專利名稱：一種靶向腫瘤的雙基因重組腺相關病毒載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及病毒學、免疫學、基因蛋白質學、生物醫藥學領域，特別涉及含有雙基因的重組腺相關病毒載體、其制備方法及其用途。
背景技術：
惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一。目前臨床上主要是采用放射治療及化學療法。然而，有些惡性腫瘤對放射治療不敏感，對化療易產生耐藥性，因此尋找新的有效治療腫瘤的候選藥物和治療方法是臨床醫生與患者的急切愿望。 腫瘤分子生物學的研究表明，腫瘤細胞凋亡是腫瘤發生發展的關鍵環節。因而以誘導腫瘤細胞凋亡從而達到抑制腫瘤目的的策略成為近些年腫瘤基因治療的熱點。Caspase-3是細胞凋亡中重要的誘導和下游執行的中心分子。正常情況下，它在細胞中以酶原形式存在，一旦活化后即可以高效地不可逆地誘導細胞凋亡，且在多種腫瘤細胞的凋亡過程中廣泛性存在作用。已有研究表明，將caspase-3的大小亞基顛倒可以得到具有天然活性的caspase 分子(rev-Caspase-3)，這種重組活化的Caspase-3分子作用于腫瘤細胞后無需其它因子激活即可有效地誘導細胞凋亡，Caspase-3的大小亞基反向連接小亞基在前大亞基在后活性更好(J BiolChem, 1998 ；273 :10107-11)。此外，腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管的生成，通過抑制腫瘤新生血管生成，也是治療腫瘤的一種途徑。在內源性血管生成抑制因子中，內皮抑素(Endostatin，ES)最引人注目，它對體外內皮細胞具有明顯的增殖抑制活性。在體內，其可特異性地抑制內皮細胞增殖和新生血管形成，從而抑制腫瘤生長。但國內外均有文獻報道ES需與化療藥物聯用才有較好的效果(Clin Cancer Res，2004，10 (Iptl) :33-42.；中國肺癌雜志，2005，8 (4) 283-290.臨床腫瘤學雜志，2007，12 (10) :728-735.) 雖然Caspase-3和內皮抑素各自具有較好的腫瘤治療效果，但是尚沒有同時使用Caspase-3和內皮抑素來治療惡性腫瘤的報道，也沒有將二者導入相同載體進而提供基因治療藥物的報道，為此，發明人想通過基因工程手段將Caspase-3和內皮抑素的基因同時導入合適的載體中，提供一種雙基因靶向治療載體，在保證caspase分子活性的基礎上，可同時使ES具有較好的效果，從而實現強效治療的目的。為了實現上述目的，申請人對何種載體可以作為合適的候選載體進行了分析，最后選擇腺相關病毒(Adeno associated virus, AAV)進行了嘗試。因為腺相關病毒是一類微小、無被膜及具有二十面體結構的細小單鏈DNA病毒。迄今為止，尚未發現與AAV相關的疾病報道，因此AAV被公認為是最安全的病毒載體。但由于包裝容量的限制，其多用于單基因的構建、包裝(Curr Opin Mol Ther. 2003 ；5 (4) :367-75.)。對于用AAV攜帶該雙基因能否成功構建與有效表達尚不得而知。為此，申請人進行了本發明的研究工作。
發明內容
本發明首先將Caspase-3與內皮抑素雙基因克隆構建于同一 AAV載體上，經包裝純化后獲得新型重組腺相關病毒載體。并通過細胞和動物實驗驗證新型重組腺相關病毒載體在體內/體外的抗癌效果，由此完成了本發明。本發明的一方面提供了一種新的攜帶雙基因在體內表達的、生物安全性高的重組腺相關病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin。該載體包含大小亞基反向連接的CaSpaSe3和內皮抑素基因，其基因連接順序為 Caspase3小亞基-CaSpaSe3大亞基-IRES-內皮抑素基因。也就是在腺相關病毒載體內可操作地連接有SEQ ID NO 9所示的序列。本發明的另一方面是提供了制備如上所述的雙基因重組腺相關病毒載體rAAV-Re v-Caspase3-IRES-Endostatin的方法，具體包括以下步驟(1)制備 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 質粒具體地，本申請的發明人采用RT-PCR方法，首先從人肺癌細胞株A549細胞中提取總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA，再根據設計的引物從該cDNA中分別擴增出caspase-3基因的543大亞基(LS :pl7)及311小亞基(SS :pl2)，然后通過預先設計的酶切位點按小亞基置前，大亞基置后的順序連入pAAV-IRES-hrGFP多克隆位點，得到按照SS-LS的順序連接的、 含有活化的重組 caspase-3 基因的 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_hrGFP 質粒。用同樣的方法從成人肝臟組織提取RNA逆轉錄獲得cDNA，以此為模板，根據設計的引物擴增出555bp的內皮抑素(Endostatin，ES)基因片段。同時pAAV-IRES-hrGFP 為模板，通過特異性引物擴增出670bp的IRES序列，將IRES與ENDOSTATIN連接，再將 IRES-ENDOSTATIN序列替換載體pAAV-IRES-hrGFP中的IRES-hrGFP序列，構建獲得按照 SS-LS-IRES-ES 順序連接的重組載體 pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin。根據本發明，所述的腺相關病毒優選用AAV2型。(2)重組腺相關病毒載體 rAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 的制備根據本發明，本發明的制備雙基因重組腺相關病毒載體的方法還包括包裝純化該重組腺相關病毒載體的步驟。所述的病毒包裝是指，由于病毒本身不能自己繁殖復制，必須依賴真核細胞的蛋白核酸等原料包裝。尤其是本發明所采用的質粒中沒有包含完整的病毒基因，轉染一般的細胞是不能包裝出病毒的(病毒基因組不完整)。只有加入輔助質粒(其中含有有助于病毒包裝的必需蛋白的基因)后，才能有效的啟動病毒包裝。根據本發明，所述的包裝步驟是指將pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin和輔助質粒共轉染包裝細胞，使之產生病毒顆粒。所述的輔助質粒可以是pSH3、pAAV_RC和pHelper等，本發明中優選使用pAAV-RC、 pHelper兩種質粒，這兩種質粒與pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin共轉染包裝細胞。所述的轉染方法可以是電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、多種陽離子物質或病毒介導轉染方法等，本發明中優選采用磷酸鈣共沉淀法。所述的包裝細胞可以是現有技術中常用的包裝細胞，例如人胚腎細胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細胞BHK-21等，本發明中，優選使用HEK293細胞。根據本發明，所述的包裝步驟還包括在用輔助質粒共轉染包裝細胞后，培養 65-72小時后，收獲細胞，用1 X PBS重懸細胞置-80 °C冰箱凍存。根據本發明，制備雙基因重組腺相關病毒載體的方法還包括用肝素一瓊脂糖親和層析方法純化，制得高純度高滴度重組腺相關病毒載體rAAV-Rev-Caspasd-IRES-Endos tatin。本發明的再一方面提供了本發明的病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostat in的醫藥用途，例如在制備用于預防和治療惡性腫瘤，特別是實體瘤(例如肝癌)的藥物中的用途。其中的腫瘤包括但不限于肝癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、腎癌。根據本發明，將制備的rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin用于肝癌細胞株及肝癌模型鼠以檢測其抗腫瘤效果，結果表明該重組腺相關病毒載體具有明顯的抑制腫瘤作用。本發明還涉及含有重組腺相關病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 的組合物，其中還含有藥學允許的賦形劑。發明的有益效果本發明首次成功地將Caspase-3與內皮抑素雙基因構建于同一 AAV載體上，經包裝純化后獲得新型重組腺相關病毒載體。實驗結果表明，本發明的新型重組腺相關病毒載體具有明顯的抗癌作用。由此提供了一種新的雙基因靶向治療載體，可能進一步提高抗腫瘤治療效果。
圖IA 質粒pAAV-IRES-GFP的結構示意 IB 質粒 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 的結構示意圖。圖 2 :rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 的純度與滴度檢測。圖 2A 結果表明該重組病毒中三種外殼蛋白VP1，VP2，VP3的比例為1 1 10，純度達到要求。圖2B表示病毒滴度檢測時的雜交結果。圖 3 用 rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 轉染肝癌細胞株 H印G2，24、48、72 小時后細胞的變化。其中，圖3A為轉染前對照；圖:3B為轉染后M小時；圖3C為轉染前對照；圖3D為轉染后M小時；圖3E為轉染前對照；圖3F為轉染后48小時；圖3G為轉染前對照；圖3H為轉染后72小時。其中圖3A，;3B是在普通光鏡下的視野照片；圖3C-3H是由瑞吉染色后由普通光鏡下觀察得到的視野照片。其中3A是;3B的對照，3C是3D的對照，3E是 3F的對照，3G是3F的對照。圖4 :rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin重組病毒對荷瘤模型鼠的作用。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下面實施例中所采用的分子生物學技術可參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南)》;所使用的工具酶均購自New England Biolab公司，具體的反應條件和使用的方法均參考商品說明書；所使用的膠回收試劑盒購自安比奧生物技術公司，使用方法參考商品說明書。實施例1.構建重組腺相關病毒載體pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin質粒DRT-PCR 克隆 Rev_Caspase3 基因的引物Rev-Caspase3分為大亞基LS (ρ 17)與小亞基SS (ρ 12)。根據序列用Ρ5軟件設計引物如下
權利要求
1.重組腺相關病毒載體，其中沿著腺相關病毒的轉錄方向可操作地連接有SEQID NO 9所示的外源基因，所述外源基因是編碼反向連接的CaSpaSe3大小亞基的基因和內皮抑素基因，其基因連接順序為5’ -Caspase3小亞基編碼基因-Caspase3大亞基編碼基因-IRES 編碼基因-內皮抑素編碼基因_3’。
2.含有權利要求1的重組腺相關病毒載體的宿主細胞。
3.含有權利要求1的重組腺相關病毒載體的組合物，其中還含有藥學允許的賦形劑。
4.制備權利要求1的重組腺相關病毒載體的方法，包括步驟(a)用基因工程方法構建質粒pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin，其包含大小亞基反向連接的CaspaSe3和內皮抑素基因，其基因連接順序為CaSpaSe3小亞基-CaSpaSe3 大亞基-IRES-內皮抑素基因；(b)將(a)中構建的質粒pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin和輔助質粒共轉染包裝細胞；(c)收獲(b)中的細胞，依照常規方法獲得重組病毒載體rAAV-Rev-CaspaseS-IRES-En dostatin。
5.權利要求4的方法，其中所述的輔助質粒可以是pSH3、pAAV-RC和pHelper，優選 pAAV-RC和pHelper兩種質粒。
6.權利要求4的方法，其中所述的轉染方法可以是電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、 磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、多種陽離子物質或病毒介導的轉染方法，優選磷酸鈣共沉淀法。
7.權利要求4的方法，其中所述的包裝細胞是人胚腎細胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細胞BHK-21，優選人胚腎細胞HEK293。
8.權利要求1的重組腺相關病毒載體在制備腫瘤治療藥物中的用途。
9.權利要求1中的重組腺相關病毒載體用于抑制腫瘤生長的用途。
10.根據權利要求9和10的用途，其中的腫瘤包括肝癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、腎癌。
全文摘要
本發明涉及一種靶向腫瘤的雙基因重組腺相關病毒載體，具體地涉及同時含有大小亞基反向連接的Caspase3和內皮抑素的重組腺相關病毒載體、其制備方法及其抗腫瘤的用途。
文檔編號A61P35/00GK102212556SQ201010137619
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者唐升斌, 肖艷桃, 譚孟群, 趙霏 申請人:深圳市湘雅生物醫藥研究院