死癌細胞。本發明大大提高化療藥物的藥效，降低了化療的副作用。
文檔編號A61K31/145GK101797242SQ20101014370
公開日2010年8月11日申請日期2010年4月7日優先權日2010年4月7日
發明者萬小妹, 張力, 溫龍平申請人:中國科學技術大學

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