牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法

專利名稱：牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海水魚(yú)病毒病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法，特別涉及一種牙鲆淋 巴囊腫病毒病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
淋巴囊腫病是由淋巴囊腫病毒引起的病毒性傳染病，具有水平和垂直雙重傳播的 特點(diǎn)，可感染多種魚(yú)類，是在中國(guó)海水養(yǎng)殖魚(yú)中大規(guī)模流行的首例病毒性疾病，該病在我國(guó) 重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類牙鲆、真鯛、石斑魚(yú)、鱸魚(yú)、等名貴魚(yú)種中廣泛傳播，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損 失。目前，我國(guó)海水養(yǎng)殖病害控制仍以抗生素等化學(xué)藥物為主，藥物的濫用導(dǎo)致了水產(chǎn)品藥 殘，嚴(yán)重影響了食品安全。此外，抗生素和化學(xué)藥品的大量使用還造成了病原微生物耐藥性 增加及養(yǎng)殖環(huán)境惡化，妨礙了產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，疫苗是治療病毒病的最好選擇?；?因工程疫苗是將外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組質(zhì)粒DNA注射到動(dòng)物體 內(nèi)，當(dāng)外源基因進(jìn)入活體細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)后，既可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，也可誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫記 憶，被譽(yù)為第三代疫苗，大規(guī)模制備臨床級(jí)質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)加工工藝逐漸受到關(guān)注，但由于 基因工程疫苗不同于以往的傳統(tǒng)疫苗，工程菌的選擇、制備工藝和生產(chǎn)方法等都不成熟，更 沒(méi)有相關(guān)的質(zhì)量保證體系，這極大地阻礙了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外獲得上市的基因工 程疫苗僅有馬西尼羅病毒的基因工程疫苗West Nile Innovator和鮭魚(yú)傳染性出血性壞死 病毒的基因工程疫苗APEX-IHN。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法，以實(shí)現(xiàn)該 疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)，該生產(chǎn)方法克服了基因工程疫苗生產(chǎn)工藝的缺陷，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的 不足。上述牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗是由大小為0.6kb的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白 基因MCP片段插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N2中構(gòu)成的重組質(zhì)粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb， 插入到基因工程疫苗中的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段序列為ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTA ATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAAT AAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTT TGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACC AATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGT ATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCT TTTTTTCGGT GTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGC TAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATG AAATGGGTAGTGAATAT。本發(fā)明的生產(chǎn)方法首先制備牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)；然后將上述牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗轉(zhuǎn)化入大腸桿菌制備生產(chǎn)用菌種K12 DH-5 α -IXDVO. 6kb ；再 將該生產(chǎn)用菌種劃線到Minca瓊脂平板、分離純化制備一級(jí)生產(chǎn)種子，并對(duì)其鑒定確定合 格的一級(jí)種子；再將該合格的一級(jí)種子接種于若干瓊脂扁瓶中，在37°C培養(yǎng)后24-48h后得 二級(jí)生產(chǎn)種子，并對(duì)其鑒定確定合格的二級(jí)種子；再將該合格的二級(jí)種子在發(fā)酵罐中無(wú)菌 條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵的二級(jí)種子培菌液；最后對(duì)該二級(jí)種子培養(yǎng)菌液進(jìn)行菌體 收集、離心、質(zhì)粒DNA提取、純化，再對(duì)提取得到質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行無(wú)菌、DNA純度、外源DNA 含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)、超螺旋質(zhì)粒含量的檢驗(yàn)，檢測(cè)合格者即得到淋巴囊腫病半成品的因 工程疫苗，再經(jīng)過(guò)常規(guī)的效力檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)，合格者即為生產(chǎn)用牙鲆淋巴囊腫病毒病基 因工程疫苗成品。詳細(xì)敘述上述各步驟如下1、制備牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)首先在真核表達(dá)載體 PEGFP-N2 (pEGFP-N2載體為常用真核表達(dá)載體，購(gòu)買于clontech公司、大小為4736bp，具有 高拷貝數(shù)、高效表達(dá)、加強(qiáng)型綠熒光蛋白標(biāo)記和卡那霉素抗性標(biāo)記等特點(diǎn)，宿主為DH5a)的 多克隆位點(diǎn)處通過(guò)SphI和EcoRI雙酶切克隆入抗原編碼基因MCP 0. 6kb片段、并經(jīng)Bam HI 和NotI雙酶切去除EGFP基因后，得到重組質(zhì)粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb,全長(zhǎng)4. 7kb,即 為牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)；上述抗原編碼基因的獲得 是由接種牙鲆淋巴囊腫 病毒中國(guó)株(IXDV-cn)的牙鲆鰓細(xì)胞系re-9307，經(jīng)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并針對(duì)MCP 設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序儀測(cè)序鑒定獲得的624bp IXDV-cn MCP基因 片段。2、基因工程疫苗生產(chǎn)用菌種的制備然后將上述重組質(zhì)粒 PEGFP-N2-LCDV-MCP0. 6kb加入到盛有感受態(tài)K12DH-5 α細(xì)胞的1. 5mL離心管中，重組質(zhì)粒 的體積不得超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的5%，輕輕旋轉(zhuǎn)該離心管混勻，然后42°C熱激90s (期間不要 搖動(dòng))后迅速將該離心管移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2min，向每200 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，加入 800μ 的SOC培養(yǎng)基(配方為2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母浸出汁，0.05% (W/ V)NaCl, 2. 5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖)，然后將管放在37°C搖床上，溫育45min，即 得到生產(chǎn)用菌種K12DH-5 α -LCDV0. 6kb。3、基因工程疫苗一級(jí)種子的制備方法將上述生產(chǎn)用菌種劃線到Minca瓊脂平 板，并且按常規(guī)方法分離純化，用0. 01mol/L pH7. 2的PBS緩沖液洗下菌落作為一級(jí)種子， 將其分裝在5mL滅菌小瓶中，加10%甘油混勻，-70°C保存；上述PBS是由每升三蒸水含8g Nacl, 0. 2g Kcl，1. 44g Na2HPO4,0. 2g KH2PO4,調(diào) ρΗ7· 2，滅菌 20min 制備而成，室溫保存。4、基因工程疫苗一級(jí)種子的鑒定以確定合格的一級(jí)種子接種一級(jí)生產(chǎn)種子至含 30ug/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，在160-190轉(zhuǎn)/分的搖床上37°C培養(yǎng)，取趨于飽和期 的細(xì)菌，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，依次用PCR方法和Xbal和EcoRl雙酶切進(jìn)行鑒定，PCR方 法和雙酶切方法的產(chǎn)物經(jīng)電泳和測(cè)序鑒定，條帶大小為0. 6kb和無(wú)突變及其它非目的性重 組的產(chǎn)生為合格的基因工程疫苗的一級(jí)種子。上述LB液體培養(yǎng)基是由每升蒸餾水中含IOg 胰蛋白胨，5g酵母浸出汁，5g NaCl，調(diào)pH為7. 0，滅菌20min制備而成，室溫保存。上述的PCR方法的上游引物為5，GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC 3，，下游引 物為5，GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3，，程序?yàn)?94°C、5min，進(jìn)入循環(huán)(94°C、 30sec，50°C、45sec，72°C、lmin，30 個(gè)循環(huán))，72°C延伸 lOmin。5、基因工程疫苗的二級(jí)生產(chǎn)種子制備并確定合格的二級(jí)種子將上述一級(jí)種子接種于生產(chǎn)用瓊脂扁瓶中，使其均勻分布于瓊脂表面上，在培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)，將 菌落生長(zhǎng)良好的扁瓶取出，每瓶加入適量的PH6. 3-6. 8生理鹽水將菌落洗下作為二級(jí)生產(chǎn) 種子，再將純凈菌液混合均勻懸浮，分裝5mL滅菌小瓶，加10%甘油混勻，逐瓶或分組作純 凈性檢驗(yàn)確定合格的二級(jí)種子。6、合格的二級(jí)生產(chǎn)種子的發(fā)酵培養(yǎng)將馬丁肉湯培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐內(nèi)，121°C、30 分鐘高壓滅菌，在無(wú)菌條件下按發(fā)酵液的2%將合格的二級(jí)種子加入發(fā)酵罐內(nèi)，并按IOOg/ L和50g/L的比例分別向發(fā)酵液中加入葡萄糖和卡那霉素，消泡劑適量；在發(fā)酵過(guò)程中，用 氨水和鹽酸調(diào)節(jié)罐內(nèi)PH至7. 0，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度保持溶氧為30%。當(dāng)溶氧高于 30 %時(shí)，進(jìn)行指數(shù)連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞0D600達(dá)到40時(shí)，添加氯霉素，使終濃度 為150 μ g/ml，并將流加速度降低50%。上述的補(bǔ)料培養(yǎng)基是由每升含酵母抽提物40g，蛋 白胨80g，葡萄糖100g，氯化鎂5g配制而成。發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)控制如下pH 7.0，攪拌轉(zhuǎn)速 200rpm,通氣量 6. 0m3/h,培養(yǎng)時(shí)間 10_12h。在發(fā)酵6h、8h、10h、12h時(shí)取樣進(jìn)行純度鏡檢，純度大于99%為合格；并進(jìn)行質(zhì)粒 穩(wěn)定性檢驗(yàn)取發(fā)酵培養(yǎng)后的細(xì)菌，分別等量涂布于含與不含卡那霉素(30ug/mL)的平板 上，菌落比例高于99%者視為穩(wěn)定的二級(jí)生產(chǎn)種子。7、將上述的發(fā)酵培養(yǎng)菌液進(jìn)行濃縮將上述的發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的二級(jí)生產(chǎn)種子， 即將檢測(cè)合格的發(fā)酵培養(yǎng)的菌液，經(jīng)3000rpm離心15分鐘，收獲菌體，稱重，分裝(60g/ 份)，將分裝菌體溶解于500mL PBS溶液中即得到濃縮菌液，再分別置于IL體積的離心轉(zhuǎn)子 中，3000rpm離心5min，得到菌體，以便進(jìn)行菌體質(zhì)粒DNA提取和純化。8、菌體質(zhì)粒DNA提取和純化8. 1將上述菌體進(jìn)行RNA的去除按每60g濕重向沉淀內(nèi)加入IOOml細(xì)胞懸浮緩 沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.5 ；IOmM EDTA ； 100 μ g/mL RNaseA)，充分混勻，在 37 °C水育搖 床中緩慢水平振蕩Ih ；8. 2菌體的堿裂解加入IOOmL細(xì)胞裂解液(0. 2M NaOH ； 1 % SDS)，邊加邊緩慢混 勻，室溫放置5分鐘，達(dá)到充分裂解；隨即緩慢加入125mL中和液(1.32M醋酸鉀，pH 4.8)， 再將加入中和溶液后的菌體4000rpm離心IOmin分鐘后，取上清液；8. 3質(zhì)粒制備液的凈化和濃縮取離心后的上清液通過(guò)多層紗布過(guò)濾到一潔凈的 IOOOmL離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，混勻后4°C，4000rpm離心15min ；棄上清，沉淀 中加入20mLTE (IOmM Tris-HCl ImM EDTA I3H = 8. 0)溶解沉淀，并用吸管將溶解后的沉淀緩 慢吹打均勻，放置4°C過(guò)夜，再13000rpm，離心lOmin，取上清，加入等體積的40% PEG8000, 混勻后13000rpm，離心lOmin，棄上清，沉淀中加入20mL滅菌過(guò)濾的0. 01mol/L pH7. 2的 PBS中以溶解沉淀，測(cè)定溶解沉淀后溶液的OD26tl,得到純化的質(zhì)粒DNA，在-20°C凍存待檢。9、質(zhì)粒DNA的檢驗(yàn)對(duì)上述凍存待檢的質(zhì)粒DNA進(jìn)行以下七個(gè)方面的檢驗(yàn)9. 1質(zhì)粒的一致性檢驗(yàn)限制性雙酶切(Xba I.EcoR I)和PCR鑒定應(yīng)符合重組質(zhì) 粒特征。方法如下(I)PCR方法上游引物為:5，GAC GAA TTC ATG ATC GGT AATAC 3，，下游 引物為:5，GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3，，程序?yàn)?94°C、5min，進(jìn)入循環(huán)(94°C、 30sec，50°C、45sec，72°C、Imin，30個(gè)循環(huán))，72°C延伸IOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶大 小為0.6kb，應(yīng)符合重組質(zhì)粒特征。(2)雙酶切方法Xba I,EcoR I雙酶切質(zhì)粒DNA，37°C酶 切2個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶大小為0. 6kb，應(yīng)符合重組質(zhì)粒特征。
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9. 2質(zhì)粒DN A純度檢驗(yàn)質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，方法如下 PBS (0. 01mlo/L、pH7. 2)溶解質(zhì)粒，取80 μ L質(zhì)粒溶液與2920 μ L PBS溶液混合，以 3000 μ LPBS溶液作為對(duì)照，OD260 OD280比值應(yīng)在1. 8-1. 9因間內(nèi)。9. 3質(zhì)粒DNA中外源DNA含量定量PCR檢測(cè)宿主K12DH-5 α的基因組DNA應(yīng)小 于 10ng/mgo9. 4質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素應(yīng)低于10EU/mg。方法參照《中國(guó)生物 制品規(guī)程》(2000版)進(jìn)行檢測(cè)。9. 5質(zhì)粒DNA中蛋白質(zhì)通過(guò)凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(KEYGEN BCAProtein Assay Kit)檢測(cè)，分光光度計(jì)檢測(cè)宿主K12DH-5 α蛋白質(zhì)應(yīng)小于10 μ g/mg。9. 6質(zhì)粒DNA中超螺旋質(zhì)粒含量的檢驗(yàn)1 %瓊脂糖或8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢 測(cè)超螺旋質(zhì)粒應(yīng)高于75%。9. 7質(zhì)粒DNA的無(wú)菌檢驗(yàn)質(zhì)粒用PBS稀釋，取樣做無(wú)菌檢驗(yàn)，按《中華人民共和國(guó) 獸藥典》第三部附錄15頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。經(jīng)以上七個(gè)方面的檢測(cè)均合格者即為半成品基因工程疫苗，再用PBS稀釋、分裝， 并于-20°C條件下保存，經(jīng)預(yù)防用生物制品規(guī)范的常規(guī)檢測(cè)，檢驗(yàn)合格者即為生產(chǎn)用牙鲆淋 巴囊腫病毒病基因工程疫苗成品，用于牙鲆淋巴囊腫病毒病的預(yù)防。本發(fā)明是牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的一套完整的生產(chǎn)方法，其生產(chǎn)工藝具有 簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好和成本較低的特點(diǎn)；該方法制備的的基因工程疫苗與目前使用的滅活疫苗、 減毒疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗等相比，具有其免疫效果好、安全無(wú)副作 用和質(zhì)量可控的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的具體生產(chǎn)方法以生產(chǎn)2000mL淋巴囊腫病基因工程疫苗(可用于1萬(wàn)尾 牙鲆淋巴囊腫病的預(yù)防)為例。將50ng重組質(zhì)粒pEGFP-N2-IXDV_MCP0. 6kb平分加入到2支盛有感受態(tài)細(xì)胞 (K12DH-5 α )的1. 5mL離心管中，重組質(zhì)粒的體積不得超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的5 %，輕輕旋轉(zhuǎn) 1. 5mL離心管混勻，然后42°C熱激90s后迅速將1. 5mL離心管移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 l-2min，向每200 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，加入800 μ L的SOC培養(yǎng)基，然后將管放在37°C搖床上， 溫育45min，即得到生產(chǎn)用菌種K12 DH-5 α -LCDV0. 6kb。上述SOC培養(yǎng)基配方為為2%胰 蛋白胨，0. 5%酵母浸出汁，0. 05% NaCl, 2. 5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM葡萄糖，滅菌20分鐘， 室溫保存?zhèn)溆?。將上?支生產(chǎn)用菌種劃線到10個(gè)Minca瓊脂平板，37°C培養(yǎng)24_36小時(shí)，取典 型菌落劃線Minca瓊脂平板5個(gè)，用0. Olmol/L、pH7. 2的PBS將平板上的菌落洗下，分裝 5mL滅菌小瓶5瓶，加10%甘油混勻作為一級(jí)種子。接種1支一級(jí)生產(chǎn)種子至含30ug/mL卡 那霉素的1升LB液體培養(yǎng)基，取趨于飽和期的細(xì)菌，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版中堿裂 解法提取質(zhì)粒DNA，依次用PCR方法和Xbal和EcoRl雙酶切進(jìn)行鑒定，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，有 0. 6kb的條帶產(chǎn)生，符合重組質(zhì)粒特征，為合格。上述PBS配方為每升三蒸水含8g Nacl, 0. 2g Kcl，1. 44g Na2HPO4, 0. 2g KH2PO4,調(diào) ρΗ7· 2，滅菌 20min,室溫保存。上述 LB 液體培養(yǎng)基配方為每升蒸餾水中含IOg胰蛋白胨，5g酵母浸出汁，5g NaCl，調(diào)pH為7. 0，滅菌20min，
室溫保存。PCR方法的上游引物為5，GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC 3，，下游引物為 5，GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3，，程序?yàn)?94°C、5min，進(jìn)入循環(huán)(94°C、30sec， 50°C、45sec，72°C、lmin，30 個(gè)循環(huán))，72°C延伸 IOmin0將上述檢驗(yàn)合格的一級(jí)種子接種于生產(chǎn)用瓊脂扁瓶中，使其均勻分布于瓊脂表面 上。37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，將菌落生長(zhǎng)良好的扁瓶取出，每瓶加入適量的pH6. 3-6. 8生理 鹽水將菌苔洗下，將純凈菌液混合均勻懸浮，分裝5mL滅菌小瓶，加10%甘油混勻，逐瓶作 純凈性檢驗(yàn)，合格者作為二級(jí)生產(chǎn)種子。將120L馬丁肉湯培養(yǎng)基裝入工作容積為170L的發(fā)酵罐內(nèi)，121°C、30 分鐘高壓滅 菌，在無(wú)菌條件下按發(fā)酵液的2%將檢驗(yàn)合格的二級(jí)種子加入到發(fā)酵罐內(nèi)，并按100g/L和 50g/L的比例分別向發(fā)酵液中加入葡萄糖和卡那霉素；在發(fā)酵過(guò)程中，用氨水和鹽酸調(diào)節(jié) 罐內(nèi)pH至7. 0，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度保持溶氧為30%。當(dāng)溶氧高于30%時(shí)，進(jìn)行指 數(shù)連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞0D600達(dá)到40時(shí)，添加氯霉素，使終濃度為150yg/ml，并 將流加速度降低50%。上述的補(bǔ)料培養(yǎng)基是由每升含酵母抽提物40g，蛋白胨80g，葡萄糖 100g，氯化鎂5g配制而成。發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)控制如下pH 7.0，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量 6. 0m7h，培養(yǎng)時(shí)間 10-12h。在發(fā)酵6h、8h、10h、12h時(shí)取樣進(jìn)行純度鏡檢，純度大于99 %，為合格；并參照下 述方法進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢驗(yàn)取發(fā)酵培養(yǎng)后的細(xì)菌，分別等量涂布于含與不含卡那霉素 (30ug/mL)的平板上，菌落比例高于99%者視為穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將檢測(cè)合格的發(fā)酵培養(yǎng)的菌液，經(jīng)3000rpm離心15分鐘，收獲菌 體，稱重，分裝(60g/份)，共計(jì)50份，將分裝菌體溶解于500mL PBS溶液中，分別置于IL體 積的離心轉(zhuǎn)子中，3000rpm離心5min，洗滌菌體一次后，進(jìn)行菌體質(zhì)粒DNA提取和純化首先，將上述菌體進(jìn)行RNA的去除按每60g濕重向沉淀內(nèi)加入100ml細(xì)胞懸浮 緩沖液，充分混勻，在37°C水育搖床中緩慢水平振蕩Ih ；上述細(xì)胞懸浮緩沖液配方為50mM Tris-HCl, pH 7. 5 ； IOmM EDTA ； 100μ g/mL RNaseA0 ；然后，加入配方為0. 2M NaOH和10A SDS的細(xì)胞裂解液IOOmL,邊加邊緩慢混勻，室 溫放置5分鐘，達(dá)到充分裂解；隨即緩慢加入配方為1. 32M醋酸鉀和pH 4. 8的125mL中和 液，再將加入中和溶液后的菌體4000rpm離心IOmin分鐘后，取上清液；再次，質(zhì)粒制備液的凈化和濃縮取離心后的上清液通過(guò)多層紗布過(guò)濾到一潔凈 的IOOOmL離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，混勻后4°C，4000rpm離心15min ；棄上清， 沉淀中加入20mLTE溶解沉淀，并用吸管將溶解后的沉淀緩慢吹打均勻，放置4°C過(guò)夜，再 13000rpm，離心lOmin，取上清，加入等體積的40% PEG8000，混勻后13000rpm，離心lOmin， 棄上清，沉淀中加入20mL滅菌過(guò)濾的0. 01mol/L pH7. 2的PBS中以溶解沉淀，測(cè)定溶解沉 淀后溶液的OD26tl,得到純化的質(zhì)粒DNA。-20°C凍存待檢。之后，對(duì)上述所獲得的凍存待檢的質(zhì)粒DNA進(jìn)行以下七個(gè)方面的檢驗(yàn)1、質(zhì)粒的一致性檢驗(yàn)限制性雙酶切(Xba I.EcoR I)和PCR鑒定應(yīng)符合重組質(zhì)粒 特征。方法如下(I)PCR方法上游引物為:5，GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC3，，下游 引物為:5，GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3，，程序?yàn)?94°C、5min，進(jìn)入循環(huán)94°C、30sec，50°C、45sec，72°C、lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶大小為0. 6kb，符合重組質(zhì)粒特征。(2)雙酶切方法Xba I、EcoRI雙酶切質(zhì)粒DNA，37°C酶切2 個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶大小為0. 6kb，符合重組質(zhì)粒特征。2、DNA純度檢驗(yàn)質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，方法如下PBS溶解質(zhì)粒，取 80 μ L質(zhì)粒溶液與2920 μ L PBS溶液混合，以3000 μ L的PBS溶液作為對(duì)照，OD26tl OD280比 值為1.89。3、外源DNA含量定量PCR檢測(cè)，無(wú)宿主K12DH-5 α的基因組的存在。4、內(nèi)毒素鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素應(yīng)低于8. 5EU/mg，符合規(guī)定。5、蛋白質(zhì)通過(guò)凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，分光光度計(jì)檢測(cè)宿主 K12DH-5 α蛋白質(zhì)為1. 89 μ g/mg，符合規(guī)定。6、超螺旋質(zhì)粒含量的檢驗(yàn)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)超螺旋質(zhì)粒應(yīng)高于85 %，符 合規(guī)定。7、無(wú)菌檢驗(yàn)質(zhì)粒用PBS稀釋，取樣根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》第三部附錄15 頁(yè)要求做無(wú)菌檢驗(yàn)，無(wú)菌，符合要求。最后，將上述檢驗(yàn)合格的質(zhì)粒DNA用PBS稀釋、分裝，每瓶10ml，共計(jì)100瓶，并 于-20°C條件下保存，經(jīng)以下四個(gè)方面的檢測(cè)，檢驗(yàn)合格者即為生產(chǎn)用牙鲆淋巴囊腫病毒病 基因工程疫苗成品，用于牙鲆淋巴囊腫病毒病的預(yù)防。1物理性狀為無(wú)色或略帶白色的透明液體，無(wú)混濁或沉淀。2無(wú)菌檢驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)。3安全檢驗(yàn)取體重為100_150g的牙鲆30條，肌肉注射50 μ g疫苗，觀察15日，
全部健活。4效力檢驗(yàn)用體重為100_150g健康牙鲆30條，各肌肉注射疫苗10yg，同時(shí)肌肉 注射PBS 20(^1^，于16-221水溫培養(yǎng)。免疫魚(yú)血清轉(zhuǎn)陽(yáng)率應(yīng)高于80%、對(duì)照魚(yú)小于10% 或免疫魚(yú)特異性抗體效價(jià)應(yīng)高于1 1600、對(duì)照魚(yú)小于1 100為合格。本發(fā)明制備的牙鲆淋巴囊腫病毒病基因工程疫苗的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、成 本較低，經(jīng)上述步驟制備的牙鲆淋巴囊腫病毒病基因工程疫苗成品，可有效預(yù)防牙鲆淋巴 囊腫病毒病的發(fā)生。
SEQUENCE LISTING
<110>國(guó)家海洋局第一海洋研究所
<120>牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>624
<212>DNA
<213> 淋巴囊月中病毒 Lymphocystis disease virus <400>1
atgatcggta atactattga tatgacacaa cccgttgatt ccaatggtca attacctgaa 60 gaagtgttaa tacttccttt accttatttc ttttctcgag atagcggtat ggctttaccc 120agcgctgctt tgccttataa tgaaataaga ttaacttttc atctgagaga ttggactgaa180
ttattgatct ttcaaaataa aaacgactct accatcatgc ctttgacagc aggcgattta240 gactggggta aacctgattt aaaggatgtg caagtatgga ttactaatgt agtagtaacc300
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caatccaatt acaccagttc ttctcctgta atctttgacg gtggaattgc tagcgattta540
ccgggtattg ctgctgatcc tatttcaaat gttaccttgg tttatgaaaa tagtgctcgt600
cttaatgaaa tgggtagtga atat62權(quán)利要求
一種牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗，特征在于該疫苗由大小為0.6kb的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段，插入到真核表達(dá)載體pEGFP N2中構(gòu)成的重組質(zhì)粒pEGFP N2 LCDV MCP 0.6kb，插入到核酸疫苗中的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段序列為ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTAATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAATAAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTTTGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACCAATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGTATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCTTTTTTTCGGTGTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCTAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATGAAATGGGTAGTGAATAT其中A為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，G為鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸，C為胞嘧啶脫氧核糖核苷酸，T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。
2.牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于生產(chǎn)步驟依次是牙鲆淋巴囊 腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)的制備；然后將該牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗轉(zhuǎn)化入大腸桿菌制備出生產(chǎn)用菌種 K12DH-5 α -IXDV0. 6kb ；再將該生產(chǎn)用菌種劃線到Minca瓊脂平板、分離純化制備出一級(jí)生 產(chǎn)種子，并對(duì)其鑒定確定合格的一級(jí)種子；再將上述合格的一級(jí)種子接種于若干瓊脂扁瓶中在37°C培養(yǎng)24-48h后得二級(jí)生產(chǎn)種 子，并對(duì)其鑒定確定合格的二級(jí)種子；再將上述合格的二級(jí)種子在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)菌液；最后對(duì)上述二級(jí)種子培養(yǎng)菌液進(jìn)行菌體收集、離心、質(zhì)粒DNA提取、純化，再對(duì)提取得 到的質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行無(wú)菌、DNA純度、外源DNA含量、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)和超螺旋質(zhì)粒含量的 檢驗(yàn)，檢測(cè)合格者即得。
3.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是所述 的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)制備方法，首先在真核表達(dá)載體PEGFP-N2的 多克隆位點(diǎn)處通過(guò)SphI和EcoR I雙酶切克隆入抗原編碼基因MCP 0.6kb片段，并經(jīng) Bam HI和NotI雙酶切去除真核表達(dá)載體pEGFP_N2中的EGFP基因后，得到重組質(zhì)粒 PEGFP-N2-IXDV-MCP0. 6kb，全長(zhǎng)4. 7kb，即為牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗質(zhì)粒庫(kù)；上述抗 原編碼基因的獲得是由接種牙鲆淋巴囊腫病毒中國(guó)株LCDV-cn的牙鲆鰓細(xì)胞系re-9307， 經(jīng)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，針對(duì)MCP設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序儀測(cè) 序鑒定獲得的624bp IXDV-cn MCP基因片段。
4.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的基 因工程疫苗生產(chǎn)用菌種的制備方法將上述生產(chǎn)用菌種劃線到Mi nca瓊脂平板，并且按常 規(guī)方法分離純化，用0. Olmo 1/L pH7. 2PBS洗下，分裝5mL滅菌小瓶，加10%甘油混勻作為 一級(jí)種子，-70°C保存。
5.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的基因工程疫苗的二級(jí)種子的制備將上述一級(jí)種子接種于生產(chǎn)用瓊脂扁瓶中，使其均勻分 布于瓊脂表面上，在37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)，將菌落生長(zhǎng)良好的扁瓶取出，每瓶加入適量的 PH6. 3-6. 8生理鹽水將菌苔洗下，將純凈菌液混合均勻懸浮，分裝5mL滅菌小瓶，加10%甘 油混勻，逐瓶或分組作純凈性檢驗(yàn)，合格者作為二級(jí)生產(chǎn)種子。
6.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的二 級(jí)生產(chǎn)種子的發(fā)酵培養(yǎng)方法將馬丁肉湯培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐內(nèi)，121°C、30分鐘高壓滅菌， 在無(wú)菌條件下按發(fā)酵液的2%將合格的二級(jí)種子加入發(fā)酵罐內(nèi)，并按100g/L和50g/L的比 例分別向發(fā)酵液中加入葡萄糖和卡那霉素，消泡劑適量；在發(fā)酵過(guò)程中，用氨水和鹽酸調(diào)節(jié) 罐內(nèi)pH至7. 0，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度保持溶氧為30% ；當(dāng)溶氧高于30 %時(shí)，進(jìn)行指 數(shù)連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞0D600達(dá)到40時(shí)，添加氯霉素，使終濃度為150μ g/ml，并 將流加速度降低50% ；發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)控制如下pH 7. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量6. Om3/ h，培養(yǎng)時(shí)間10-12h ；在發(fā)酵6h、8h、10h、12h時(shí)取樣進(jìn)行純度鏡檢，純度大于99 %為合格； 并進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢驗(yàn)取發(fā)酵培養(yǎng)后的細(xì)菌，分別等量涂布于含30ug/mL卡那霉素與不 含卡那霉素的平板上，菌落比例高于99%者視為穩(wěn)定；上述的補(bǔ)料培養(yǎng)基是由每升含酵母 抽提物40g，蛋白胨80g，葡萄糖100g，氯化鎂5g配制而成。
7.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的 二級(jí)生產(chǎn)種子的發(fā)酵培養(yǎng)后菌液的濃縮方法將上述的檢測(cè)合格的發(fā)酵培養(yǎng)的菌液，經(jīng) 3000rpm離心15分鐘，收獲菌體，稱重，分裝，60g/份，將分裝菌體溶解于500mL PBS溶液中 即得到濃縮菌液，再分別置于IL體積的離心轉(zhuǎn)子中，3000rpm離心5min，得到菌體，以便進(jìn) 行菌體質(zhì)粒DNA提取和純化。
8.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的菌 體質(zhì)粒DNA提取和純化，分三個(gè)步驟進(jìn)行(1)上述菌體進(jìn)行RNA的去除按每60g濕重向沉 淀內(nèi)加入IOOml細(xì)胞懸浮緩沖液，充分混勻，在37°C水育搖床中緩慢水平振蕩Ih ； (2)菌體 的堿裂解加入IOOmL細(xì)胞裂解液，邊加邊緩慢混勻，室溫放置5分鐘，達(dá)到充分裂解；隨即 緩慢加入125mL中和液再將加入中和溶液后的菌體4000rpm離心IOmi η分鐘后，取上清液； (3)質(zhì)粒制備液的凈化和濃縮取離心后的上清液通過(guò)多層紗布過(guò)濾到一潔凈的IOOOmL離 心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，混勻后4°C，4000rpm離心15min ；棄上清，沉淀中加入 20mLTE溶解沉淀，并用吸管將溶解后的沉淀緩慢吹打均勻，放置4°C過(guò)夜，再13000rpm，離 心lOmin，取上清，加入等體積的40% PEG8000，混勻后13000rpm，離心lOmin，棄上清，沉 淀中加入20mL滅菌過(guò)濾的0. 01mol/LpH7. 2的PBS中以溶解沉淀，測(cè)定溶解沉淀后溶液的 OD260,得到純化的質(zhì)粒DNA，在_20°C凍存待檢。
9.如權(quán)利要求2所述的牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是上述的質(zhì) 粒DNA的檢驗(yàn)，分七個(gè)方面進(jìn)行(1)質(zhì)粒的一致性檢驗(yàn)限制性雙酶切和PCR鑒定應(yīng)符合 重組質(zhì)粒特征；(2) DNA純度檢驗(yàn)質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260 OD280比值應(yīng)在 1.8-1.9區(qū)間內(nèi)；HPLC檢測(cè)純度應(yīng)大于95% ； (3)外源DNA含量測(cè)定定量PCR檢測(cè)宿主 K12DH-5 α的基因組DNA應(yīng)小于lOng/mg ； (4)內(nèi)毒素含量測(cè)定鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素應(yīng)低于 10EU/mg ； (5)外源蛋白質(zhì)含量檢測(cè)通過(guò)凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，分光光度計(jì)檢 測(cè)宿主K12DH-5ci蛋白質(zhì)應(yīng)小于10μ g/mg ;(6)超螺旋質(zhì)粒含量的檢驗(yàn)瓊脂糖或8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)超螺旋質(zhì)粒應(yīng)高于75% ； (7)無(wú)菌檢驗(yàn)質(zhì)粒用PBS稀釋，取樣做無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)；經(jīng)以上七個(gè)方面的檢測(cè)均合格者即為半成品基因工程疫苗，再經(jīng)過(guò) 常規(guī)的效力檢驗(yàn)，血清轉(zhuǎn)陽(yáng)率應(yīng)高于80%，最后常規(guī)的安全檢驗(yàn)，合格者即為生產(chǎn)用牙鲆淋 巴囊腫病毒病基因工程疫苗成品。
10.牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗應(yīng)用于牙鲆淋巴囊腫病毒病的預(yù)防。
全文摘要
一種牙鲆淋巴囊腫病基因工程疫苗及其生產(chǎn)方法，其特征是該基因工程疫苗由大小為0.6kb的淋巴囊腫病毒核衣殼蛋白基因MCP片段，插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N2中構(gòu)成的重組質(zhì)粒pEGFP-N2-LCDV-MCP 0.6kb。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌制備生產(chǎn)用菌種，劃線到Mi nca瓊脂平板、分離純化、制備并確定合格的一級(jí)種子，再接種于瓊脂扁瓶中，在37℃培養(yǎng)后24-48h后，對(duì)其鑒定確定合格的二級(jí)種子；再發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)菌液；進(jìn)行菌體收集、離心、質(zhì)粒DNA提取、純化，進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)合格者即得。本發(fā)明完整的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好和成本低；比目前的滅活疫苗、減毒疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗等免疫效果好、安全無(wú)副作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101954092SQ20101014135
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者吳興安, 吳謖琦, 孫修勤, 張進(jìn)興, 曲凌云, 沈志強(qiáng), 洪旭光, 鄭明剛, 鄭風(fēng)榮 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所