專利名稱：：一種具有酸敏性的血根堿脂質體的制備方法
技術領域：
：本發明涉及藥物制劑領域，具體涉及方法制備的血根堿脂質體具有酸敏性。種血根堿脂質體的制備方法，采用本發明
背景技術：
：血根堿發現于19世紀初，分子式為(:2。1114冊4，相對分子質量為332。作為一種卞基異喹啉類生物堿，具有一系列廣泛的抗細菌、抗真菌、抗感染的特性。近期研究表明，血根堿對人類多種癌癥細胞具有良好的抑制活性，它可通過抑制內皮生長因子減少癌細胞周圍血管增生，在微摩爾濃度就能抑制癌細胞生長而不影響正常細胞，并能有效地阻斷多數腫瘤細胞MDR(多藥耐藥效應)，因此有望在臨床腫瘤治療方面發揮作用。詳見(Mackraj，ThirumalaGovender，PremGathiram.Sanguinarine[J].CardiovascularTherapeutics,2008,26:75-83)(HaseebAhsan，ShannonReagan-Shaw，JorienBreur，NihalAhmad，SanguinarineinducesapoptosisofhumanpancreaticcarcinomaAsPC—landBxPC-3cellsviamodulationsinBcl-2f咖ilyproteins[J].CancerLetters,2007，249(2):198-208.)該藥和大多數腫瘤藥物一樣具有毒性，人體不良反應有惡心嘔吐，肢體腫脹紅斑，心臟衰竭等，因此有必要選擇適合的給藥系統以降低其毒性，提高其體內療效。脂質體作為一種具有生物降解性和生物相容性的載藥系統，是抗癌藥物首選的一種給藥系統。脂質體雖然具有降低抗癌藥物全身毒副作用、提高療效等一系列優點，但也存在易被RES系統清除、靶向性不足、免疫原性等眾多問題。其中之一是大多數普通脂質體是以內吞方式進入細胞，首先存在于核內體(endosome)中，然后在微管系統的介導下被運送至溶酶體(lysosome)，在溶酶體中，脂質體及其所包含的活性成份被降解，因而直接導致抗癌藥物的損失。人體血液的pH值為7.4，腫瘤組織的pH值約為6.5，而核內體的pH值約為5.5，如果脂質體能被核內體較低的pH所觸發，將其所包含的活性成份釋放出來，逃逸到細胞質中，就可以避免藥物被溶酶體所破壞，從而提高療效。酸敏脂質體就是利用上述pH的差異，觸發脂質體內活性成份釋放到細胞質中，避免被溶酶體降解的一種功能性脂質體。目前，酸敏性脂質體主要有兩種原理，一種是應用PH敏感性類脂，如D0PE、油酸、半琥珀酸膽固醇等；另一種是應用pH敏感性的聚電解質結合于脂質體表面，如聚(2-乙基丙烯酸)等。這些物質的構象隨著pH而改變，引發脂質體膜不穩定、聚集、融合、釋放內容物。
發明內容本發明公開了一種具有酸敏性的血根堿脂質體的制備方法。我們在采用銨鹽梯度法制備血根堿脂質體的過程中發現采用常規的硫酸銨鹽，所得到的血根堿脂質體沒有酸敏性；而采用枸櫞酸銨鹽，所得到的血根堿脂質體卻具有酸敏性，這明顯有利于提高血根堿的抗腫瘤作用。本發明的制備方法包括將磷脂、膽固醇溶于有機溶劑，減壓蒸發去除有機溶劑，加入枸櫞酸銨水溶液水合形成混懸液，勻化，透析，再與血根堿水溶液孵化即得。其中所述有機溶劑優選氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮中的一種或幾種。更優選氯仿、甲醇、二氯甲烷或乙醇。本發明的制備方法還可以是將磷脂、膽固醇溶于有機溶劑，攪拌條件下滴入枸櫞酸銨水溶液，減壓蒸發除去有機溶劑，勻化，透析，再與血根堿水溶液孵化即得。有機溶劑優選乙醇或乙醚。本發明中所述磷脂優選大豆磷脂。本發明所涉及的比例均為摩爾比。本發明中，血根堿與磷脂、膽固醇的配比直接影響到脂質體的質量，制備過程中使用的枸櫞酸銨的濃度對其質量也有影響。當固定處方和制備過程中的其他參數不變，僅考察藥物和磷脂的比例時，血根堿脂質體的平均粒徑和包封率如表1所示。表1.血根堿/磷脂的比例對脂質體粒徑和包封率的影響(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>從表l可以看出，血根堿和磷脂的摩爾比例在l:15范圍內，包封率低于80%;當兩者的摩爾比在l:620范圍內，包封率大于80%，符合要求；但在兩者的比例超過i:15后，由于脂質體中磷脂濃度較高，導致液體粘稠，而且容易分層。因此本發明中血根堿/磷脂的比例優選在i:615。當固定處方中的其他因素不變，僅改變膽固醇的用量時，血根堿脂質體的平均粒徑和包封率也不同。結果見表2。表2.血根堿/膽固醇的比例對脂質體粒徑和包封率的影響(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表2可以看出，當藥物和膽固醇的摩爾比例小于1:0.1時，包封率低于80%;當兩者的比例在l:0.52.5范圍內，包封率在80%以上；當兩者的摩爾比在1:515范圍內，包封率隨膽固醇增加而下降，粒徑也逐漸增大，且制備的脂質體不穩定，容易分層。因此本發明中藥物/膽固醇的摩爾比例優選在l:0.52.5。當固定處方中的其他因素不變，僅改變制備過程中使用的枸櫞酸銨的濃度時，血根堿脂質體的平均粒徑和包封率也不同，結果見表3。表3.枸櫞酸銨濃度對血根堿脂質體粒徑和包封率的影響(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表3可以看出，不同的枸櫞酸銨水溶液濃度對脂質體粒徑影響較小，但對包封率影響顯著。隨著枸櫞酸銨濃度增大，包封率逐漸升高。當枸櫞酸銨濃度在0200mmol/L時，包封率低于80%;當枸櫞酸銨濃度在250500mmol/L時，包封率高于80%，其中濃度在400mmol/L時包封率已經接近100%。但是當枸櫞酸銨濃度在500mmol/L以上時，所制備的脂質體不穩定，容易分層。因此本發明中枸櫞酸銨的優選濃度范圍為250500rnmo1/L。在采用銨鹽梯度法制備血根堿脂質體時，本領域更多地使用硫酸銨作為銨鹽，但本試驗發現在采用銨鹽梯度法制備血根堿脂質體時，使用枸櫞酸銨和硫酸銨所制備的血根堿脂質體具有一定的差異，其中枸櫞酸銨制備的血根堿脂質體具有明顯的酸敏性，可由體外釋放試驗得到證明。—、體外釋放實驗配置HEPES緩沖液(0.14mol/LNaCl，0.01mol/LHEPES)作為釋放介質，用NaOH溶液調節pH為7.4、6.5、5.5。這三個pH分別模擬生理體液(pH7.4)、腫瘤組織(p朋.5)、核內體攝取后環境(PH5.5)。精密移取血根堿脂質體1.5mL，置于透析袋中，兩端扎緊，置40mLHEPES緩沖液中，37t:恒溫磁力攪拌，定時取樣O.5mL，并及時補充新鮮的釋放介質。樣品經高速離心后吸取上清液，HPLC測定藥物含量，計算累計釋放率，并繪制時間釋放曲線。所考查的兩種脂質體分別是由硫酸銨梯度法制備的血根堿脂質體和由枸櫞酸銨梯度法制備的血根堿脂質體。見圖1和圖2。其中，硫酸銨組幾乎不表現出酸敏性，在三種pH環境下，釋放無明顯差異；但采用枸櫞酸銨組脂質體卻表現出明顯的酸敏性，隨著溶液pH的降低，脂質體中藥物的釋放顯著加快。二、采用人宮頸癌Hela細胞對兩種脂質體進行體外抗腫瘤實驗比較處于對數生長期的人宮頸癌Hela細胞，用0.02%EDTA消化，臺盼藍計數活細胞，制成細胞懸液，H22細胞直接離心收集。以0.5X10VmL細胞濃度加入96孔培養板內，每孔100iiL，設三復孔，置37t:5%(A孵箱內過夜培養，分別加入3、5、7、9iig*mL—1的血根堿溶液、采用硫酸銨制備的血根堿脂質體、本發明的血根堿脂質體，無其他陽性對照，陰性對照組加入等體積的空白脂質體，以等體積單純細胞懸液作為空白對照，100iiL/孔，37t:5%C02孵箱孵育44h，每孔加入5mgmL—^TT溶液20yL，繼續培養4h，腫瘤細胞貼壁細胞直接棄去全部上清，H22懸浮細胞于板式離心機1000rpm離心10min，倒扣于吸水紙，吸去上清。分別加入匿S0100iiL/孔，微型振蕩器上振動5分鐘，使結晶完全溶解，于酶聯儀570nm波長處測定吸光度值(A)，A值越高活細胞數也越多。根據A可計算藥物對細胞的生長抑制率，結果如表4所示。(1_加藥組細胞平均吸光值)濕對照組細胞平均吸光值表4血根堿溶液及脂質體對人宮頸癌Hela細胞24h抑瘤作用C(嗎-mL'1)血根堿水溶液本發明的脂質體采用硫酸銨梯度法制備的脂質體311.31%34.08%**14.63%515.86%52.58%**21.58%720.57%60.18%**24.47%923.46%63.22%**31.54%*P<0.05，**P<0.01本發明的脂質體與硫酸銨梯度法制備的脂質體組比較兩組脂質體作用于人宮頸癌Hela細胞24h后，均有明顯抑瘤作用，且有濃度依賴性。其中本發明的脂質體在同等給藥濃度下的抑瘤作用顯著高于硫酸銨制備的血根堿脂質體，具有顯著性差異。6分析原因，脂質體在內吞進入細胞后，由于枸櫞酸銨梯度法制備的脂質體具有酸敏性，在核內體較低pH的觸發下，脂質體膜與核內體的膜融合，將血根堿釋放出來，進入細胞質，從而發揮抑瘤作用；而硫酸銨梯度法制備的血根堿脂質體不具酸敏性，更多地由核內體轉入溶酶體，藥物被溶酶體降解，因此抑瘤效果較差。三、采用荷H印s瘤的小鼠評價兩種脂質體的體內抗腫瘤效果。取ICR小鼠50只，18-22g，雌雄各半。按移植性腫瘤研究法，接種H印s實體型瘤(在無菌操作下取瘤塊，稱重，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后放人無菌容器內，加生理鹽水稀釋成l:3的細胞懸液，容器置冰塊上，用空針抽吸，每次抽吸前將細胞混勻，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0.2mL)，接種后24小時稱鼠重，并隨機分為5組，空白對照組、環磷酰胺溶液組(20mg/kg)分別為陰、陽性對照組，血根堿溶液組，采用硫酸銨制備的血根堿脂質體，本發明的血根堿脂質體(劑量均為14mg/kg)，于接種24小時后尾靜脈注射給藥，每天一次，共給藥6次，于停藥后第2天處死荷瘤小鼠，稱重，并分離瘤塊稱重，所得數據進行統計學處理(t檢驗)。結果如表5所示。表5血根堿溶液及脂質體i.v.對小鼠移植瘤H印s的抑制作用(f±SD)(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01與空白組比較與溶液組相比，兩種脂質體皆有顯著抑制H印s腫瘤生長的作用(P<0.01)。但本發明脂質體的體內抑瘤率明顯優于硫酸銨制備的非酸敏性血根堿脂質體。這進一步說明采用枸櫞酸梯度法制備的血根堿脂質體，由于具有酸敏性而顯著提高其在體內的療效。本發明制備的血根堿脂質體，在優化處方范圍內，包封率大于80%，粒徑在100300nm范圍內。本發明的優點在于采用枸櫞酸梯度法制備血根堿脂質體，制備工藝簡單，不僅可使脂質體具有高的包封率，而且還使脂質體具有酸敏性的特點，從而顯著提高其體內外抑瘤率。圖1是采用硫酸銨制備的血根堿脂質體在三種pH條件下的釋放情況圖2是本發明方法制備的血根堿脂質體在三種pH條件下的釋放情況圖3是本發明的血根堿脂質體粒徑分布圖圖4是本發明的血根堿脂質體透射電鏡照片具體實施方式實施例1稱取1.6g大豆磷脂(純度大于99X磷脂酰膽堿)、160mg膽固醇溶于50mL乙醇中，超聲，溶解；在300rpm磁力攪拌條件下，將上述溶液緩慢注入30mL的枸櫞酸銨溶液(300mmol/L)。混合液5(TC旋轉蒸發2h，使乙醇完全揮干，高壓均質以減少粒徑(5000psi，3次)，得到載藥前空白脂質體。然后將空白脂質體置于透析袋，兩端扎緊，放入500mL生理鹽水2小時，每小時更換一次生理鹽水。后將90mg血根堿溶于90mL蒸餾水中，再與上述透析后的脂質體混合，3(TC水浴孵化5min，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2ym)，將續濾液分裝于西林瓶中即可。其中血根堿大豆磷脂膽固醇的摩爾比例為i:7.5:1.5。所制備的脂質體包封率為94.45%，平均粒徑為110.5nm，多分散系數為0.18。成品性狀本品為橙紅色混懸液體。粒徑測定本品用生理鹽水作為稀釋溶劑，稀釋數倍后用PCS法測定粒徑(MalvernZetasizer3000HS)，粒徑分布圖見圖3所示，形態學觀察本品用等滲生理鹽水作為稀釋溶劑，稀釋數十倍后在透射電鏡下觀察。如圖4所示，脂質體為規則的球體，外觀圓整度良好，脂質膜規則均一。實施例2與實施例1基本相同，但有以下改變前期制備空白脂質體時，操作流程為稱取lg大豆磷脂(純度大于99%磷脂酰膽堿)、160mg膽固醇溶于50mL乙醚中，超聲，溶解；在300rpm磁力攪拌條件下，將上述溶液緩慢注入30mL的枸櫞酸銨溶液(300mmol/L)中，混合液5(TC旋轉蒸發2h，使乙醚完全揮干，水浴超聲以減少粒徑，得到載藥前空白脂質體。然后將空白脂質體置于透析袋，兩端扎緊，放入500mL生理鹽水2小時，每小時更換一次生理鹽水。后將使實例1中配制的血根堿水溶液再與上述溶液混合，3(TC水浴孵化5min，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2ym)，將續濾液分裝于西林瓶中即可。其中血根堿大豆磷脂膽固醇的摩爾比例為i:7.5:i.5。所制備的血根堿脂質體包封率為92.71%，平均粒徑為104.3nm，多分散系數為0.15.實施例3稱取1.6g大豆磷脂(純度大于99X)、160mg膽固醇溶解于二氯甲烷中，將該溶液置于磨口茄形瓶中，于3(TC恒溫水浴上減壓蒸發除去有機溶劑，使磷脂、膽固醇在瓶底形成均勻膜，后置于真空干燥器中抽真空過夜，備用。另將30mL的300mmol/L的枸櫞酸銨溶液加入上述茄形瓶中，在3(TC條件下轉動洗膜，直至形成乳白色脂質體混懸液，高壓均化，減小粒徑(5000psi，3次)，得到載藥前空白脂質體。然后將空白脂質體置于透析袋，兩端扎緊，放入500mL生理鹽水2小時，每小時更換一次生理鹽水。將實施例1中的血根堿水溶液與上述空白脂質體混懸液混合，3(TC水浴孵化5min，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2ym)即可。其中血根堿大豆磷脂膽固醇的摩爾比例為i:7.5:i.5。所制備血根堿脂質體的包封率為93.78%，粒徑為113.2nm，多分散系數為0.174。實施例4稱取1.5g大豆磷脂(純度大于99%)、200mg膽固醇溶解于二氯甲烷中，將該溶液置于磨口茄形瓶中，于3(TC恒溫水浴上減壓蒸發除去有機溶劑，使磷脂、膽固醇在瓶底形成均勻膜，后置于真空干燥器中抽真空過夜，備用。另將30mL的300mmol/L的枸櫞酸銨溶液加入上述茄形瓶中，在3(TC條件下轉動洗膜，直至形成乳白色脂質體混懸液，高壓均化，減小粒徑(5000psi，3次)，得到載藥前空白脂質體。然后將空白脂質體置于透析袋，兩端扎緊，放入500mL生理鹽水2小時，每小時更換一次生理鹽水。將實施例1中的血根堿水溶液與上述空白脂質體混懸液混合，3(TC水浴孵化5min，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2ym)即可。其中血根堿大豆磷脂膽固醇的摩爾比例為i:7.0:1.9。所制備血根堿脂質體的，包封率為91.37%，多分散系數為0.174，粒徑為105.lnm。實施例5稱取2g大豆磷脂(純度大于99%)、150mg膽固醇溶解于二氯甲烷中，將該溶液置于磨口茄形瓶中，于3(TC恒溫水浴上減壓蒸發除去有機溶劑，使磷脂、膽固醇在瓶底形成均勻膜，后置于真空干燥器中抽真空過夜，備用。另將30mL的300mmol/L的枸櫞酸銨溶液加入上述茄形瓶中，在3(TC條件下轉動洗膜，直至形成乳白色脂質體混懸液，高壓均化，減小粒徑(5000psi，3次)，得到載藥前空白脂質體。然后將空白脂質體置于透析袋，兩端扎緊，放入500mL生理鹽水2小時，每小時更換一次生理鹽水。將實施例1中的血根堿水溶液與上述空白脂質體混懸液混合，3(TC水浴孵化5min，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2ym)即可。其中血根堿大豆磷脂膽固醇的摩爾比例為i:9.4:1.4。所制備血根堿脂質體的，包封率為97.47%，多分散系數為0.174，粒徑為117.2nm。9權利要求一種血根堿脂質體的制備方法，包括采用銨鹽梯度法制備，其特征是所用的銨鹽為枸櫞酸銨。2.權利要求1的制備方法，包括將磷脂、膽固醇溶于有機溶劑，減壓蒸發去除有機溶劑，加入枸櫞酸銨水溶液水合形成混懸液，勻化，透析，再與血根堿水溶液孵化即得。3.權利要求2的制備方法，其中所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮中的一種或幾種。4.權利要求1的制備方法，包括將磷脂、膽固醇溶于有機溶劑，攪拌條件下滴入枸櫞酸銨水溶液，減壓蒸發除去有機溶劑，勻化，透析，再與血根堿水溶液孵化即得。5.權利要求4的制備方法，其中有機溶劑為乙醇或乙醚。6.權利要求1的制備方法，其中枸櫞酸銨水溶液的濃度為250500mmol/L。7.權利要求2或4的制備方法，其中血根堿、磷脂、膽固醇的摩爾比為1:l`20:0.0515。8.權利要求7的制備方法，其中血根堿、磷脂、膽固醇的摩爾比為1:615:0.5`2.5。全文摘要本發明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種具有酸敏性的血根堿脂質體的制備方法，其特征是采用銨鹽梯度法制備時選取枸櫞酸銨鹽制備血根堿脂質體，采用本發明方法制備的血根堿脂質體具有酸敏性，有利于其抗腫瘤作用。文檔編號A61K9/127GK101780043SQ201010135588公開日2010年7月21日申請日期2010年3月30日優先權日2010年3月30日發明者柯學,栗婕,董曉卉,貝俊宏,邱黎娜申請人:中國藥科大學