核重新編程因子的制作方法

專利名稱：核重新編程因子的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有使分化的體細胞重新編程來誘導誘導式多能性干細胞的作用的 核重新編禾呈因子(nuclear reprogramming factor)。
背景技術：
胚胎干細胞(ES細胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干細胞，具有能長期進行培 養并維持可以分化成存在于生物體中的所有類型細胞的多能性的特征。人們期待利用該性 質將人ES細胞作為針對帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多種疾病的細胞移植療法的來 源。但是，存在著ES細胞的移植與臟器移植同樣會引起排斥反應這樣的問題。而且，對于 通過破壞人胚胎建立的ES細胞的利用，出于倫理的觀點的反對意見也很多。如果能夠誘導 患者自身的分化體細胞脫分化，建立具有接近于ES細胞的多能性和增殖能力的細胞(該細 胞在本說明書中被稱為“誘導式多能性干細胞”(iPS細胞)，但也存在被稱為“胚胎干細胞 樣細胞”或“ES樣細胞”的情況)的話，則預期能夠利用它們作為沒有排斥反應和倫理性問 題的理想的多能性細胞。作為使體細胞核重新編程的方法，已報道了，例如，從將體細胞的核移植到卵細胞 中制備的克隆胚中建立ES細胞的技術(W. S. Hwang等，Science，303，pp. 1669-74，2004 ； W. S. Hwang等，Science, 308, pp. 1777-83，2005 但是，現已清楚了這些論文都是捏造的，而 且已于日后撤下這些論文)。然而，這些技術只是為了建立ES細胞的目的而制備克隆胚，因 此與使用不孕治療中產生的剩余胚的常規ES細胞相比，倫理的問題反而大。而且，現已報 道了通過使體細胞與ES細胞相融合使體細胞核重新編程的技術(M. Tada等，Curr. Biol.， 11，pp. 1553-1558，2001 ；C. A. Cowan 等，Science, 309, pp. 1369-73，2005)。但是，即使在該 方法中也存在以下問題無法解決由于導致最終使用人ES細胞而產生的倫理性問題。而 且，現已報道了使生長于人中的生殖細胞腫瘤來源的細胞株的提取物和分化細胞反應而使 細胞核重新編程的技術(C. K. Taranger 等，Mol. Biol. Cell, 16, pp. 5719-35，2005)。該方 法，提取物中何種成分誘導重新編程完全不清楚，因此在技術的可靠性和安全性上存在問 題。另一方面，提出了篩選具有使分化的體細胞重新編程來誘導誘導式多能性干細胞 的作用的核重新編程因子的方法(國際公開W02005/80598)。該方法包括以下步驟使含有 在受ECAT(ES cellassociated transcript)基因(ES細胞中特異性表達的基因群ES細 胞相關轉錄物)的表達調節區域的表達調節位置上存在標記基因的基因的體細胞與被檢 物質相接觸、研究標記基因表達細胞的出現的有無，選擇使該細胞出現的被檢物質作為體 細胞的核重新編程因子的候選物。而且，該出版物的實施例6等中公開了使體細胞重新編 程的方法。但是，上述出版物中沒有公開實際上鑒定核重新編程因子的報告。
專利文獻1國際公開WO 2005/80598

發明內容
本發明的課題在于提供核重新編程因子。更具體的是，本發明的課題在于提供用 于不利用卵細胞、胚和ES細胞而誘導分化細胞的重新編程，簡便且再現性強地建立具有與 ES細胞同樣的多能性和增殖能力的誘導式多能性干細胞的方法。本發明者為了解決上述的課題進行了積極的研究，使用國際公開WO 2005/80598 中記載的核重新編程因子的篩選方法嘗試鑒定核重新編程因子。其結果是，發現了 24種候 選作為與核重新編程相關的基因，確認了它們中的3種基因是核重新編程所必需的基因。 本發明是基于上述發現而完成的。
也就是，根據本發明，提供了一種體細胞的核重新編程因子，其含有下述3種基 因0ct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產物。根據本發明的優選方式， 提供了含有下述3種基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產物的上述因子。而且，根據其它的優選方式還提供了還含有下述基因S0X家族基因的基因產物 的上述因子，作為更優選的方式，提供了含有SOX2的基因產物的上述因子。而且，如果根據其它的優選方式，提供了含有細胞因子，該細胞因子和Myc家族基 因的基因產物共同存在、或代替Myc家族基因的基因產物。作為更優選方式，提供了細胞因 子為堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和/或干細胞因子(SCF)的上述因子。如果根據特別優選的方式，提供了除Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、 和Sox家族基因的各基因的產物之外，還含有TERT基因的基因產物的體細胞的核重新編程 因子；以及除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的 各基因的產物之外，還含有從由下述的基因SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16E7和Bmil構 成的組中選出的一種以上的基因產物的因子。除了這些因子，還提供了進一步含有選自于下組中的1種以上的基因的基因產物 的上述的因子Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll 禾口 β -連環素(catenin)。而且，如果根據上述發明的其它優選方式，還提供了進一步含有選自于下組中的 1種以上的基因的基因產物的上述的因子，所述組為ECAT1、EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3, Soxl5、ECAT15-l、Fthll7、Sall4、Rexl、UTFl、Stella、Stat3和 Grb2。從其它的觀點出發，本發明提供了通過體細胞的核重新編程制備誘導式多能性干 細胞的方法，該方法包括使上述的核重新編程因子與體細胞接觸的步驟。如果根據本發明的優選方式，提供了包括在體細胞的培養物中添加上述的核重新 編程因子的步驟的上述方法；包括在體細胞中導入編碼上述的核重新編程因子的基因的步 驟的上述方法；包括使用含有至少1種以上的編碼上述核重新編程因子的基因的重組載體 將該基因導入體細胞中的步驟的上述方法；和使用從患者中采集的體細胞作為體細胞的上 述方法。再從其它的觀點出發，本發明提供了由上述方法獲得的誘導式多能性干細胞。而 且，本發明還提供了誘導上述的誘導式多能性干細胞分化而得到的體細胞。而且，根據本發明，還提供了一種干細胞療法，該方法包括將對誘導式多能性干細 胞進行分化誘導而獲得的體細胞移植到該患者中的步驟，所述誘導式多能性干細胞是通過使用從患者中分離和采集的體細胞用上述方法獲得的。而且，本發明 還提供了使用對由上述方法獲得的誘導式多能性干細胞進行分化誘 導而獲得的各種細胞來評價化合物、藥物、毒物等的生理作用和毒性的方法。而且，本發明提供了一種改善細胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包 括使上述的核重新編程因子與細胞接觸的步驟，以及提供了由上述方法獲得的細胞和對由 上述方法獲得的細胞進行分化誘導而得到的體細胞。通過使用由本發明提供的核重新編程因子，不利用胚和ES細胞就可以簡便且再 現性強地誘導分化細胞核的重新編程，可以建立與ES細胞具有同樣的分化和多能性和增 殖能力的未分化細胞-誘導式多能性干細胞。例如、使用本發明的核重新編程因子能夠由 患者自身的體細胞制備具有高增殖能力和分化多能性的誘導式多能性干細胞，通過使該細 胞分化而獲得的細胞(例如心肌細胞、胰島素產生細胞、或神經細胞等)可以應用于針對心 力衰竭、胰島素依賴性糖尿病、帕金森病和脊髓損傷等多種疾病的干細胞移植療法中，由此 可以回避使用人胚的倫理問題以及移植后的排斥反應，因此極為有用。而且，可以使誘導式 多能性干細胞分化的各種細胞(例如心肌細胞、肝細胞等)，作為用于評價化合物、藥物、毒 物等的藥效和毒性的系統極為有用。附圖簡述

圖1是表示使用在Fbxl5基因中敲入了 β geo的小鼠的胎兒成纖維細胞(MEF)的 重新編程因子的篩選方法的圖。圖2是表示通過導入表4中所示的24個基因而獲得的iPS細胞的形態的照片。還 顯示了分化細胞(MEF)和正常的胚胎干細胞(ES)的形態作為對照。圖3是表示iPS細胞中標記基因的表達的圖。顯示了以從iPS細胞、ES細胞和MEF 細胞中提取的總RNA作為模板進行RT-PCR獲得的結果。圖4是表示iPS細胞中DNA甲基化狀態的圖。對從iPS細胞、ES細胞、和MEF細 胞提取的基因組DNA進行亞硫酸鹽處理，對目的DNA進行PCR擴增后，插入于質粒。每個基 因分離出10個克隆的質粒，測定序列。甲基化CpG用黑點表示，非甲基化CpG用白點表示。圖5是表示通過24個基因的群、和從24個基因的群中每次除去1個基因后的23 個基因的群的導入獲得的G418抗性細胞的克隆數的圖。圖下側表示G418選擇后一周內獲 得的集落數，圖上側表示3周內獲得的集落數。當除去用四方形圍起來的基因(基因的編 號與表1所示的相同)時，完全沒有獲得集落，或是在3周后只發現少數集落。圖6是表示通過10個基因的群、和從10個基因的群中每次除去1個基因后的9 個基因的群的導入而獲得的G418抗性細胞的集落數的圖。除了 #14、#15、或#20的各基因 時一個集落都沒有獲得。當除去#22的基因時，獲得了少數的G418抗性集落，但是細胞呈 現出分化的形態，其明顯與iPS細胞不同。圖7是表示由10個基因的群、4個基因的群、3個基因的群、或2個基因的群產生 的G418抗性集落(重新編程集落)的出現數的圖。顯示了各集落的代表性形態及大小。圖8是表示對將MEF來源的iPS細胞移植到裸鼠皮下形成的腫瘤進行蘇木精-曙 紅(H&E)染色的結果的照片。發現了三胚層系向各種組織的分化。圖9是表示通過將成體皮膚成纖維細胞來源的iPS細胞移植到小鼠胚泡中，移植 到假孕小鼠的子宮中制備的胎兒的照片。由上圖可知在左側的胎兒中來源于iPS細胞的細胞(發出綠色熒光)分布于全身。在下圖中清楚了同一胎兒的心臟、肝臟、脊髓的幾乎全部 細胞為GFP陽性，其源于iPS細胞。圖10是表示通過RT-PCR確認ES細胞標記基因的表達的結果的照片。圖中，Sox2 minus表示在MEF中導入3個基因而建立的iPS細胞，4ECAT表示在MEF中導入4個基因而 建立的iPS細胞，10ECAT表示在MEF中導入10個基因而建立的iPS細胞，10ECAT皮膚成纖 維細胞表示在皮膚成纖維細胞中導入10個基因而建立的iPS細胞，ES細胞表示小鼠ES細 胞，MEF表示沒有進行基因導入的MEF細胞。其下的編號表示克隆編號。圖11是表示在由MEF建立iPS細胞中bFGF的效果的圖。在常規的飼養細胞(ST0 細胞)(左)和導入了 bFGF表達載體的STO細胞(右)上培養的FbX150gWege。小鼠來源的 MEF中通過逆轉錄病毒導入4個因子(上部分)或c-Myc以外的3個因子(下部分)。2周 內通過G418進行選擇，經晶體藍染色后，拍照。數字表示集落數。圖12是對采用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的實驗進行說明的圖。A.分離在中心 含有小鼠Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，在Nanog的編碼環形區域的上游通過重 組插入EGFP-IRES-Pur0盒。B.用改良的BAC制備轉基因小鼠。發現GFP的表達局限于胚 泡的內細胞團塊和生殖腺中。圖13是表示對使用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的實驗進行說明的圖。從 Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的胎兒(受精后13. 5日)中除去頭部、內臟和生殖腺，建 立MEF。用細胞分選器進行分析的結果是，即使在Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠來源的 MEF(Nanog)中，與Fbxl50gWfige°小鼠來源的MEF(Fbxl5)和野生型小鼠來源的MEF(Wild) 同樣，幾乎不存在GFP陽性細胞。圖 14 是由 Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠 MEF(左)禾口 Fbxl50ge。/ege。小鼠 MEF(右) 建立的iPS細胞的照片。分別用嘌呤霉素和G418進行選擇。圖15是表示iPS細胞的增殖的結果的圖。表示將ES細胞、Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠MEF (左)來源的iPS細胞(Nanog iPS)和Fbxl50geo/figeo小鼠MEF來源的i PS細胞 (Fbx iPS)各10萬個分別接種于24孔板中，每3天進行一次傳代，測定細胞數的結果。數 字表示加倍時間的平均。圖16是表示iPS細胞的基因表達的圖。用RT-PCR分析標記基因在MEF、ES細胞、 Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠 MEF(左)來源的 iPS 細胞(Nanog iPS)禾口 Fbxl50geo/0geo 小鼠 MEF來源的iPS細胞(Fbx iPS)中的表達。下面的數字表示傳代數。圖17是表示由Nanog iPS細胞形成畸胎瘤的圖。顯示在裸鼠的背部皮下注射100 萬個ES細胞或Nanog iPS細胞，3周后產生的腫瘤的外觀(左)和組織圖像(右H&E染 色)。圖18是表示用Nanog iPS細胞制備嵌合體小鼠的圖。將Nanog iPS細胞(克隆 NPMF4EK-24，傳代數6)移植于胚泡中，誕生出嵌合體小鼠。由90個移植胚誕生出4只嵌合 體小鼠。圖19是表示由Nanog iPS細胞出發的種系傳遞(germlinetransmission)的圖。 對通過圖18所示的嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠的交配所誕生的小鼠進行基因組DNA的PCR 分析時，根據在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的轉基因，確認了種系傳遞。圖20是表示由iPS細胞向神經細胞的分化誘導的圖。顯示由來源于皮膚成纖維細胞的iPS細胞在體外分化成的神經細胞(上β III微管蛋白陽性)、寡突膠質細胞(左 04陽性)、星形膠質細胞(右GFAP陽性)。圖21是表示對不使用藥物選擇的iPS細胞的建立進行說明的圖。在每個IOcm皿 中接種1萬至10萬個MEF，通過逆轉錄病毒導入4個因子。對照(Mock)中沒有產生集落 (左)，而導入了 4個因子的皿中，除了扁平的轉化集落，還獲得了與膨脹的iPS細胞相類似 的集落(中央)。一旦將這些細胞傳代培養，就獲得了與iPS細胞相類似的細胞(右)。圖22是表示通過無藥物篩選建立的細胞的基因表達的圖。從圖21中所示的建立 的細胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES細胞標記基因的表達。圖23是表示人成纖維細胞來源的iPS細胞樣細胞的圖。顯示了通過逆轉錄病毒 將4個因子的人同源基因導入于人胎兒來源的成纖維細胞中而獲得的集落(左)、和2次傳 代后的細胞(右)。
圖24是表示由人成體皮膚成纖維細胞建立iPS細胞的圖。通過逆轉錄病毒將左邊 部分所示的因子導入到用慢病毒感染了小鼠逆轉錄病毒受體的人成體皮膚成纖維細胞中。 照片表示病毒感染后第8天的相位差圖像(物鏡xlO)。用于實施發明的最佳方式本發明的核重新編程因子的特征在于含有下述3種基因0ct家族基因、Klf家族 基因和Myc家族基因的各基因的產物，在優選方式中，特征在于除了上述的3種基因之外還 含有Sox家族基因的基因產物。作為確認本發明的核重新編程因子的方法，可以利用例如、國際公開WO 2005/80598中記載的核重新編程因子的篩選方法。通過參照上述出版物的所有公開的內 容，包含于本說明書的公開內容中。本領域人員參照上述出版物篩選核重新編程因子，可以 確認本發明的重新編程因子的存在和作用。例如，可以利用Fbxl5基因座中敲入了 i3geo(i3半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的 融合基因)的小鼠作為容易觀察重新編程現象的實驗系統。詳細內容示于本說明書的實施 例中。小鼠Fbxl5基因是在ES細胞和早期胚等的分化多能性細胞中特異性表達的基因。 在小鼠Fbxl5基因中敲入i3geo的且缺失Fbxl5的功能的同源變異小鼠中，通常沒有觀察 到包括分化多能性或發生在內的異常的表現型。在該小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增 強子和啟動子的表達控制，Pgeo在分化的體細胞中不表達，顯示出對G418的敏感性。另 一方面，敲入了 Pgeo的同源變異ES細胞顯示出對極高濃度(12mg/ml以上)的G418的抗 性。利用該現象，可以構建使體細胞的重新編程可視化的實驗系統。利用上述實驗系統，可以首先從敲入了 β geo的同源變異小鼠的胎兒(受精后 13.5天)中分離成纖維細胞(Fbxl5ege°〃ge。的MEF)。由于MEF不表達Fbxl5基因，因此也 不表達β geo，表現出對G418的敏感性。可是，一旦該MEF與沒有進行基因操作的ES細胞 (仍然呈現對G418的敏感性)相融合，MEF的核進行重新編程的結果是，表達β geo而形成 G418抗性。因此，通過利用該實驗系統，可以置換成G418抗性使重新編程現象可視化。可以使用上述的實驗系統選擇核重新編程因子。作為與核重新編程因子相關的基 因的候選物，選擇出多個顯示出在ES細胞中特異性表達的基因和提示在ES細胞的分化多 能性維持中起重要作用的基因，通過這些候選物單獨或適當組合可以確認是否引出核重新 編程。例如，通過組合所有的選擇出的初次候選物，確認可以將分化細胞重新編程誘導至接近ES細胞的狀態后、制備從前述組合中每次除去1個基因的組合，確認同樣的作用，可以選 擇該基因不存在時重新編程誘導能力減弱，或重新編程誘導能力喪失的二次候選物。對于 這樣選擇出的二次候選物，通過重復同樣的步驟，可以選擇出必需的核重新編程基因的組 合，可以確認Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3種基因的基因產物的組合作 為核重新編程因子起作用，除了這3種基因的基因產物，還可以確認Sox家族基因的基因產 物的組合作為核重新編程因子具有極好的性質。核重新編程因子的選擇方法的具體例子具 體示于本說明書的實施例中，本領域技術人員參照上述的一般的說明和實施例的具體性說 明可以容易地確認這3種基因的組合誘導體細胞的重新編程，和這3種基因產物的組合對 于核重新編程是必需的。由本發明提供的核重新編程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家 族基因的基因產物的組合，包括例如0ct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因的基因產物的組合。 作為Oct家族基因，可以例舉例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。0ct3/4是屬于POU家族的轉 錄因子，據報道其是未分化標記(K. Okamoto等，Cell，60，pp461-72，1990)。而且，還有報告 指出0ct3/4與多能性維持相關(J. Nichols等，Cell, 95, pp379_91，1998)。作為Klf家族 基因，可以例舉 Klfl、Klf2、Klf4 和 Klf5 等。據報道 Klf4(Kruppel likefactor-4)是腫 瘤抑制因子(A.M. Ghaleb等，Cell Res.，15，pp92_6，2005)。作為Myc家族基因，可以例舉 c-Myc,N-Myc和L-Myc等。有報道指出c-Myc是與細胞的分化和增殖相關的轉錄控制因子 (S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.，6，pp635_45，2005)，且與多能性維持相 關(P. Cartwright 等，Development，132，pp885_96，2005)。0ct3/4、Klf4 和 c_Myc 以外的 各家族基因的NCBI登錄號如下所示。表 1小鼠人 這些基因都是在包括人在內的哺乳類動物中共通存在的基因，為了在本發明中利 用上述基因產物，可以使用任意哺乳類動物來源(例如小鼠、大鼠、牛、綿羊、馬、猴等的哺 乳類動物來源)的基因。而且，除了野生型的基因產物外，還可以利用取代、插入和/或缺 失了多個(例如1 10個、優選1 6個、更優選1 4個、更優選1 3個、特別優選1 或2個)氨基酸的，且與野生型的基因 產物具有同樣功能的變異基因產物。例如，除了野生 型之外還可以使用穩定型(T58A)等作為c-Myc的基因產物。對于其它的基因產物也是同 樣。本發明的核重新編程因子，除了上述3種基因產物之外，可以包括其它的基因產 物。作為這樣的基因產物，可以例舉Sox家族基因的基因產物。作為Sox家族基因，可以例 舉，例如Soxl、Sox3、Sox7、Soxl5、Soxl7、和Soxl8、優選Sox2。至少包括Oct家族基因(例 如0ct3/4)、Klf家族基因(例如Klf4)、Myc家族基因(例如c_Myc)和Sox家族基因(例 如Sox2)這4種基因的基因產物的組合的核重新編程因子，從重新編程的效率的觀點出發 是本發明的優選方式，尤其是為了獲得多能性，存在優選組合Sox家族基因的基因產物的 情形。Sox2在初期發生過程中表達，是編碼轉錄因子的基因(A.A. Avilion等，Genes Dev.， 17，ppl26-40,2003)。Sox2以外的Sox家族基因的NCBI登錄號如下所示。表 2小鼠人 而且，Myc家族基因的基因產物存在可以被細胞因子替代的情況。作為細胞因子， 例如，優選SCF或bFGF等，但不僅限于此。作為更優選方式，除了上述3種基因產物、優選上述4種基因產物外，還可以列舉 誘導細胞的永生的因子。例如，可以列舉包括TERT基因的基因產物的因子，與包括選自于 下述基因中的1種以上的基因的基因產物的因子的組合SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16E7和Bmil。TERT是DNA復制時用于維持染色體末端端粒結構所必需的，在人中的干細胞和 腫瘤細胞中表達，但是在許多體細胞中沒有發現表達(I. Horikawa，等，Proc Natl Acad Sci USA. 102，ppl8437-442, 2005)。據報道，SV40 大 T 抗原、HPV16 E6、HPV16 E7 或 Bmil 通過 與大T抗原組合，導致人體細胞的永生(S. Akimov等，Stem Cells, 23，ppl423_1433，2005 ； P. Salmon等，Mol. Ther.，2，pp404-414，2000)。這些因子，尤其是在由人細胞誘導i PS細 胞時極為有用。TERT和Bmil基因的NCBI登錄號如下所示。表3小鼠人 而且，還可以組合選自于下述基因中的1種或2種以上的基因的基因產物Fbxl5、 Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcll和β -連環素。出于重新編程的效率的觀點，作為特別優選 的方式，可以例舉含有將Fbxl5、Nanog、ERas, ECAT15-2, Tcll和β -連環素的基因產物與 上述4種基因產物組合的共計10種基因產物的核重新編程因子。有報道指出Fbxl5 (Y. Tokuzawa 等，Mol Cell Biol.，23，pp2699_708，2003)、Nanog (K. Mitsui 等，Cell，113， pp631-42,2003) >ERas(K. Takahashi, K. Mitsui, S. Yamanaka, Nature,423, pp541-5,2003) 和 ECAT15-2(A. Bortvin 等，Development, 130, ppl673_80，2003)為 ES 細胞特異性表達基 因，Tcll 與 Akt 的活性化相關(A. Bortvin 等，Development，130，ppl673-80，2003)、β-連 環素為Wnt信號傳遞途徑的重要構成因子，與多能性維持相關(N. Sato等，Nat. Med.，10， pp55-63，2004)。而且，本發明的核重新編程因子還可以含有例如、選自于選自于由下述的基因 構成的組中的1種以上的基因的基因產物ECATU EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3, Soxl5、 ECAT15-1、Fthll7、Sall4、RexU UTFU Stella、Stat3 禾口 Grb2。ECATU EsgU ECAT8、 Gdf3 和 ECAT15-1 為 ES 細胞特異性表達基因(K. Mitsui 等，Cell, 113, pp631_42，2003)、 Dnmt3L是DNA甲基化酶相關因子，Soxl5是在初期發生過程中表達編碼轉錄因子的一組 基因(M. Maruyama 等，J Biol Chem.，280，pp24371_9，2005)。Fthll7 編碼鐵蛋白重鏈多 肽-樣 17 (A. colLoriot, T. Boon, C. De Smet, Int J Cancer, 105, pp 371-6，2003)，Sall4 編碼在胚胎干細胞中高表達的鋅指蛋白質(J. Kohlhase等，Cytogenet Genome Res. ,98, pp274-7, 2002) ,Rexl 編碼存在于 0ct3/4 下游的轉錄因子(E. Ben-Shushan, J. R. Thompson, L. J. Gudas, Y. Bergman, Mol Cell Biol.，18，ppl866_78，1998)。有報道指出 UTFl 是位于 0ct3/4下游的轉錄輔助因子，一旦抑制它就抑制ES細胞的增殖(A. Okuda等，EMBO J.，17， PP2019-32,1998)。Stat3是細胞增殖 分化的信號因子，通過Stat3的活性化，激起LIF的 運作，對多能性維持起重要的作用(H. Niwa, T. Burdon, I. Chambers, A. Smith, Genes Dev.， 12，pp2048-60，1998)。Grb2編碼存在于細胞膜的各種成長因子受體和Ras/MAPK級聯之間 進行介導的蛋白質(A.M. Cheng 等，Cell，95，pp 793-803,1998)。不過，可以包含于本發明的核重新編程因子的基因產物不限于上述具體說明的基 因的基因產物。本發明的核重新編程因子中，除了可以作為核重新編程因子起功能的其它基因產物之外，還可以包括1或2種以上的與分化、發生或增殖等相關的因子或具有其它生 理活性的因子，當然這樣的實施方式也應理解為包含于本發明的范圍中。可以作為核重新 編程因子起作用的其它基因產物，可以使用例如、只使0ct3/4、Klf4和c-Myc這3種基因中 的1種或2種表達的體細胞，通過篩選可以誘導該細胞的核重新編程的基因產物進行鑒定。 通過本發明提供了上述篩選方法作為新的核重新編程因子的篩選方法。而且，包含于本發明的核重新編程因子的基因產物除了例如由上述基因產生的蛋 白質自身之外，還可以是該蛋白質與其它的蛋白質或肽等的融合基因產物的形態。例如，還 可以使用與綠色熒光蛋白質(GFP)的融合蛋白質或與組氨酸標簽等肽的融合基因產物。而 且，制備與來源于HIV病毒的TAT肽的融合蛋白質，通過使用該融合蛋白質，可以促進細胞 膜對于核重新編程因子的細胞內攝取，可以回避基因導入等復雜的操作，只在培養基中添 加融合蛋白質就可以誘導重新編程。這種融合基因產物的制備方法是本領域技術人員所熟 知的，因此本領域技術人員根據目的，可以容易地設計適當的融合基因產物并進行制備。使用本發明的核重新編程因子，使體細胞的核重新編程，可以獲得誘導式多能性 干細胞。本說明書中所謂“誘導式多能性干細胞”是具有接近于ES細胞的性質的細胞，更 具體的是，包含一種未分化的且具有多能性和增殖能力的細胞，但該用語無論在何種意思 中都不是限定性解釋，需要最廣義的解釋。對于使用核重新編程因子制備誘導式多能性干 細胞的方法，在國際公開W02005/80598中已有說明(上述公報中使用了 ES樣細胞這樣的 用語)、誘導式多能性干細胞的分離方法也有具體的說明。因此，本領域技術人員通過參照 上述出版物，可以使用本發明的核重新編程因子容易地制備誘導式多能性干細胞。對使用本發明的核重新編程因子由體細胞制備誘導式多能性干細胞的方法沒有 特別的限定，如果在體細胞和誘導式多能性干細胞可以增殖的環境中核重新編程因子可以 與體細胞接觸，可以采用任意一種方法。例如，可以在培養基中添加包含于本發明的核重新 編程因子中的基因產物，或還可以采用使用含有可以表達本發明的核重新編程因子的基因 的載體將該基因導入體細胞中等方法。使用這種載體時，通過在載體中整合2種以上的基 因，也可以使各個基因產物在體細胞中同時表達。在應當重新編程的體細胞中，包含于本發 明的核重新編程因子中的基因產物中的1種或2種以上已經表達時，可以從本發明的核重 新編程因子中除去該基因產物，這樣的實施方式也應理解為包含于本發明的范圍中。使用本發明的核重新編程因子制備誘導式多能性干細胞時，對應當重新編程的體 細胞的種類沒有特別的限定，可以使用任意的體細胞。例如、除了胎兒期的體細胞之外，也 可以使用成熟的體細胞。在疾病的治療中使用誘導式多能性干細胞時，理想的是使用從患 者中分離的體細胞，例如，可以使用與疾病相關的體細胞或與疾病治療相關的體細胞等。對 按照本發明的方法選擇在培養基中出現的誘導式多能性干細胞的方法沒有特別的限定，例 如，可以適當采用使用藥物抗性基因等作為標記基因，以藥物抗性作為指標分離誘導式多 能性干細胞等的公知的方法。可以維持ES細胞的未分化性和多能性的培養基或不能維持 該性質的培養基在本領域中已知有多種，通過組合使用適當的培養基，可以有效分離誘導 式多能性干細胞。通過利用對于ES細胞廣泛使用的確認手段，本領域技術人員可以容易地 確認分離的誘導式多能性干細胞的分化能力和增殖能力。對用本發明的方法制備的誘導式多能性干細胞的用途沒有特別的限定，可以在使 用ES細胞進行的所有的試驗 研究和使用ES細胞的疾病的治療等中進行利用。例如，通過用視黃酸、EGF等增殖因子、或糖皮質激素等處理由本發明的方法獲得的誘導式多能性干 細胞，可以誘導所希望的分化細胞(例如神經細胞、心肌細胞、血細胞等)，通過將這樣獲得 的分化細胞返回到患者中的自身細胞移植可實現干細胞療法。然而，本發明的誘導式多能 性干細胞的用途不限于上述的特定的方式。
實施例以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明的范圍不受下述實施例 的限定。例1 重新編程因子的選擇為了鑒定重新編程因子，需要容易地觀察重新編程現象的實驗系統。作為實驗系 統，利用在Fbxl5基因座中敲入了半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的 小鼠。小鼠Fbxl5基因是在ES細胞和初期胚等分化多能性細胞中特異性表達的基因。然 而，在小鼠Fbxl5基因中敲入了 0 geo的、缺失Fbxl5功能的同源變異小鼠中沒有觀察到包 括分化多能性和發生在內的異常的表現型。在該小鼠中，0 geo受到Fbxl5基因的增強子和 啟動子的表達控制。也就是，0 geo在分化的體細胞中不表達，對G418顯示出敏感性。一 方面，敲入了 0 geo的同源變異ES細胞對極高濃度(12mg/ml以上)的G418顯示出抗性。 利用該現象，構建使體細胞的重新編程可視化的實驗系統。上述實驗系統中，首先從敲入了 0geo的同源變異小鼠的胎兒(受精后13.5日) 中分離成纖維細胞(Fbxl5ege°〃ge。的MEF)。由于MEF不表達Fbxl5基因，因此也不表達 3§60，對6418顯示出敏感性。另一方面，一旦該MEF與不進行基因操作的ES細胞(仍然 呈現對G418的敏感性)相融合，MEF的核進行重新編程的結果是，表達0 geo而形成G418 抗性。也就是，通過該實驗系統，可以使重新編程現象可視化為G418抗性(國際公開TO 2005/80598)。使用上述實驗系統進行重新編程因子的探索(圖1)，選擇出在ES細胞中顯 示特異性表達的基因、和提示在ES細胞的分化多能性維持中有重要作用的基因共計24種 作為重新編程因子的候選物。這些基因示于下表4和表5中。而且，就#21的連環素 和#22的c-Myc而言，使用了活性型的變異體(連環素S33Y，c-Myc :T58A)。表 4 表4(續) 表 5NCBI 登錄號 表5 (續) 表5 (續) 在逆轉錄病毒載體pMX-gw中通過Gateway技術插入這些基因的cDNA。首先使 24個基因一個一個地感染Fbxl50ge°〃ge°的MEF，然后，在ES細胞培養條件下進行G418選 擇。然而，G418抗性集落一個都沒有獲得。接著，使所有24個基因的逆轉錄病毒同時感染 Fbxl5@geo/Bgeo的MEF。在ES細胞培養條件下進行G418選擇時，獲得了多個藥物抗性集落。 分離這些集落繼續培養。這些細胞可以長期培養，而且清楚地顯示出與ES細胞類似的形態 (圖2)。圖中，iPS細胞表示誘導式多能性干細胞(也稱為ES樣細胞、ES-like細胞、ESL 細胞)，ES表示胚胎干細胞，MEF表示分化細胞(胎兒成纖維細胞)。通過RT-PCR研究標記基因的表達，NanOg、0ct3/4等的未分化標記表達了(圖3)。 清楚了 Nanog的表達接近于ES細胞，但0ct3/4的表達比ES細胞低。而且，通過亞硫酸鹽 測序法確認了 DNA甲基化狀態，清楚了 Nanog基因和Fbxl5基因在MEF中處于高甲基化狀 態，但在iPS細胞中被脫甲基化(圖4)。印記(imprinting)基因-IGF2基因在MEF和iPS 細胞這兩者中約50%被甲基化。已知收集了？1^150^{^°的1^，受精后13.5天的原始生 殖細胞中失去印記記憶的IGF2基因幾乎被完全脫甲基化，因此得出了 iPS細胞不是來源于 混入Fbxl5egWege。的MEF中的原始生殖細胞的結論。根據以上結果，表示通過24種因子的 組合，可以將分化細胞(MEF)重新編程誘導成接近于ES細胞的狀態。然后，對所有24種基因對于重新編程是否必需進行了研究。使每次除去1個基因 的23個基因感染FbX150gWege°的MEF。其結果清楚了，對于10個基因，除去它們的時候， 抑制集落的形成(圖5 基因的編號對應于表4中所示的基因的編號，#3、#4、#5、#11、#14、 #15、#18、#20、#21、和#22這10種基因)。使這10種基因同時感染Fbxl50geo/figeo的MEF 時，結果，與使24種基因同時感染時相比，顯著更有效地獲得了 G418抗性集落。進而，使這10個基因中每次除去1個基因的9個基因感染Fbxl5ege°〃ge。的MEF。 其結果是，發現分別除去4種基因(#14、#15、#20、或#22)時，沒形成G418抗性的iPS細胞 集落(圖6)。因此提示，10個基因中，這4種基因對于重新編程誘導來說起到了特別重要 的作用。例2 通過4種基因群的組合進行的重新編程誘導對10種基因中提示有特別重要性的4個基因是否可以誘導體細胞的重新編程進 行了研究。在Fbxl5基因中敲入了 0 geo的MEF的細胞中，使用上述10種基因的組合、上述4種基因的組合、上述4種中的僅3種基因的組合和上述4種中的僅兩種基因的組合，將這 些基因組合(gene set)通過逆轉錄病毒導入體細胞中。其結果是在導入了 4種基因時獲 得了 160個G418抗性集落。盡管該結果與導入10種基因時的結果(179個集落)幾乎數 量相同，但是導入4個基因時，集落比導入10個基因時要小。而且，傳代培養這些集落時， 呈現iPS細胞的形態的集落，在導入10個基因時，在12個克隆中有9個克隆，與之相對，在 導入4個基因時，12個克隆中有7個克隆，存在某種程度減少的傾向。作為4個基因，無論 是小鼠來源的基因還是人來源的基因中都獲得了數目幾乎相同的iPS細胞。導入從上述4個基因中選擇出的3個基因時，有個組合(#14、#15和#20)中獲得 了 36個扁平的集落，但是即使傳代培養也沒有觀察到iPS細胞。其它的組合(#14、#20、和 #22)中獲得了 54個小集落。這些集落中，對較大的6個集落進行次傳代培養時，所有6個 克隆都獲得了與ES細胞類似的細胞。然而，如果與ES細胞相比，認為細胞與細胞之間以及 與培養皿的粘附弱。而且，細胞增殖的速度，與導入4個基因的情況相比要慢。而且，從4 個基因中選擇出3個基因的其它的2組組合中分別形成了各1個集落，但是即使傳代培養 也沒有發現細胞的增殖。從4個基因中選擇出的2個基因的組合(組合6)中，每一種情況 連1個G418抗性集落都沒有形成。以上結果示于圖7。而且，圖10中，表示了通過RT-PCR確認ES細胞標記基因的表達的結果。方法的 詳細內容如下所示。從向Fbxl50geo/figeo的MEF中導入3個基因(0ct3/4、Klf4和c-Myc、表 示為Sox2minus)、4個基因(除3個基因之外還加上了 Sox2，表示為4ECAT)、10個基因(除 了 4個基因之外還加上了表4的#3、#4、#5、#11、#18、#21，表示為10ECAT)所建立的iPS 細胞、在有其Fbxl5基因中敲入了 0geo的成體小鼠的尾部皮膚而建立的成纖維細胞中導 入10個基因所建立的iPS細胞(表示為10ECAT皮膚成纖維細胞)、從小鼠ES細胞和沒有 導入基因的MEF細胞中純化總RNA，通過DNasel處理除去混入的基因組DNA。通過逆轉錄 反應制備第一鏈cDNA，通過PCR研究ES細胞標記基因的表達。而且，對于0ct3/4、Nanog, ERas，使用不對來自導入的逆轉錄病毒，而只對來自內源性基因擴增轉錄產物的引物進行 PCR。引物序列示于表6。表 6 根據此圖中所示的結果，清楚了導入3個基因時，ERas和Fgf4被有效誘導表達，但 不引起多能性維持所必需的因子_0ct3/4與Nanog的誘導，或者即使引起也非常弱。另一 方面，導入4個基因時，在檢測的4個克隆中，存在有一個0ct3/4和Nanog被較強誘導的克 隆(#7)。進而，在導入10個基因時，研究的5個克隆中，3個克隆中發現了 0ct3/4和Nanog 的強誘導。根據這些結果清楚了，為了重新編程，至少3個基因的組合(#14、#20、和#22)是 必需的，在含有這3種基因的4個基因群和10個基因群中隨著基因的數目增加，重新編程 的效率上升。例3 重新編程的細胞的多分化能力的分析為了評價建立的iPS細胞的分化多能性，將通過24個因子、10個因子和4個因子 建立的iPS細胞移植到裸鼠的皮下。其結果是，在所有例子中均形成了與ES細胞同樣大小 的腫瘤。以組織學觀察，腫塊由多種細胞構成，確認有軟骨組織、神經組織、肌肉組織、脂肪 組織和腸道樣組織(圖8)，因此證明了 iPS細胞的多能性。另一方面，一旦將由3個因子建 立的細胞移植到裸鼠中就形成腫瘤，其只由組織學上未分化細胞形成。因而清楚了，為了誘 導分化多能性，Sox家族是必需的。例4 源于成體小鼠的尾部的成纖維細胞的重新編程將用小鼠胎兒成纖維細胞(MEF)鑒定的4個因子導入來源在Fbxl5基因中敲入 3 geo且在全身表達綠色熒光蛋白質(GFP)的成體小鼠的尾部的成纖維細胞。然后，在飼養 細胞上，在與ES細胞培養條件相同的條件下進行培養，通過G418進行選擇。藥物選擇開始 后約2周內獲得了多個iPS細胞集落。一旦將這些細胞移植到裸鼠的皮下，就形成了三胚 層系的各種組織構成的畸胎瘤。而且，將來源于成體皮膚成纖維細胞的iPS細胞移植到胚 泡中，移植到假孕小鼠的子宮中，結果在受精后第13. 5天的胚中發現GFP陽性細胞分布于 全身(圖9)。這表明iPS細胞具有多能性，對小鼠胚胎形成有作用。該結果表明鑒定的因 子群不止對胎兒期的體細胞而且對成熟的小鼠的體細胞都具有誘導重新編程的能力。在成 體皮膚來源的細胞中可以重新編程誘導這一點在實用性上極為重要。仿lj 5研究iPS細胞建立中細胞因子的影響。在飼養細胞(ST0細胞)中導入堿性成纖 維細胞生長因子(bFGF)或干細胞因子(SCF)的表達載體(pMX逆轉錄病毒載體)，建立穩定 表達這些細胞因子的細胞。在這些ST0細胞上培養Fbxl5egWege°小鼠來源的MEF(50萬個 /100mm皿)，導入4個因子后，通過G418進行選擇時，結果與在常規的ST0細胞上的培養的 情況相比，在產生bFGF(圖11)、SCF (數據未顯示)的ST0細胞上的集落形成數提高20倍 以上。而且，即使導入c-Myc以外的3個因子，在常規的ST0細胞上沒有形成iPS細胞集落， 但是在產生bFGF(圖11)、SCF(數據未顯示)的ST0細胞上發現集落的形成。根據這些結 果，清楚了通過細胞因子的刺激，由MEF建立iPS細胞的效率提高，和可以通過使用細胞因 子代替從c-Myc使核重新編程成為可能。
例 60ct3/4、Klf4、c_Myc、和Sox2基因都存在家族基因(表1和2)。于是，研究通過 家族基因代替4個基因是否可以建立iPS細胞。表7中公開了 2次實驗的匯總的結果。對 于Sox家族而言，Soxl的G418抗性集落數和iPS細胞建立效率，均與Sox2的程度相同。 Sox3的G418抗性集落數是Sox2的十分之一左右，但挑選的集落中的iPS細胞建立效率要 比Sox2高。Soxl5的G418抗性集落數和iPS細胞建立效率都比Sox2低。Soxl7的G418 抗性集落與Sox2程度相同，但是iPS細胞建立效率低。對于Klf家族而言，Klf2產生了比 Klf4更少的G418抗性集落，iPS細胞的建立效率程度相同。對于Myc家族而言，首先確認 了野生型的c-Myc與T58A變異體在G418抗性集落數、iPS細胞建立效率兩方面的程度均 相同。而且，N-Myc和L-Myc (都是野生型)，同時在這二者中的c_Myc和G418抗性集落數、 iPS細胞建立效率的程度均相同。表7 例 7用Fbxl5-0geO以外的報告因子研究是否可以建立iPS細胞。首先，分離中心部 位含有Nanog基因的大腸桿菌人工染色體(BAC)，通過大腸桿菌內的重組，敲入GFP基因和 嘌呤霉素抗性基因(圖12A)。然后，在ES細胞中導入進行了相同的改良的BAC，確認了形 成未分化狀態特異的GFP陽性(數據未顯示)。然后，通過移植到相同的ES細胞的小鼠胚 泡中通過嵌合體小鼠制備轉基因小鼠。在該小鼠中在胚泡的內部細胞塊和受精后第13.5 天胚的生殖腺中特異性發現了 GFP陽性細胞(圖12B)。從受精后13. 5天胚(DBA、129和 C57BL/6小鼠的雜種)中除去生殖腺，分離MEF。確認了用流式細胞儀分離的MEF為GFP陰 性(圖13)。通過逆轉錄病毒將4個因子導入于該MEF中，通過嘌呤霉素進行選擇時，獲得 了多個抗性集落。其中只有約10 20%為GFP陽性。一旦傳代培養GFP陽性集落，就呈 現出類似于ES細胞的形態(圖14)和增殖(圖15)。而且如果觀察基因表達，就會清楚相 較于通過G418從Fbxl5egWege°的MEF中選擇分離出的iPS細胞，其更接近于ES細胞的表 達模式(圖16)。一旦將該細胞移植于裸鼠中，根據形成畸胎瘤，確認了其為iPS細胞(圖 17)。而且，通過將經Nanog-GFP選擇獲得的iPS細胞移植到C57BL/6小鼠的胚泡中誕生了嵌合體小鼠(圖18)。而且，通過使該嵌合體小鼠之間交配，確認了種系傳遞(圖19)。在 通過這種Nanog-GFP選擇建立的更接近于ES細胞的iPS細胞中，來自于逆轉錄病毒的4個 因子的表達幾乎完全被沉默，這提示自我復制由于內源性的0ct3/4和Sox2而被維持。例 8對10cm匯合的iPS細胞進行胰蛋白酶處理，懸浮于ES細胞用培養基中(懸浮后 10 20分鐘通過使ST0細胞粘附于涂覆了明膠的皿，而將其除去)。在涂覆了 HEMA(甲基 丙烯酸-2-羥乙酯)的大腸桿菌培養用皿中懸浮培養2X 106的細胞4天，使之形成胚狀體 (EB) (1-4天)。EB形成的第4天(第4天)，將所有EB轉移到10cm組織培養用皿中，用ES 細胞用培養基培養24小時使之粘附。24小時后(第5天)，更換成含有ITS/纖連蛋白的 培養基。培養7天(每兩天進行培養基更換)、選擇腦巢蛋白(nestin)陽性細胞(如果在 無血清下培養，其它譜系的細胞會在一定程度死亡)(第5-12天)。然后進行A2B5陽性細 胞的誘導。7天后(第12天)通過胰蛋白酶處理使細胞分散，除去殘存的EB。將1X105個 細胞接種于涂覆了聚-L-鳥氨酸/纖連蛋白的24孔板上，在含有N2/bFGF的培養基中培養 四天(每兩天更換一次培養基(第12-16天)。四天后(第16天)更換成含有N2/bFGF/ EGF的培養基，培養四天(每兩天更換一次培養基)(第16-20天)。四天后(第20天) 更換成含有N2/bFGF/PDGF的培養基，培養四天(每兩天更換一次培養基)(第20-24天)。 這期間(第12-24天)，在細胞過度增加形成匯合的時候隨時傳代，接種1 2X105個細 胞(數量由于傳代時期而改變)。四天后(第24天)更換成N2/T3培養基，培養7天(第 24-31天)，每兩天更換一次培養基。第31天固定，免疫染色。其結果是，確認了由iPS細 胞分化出0 III微管蛋白陽性的神經細胞、04陽性的寡突膠質細胞、GFAP陽性的星形膠質 細胞(圖20)。例 9為了由敲入了 Fbxl5_ 3 geo的小鼠以外的任意的小鼠體細胞建立iPS細胞，開發 了不使用藥物選擇的建立方法。在10cm皿(ST0飼養細胞上)中培養比以上的更少數量(1 萬、5萬或10萬個)的小鼠胎兒成纖維細胞(MEF)，通過逆轉錄病毒導入對照DNA或4個因 子。在ES細胞培養基中進行2周培養(無G418選擇)，在導入了對照DNA的皿中沒有發現 集落形成，但在導入了 4個因子的皿中除了被認為是轉化的扁平的集落，還形成了多個致 密的集落(圖21)。從這些中選擇出24個集落，繼續培養，發現了 ES細胞樣的形態。通過 RT-PCR研究其基因表達，7個克隆中發現了 ES細胞標記-Esgl的表達。而克隆4中發現了 Nanog、ERas、⑶F3、0ct3/4、Sox2等許多ES細胞標記的誘導，因此被認為其是iPS細胞(圖 22)。根據以上結果，表明i PS細胞建立中使用Fbxl5-0 geo敲入等的藥物選擇不是必需 的，由任意的小鼠來源的體細胞可以建立iPS細胞。提示出通過本技術可以由疾病模型小 鼠的體細胞中建立iPS細胞的可能性。例10作為誘導iPS細胞的細胞，研究了成纖維細胞以外的細胞-肝細胞和胃粘膜細胞。 通過灌流從FbX150gWeg 小鼠的肝臟中分離出肝細胞。用逆轉錄病毒將4個因子施加給該 肝細胞，通過G418進行選擇，結果獲得了多個iPS細胞集落。通過DNA微陣列對基因表達 模式進行分析的結果是，清楚了肝臟來源的iPS細胞比皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞 來源的iPS細胞更接近于ES細胞。同樣，從胃粘膜細胞和肝細胞中也獲得了 iPS細胞。
例11已知PD98059為MAP激酶的抑制劑，在許多分化細胞中抑制增殖，但在ES細胞中 促進未分化狀態維持和增殖。于是研究了 iPS細胞建立中PD98059的效果。用逆轉錄病毒 將4個因子施加到由具有Nanog-EGFP-IRES-Puro的選擇標記的小鼠建立的MEF中，通過嘌 呤霉素進行選擇。不施加PD98059時，在獲得的iPS細胞集落中，GFP陽性的比率為8%。 另一方面，逆轉錄病毒感染的次日開始持續施加PD98059 (終濃度25 u M)的組中，所獲得 的集落中的45%為GFP陽性。這可被認為因為PD98059促進GFP陽性的更接近ES細胞的 iPS細胞的增殖，也可能是PD98059抑制GFP陰性的iPS細胞和分化細胞的增殖。因此表 明PD98059可以用于更接近于ES細胞的iPS細胞的建立和不使用藥物選擇的iPS細胞的 建立中。例12 通過核轉染(Nucleofection)將小鼠0ct3/4基因啟動子下游整合了紅色熒光蛋 白質基因和在PGK啟動子下游整合了潮霉素抗性基因的質粒導入于用慢病毒使小鼠同向 性病毒(ecotropic virus)受體-可溶性載體家族7 (Slc7al、NCBI登錄號NM_007513)在 胎兒來源的人皮膚成纖維細胞(HDF)中表達的細胞中。通過潮霉素進行選擇，建立穩定 表達株。用絲裂霉素處理800000個的細胞，接種在ST0細胞上，次日通過逆轉錄病毒導入 0Ct3/4、SOX2、Klf4、C-MyC (均來源于人)。挑選3周后獲得的集落中的24個(圖23左)， 轉移到接種了 ST0細胞的24-孔板上進行培養。將2周后逐漸增加的1個克隆傳代到接種 了 ST0細胞的6-孔板上進行培養，結果獲得了在形態上類似于ES細胞的細胞(圖23右)， 提示其為iPS細胞。培養基通常使用小鼠ES細胞用培養基。例13將用慢病毒使Slc7al (小鼠逆轉錄病毒受體)導入于人成體皮膚成纖維細胞(成 體HDF)的細胞接種于800000個飼養細胞(絲裂霉素處理ST0細胞)上，以以下組合，用逆
轉錄病1_導入基因。
1.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:;-Myc、TERT、SV40 大 T 抗原
2.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E6
3.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E7
4.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7
5.0ct3/4、Sox2、Klf4、(-Myc、TERT、Bmil(0ct3/4、Sox2, Klf4，c_Myc，TERT 來源于人，Bmil 來源于小鼠)在小鼠Es細胞的培養條件下，繼續無藥物篩選的培養，在導入了組合1的因子的 皿中，在病毒感染8天后出現了被認為是iPS細胞的集落(圖24)。在其它的組合(2至5) 中，盡管沒有組合1的情況明顯，但出現了 iPS細胞樣的集落。當只導入4個因子時，也沒 有出現任何集落。產業上應用的可能性通過使用由本發明提供的核重新編程因子，不使用胚和ES細胞就可以簡便且再 現性強地誘導分化細胞核的重新編程，可以建立與ES細胞具有同樣的分化和多能性和增 殖能力的未分化細胞_誘導式多能性干細胞。本說明書還包括以下內容
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1. 一種體細胞的核重新編程因子，該因子含有下述3種基因0ct家族基因、Klf 家族基因和Myc家族基因的各基因的產物。2.項目1中記載的因子，其含有下述3種基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的產物。3.項目1或2中記載的因子，其還含有下述基因Sox家族基因的基因產物。4.項目3中記載的因子，其含有Sox2的基因產物。5.項目1至4中任意一項中記載的因子，其含有細胞因子，該細胞因子和Myc家族 基因的基因產物共同存在、或者代替Myc家族基因的基因產物。6.項目5中記載的因子，所述細胞因子為bFGF和/或SCF。7.項目1至6任意一項中記載的因子，其還含有下述的基因TERT基因的基因產 物。8.項目1至7任意一項中記載的因子，其還含有選自于由下述的基因構成的組中 的1種以上的基因的基因產物SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16 E7和Bmil。9.項目1至8任意一項中記載的因子，其還含有選自于由下述的基因構成的組中 的1種以上的基因的基因產物:Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和3 -連環素。10.項目1至9任意一項中記載的因子，其還含有選自于由下述的基因構成的組 中的 1 種以上的基因的基因產物ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、 Fthll7、Sall4、Rexl、UTF1、Stella、Stat3、和 Grb2。11.通過體細胞的核重新編程制備誘導式多能性干細胞的方法，其包括使項目1 至10任意一項中記載的核重新編程因子與該體細胞接觸的步驟。12.項目11中記載的方法，所述體細胞為人細胞。13.由項目11或12中記載的方法獲得的誘導式多能性干細胞。14.通過誘導項目13中記載的誘導式多能性干細胞分化而得到的體細胞。15. 一種改善細胞的分化能力和/或增殖能力的方法，該方法包括使項目1至10 任意一項中記載的核重新編程因子與細胞接觸的步驟。16.項目15中記載的方法，所述細胞為人細胞。17.由項目15或16中記載的方法獲得的細胞。18.通過誘導項目17中記載的細胞分化而得到的體細胞。
權利要求
一種誘導式多能性干細胞，其特征在于下述的(i)-(iii)(i)衍生自體細胞；(ii)不使用生殖細胞或者胚胎干細胞即可獲得；和(iii)具有多能性和生長能力。
2.一種誘導式多能性干細胞，其可通過將選擇的核重新編程因子導入到體細胞獲得。
3.根據權利要求1或2的誘導式多能性干細胞，其中的體細胞是人細胞。
4.根據權利要求1或2的誘導式多能性干細胞，其表達內源性Oct3/4基因和Nanog基因。
5.根據權利要求2的誘導式多能性干細胞，其中的重新編程因子包含在胚胎細胞中 表現出特異性表達的基因，或在維持胚胎細胞的多能性中具有重要作用的基因。
6.根據權利要求2的誘導式多能性干細胞，其中的重新編程因子包含至少0ct3/4基因。
7.根據權利要求6的誘導式多能性干細胞，其中的重新編程因子包含選自0ct3/4基 因、Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因的兩個基因。
8.根據權利要求7的誘導式多能性干細胞，其中的重新編程因子包含選自0ct3/4基 因、Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因的三個基因。
9.根據權利要求8的誘導式多能性干細胞，其中的重新編程因子包含0ct3/4基因、 Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因。
10.制備誘導式多能性干細胞的方法，其包括下述的步驟(i)-(iv) (i)將重新編程因子導入到體細胞；( )在培養基中培養在步驟(i)中獲得到細胞以產生表達內源性0ct3/4基因和 Nanog基因的細胞；(iii)選擇在步驟(ii)中產生的具有胚胎干細胞樣形態學的細胞；和(iv)進一步在培養基中培養在步驟(iii)中選擇的細胞。
11.根據權利要求10的方法，其中的體細胞是人細胞。
12.根據權利要求10的方法，其中的重新編程因子包含在胚胎細胞中表現出特異性 表達的基因，或在維持胚胎細胞的多能性中具有重要作用的基因。
13.根據權利要求12的方法，其中的重新編程因子包含至少0ct3/4基因。
14.根據權利要求13的方法，其中的重新編程因子包含選自0ct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的兩個基因。
15.根據權利要求14的方法，，其中的重新編程因子包含選自0ct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的三個基因。
16.根據權利要求15的方法，其中的重新編程因子包含0ct3/4基因、Sox2基因、c-Myc 基因和Klf4基因。
17.重新編程因子在制備誘導式多能性干細胞中的用途，其中的誘導式多能性細胞來 自體細胞。
18.根據權利要求17的用途，其中的重新編程因子包含在胚胎細胞中表現出特異性 表達的基因或對應的基因產物，或在維持胚胎細胞的多能性中具有重要作用的基因或對應 的基因產物。
19.根據權利要求18的用途，其中的重新編程因子包含至少Oct3/4基因或者Oct3/4 基因產物。
20.根據權利要求19的用途，，其中的重新編程因子包含選自Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的兩個基因或其對應的基因產物。
21.根據權利要求20的用途，其中的重新編程因子包含選自Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的三個基因或其對應的基因產物。
22.根據權利要求21的方法，其中的重新編程因子包含Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因；或Oct3/4基因產物、Sox2基因產物、c_Myc基因產物和Klf4基因 產物。
23.用于制備體細胞的方法，其包括誘導權利要求1-9的誘導式多能性干細胞分化的步驟。
24.用于評價化合物、藥物或毒藥的生理功能、功效或毒性的方法，包括使用通過誘導 權利要求1-9的誘導式多能性干細胞分化可獲得的細胞。
25.細胞在制備用于干細胞移植治療的化合物中的用途，其中所述細胞是通過誘導權 利要求1-9的誘導式多能性干細胞分化而獲得的細胞。
全文摘要
作為用于不利用胚和ES細胞而誘導分化細胞的重新編程，簡便且再現性強地建立具有與ES細胞同樣的多能性和增殖能力的誘導式多能性干細胞的方法，本發明提供了含有下述3種基因Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的產物的體細胞的核重新編程因子。
文檔編號A61L27/38GK101864392SQ20101012618
公開日2010年10月20日 申請日期2006年12月6日 優先權日2005年12月13日
發明者山中伸彌 申請人:國立大學法人京都大學