專利名稱：特丁基對苯二酚在制備治療地中海貧血的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及特丁基對苯二酚(tBHQ)在制備治療地中海貧血的藥物中的用途，特別是涉及特丁基對苯二酚通過激活Nrf2而上調α-珠蛋白穩定蛋白(AHSP)的表達從而緩解并治療地中海貧血的癥狀。
背景技術：
1.地中海貧血及其治療地中海貧血是人類最為常見的單基因遺傳性疾病之一。當珠蛋白基因發生突變時，一種或多種珠蛋白肽鏈的合成受阻，最終導致α-珠蛋白肽鏈和珠蛋白肽鏈的合成不平衡。游離的珠蛋白肽鏈是強氧化劑，可以催化產生活性氧自由基ROS。ROS的產生可以破壞紅系前體細胞和成熟的紅細胞，嚴重時可導致凋亡。凋亡的紅系前體細胞累積即可導致無效的紅系生成，其癥狀即為貧血。另外，游離的珠蛋白不穩定而易發生沉淀或降解。珠蛋白在紅細胞膜上的沉淀會破壞細胞膜導致溶血性貧血。降解的珠蛋白釋放有毒的血紅素、嚇啉和鐵離子等，這些游離的離子也會催化產生ROS。ROS的產生是關于地中海貧血的分子病理學的重要內容。目前關于地中海貧血的治療主要分為三類，輸血、利用鐵螯合劑去除血液中過量的鐵離子和利用激素進行內分泌調節等方法是對癥治療，可以在一段時間內減輕地中海貧血的臨床癥狀，但需終生用藥；而通過異體骨髓移植、藥物開啟胎兒型珠蛋白基因的表達和利用抗氧化劑等方法則是從病因出發，可以在一定程度上改善地中海貧血癥狀，但仍面臨排異反應，藥物毒性等因素的困擾；另外有關地中海貧血基因治療的方法也在艱難探索中。2. AHSP蛋白及其調節α -珠蛋白穩定蛋白AHSP是新近發現的α -珠蛋白特異的分子伴侶。AHSP的結構決定其功能，通過結合并穩定各種形式的α-珠蛋白，AHSP可以減少ROS的產生，在正常的紅系發生和地中海貧血發生發展過程中發揮重要作用。以AHSP為靶標，尋找可以預防地中海貧血發生，緩解或者改善地中海貧血癥狀的藥物是很有前景的地中海貧血治療方案。因此關于AHSP表達調節的研究顯得尤為重要。AHSP是作為GATA-I的靶基因被發現的，GATA-1對AHSP的調節作用也是最早被詳細闡明的。Gallagher等人通過5’ RACE的方法首先鑒定了 AHSP啟動子區的5’端，進一步結合多種實驗手段證明了 GATA-I和廣譜的轉錄因子Oct-I在AHSP調控區的結合位點，以人AHSP啟動子導向的報告基因在轉基因鼠體內特異地在骨髓、脾和網織紅細胞等紅系組織中表達。Pilon等人進一步在細胞和動物水平證明了 EKLF對AHSP的轉錄激活作用，同時，EKLF作為染色質調節子還可以改變AHSP的染色質水平。另有文獻報道表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑和細胞內的鐵的水平都可以調節AHSP的表達。細胞內游離的鐵可以通過與鐵調節蛋白相互作用而去穩定AHSP的mRNA的穩定性，從而負調節AHSP在鐵過多狀態下的表達，加劇α-珠蛋白的不穩定性，進而加劇地中海貧血的癥狀。本實驗室成員通過研究在AHSP啟動子區預測到小Maf家族成員的識別位點，因此推測CNC-bZIP家族成員可能調節AHSP的表達。CNC-bZIP蛋白家族的成員眾多，包括 NF-E2, Nrfl，Nrf2 (NF-E2 relatedfactor 2)，Nrf3, Bachl 和 Bach2 等，均可以與小 Maf 家族蛋白形成二聚體。其中，NF-E2與GATA-1、EKLF等同為調節紅系正常生成的重要轉錄因子，對紅系分化晚期的珠蛋白基因的表達調節至關重要。而Nrf2主要在細胞氧化應激狀態及抵抗炎癥等方面發揮重要的調節作用，可以調節大量參與細胞保護的基因。β -珠蛋白基因簇LCR區高敏位點HS2含有串聯的NF-E2結合位點，以此串聯序列為探針在Κ562 cDNA文庫中篩選得到Nrf2。Nrf2可結合的保守序列被稱為抗氧化劑效應元件(antioxidant responsiveelement,ARE)或者親電子試齊Ll效應元件(electrophile responsiveelement, EpRE)。作為細胞內重要的抗氧化分子，Nrf2可通過促進抗氧化蛋白和二類去毒素酶類的表達，來對抗細胞在氧化應激或親電子試劑刺激下產生的不良反應。Nrf2包含有六個Neh (Nrf2-ECH homology)功能域。其中Nehl為堿性亮氨酸拉鏈區，可與Maf家族形成二聚體，繼而與DNA相結合。Neh4和Neh5為轉錄激活域，可與CBP相結合激活下游基因轉錄。Neh2為Keapl結合區域，Keapl的結合可引起Nrf2的降解。ROS 作為信號分子激活蛋白激酶C(I3KC)，則可引起Nrf2 Neh2功能域的kr 104被PKC磷酸化而使Nrf2與Keapl解離。解離后的Nrf2在核內累積發揮效應。3.抗氧化劑與作為潛在的治療地中海貧血的藥物特丁基對苯二酚tBHQ (Tertiary Butyl Hydroquinone)是一種親離子試劑，可以起抗氧化的作用。tBHQ作為抗氧化劑的應用非常廣泛，主要集中在食品加工、美容產品、橡膠工業以及油脂加工等。tBHQ在基礎科學研究中的也有廣泛的應用，主要作為Nrf2的特異性激活劑發揮作用。DEM是另一種Nrf2的激活劑，化學名為馬來酸二乙酯。DEM在細胞水平也可以顯著升高AHSP的表達水平。tBHQ作為潛在的治療地中海貧血的藥物，主要存在以下優勢首先，特異性強。作為Nrf2的激活劑，DEM沒有tBHQ應用廣泛，分析可能為DEM沒有tBHQ的特異性強。DEM對Nrf2的激活作用可以被抗氧化劑或者抗氧化酶所封閉，但是tBHQ對Nrf2 的激活則不受影響。其次，安全性高。tBHQ廣泛用于食品、油脂和化妝品等物質的抗氧化保護，而DEM則多用于化學工業中，顯然tBHQ更具有安全性。最后，有效性好。tBHQ作為多酚類抗氧化劑，除可以通過激活Nrf2信號通路誘導解毒酶類的表達外，還可以通過直接與三價鐵離子結合發揮抗氧化作用，抗氧化能力強于DEM。
發明內容
本發明人經研究發現，tBHQ不僅在細胞水平，還可以在動物水平升高AHSP的表達，從而增強其對α-珠蛋白的穩定作用，并且在地中海貧血細胞模型中tBHQ處理可引起 AHSP的表達在內源性反饋增加的基礎上進一步提高。在第一個方面，本發明提供了 tBHQ在制備治療地中海貧血的藥物中的用途。特別地，所述的地中海貧血為β-地中海貧血。tBHQ通過上調地中海貧血患者中紅細胞中的 α-珠蛋白穩定蛋白的表達而穩定過多的游離α -珠蛋白，從而緩解地中海貧血的癥狀，達到治療的目的。特別地，本發明人發現，tBHQ通過激活Nrf2而上調α-珠蛋白穩定蛋白的表達。以Nrf2特異性激活劑tBHQ處理K562細胞后，AHSP的表達顯著上調；過表達和干擾 Nrf2可以引起AHSP表達的上調和下調，說明Nrf2對AHSP存在正向調節作用；熒光素酶報告系統和ChIP證明Nrf2可以通過直接與AHSP調控區結合而在轉錄水平調節其表達。在第二個方面，本發明提供了 tBHQ在制備上調β-地中海貧血患者中的α-珠蛋白穩定蛋白的藥物中的用途。由于存在內在的反饋環路，β-地中海貧血患者體內的AHSP 的表達水平應該高于正常人體內的AHSP表達水平。本發明人通過細胞水平實驗和動物水平實驗證明，tBHQ進一步升高了地中海貧血模型中的AHSP表達水平，從而可以起到治療的作用。在另一個方面，本發明提供了一種治療地中海貧血的藥物組合物，其包括tBHQ和藥學上可接受的載體。
圖1. Nrf2的特異性激活劑tBHQ可調節AHSP的表達。A :tBHQ處理后半定量PCR 檢測Nrf2和AHSP的表達。B tBHQ處理后，實時定量PCR檢測AHSP的表達。C:tBHQ處理后western blot檢測Nrf2和AHSP的表達情況。圖2.在Nrf2干擾的K562細胞中檢測AHSP的表達。A 半定量PCR檢測AHSP在干擾Nrf2的K562細胞中的表達。B 實時定量PCR檢測AHSP在干擾Nrf2的K562細胞中的表達。干擾GFP 感染pSIREN-siGFP后篩選得到的K562穩定細胞株，干擾GFP的細胞株作為干擾Nrf2細胞株的對照組。干擾Nrf2 感染pSIREN_siNrf2后篩選得到的K562穩定細胞株。圖3.通過熒光素酶報告基因檢測GATAl和Nrf2激活AHSP的啟動子的活性A AHSP啟動子元件的各個片段示意圖。B :Nrf2可激活AHSP的啟動子的活性。GATAl作為可以激活AHSP表達的陽性對照。圖4. ChIP檢測Nrf2在AHSP啟動子區的富集AHSP-m/AHSP_P3。兩個位于AHSP 啟動子區的Nrf2的潛在結合位點。H0-1-E1/2 血紅素加氧酶的兩個增強子序列，Nrf2已報道的結合位點，為本實驗的陽性對照。H0-l-eXon3 血紅素加氧酶的第三外顯子片段，作為本實驗的陰性對照。Input為樣品輸出量，是每對引物的陽性對照，Nrf2為通過Nrf2的抗體免疫共沉淀而富集的DNA樣品。IgG是通過IgG富集的DNA模板，為本實驗的陰性對照。圖5.在α -珠蛋白過表達的k562穩定株中(A)，tBHQ處理后western blot檢測 Nrf2的激活情況⑶以及實時定量PCR檢測AHSP的表達(C)。圖6. A 實時定量PCR檢測H0-1和AHSP在tBHQ處理Balb/C小鼠中的表達(tBHQ 注射用劑量。30毫克/公斤，小鼠尾靜脈注射三次，每次間隔8小時，數量5只。B =Western blot檢測HO-I和AHSP在tBHQ處理Balb/C小鼠中的表達。C和D :tBHQ處理Balb/C小鼠中AHSP和HO-I表達情況的統計學結果。
具體實施例方式1. Nrf2特異性激活劑tBHQ上調AHSP的表達親電子試劑特丁基對苯二酚(tBHQ)和馬來酸二乙酯(DEM)可以通過激活激酶通路而促進Nrf2的磷酸化，Nrf2磷酸化后入核而激活下游的靶基因。因此tBHQ和DEM已經被廣泛作為Nrf2的特異性激活劑使用。
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tBHQ上調AHSP的表達首先配制濃度為20mM的tBHQ貯存液，然后將tBHQ加入處于對數生長期的K562細胞中，同時加DMSO為對照。分別按照時間梯度和藥物濃度梯度處理后收細胞，提取RNA和蛋白，通過western blot檢測Nrf2的激活情況，通過半定量PCR反應檢測AHSP的表達情況。結果如圖1所示，Nrf2可以在蛋白水平被tBHQ顯著激活，RNA水平沒有改變，這與文獻報道是一致的。AHSP的RNA水平顯著提高。這說明AHSP很可能是Nrf2的下游靶基因。干擾Nrf2降低AHSP的表達為了獲得相對穩定的Nrf 2干擾細胞株，將pSIREN_siNrf2載體包裝成逆轉錄病毒進行RNA干擾。在實驗中，采用細胞作為病毒包裝細胞系，用皰疹口炎病毒G(VSV-G) 提供包膜蛋白。VSV-G可識別一種所有細胞上都存在的磷脂，所以理論上能有效地感染所有有絲分裂的細胞。此外，VSV-G很穩定，因此病毒上清液可以通過離心濃縮到2000倍以上， 從而得到高滴度的病毒。提高病毒滴度可以提高靶mRNA的干擾效率，因為病毒滴度的增加提高了整合事件的發生從而引起了很強的shRNA的表達，進一步提高了細胞內siRNA的濃度。這一特點對于那些中低效率的RNA干擾序列尤其適用。收集的病毒上清經0.45μπι的濾膜過濾除去細胞碎片，分裝，-70°C凍存，備用。用病毒感染時，直接將3ml病毒上清(含 polybrene 8 μ g/ml)加入處于對數生長期的K562細胞中，混勻后放回CO2孵箱中培養。 10-12小時后，離心換正常培養基繼續培養。24h再感染一次。感染M小時后即可加含有嘌呤霉素(puromycin，1 μ g/ml)的選擇培養基進行選擇培養，約7-10天后形成混合細胞克隆。通過半定量RT-PCR、real-time PCR和western blot檢測Nrf2的干擾效果和AHSP的表達情況。結果如圖2所示，K562細胞中的Nrf2可以被有效的干擾，而AHSP的表達水平都顯著下調。Nrf2可以激活AHSP基因的啟動子活性上述研究表明Nrf2可以正向調節AHSP的表達，為了進一步研究Nrf2對AHSP的調節是否在轉錄水平進行，用雙熒光素酶報告系統檢測Nrf2是否能夠調節AHSP基因的啟動子活性。AHSP基因啟動子區熒光素酶報告質粒的構建對AHSP基因啟動子區0. 4k的片段進行截短缺失。分別為0. 4k-刪除片段_1、 0. 4k-刪除片段-2和0. 4k-刪除片段-3。首先，在引物中引入酶切位點，從基因組中通過PCR方法將AHSP啟動子區克隆。進而通過酶切連接的方法將其引入PGIXBbasic報告基因載體將構建好的熒光素酶報告質粒分別轉染細胞，同時共轉pcDNA4、 pcDNA4-GATAl和pcDNA4_Nrf2等表達質粒檢測對啟動子的激活情況，其中，pcDNA4作為陰性對照，GATAl作為陽性對照。結果如圖3所示，與pcDNA4比，GATAl和Nrf 2均可激活AHSP的啟動子活性，且二者對0. 4k-刪除片段-1、0. 4k-刪除片段-2和0. 4k-刪除片段-3三個截短體的轉錄激活能力逐漸降低，但仍可激活。這說明Nrf2可以在轉錄水平調節AHSP的表達。Nrf2在AHSP啟動子區的募集
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首先獲得合適的超聲破碎的染色質DNA片段。然后根據生物信息學的預測設計Nrf2潛在結合位點的引物，根據引物的擴增效率確定模板用量。實驗中，除了特異的 anti-Nrf2抗體之外，還包括IgG對照用于校正抗體與染色質間的非特異性結合。此外， 根據人血紅素加氧酶I (heme oxygenase I，H0_1)的增強子1和增強子2設計的引物作為 Nrf2結合的陽性對照，根據HO-I外顯子3設計的引物作為陰性對照，以驗證ChIP操作的可靠性。結果表明，Nrf2可以與AHSP啟動子區的兩個位點結合，且當K562細胞經tBHQ處理后，Nrf2與其中一個位點的結合增強，如圖4所示。2. Nrf2特異激活劑tBHQ在細胞和動物水平上調AHSP的表達tBHQ可以進一步提高α -珠蛋白過表達的Κ562穩定株內AHSP的表達水平由于存在內在的反饋環路，β-地中海貧血患者體內的AHSP的表達水平通常高于正常人體內的AHSP表達水平。這點在地中海貧血小鼠體內也得到證明。首先需要明確的是，tBHQ是否可能進一步升高地中海貧血患者體內的AHSP表達水平而起到治療的作用。以過表達α-珠蛋白的K562細胞作為研究的模型模擬β-地中海貧血的效應。首先以tBHQ處理過表達α-珠蛋白的K562細胞，通過Wfestern blot和實時定量PCR的方法分別檢測Nrf2和AHSP的蛋白水平和RNA水平。結果如圖5所示，tBHQ可以顯著升高Nrf2 的蛋白表達水平，同時β-地中海貧血模型細胞中的AHSP RNA水平也都較藥物處理前顯著升高。tBHQ可以上調Balb/C小鼠體內AHSP的表達水平以上的結果表明tBHQ的確可以進一步上調α -珠蛋白過表達的Κ562穩定株中 AHSP的表達水平，說明了以tBHQ作為治療地中海貧血藥物的可能性。那么，tBHQ在動物體內是否可以發揮相同的作用呢？通過尾靜脈注射的方法以tBHQ處理Balb/C小鼠，檢測小鼠骨髓中AHSP等基因的表達情況。具體步驟如下(1)實驗用小鼠的選擇實驗中選擇18_22g的雄性Balb/C小鼠。飼養時注意溫度和濕度適宜，環境安靜， 12小時明暗交替。(2) tBHQ 的配制稱取0. 5g tBHQ溶解在Iml的DMSO中，配制成250 μ g/μ 1的母液。再以PBS稀釋成2. 5 μ g/ μ 1的工作液(含1 % DMS0)。高濃度tBHQ極易氧化，故每次加藥均應新鮮配制。C3) tBHQ 處理小鼠采用尾靜脈注射的方法先將小鼠置于固定筒內，使尾部露在外面。先以45-59°C 溫水熱敷鼠尾，再用70 %的酒精棉球擦拭尾部，待尾部左右側靜脈擴張后，左手拉尾，右手進針。給藥量約為30mg/kg鼠重。對照組給同等劑量的用PBS稀釋的1%DMS0。共給藥三次，間隔8小時。(4)骨髓細胞的獲取引頸處死給藥組和對照組小鼠，取小鼠的兩條股骨，用2ml —次性注射器吸取生理鹽水將骨髓從股骨中沖出。注意冰上操作。離心后用PBS將骨髓細胞懸起，分成兩份，其中1/3的骨髓離心后直接加Trizol處理，用于RNA的提取。另外2/3的骨髓經液氮速凍后可貯存于-70°C。用于蛋白的提取。(5) Western blot和實時定量PCR檢測血紅素加氧酶和AHSP的表達情況結果表明Nrf2經典下游分子血紅素加氧酶H0_1的表達無論在蛋白水平還是在 RNA水平都顯著升高(ρ < 0. 05)，這說明tBHQ在動物體內可以有效地誘導Nrf2的轉錄激活能力；AHSP的表達在蛋白水平和RNA水平也都顯著升高(ρ < 0. 05)，說明tBHQ的確可以上調動物體內的AHSP的表達(圖6)。
權利要求
1.特丁基對苯二酚在制備治療地中海貧血的藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述的地中海貧血為地中海貧血。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其中特丁基對苯二酚通過上調地中海貧血細胞中的α-珠蛋白穩定蛋白的表達而緩解地中海貧血的癥狀。
4.根據權利要求3所述的用途，其中特丁基對苯二酚通過激活Nrf2而上調α-珠蛋白穩定蛋白的表達。
5.特丁基對苯二酚在制備上調地中海貧血患者中的α-珠蛋白穩定蛋白的藥劑中的用途。
6.根據權利要求5所述的用途，其中所述患者中的α-珠蛋白穩定蛋白的表達水平通常高于正常個體內的表達水平。
7.根據權利要求5或6所述的用途，其中特丁基對苯二酚通過激活Nrf2而上調α-珠蛋白穩定蛋白的表達。
8.一種治療地中海貧血的藥物組合物，包括特丁基對苯二酚和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及特丁基對苯二酚在制備治療地中海貧血的藥物中的用途，特別是涉及特丁基對苯二酚通過激活Nrf2而上調α-珠蛋白穩定蛋白(AHSP)的表達從而緩解并治療地中海貧血的癥狀。
文檔編號A61K31/05GK102188413SQ20101012576
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者劉德培, 呂湘, 曹聰, 梁植權, 趙國偉 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所