專利名稱：人成體干細胞在治療惡性實體瘤中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞治療領域。具體而言，本發明涉及人成體干細胞在治療惡性實體瘤中的用途。更具體而言，本發明涉及人成體干細胞，特別是人間充質干細胞和人造血干細胞在制備治療惡性實體瘤的細胞制劑中的用途。
背景技術：
21世紀社會在進步與發展，但人類仍受眾多疾病折磨。因重大疾病，如心腦血管病、惡性腫瘤、創傷、衰老和遺傳缺陷等所導致的組織器官缺損與功能障礙是人類難以攻克的醫學難題。干細胞再生醫學和干細胞治療醫學是新型的醫學手段，為重大疾病的治療、壽命的延長、生活質量的提高提供了一個新途徑(Nichols et al. , 1998 ；Pan et al. ,2002 ； Pesce and Scholer,2000 ；Thomson et al.，1998)。干細胞及其治療性克隆的迅速發展，將是人類歷史上的第三次醫學革命，即再生醫學治療途徑。干細胞再生醫學與治療的發展不僅會帶來醫學史上的革命，也將與我國構建和諧社會的長遠目標相符合，具有深遠的科學意義與社會效益。干細胞是一類具有自我更新能力、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。它們可以通過對稱性分裂維持自身細胞群的數量，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而構成機體各種復雜的組織和器官。干細胞分為胚胎干細胞(ES細胞)與成體干細胞。ES細胞是人體各種組織細胞的起源。成體干細胞存在于成體的各種組織中，它們具有多向分化潛能，可以分化為某一組織的多種細胞。干細胞的研究與應用幾乎涉及了所有的生命科學和生物醫藥學領域，并將在細胞治療、組織器官移植、基因治療、新基因發掘與基因功能分析、發育生物學模型、新藥開發與藥效、毒性評估等領域產生極其重要的影響，因此，干細胞與再生醫學研究成果將成為21 世紀具有巨大潛力的新興高科技產業之一，其研究水平正逐步成為衡量一個國家或地區科技發展水平與健康水平的重要標志之一。腫瘤干細胞理論提出后，腫瘤治療理念受到重要的影響，惡性腫瘤的治療不僅僅以化療，放療和手術為主，也要探索以干細胞治療惡性腫瘤。骨髓來源的細胞(Bone Marrow-Derived Cells, BMDCs)尤其是人造血干細胞(Hematopoietic Stem Cell, HSCs) 用于臨床治療重癥再生障礙性貧血及重癥放射病、急性白血病、慢性髓性白血病等血液病方面已取得了巨大成就。二十世紀70年代，E. D. Thomas開創了異基因造血干細胞移植治療白血病，并獲得 1990年諾貝爾獎，開創了干細胞治療腫瘤的先河。美國于2005年10月報道明尼蘇達大學首次成功地應用人類胚胎干細胞殺死癌細胞。這項新的研究揭示出人類胚胎干細胞能夠更好地靶向癌細胞。人成體干細胞治療惡性實體瘤尚未見報道。因此，本領域需要可用于惡性實體瘤治療的干細胞。
發明內容
根據上述需要，本發明人以人間充質干細胞和人造血干細胞分別與人食管癌細胞 EC9706或KYSE150融合；并將融合細胞注入SCID/小鼠和裸鼠以觀察成瘤情況。融合細胞成瘤數明顯減少，其體積也縮小。結果表明人間充質干細胞和人造血干細胞對人食管癌細胞EC9706或KYSE150有抑制作用，為惡性實體瘤的干細胞治療提供了理論基礎，并開創了惡性腫瘤治療的新途徑。因此，本發明的一個方面涉及人成體干細胞在制備治療惡性實體瘤的細胞制劑中的用途。本發明的人成體干細胞可通過作為藥物組合物的細胞制劑的形式提供給患有惡性實體瘤的患者。優選地，本發明所述的人成體干細胞為人間充質干細胞或人造血干細胞。優選地，本發明提供的含有人成體干細胞的細胞制劑用于治療的惡性實體瘤為人
食管癌。優選地，本發明提供含有人間充質干細胞或人造血干細胞的細胞制劑用于治療人
食管癌。本發明提供的細胞制劑可通過移植給予受治療者。為通過移植給予受治療者，細胞制劑中需要加入適合于移植的本領域技術人員已知的其他成分，例如植入后可降解的的生物材料。本發明提供的細胞制劑可通過靜脈輸注給予受治療者。為通過靜脈輸注給予受治療者，細胞制劑中需要加入適合于靜脈輸注的本領域技術人員已知的其他成分。本發明的細胞制劑還可以包括本領域公知的其他成分，如適合患者接納的材料或基質，該基質可作為細胞移植用的三維模板，具有特定的孔徑，例如申請日為2004年6月7 日的中國發明專利號為200480019202. 5，授權公告號為CN100447186C的發明專利中所描述的基質。還可以包括生物可降解聚合物如白蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、明膠等，并制作成治療用途的試劑盒的形式。本發明所述的細胞制劑可以是非凍存的細胞制劑或凍存的細胞制劑。如本領域技術人員所知，干細胞移植必須保存足夠量的干細胞，保存在一定條件下，等移植需要時，再將保存的干細胞回輸到體內，達到治療的目的。根據保存的方法不同，可分為非凍存保存或凍存保存。非凍存保存為零上溫度保存如4°C保存，優點是不需要冷凍設備，不需要在細胞懸液中添加冷凍防護劑，也不需要輸用前解凍。缺點是保存時間受限。凍存保存為零下溫度保存如_79°C的冷凍保存(_80°C保存)或深低溫保存(_196°C )。零下溫度時細胞代謝和各種酶的活性幾乎停止，細胞保存的時間可以延長，細胞保存溫度越低，細胞活性保存越好。細胞若深低溫保存之前，必須先控速降溫。制備非凍存的細胞制劑或凍存的細胞制劑的方法和設備都是本領域已知的。在進行冷凍保存時，需要添加冷凍保存劑，以保護細胞免受冷凍損傷。如本領域技術人員所知，可以使用的冷凍保存劑包括能滲透到細胞內部的甘油、二甲基亞砜、丙二醇、 乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇等，也可以使用非滲透性保存劑如白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。本領域技術人員可以根據現有技術知識同時選用滲透性保存劑和非滲透性保存劑中的一種或幾種組合使用。本發明的細胞制劑滿足本領域技術標準，例如符合國家食品藥品監督管理局《人
4體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》等相關標準。
圖1 ⑶90和⑶106在各細胞的表達。其中FCl兩者陽性率為觀.8 %，FC2兩者陽性率為74. 9%，FC3兩者陽性率為 44. 4%。圖2 顯示CK18在各細胞的表達。CK18在hMSCs為陰性表達外，其余均為陽性表達。圖3:DNA含量分析。hMSC以雞血為內參進行DNA含量檢測，EC9706、FCl、FC2和FC3以正常人淋巴細胞為內參進行檢測，MSC為2η，其余均為6η。圖4:軟瓊脂克隆形成。A所示軟瓊脂試驗克隆形成試驗所成克隆，發明人每孔做兩個副孔，圖中只取一個。B中的EC9706為食管癌細胞克隆形成多，FCU FC2、FC3為融會細胞，腫瘤克隆形成少。對形成的克隆計數后進行統計分析的結果，差異具有顯著性(P <0.01)。圖5 免疫缺陷鼠皮下成瘤。A顯示各組細胞成瘤大體情況，各組成瘤外觀一致，未見紅色肉瘤樣外觀；FC組成瘤體積明顯小于EC0706組，FCl組有2只成瘤，FC2組有4只成瘤。B所示為成瘤病理切片分析結果，各組成瘤性質一致，均為鱗狀上皮癌，實質與間質分界清楚，腫瘤細胞成巢狀分布。C中顯示了 EC9706和FC3組成瘤重量的差異性，統計學分析具有顯著性(P < 0. 01)，由于FCl組與FC2組瘤重量較小，所以發明人只對EC9706和FC3組進行了對比。圖6 hMSCs與KYSE150融合后，裸鼠成瘤的時間。KYSE150為食管癌細胞，腫瘤成長早；hMSCs為間充質干細胞未發現腫瘤生長；FC 為融合細胞的不同組，腫瘤生長晚。圖7 hMSCs與KYSE150融合后，各組腫瘤生長情況。圖8 hMSCs與KYSE150融合后腫瘤重量的變化。KYSE150為食管癌細胞，腫瘤重量最重；hMSCs為間充質干細胞未發現腫瘤生長； FC為融合細胞的不同組，腫瘤生長小，重量輕。圖9 造血干細胞與EC9706細胞融合后，各組腫瘤生長情況。圖10顯示融合細胞與非融合細胞成瘤比較。圖11顯示腫瘤重量，細胞融合方法詳見方法描述。圖12 全基因組cDNA微陣列(microarray)聚類分析。紅色表示該基因表達上調，綠色表示該基因表達下調，顏色深淺表示基因表達強度。圖13 總RNA電泳檢測。圖中顯示了消化純化后的電泳結果，可以看出用于逆轉錄反應的總RNA質量還可以，可以進行后續試驗。
圖14 總RNA消化基因組DNA效果驗證。圖中1 5分別以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的消化后總RNA為模板普通PCR 擴增GAPDH基因；+為陽性對照，NC為陰性對照。標記(Marker, Μ) =TaKaRa DL2000 plus, 條帶大小(從下往上 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp)。從圖中可以看出用于逆轉錄的RNA已經把基因組DNA消化完全。實時(RealTime)PCR反應特異性檢測圖15 實時(RealTime) RT-PCR產物電泳檢測。圖中1 5分別以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的lst-cDNA為模板，實時PCR 擴增GAPDH基因；6 10分另Ij以9706、MSC、FC1、FC2和FC3樣品的lst-cDNA為模板，實時 PCR擴增NM_001946基因。標記(Marker, Μ) TaKaRa DL2000plus，條帶大小(從下往上 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp)。從電泳圖結果可以看出實時 PCR反應特異性都很好。圖 16 實時(realtime)-PCR 檢測 DUSP6/MKP3 變化。A所示為GAPDH和DUSP6的溶解曲線和擴增曲線。B為DUSP6相對于內參的表達豐度。從圖中可以看出，DUSP6在FC中較EC9706和MSC明顯高表達，統計學分析表明差異具有顯著性(P < 0. 01)。附注9706為食管癌細胞。MSC為間充質干細胞。FC1，FC2，FC3 分別為克隆1，2，3。圖17 細胞周期變化。圖中可見FCG0/G1期細胞明顯增加，統計學分析差異具有顯著性(P < 0. 01)。圖18 增殖指數變化。圖中表明FC細胞的增殖指數較EC9706明顯降低，統計學分析差異具有顯著性(P < 0. 01)。圖19 裸鼠尾靜脈注射hMSCs細胞能趨向腫瘤細胞。圖20 hMSCs與EC9706和Kysel50融合的結果與機理。圖21 hMSCs進入人機體的途徑和作用機理圖。
具體實施例方式(一 )人成體干細胞與腫瘤細胞融合技術1)細胞融合技術(Robinson，1979)。A. 0. 125%胰酶消化細胞EC9706細胞和hMSCs細胞，制備成單個細胞懸液，B.計數，hMSCs EC9706 = 1 10 混合于錐形離心管中，PBS 洗，lOOOrpm，10 分
鐘，三次；C.棄上清，用H-DMEM重懸細胞，lOOOrpm, 10分鐘；D.小心吸取上清后，輕彈、旋轉并搖動，使細胞充分分散成糊狀，置于37°C水浴鍋內；E.邊搖邊加入37°C預溫的50%無菌PEG1500 1ml，在1分鐘內滴完a) 37°C水浴90秒，期間輕輕搖動離心管；b)輕輕滴加10ml 37°C預溫的H-DMEM IOml以終止PEG的作用，并在3分鐘內滴完，滴加時盡可能不攪散細胞；c) IOOOrp, 10分鐘，吸棄上清；將細胞接種在3個IOcm —次性平皿內，37°C恒溫、 恒濕培養。2)融合細胞克隆的挑選與鑒定技術。3)流式細胞儀檢測活細胞表面標記。4)軟瓊脂集落形成技術。5)免疫缺陷鼠移植瘤技術。2.人成體干細胞趨向腫瘤細胞技術人成體干細胞治療惡性實體瘤需要解決給藥途徑問題。人成體干細胞靜脈移植后，人成體干細胞是否趨向腫瘤組織(靶向性)是人成體干細胞治療惡性實體瘤的關鍵。1)熒光標記人成體干細胞的技術。2)小動物活體成像技術。( 二)研究結果1.融合細胞的篩選鑒定1)流式細胞儀分選hMSCs是一種間質來源的干細胞，通常它需要通過多種標記來鑒定，而且不同的研究人員可能采取的標記也不盡相同，通常使用的標記有如下幾種陽性標記CD13，CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105, CD106陰性標記CD14，CD31, CD33, CD34, CD36, CD45, CD133發明人在對人臍帶源hMSCs進行各標記檢測后，選擇了表達強度較高的⑶90和 ⑶106作為實驗用檢測標記。經過PEG1500誘導hMSCs和EC9706融合后，將得到的含有 hMSCs、EC9706和融合細胞的混合細胞在hMSCs培養基中培養，以確保hMSCs標記的不丟失。 培養3天后，0. 125%胰酶消化，PBS清洗，⑶90染色后上流式細胞儀分選。得到的⑶90+細胞繼續在hMSCs培養基中培養。2)融合細胞克隆的挑選發明人對培養的CD90+細胞并以IO3/皿的密度均勻分散后接種在d= IOcm的一次性培養皿中，10天后在顯微鏡下根據形態挑選克隆。發明人挑選了 90個克隆，分別培養在12孔板中，當細胞數量達到實驗所需數量時開始對各克隆進行驗證。3) hMSCs表面標記檢測來源于hMSCs和EC9706的融合細胞，在早期理論上應該同時含有hMSCs和EC9706的特征分子。因此，發明人在得到克隆后選取了⑶90和⑶106兩個標記作為鑒定hMSCs特征的指標，對挑選的每一個克隆進行了上述兩個標記的檢測(圖 1)。4)上皮特征的檢測由于EC9706為上皮源性腫瘤細胞，因此，它應該表達一定的細胞角蛋白(CK)分子。發明人對EC9706進行了一系列CK分子的免疫熒光的檢測，最終選擇了表達強度較高的CK18作為鑒定EC9706特征的標記。CK18陽性染色為綠色熒光(圖 2)。5)細胞DNA含量分析為了進一步確定發明人得到的克隆，發明人對所挑選的克隆進行了 DNA含量的檢測，正常hMSCsDNA含量為2η，而EC9706的DNA含量為如，得到的融合細胞DNA含量應該在6η、小于6η或大于6n (如圖3)。在經過以上五步的篩選，發明人最終挑選出3個⑶90+、⑶106+、CKlS+且染色體為
76n的克隆，并用這三個克隆進行后續試驗。2. hMSC與HSC對EC9706和KYSE150細胞成瘤的抑制作用DhMSC對EC9706細胞成瘤的抑制作用發明人從hMSCs對實體瘤治療這一目的出發，進行了細胞融合實驗。而評價治療腫瘤療效在細胞水平的重要實驗通常是對腫瘤細胞成瘤能力的檢測。如果hMSCs對食管癌具有治療作用，則融合細胞的成瘤能力必然發生變化。因此發明人首先從增殖能力的檢測進行了一系列實驗。通常檢測腫瘤細胞增殖的實驗有軟瓊脂集落形成和裸鼠成瘤實驗。a.軟瓊脂集落形成軟瓊脂集落形成實驗是反映非錨著依賴性生長的細胞的單個細胞增殖能力的有效方法之一，由于它與體內成瘤實驗具有很好的一致性，因此在腫瘤學的實驗中被廣泛采用。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆細胞形成率差別也很大，一般原代培養細胞克隆形成率弱，穩定傳代的細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，到基本形成克隆時終止培養。發明人用軟瓊脂集落形成實驗在體外檢測融合細胞的克隆形成能力，3周后，用染料染色觀察， EC9706和融合細胞均形成了克隆。融合細胞形成的克隆與EC9706相比，形成的克隆數量少，而且體積也小，克隆形成率明顯小于EC9706組，差異具有統計學意義(P < 0. 01)(圖 4)。差異有顯著性，表明細胞融合對腫瘤細胞的增殖具有抑制作用。2)hMSCs與EC9706融合在免疫缺陷鼠皮下成瘤在軟瓊脂集落形成試驗的基礎上，發明人又進行了 hMSCs與EC9706融合后對免疫缺陷鼠移植瘤生長的影響。在4周齡雌性SCID鼠左腋窩皮下以5X IO5/只的數量級接種細胞，每組6只SCID鼠。EC9706在第 8天就可在皮下觸及粟粒大小腫塊，而融合細胞只有FC3在15天時才可觸及粟粒大小的腫塊，FC1、FC2組在27天時才可觸及腫塊。接種后5周，引頸處死SCID小鼠。取出成瘤，稱重，EC9706組腫瘤重量明顯比融合細胞組大，且6只全部成瘤，而融合細胞中FCl只有2只成瘤，FC2組只有4只成瘤，FC3有6只成瘤(表1)。由于FCl和FC2所成腫瘤較小，肉眼就有極顯著的差異，因此發明人只對FC3與EC9706組進行了統計學分析。EC9706與FC3相比差異具有顯著性(P <0.01)。瘤組織經10%甲醛固定后，石蠟包埋，HE染色病理分析表明，瘤組織為鱗狀上皮癌，癌細胞呈巢狀分布，實質與間質分界清楚。表1 :EC9706和FC細胞接種裸鼠后的成瘤重量
權利要求
1.人成體干細胞在制備治療惡性實體瘤的細胞制劑中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述的人成體干細胞為人間充質干細胞。
3.根據權利要求1所述的用途，其中所述的人成體干細胞為人造血干細胞。
4.根據權利要求1所述的用途，其中所述的惡性實體瘤為人食管癌。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的細胞制劑通過移植給予受治療者。
6.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的細胞制劑通過靜脈輸注給予受治療者。
7.根據權利要求1-4中任意一項所述的用途，其中所述的細胞制劑包括非凍存的細胞制劑和凍存的細胞制劑。
8.根據權利要求7所述的用途，其中所述的凍存的細胞制劑包含冷凍保存劑。
9.根據權利要求8所述的用途，其中所述的冷凍保存劑包括甘油、二甲基亞砜、丙二醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、乳糖蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖。
全文摘要
本發明涉及人成體干細胞在治療惡性實體瘤中的用途。具體而言，本發明涉及人成體干細胞在制備治療惡性實體瘤的細胞制劑中的用途。發明人以人間充質干細胞和人造血干細胞分別與人食管癌細胞融合，并將融合細胞注入SCID/小鼠和裸鼠，融合細胞成瘤數明顯減少，其體積也縮小。本發明提供的干細胞制劑可以顯著抑制惡性實體瘤的生長。
文檔編號A61K35/28GK102188446SQ201010125040
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者陸士新 申請人:中國醫學科學院腫瘤研究所