α型芋螺多肽及其應用的制作方法

專利名稱：：α型芋螺多肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種a型芋螺多肽及其應用。
背景技術：
：芋螺屬腹足綱軟體動物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區，我國有芋螺100多種，主要分布在我國的西沙群島、海南島及臺灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計約存在5萬多禾中不同活性的多月太(Mcintosh,J.M.，Jones，R.M.(2001).Conevenom—fromaccidentalstingstodeliberateinjection.Toxicon，39，1447-1451.Nelson,L.(2004).Venomoussnails:Oneslip,andyou'redead.Nature,429，798-799.)。芋螺多肽能特異性作用于乙酰膽堿等神經遞質的各種受體亞型，以及鈣、鈉和鉀等多種離子通道，不僅可以直接作為藥物，還可以作為理想的分子模型用于開發新藥的先導化合物。其中，"型芋螺多肽MVIIA已被FDA批準作為治療HIV和晚期癌癥痛的藥物進入市場；從中國南海線紋芋螺中發現的S0-3也具有很強的鎮痛活性(Daiqyetal.JNatProd2003，66(9)1，276-9;專利Zl00128525.4)。但上述兩種芋螺多肽作用于中樞神經的N_型鈣通道，給藥方式為鞘內，不方便使用。a-芋螺多肽(a-CTX)屬于芋螺多肽A超家族(按信號肽保守序列及二硫鍵排列模式芋螺多肽分為A，M，0，P，I，J，S，T等超家族)，特異作用于肌肉型及神經元型nAChRs。絕大多數a-芋螺多肽含12-18個氨基酸、兩對二硫鍵(CCXmCXnC，連接方式為1_3，2_4)。根據m，n的數目不同，a-芋螺多肽細分為a3/5，a4/3，a4/4，a4/6，a4/7亞家族。目前發現某些a-芋螺多肽具有鎮痛活性，其中a-芋螺多肽Vcl.1(GCCSDPRCNYDHPEIC0NH2)是來自維多利亞芋螺(Co皿sVictoriae)，由16個氨基酸組成，含兩對二硫鍵(二硫鍵的排列方式為l-3，2-4)(Sandalletal.Biochemistry2003，42，6904-6911.)。研究表明Vcl.1在神經性疼痛動物模型中表現出了較好的鎮痛活性并具有加速損傷神經恢復的作用(Satkunanathanetal.BrainRes2005，1059，149-158)，2006年已進入臨床研究階段。另一種a型芋螺多肽Rgla在動物模型中同樣表現出鎮痛作用。由此可見，a型芋螺多肽中存在某些具有較好鎮痛活性的多肽，它們對于開發新一代神經性疼痛的治療藥物具有重要意義，而且這些多肽可以采用皮下、肌肉或腹腔等給藥方式，大大方便了應用。根據神經損傷的病因、性質和程度不同，在臨床上分為中樞神經疼痛和外周神經損傷所致的周圍神經疼痛兩大類。其中，中樞神經疼痛簡稱中樞痛，為中樞神經系統的疼痛傳導通路發生損害或功能障礙而引起的原發性疼痛，常見于脊髓的創傷、腦血管疾病或多發性硬化癥和腫瘤等。周圍神經疼痛系外傷、缺血、壓迫、感染、炎癥或代謝等因素損傷外周神經所致，如幻肢痛、帶狀皰疹后神經痛、多發性神經炎、糖尿病性周圍神經痛等。神經性疼痛的典型癥狀包括感覺異常、痛覺過敏和痛覺超敏等。臨床上常用的藥物主要有抗驚厥藥(如萊提西酞、奧卡西平)、阿片類藥(如嗎啡)和各種抗抑郁藥的聯用，但是由于毒副作用以及長期用藥帶來的耐受性、成癮性等問題，治療效果不佳(Drayetal，BrJAnaesth.2008，101(1)，48-58;Gilronetal，ExpertOpinEmergDrugs.2007，12(1)，113-26.)。因此，發現新一代高活性、低耐受和非成癮的鎮痛藥物十分必要。
發明內容本發明的目的是提供一種a型芋螺多肽及其應用。本發明提供的a型芋螺多肽為通式I所示的多肽；Xi-X^CCXg-X^-Xs-XgCX^^-Xs-Xg-Xio-Xii-Xi^-Xig-Xi^C-_p通式I通式I中&選自G、R中任意一個氨基酸或空缺；^選自G、N、K中任意一個氨基酸；^選自S、T、D、M中任意一個氨基酸；乂4選自N、R、I、F中任意一個氨基酸；Xs選自P、S、H中任意一個氨基酸；乂6選自A、F、D、T中任意一個氨基酸；^選自M、K、Y、P、N中任意一個氨基酸；Xs選自L、R、N、1中任意一個氨基酸；Xg選自K、I、D、Y中任意一個氨基酸；&。選自Y、N中任意一個氨基酸；Xn選自P、R、S、K中任意一個氨基酸；乂12選自N、D、E、R、L中任意一個氨基酸；X13選自L、Q、F中任意一個氨基酸或空缺；X14選自N、Y中任意一個氨基酸或空缺；|3選自酰胺基、或羧基；上述字母定義如下D-天冬氨酸；E-谷氨酸；1_異亮氨酸；K_賴氨酸；L_亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S_絲氨酸；T_蘇氨酸；G_甘氨酸；F_苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-組氨酸；A-丙氨酸；Y_酪氨酸。所述多肽具體可為如下七種多肽中的任意一種多肽I:氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II:氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III:氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV:氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V:氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI:氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII:氨基酸序列如序列表的序列13所示。7個多肽的氨基酸序列如下多肽Tl:NH2-GCCSNPACMLKNPNLC-CONH2;多肽T2:NH2-NCCTRSFCKRIYPDLC-CONH2;多肽T3:NH2-GCCDIPDCYNKNREQC-CONH2;多肽T4:NH2-NCCMFHTCPIDYSRFNC-CONH2;多肽T5:NH2-GNCCMFHTCPIDYSRFNC-CONH2;多肽T6:NH2-GNCCMFHTCPIDYSRFYC-CONH2;多肽T7:NH2-RKCCSNPACNRYNKLC-COOH。所述多肽II的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽II。所述多肽III的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽III。所述多肽IV的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列IO所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽IV。所述多肽V的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節PH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽V。所述多肽VI的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24_48h，得到多肽VI。所述多肽I的制備方法具體如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl緩沖液中氧化28h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與lOmM碘溶液避光反應lOmin，得到多肽I。所述多肽VII的制備方法具體如下化學合成序列表的序列13所示的線性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl緩沖液中氧化28h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與lOmM碘溶液避光反應10min，得到多肽VII。所述多肽的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述多肽的編碼基因具體可為如下七種DNA片段中的任意一種(1)序列表的序列1自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子(2)序列表的序列2自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子(3)序列表的序列3自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子(4)序列表的序列4自5'端第139至189位核苷酸所示的DNA分子(5)序列表的序列5自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子(6)序列表的序列6自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子(7)序列表的序列7自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。本發明還保護一種用于鎮痛的藥物，其活性成分為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽在制備用于鎮痛的藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護一種鎮痛劑，為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽或均可應用于制備鎮痛劑。上述a型芋螺多肽可采用Fmoc法固相合成，用高效液相色譜技術純化。經過活性測定發現通式I的7個多肽具有鎮痛作用，其中a芋螺多肽T-l、T_2、T-3、T-4具有顯著的鎮痛活性，T5-T7也有明顯鎮痛活性，在抑制鎮痛方面具有應用價值c所述的a型芋螺多肽的衍生物也屬于本發明的保護范圍。所述的a型芋螺多肽的衍生物可為如下(1)、(11)、(III)或(IV):(I)將所述a型芋螺多肽進行一個或多個氨基酸的插入和/或替換和/或缺失，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(II)將所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物進行環化、脂化或PEG化修飾，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(III)將所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物與載體聯接，得到的a型芋螺多肽的衍生物；(IV)將一個或幾個所述a型芋螺多肽或(I)a型芋螺多肽的衍生物連接為多聚體，得到的a型芋螺多肽的衍生物。所述的a型芋螺多肽中，可對側鏈氨基酸進行修飾，這些殘基的修飾可以增強肽的生物活性或者靶向的選擇性。所述取代還可以是"保守性取代"或"非保守性取代"。取代可以是一個氨基酸的取代，也可以是多個氨基酸的取代，可以是連續的取代，也可以是分散的取代。"保守性取代"將所述的a型芋螺多肽中的一個或多個氨基酸殘基用構象為D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸替換，以增加生物利用度及提高抑制活性；D-型的氨基酸指與組成蛋白質的L-型的氨基酸相對的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括組成蛋白質的不常見氨基酸和不組成蛋白質的氨基酸，如5_羥基賴氨酸、甲基組氨酸、Y_氨基丁酸、高絲氨酸等；人工修飾的氨基酸指經過甲基化，磷酸化等修飾的組成蛋白質的常見L-型氨基酸。"非保守性取代":多肽中的一個氨基酸或多個氨基酸殘基被不同性質的氨基酸所取代，或者被非常規氨基酸所取代。所述添加，可以是一個氨基酸或者多個天然的或者非常規的氨基酸。所述缺失，也包括一個或者多個氨基酸的缺失。所述載體包括但是不局限于蛋白質、聚乙二醇、脂類物質等。幾個(1-4個)相同的a型芋螺多肽可通過氨基酸，如賴氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子連接在一起形成多聚體。所述藥物中還可含有阿片受體拮抗劑、阿片受體部分激動劑、去甲腎上腺素受體拮抗劑、a2去甲腎上腺素受體激動劑、膽堿能神經拮抗劑、鈣通道阻斷劑或NMDA受體拮抗劑中的任意一種或幾種，以增強其鎮痛的效果。所述藥物中可添加藥劑學可接受的輔料，制成針劑、口服劑、直腸體給藥劑或皮膚吸收劑等不同劑型。本發明的a型芋螺多肽具有以下特點1、本發明的a型芋螺多肽具有很強的鎮痛活性，其中T-2、T-3、T-4四個肽在肌肉注射劑量在很低的情況下(10nmol/kg)既可使痛閾率提高40%以上，T_l可使痛閾率提高80%以上，T-5、T-6、T-7也可使痛閾提高20%以上。2、本發明的a型芋螺多肽來自中國南海芋螺，具有全新的氨基酸組成，與目前報道的a型芋螺多肽在氨基酸組成上具有顯著差異。3、本發明的a型芋螺多肽作用于外周神經系統，給藥方式為皮下、肌肉或腹腔注射，與現有的鎮痛藥物MVIIA的鞘內給藥方式相比，應用更便利。圖1為T-2、T-3、T-4、T-5、T-6禾PVcl.1折疊24h后的色譜分析圖；A:T_2折疊B:T-3折疊圖；C:T-4折疊圖；D:T_5折疊圖；E:T_6折疊圖；F:Vcl.1折疊圖。圖2為T-l、T-7第一步折疊和第二步折疊后的色譜分析圖；A:T_1第一步氧化折疊圖；B:T-l第二步氧化折疊圖；C:T_7第一步氧化折疊圖；D:T_7第二步氧化折疊圖。圖3為T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、Vcl.1多肽純化后的色譜分析圖；A:T_1純化分析圖；B:T-2純化分析圖；C:T-3純化分析圖；D:T-4純化分析圖；E:T_5純化分析圖；F:T-6純化分析圖；G:T_7純化分析圖；H:Vcl.1純化分析圖。圖4為T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、Vcl.1多肽的鎮痛活性。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、a型芋螺多肽的發現1、芋螺總RNA的提取從西沙群島、海南三亞等地采集6種芋螺活體作為樣本材料，分別采用Trizol法提取6種芋螺的總RNA。6種芋螺大理石芋螺(Conusmarmoreus)、堂皇芋螺(Co皿simperialis)、信號芋螺(Co皿slitteratus)、黑心芋螺(Co皿semaciatus)、少女芋螺(Co皿seberneus)、小牛芋螺(Co皿svituli皿s)。Trizol法提取總RNA的具體步驟①先于冰上取芋螺毒腺管，將其置于液氮中冷凍并用研磨器研成粉末，倒入事先冰浴的微量勻漿器中。②吸取1.2mlTrizol加入勻漿器并進一步研磨使芋螺組織裂解釋放RNA。③將研磨好的漿液倒入1.5ml的離心管中，室溫靜置5min。加入20%氯仿240iU，劇烈震蕩15s后，放于冰上10min。⑤4t:、12000rpm離心15min，小心轉移上清到一新的離心管中，加入高鹽沉淀液250iil、異丙醇250iU，反復顛倒30次左右，再放于冰上10min。⑥4。C、12000rpm，離心10min，棄去上清。⑦加入1.2ml75X乙醇混勻，4。C、9045rpm離心5min。⑧棄去上清，空氣中干燥10min，加入50-80iilDEPC溶解沉淀，溶液即為RNA溶液，于-8(TC保存備用。2、cDNA的合成采用大連TaKaRa公司的3'Full-RACE試劑盒(3'-FullRACECoreSetVer2.0)進行cDNA的合成，具體方法如下按下列比例混合樣品RNaseFreeddH204.5ii183'RACEAdaptor(5iiM)1ii1RNA(l.5iigtotalRNA)1ii1混勻后，70。C變性10min，冰上急冷2min。上述反應溶液6.5ii1d證Mixture(10mMeach)1ii1RNaseInhibitor0.25ii1ReverseTranscriptaseM-MLV(RNaseH_)0.25ii15XM-MLVBuffer2ii1混勻后，42t:反應lh，7(TC反應15min，反應結束后的反轉錄產物于-2(rC保存。3、芋螺毒素cDNA的3'-RACE擴增以步驟2合成的cDNA為模板，根據芋螺多肽A超家族a芋螺多肽信號肽區域設計a-CTX外側引物Fl和內側引物F2，分別和3'-RACE外側引物Rl，3'-RACE內側引物R2進行巢式PCR。Fl:5'—ATGGGCATGCGGATGATGTTC-3，；F2:5'-CTGTTGGTTGTCTTGGCAACCAC-3';Rl:5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，；R2:5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'。具體步驟第一輪PCR反應體系包括反轉錄的cDNA模板3iil，1XcDNADilutionBufferII7ii1，上游引物Fl2ii1，3'-RACE夕卜偵U弓|物Rl2iU，10XLAPCRBufferII(Mg2+plus)5iil，TaKaRaLATaq(5U/ii1)0.25ii1，用滅菌的去離子水補齊總體積50ii1。進行PCR的循環條件為94t:預變性4分鐘；94t:變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸50秒(桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個循環，最后在72t:延伸10min，4t:保溫。第二輪PCR反應體系包括第一輪PCR產物lii1，dNTPMixture(各2.5mM)8ii1，10XLAPCRBufferII(Mg2+plus)5ii1，3，-RACE內側引物R22iU，下游引物F22iU，TaKaRaLATaq(5U/iU)0.5iU，用滅菌的去離子水補齊總體積50iU。進行PCR的循環條件為94t:預變性4分鐘；94t:變性30秒，55t:退火30秒，72t:延伸50秒(桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個循環，最后在72。C延伸10min，4。C保溫。PCR產物取8iiL點樣，擴增產物經1.0^瓊脂糖凝膠電泳分離，在圖像分析儀下紫外透射觀察分析照相。4、PCR產物的克隆與測序用膠回收試劑盒回收上述特異PCR產物(300bp-800bp)與載體連接，6種PCR產物與pGM-T載體(TIANGEN生物公司)連接；轉化大腸桿菌DH5a，利用氨芐青霉素抗性挑選單克隆，37°C、220rpm進行搖菌，再通過PCR法挑選陽性克隆進行測序，PCR反應體系為反應菌液1i！1，3'-RACE內側引物R2lyl，下游引物F2lyl，2XTaqPCRMasterMix(TIANGEN生物公司)12.5iU，ddH209.5ii1，總反應體系為25y1，反應條件同第二輪PCR的循環條件，陽性克隆進行測序，經過序列的分析和比對，獲得了本發明所述通式I的新型a芋螺多肽序列。通式I的新型a芋螺多肽序列是根據前肽及芋螺毒素特點推測而來，前肽是根據前體基因推測而來。6種a芋螺多肽前肽序列見表1，6種a芋螺多肽前肽編碼的多核苷9酸序列見表2。表l前肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>見序列表的序列7實施例2、a型芋螺多肽的合成分別合成表3所示的七種多肽。表3a型芋螺多肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>D-天冬氨酸；E-谷氨酸；1-異亮氨酸；K-賴氨酸；L_亮氨酸；M_蛋氨酸；N_天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T_蘇氨酸；G_甘氨酸；F_苯丙氨酸；P_脯氨酸；H-組氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。T-l和T-7，每個多肽中二硫鍵連接方式均為C1_C3，C2-C4。*表示酰胺化(C0NH2)。—、多肽(—)T-l的合成(采用Fmoc方法人工合成)1、肽樹脂的合成使用固相合成技術。在433A多肽合成儀(ABI美國應用系統生物公司儀器)上進行。使用的氨基酸為Fmoc氨基酸(美國AdvancedChemtech公司產品)，使用的樹脂為Rink樹脂(美國AdvancedChemtech公司產品)和Wang樹脂(美國AdvancedChemtech公司產品)，使用的試劑包括DCC(Acros公司產品)、H0Bt(美國AdvancedChemtech公司產品)、NMP(PE公司產品)、哌啶(上海吉爾生化產品)、甲醇(國產分析純)和二氯甲烷(國產分析純)。Fmoc氨基酸的側鏈保護基分別如下His、Cys、Asn、Gln的側鏈保護基為三苯甲基(-Trt);Cys的側鏈保護基為三苯甲基(-Trt)或Acm，以利于分步氧化；Arg的側鏈保護基為9-苯基芴甲基(-Pbf);Trp的側鏈保護基為叔丁氧羰基(-Boc);Ser、Tyr的側鏈保護基為叔丁基(-tBu);Asp、Glu、Try的側鏈保護基為叔丁氧基(-0tBu)。羧基化或者酰胺化由采用的樹脂決定的，T7用的是王樹脂，Tl至T6用的是Rink樹脂，所以T7末端羧基化，Tl至T6末端酰胺化。反應體系中，樹脂與氨基酸的摩爾比為1:5，每次合成0.lmmol肽樹脂(帶有側鏈保護基)。2、肽樹脂的裂解將步驟1獲得的帶有側鏈保護基的肽樹脂(0.lmmol)加入10ml裂解液中進行裂解；常溫下裂解3h后，蒸去大部分三氟乙酸，然后加入冷乙醚進行沉淀，過濾，所得沉淀用5%(質量百分含量)乙酸溶解，然后凍干，得到多肽T-1(粗肽)。裂解液的組成88體積份三氟乙酸(TFA)、5體積份H20、2體積份三異丙基硅烷和115體積份二巰基蘇糖醇(DTT)。(二)其它多肽的合成方法同T-1的合成，分別得到多肽T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7。二、多肽的折疊和富集色譜分析條件C_18，Calesil0DS-100(PromptarCompany);5iim，。4.6X250mm;柱溫25。C;上樣量100ii1;流速lml/min;檢測波長214nm;梯度(在每個時間段，為線性梯度洗脫):0-lmin，乙月青0%-5%;l-25min，乙月青5%-70%;25-28min，乙腈70%-80%。1、多肽的折疊(1)—步折疊法(空氣氧化法)T-2、T-3、T-4、T-5、T-6采用一步折疊法，步驟如下取40mg步驟一獲得的多肽，溶解于300ml0.1M的NH4HC03緩沖溶液中，用氨水調節pH值為8.2，室溫下磁力攪拌24_48h。折疊結束后，用冰醋酸調節pH值至5，終止反應，進行色譜分析。[OH4](2)兩步折疊法T-l、T-7采用兩步折疊法，先用Acm保護線性肽中的一對巰基，用空氣氧化法氧化另外一對二硫鍵，然后再用碘氧化法除去Acm基，形成剩下的一對二硫鍵。兩步折疊法具體步驟如下(1)第一步氧化折疊0.1MTris-HCl緩沖溶液(pH7.7)中折疊氧化28h，HPLC監測反應進程，反應結束后加入少量醋酸終止反應，富集脫鹽凍干，純化后用去離子水溶解后進行下一步折疊；(2)第二步氧化折疊10mM碘溶液與0.4mg/mL步驟(1)的產物等體積混合，避光反應10min，然后加入適量的抗壞血酸溶液終止反應，HPLC分析，富集，凍干。T-2、T-3、T-4、T_5、T_6折疊24h后的色譜分析圖如圖1所示；A為T_2折疊24h后的色譜分析圖，B為T-3折疊24h后的色譜分析圖，C為T-4折疊24h后的色譜分析圖，D為T-5折疊24h后的色譜分析圖，E為T-6折疊24h后的色譜分析圖。T_l、T_7第一步和第二步氧化折疊后的色譜分析圖如圖2所示；A為T-l第一步折疊后的色譜分析圖，B為T-l第二步折疊后的色譜分析圖，C為T-7第一步折疊后的色譜分析圖，D為T-7第二步折疊后的色譜分析圖。多肽T-1的第一步折疊的保留時間為17.828min，第二步折疊的保留時間為17.699;多肽T-2的保留時間為17.288min;多肽T_3的保留時間為10.654min;多肽T-4的保留時間為15.390min;多肽T_5的保留時間為15.198min;多肽T_6的保留時間為15.656min;多肽T-7的第一步折疊的保留時間為11.266min，第二步折疊的保留時間為11.653。2、多肽富集取300ml步驟1得到的Tl多肽溶液用WatersDeltaPr印4000HPLC富集。制備柱(C18，Nucleosil，25mmX100mm，大連物化所)。上樣速度為2.5ml/min;上樣結束后用水(含0.1%TFA)脫鹽，水的體積為兩個柱體積(約140ml)，流速4ml/min;然后用90%乙腈(含O.1%TFA)和10%水(含O.1%TFA)洗脫，流速5ml/min，收集洗脫液，214nm下進行檢測。將收集到的洗脫液旋轉蒸發去掉大部分乙腈，凍干后得到70mg多肽Tl(粗肽)。采用相同的方法分別得到T_2、T_3、T_4、T_5、T_6、T_7的粗肽。三、多肽的純化(HPLC法)多肽的純化中多肽T-lT-7的保留時間為10-14min之間。多肽的分析中多肽T-1的保留時間為17.675min;多肽T-2的保留時間為11.631min;多肽T-3的保留時間為10.669min;多肽T-4的保留時間為15.133min;多月太T-5的保留時間為14.889min;多肽T-6的保留時間為15.504min;多肽T-7的保留時間為11.554min。1、多肽的純化取30mg步驟二制備的Tl粗肽，使用反相HPLC進行純化。以水和乙腈(分別含0.1X體積百分含量的TFA)為流動相，采用梯度洗脫的方法，用C-18半制備柱制備。液相HPLC條件如下半制備柱C-18，Kromasil，10m，10.0X250mm;f克速3ml/min;檢測波長214nm;柱溫25。C;梯度(在每個時間段，為線性梯度洗脫)0-lmin，乙腈5%-10%;l-25min，乙腈10%-40%;25-28min，乙腈40%-100%;上樣量2mg。收集目標峰，蒸去大部分乙腈，凍干后得到8mg多肽Tl(純肽)。2、多肽的分析對得到Tl的純肽采用HPLC法進行分析，分析純肽的HPLC條件如下分析柱C-18，CalesilODS-IOO，5iim，4.6X250mm;柱溫25。C;上樣量100ill;流速lml/min;檢測波長214nm;梯度(在每個時間段，為線性梯度洗脫)0-lmin，乙腈0%_5%;l-25min，乙腈5%-70%;25-28min，乙腈70%-80%;上樣量20ug。采用相同的方法分別得到T-2、T-3、T-4、T_5、T_6、T_7的純肽。T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7的色譜分析圖如圖3所示。其中，A為T-1的色譜分析圖，B為T-2為的色譜分析圖，C為T-3的色譜分析圖，D為T-4的色譜分析圖，E為T-5的色譜分析圖，F為T-6的色譜分析圖，G為T-7的色譜分析圖。結果表明，采用HPLC法純化后獲得的T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7純度為70-90%。實施例3、a型芋螺多肽的鎮痛活性測定—、a-芋螺多肽Vcl.1的制備a-芋螺多肽Vcl.1:GCCSDPRCNYDHPEICONH2。1、肽樹脂的合成使用固相合成技術。在433A多肽合成儀(ABI美國應用系統生物公司儀器)上進行。合成使用的氨基酸為Fmoc保護氨基酸(美國AdvancedChemtech公司產品)，使用的樹脂為Rink樹脂(美國AdvancedChemtech公司產品)，使用的試劑包括DCC(Acros公司)、H0Bt(美國AdvancedChemtech公司產品)、NMP(PE公司)、哌啶(上海吉爾生化)、甲醇(國產分析純)和二氯甲烷(國產分析純)。Fmoc氨基酸的側鏈保護基分別如下His、Cys的側鏈保護基為三苯甲基(_Trt)，Arg的側鏈保護基為9-苯基芴甲基(-Pbf)、Trp的側鏈保護基為叔丁氧羰基(-Boc)，Ser、Tyr的側鏈保護基為叔丁基(-tBu)，Asp、Glu的側鏈保護基為叔丁氧基(-OtBu)。反應體系中，樹脂與氨基酸的摩爾比為1:5，每次合成0.lmmol肽樹脂(帶有側鏈保護基)。2、肽樹脂的裂解將步驟1獲得的帶有側鏈保護基的肽樹脂(0.lmmol)加入10ml裂解液中進行裂解；常溫下裂解3h后，蒸去大部分三氟乙酸，然后加入冷乙醚進行沉淀，過濾，所得沉淀用5%(質量百分含量)乙酸溶解，然后凍干，得到多肽Vcl.l(粗肽)。裂解液的組成88體積份三氟乙酸(TFA)、5體積份H20、2體積份三異丙基硅烷和5體積份二巰基蘇糖醇(DTT)。3、多肽的折疊和富集色譜分析條件KromasilC-18(北京分析儀器廠)分析柱，5ym，①4.6X250mm;柱溫25°C;上樣量100iU;流速lml/min;檢測波長214nm;梯度l-30min，乙腈5%-60%(線性梯度洗脫)。(1)多肽的折疊采用空氣氧化法，取90mg步驟2獲得的多肽Vcl.1，溶解于300ml0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節PH值為8.5，室溫下磁力攪拌24-48h。折疊結束后，用冰醋酸調節pH值至3.5，終止反應，進行色譜分析。Vcl.l折疊24h后的色譜分析圖如圖1F所示。圖中主峰為目標多肽Vcl.l(保留時間為14.365min)。(2)多肽的富集使用制備液相富集折疊后的多肽溶液，具體操作步驟如下在waters300E半制備液相系統中，制備柱(C_18，15iim，①25XlOmm(預柱)+①25X100mm)，用1120平衡兩個柱體積(5ml/min，20min)后，緩慢進樣(2.5ml/min)，用H^洗脫兩個柱體積(2.5ml/min，40min以上)以洗脫掉鹽及其他小分子物質，再用60%的乙腈進行等梯度洗脫(5ml/min)，監測214nm處的吸光度，接收多肽目標峰，最后用100%的乙腈保存C18柱。收集的多肽溶液，凍干后得到Vcl.1(粗肽)。4、HPLC法純化(1)多肽的純化取30mg步驟3制備的Vcl.1初肽，使用反相HPLC進行純化，以水及乙腈(分別含0.1X體積百分含量的TFA)為流動相，采用梯度洗脫的方法，用C-18半制備柱制備。液相HPLC條件如下半制備柱:Zorabx300SB，C_18，10m，①9.4X250m;14流速3ml/min;檢測波長:214nm;柱溫25°C;梯度(在每個時間段，為線性梯度洗脫)0-lmin，0-5X體積百分含量乙腈；1-30min，5%_60%體積百分含量乙腈；30-32min，60%_100%體積百分含量乙腈；上樣量2mg。收集目標峰(保留時間為13-15min)，蒸去大部分乙腈，凍干后得到6mgVcl.1純(2)多肽的分析對Vcl.1的純肽采用HPLC法進行分析，分析純肽的HPLC條件如下分析柱KromasilC-18柱(北京分析儀器廠)，5iim，①4.6X250mm;流速lml/min;檢測波長:214nm;柱溫25°C;梯度(在每個時間段，為線性梯度洗脫)0-lmin，0-5X體積百分含量乙腈；1-30min，5%_60%體積百分含量乙腈；30-32min，60%_100%體積百分含量乙腈；上樣量50ug。Vcl.1的色譜分析圖如圖3H所示(保留時間為14.465min)。結果表明，采用HPLC二、構建大鼠坐骨神經半切模型利用大鼠坐骨神經半切模型作為鎮痛模型。該模型是對大鼠坐骨神經直接穿剌造成傷害，可誘發強烈的機械痛敏，動物極少出現自噬，可以較好的模擬神經源性疼痛，同時手術過程簡單快捷，是一種良好鎮痛模型。SD大鼠，$，體重200-220g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。參照文獻(Seltzeretal.Pain，Anovelbehavioralmodelofneuropathicpaindisordersproducedinratsbypartialsciaticnerveinjury.1990，43，205-218.)的方法構建坐骨神經半切模型大鼠。具體步驟如下大鼠在麻醉及無菌操作下在股段高位暴露右側坐骨神經，在25倍放大鏡下，在坐骨神經干向后二頭肌和半腱肌分支處的遠端小心地將神經背側與周圍組織分離開來，用小止血鉗夾住神經背側，將一條6-0號硅制絲線縫入神經干內，使神經的背側3/1-2/1被收在線套內，然后扎緊線套。肌肉和皮膚均用棉線縫合。手術七天后使用Ugo37215型壓痛儀測試大鼠痛閾值，痛閾值下降50%以上者視為建模成功大鼠。二、利用大鼠坐骨神經半切模型測定a型芋螺多肽對大鼠的鎮痛活性1、T-l、T_4、T_5、T_6的鎮痛活性將建模成功的大鼠分成6組，每組8只，第一組至第四組分別肌肉注射3翻l(0.2mL)上述實施例2獲得的a型芋螺毒素T-l、T-4、T-5、T-6，第五組(陽性對照)注射3翻lVcl.1(0.2mL)，第六組(陰性對照)注射0.2mL生理鹽水。給藥2.5-3h后，測試大鼠給藥前后痛閾值的變化。實驗設三次重復，痛閾值取8只大鼠三次重復實驗的平均值。各實驗組大鼠痛閾值提高率見表4。表4a型芋螺多肽的鎮痛效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、T-2、T-3、T-7的鎮痛活性將建模成功的大鼠分成5組，每組6只，第一組至第三組分別肌肉注射3nmo1(0.2mL)上述實施例2獲得的a型芋螺毒素T_2、T_3、T_7，第四組(陽性對照)注射3nmo1Vcl.1(0.2mL)，第五組(陰性對照)注射0.2mL生理鹽水。給藥2.5_3h后，測試大鼠給藥前后痛閾值的變化。實驗設三次重復，痛閾值取6只大鼠三次重復實驗的平均值。各實驗組大鼠痛閾值提高率見表5。表5a型芋螺多肽的鎮痛效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>不同a型芋螺毒素的鎮痛活性結果如圖4所示。圖4中，縱坐標為大鼠肌肉給藥2.5-3h后痛閾值的提高率，橫坐標表示不同的a型芋螺多肽。鎮痛結果表明，在相同的劑量下，與生理鹽水組相比，T-l、T-2、T-3、T-4、T_5、T_6、T_7均顯著的提高了大鼠的痛閾值。T-l、T-2、T-3、T-4的鎮痛活性顯著高于對照肽Vcl.1。當給藥量為3nmo1時，T-1可使大鼠的痛閾值提高80.4士16.0X，比Vc1.1(34.3±6.1%)的鎮痛效果提升了約134%，T_2可使大鼠痛閾值提高40.9±11.1%，T-3可使大鼠痛閾值提高46.8±10.3%，T_4可使大鼠痛閾值提高58.9±8.5%。T-5可使大鼠痛閾值提高26.9±5.9%，T_6可使大鼠痛閾值提高20.6±4.7%，T-7可使大鼠痛閾值提高26.6±7.2%。權利要求通式I所示的多肽；X1-X2CCX3-X4-X5-X6CX7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14C-β通式I通式I中X1選自G、R中任意一個氨基酸或空缺；X2選自G、N、K中任意一個氨基酸；X3選自S、T、D、M中任意一個氨基酸；X4選自N、R、I、F中任意一個氨基酸；X5選自P、S、H中任意一個氨基酸；X6選自A、F、D、T中任意一個氨基酸；X7選自M、K、Y、P、N中任意一個氨基酸；X8選自L、R、N、I中任意一個氨基酸；X9選自K、I、D、Y中任意一個氨基酸；X10選自Y、N中任意一個氨基酸；X11選自P、R、S、K中任意一個氨基酸；X12選自N、D、E、R、L中任意一個氨基酸；X13選自L、Q、F中任意一個氨基酸或空缺；X14選自N、Y中任意一個氨基酸或空缺；β選自酰胺基或羧基；上述字母定義如下D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-異亮氨酸；K-賴氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T-蘇氨酸；G-甘氨酸；F-苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-組氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽為如下七種多肽中的任意一種多肽I:氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II:氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III:氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV:氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V:氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI:氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII:氨基酸序列如序列表的序列13所示。3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽II的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽I1;所述多肽III的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24_48h，得到多肽III;所述多肽IV的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24-48h，得到多肽IV;所述多肽V的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24_48h，得到多肽V;所述多肽VI的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，溶解于0.1M的NH4HC03緩沖液中，用氨水調節pH值為8.2，磁力攪拌24_48h，得到多肽VI。4.如權利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽I的制備方法如下化學合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl緩沖液中氧化28h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與lOmM碘溶液避光反應10min，得到多肽I;所述多肽VII的制備方法如下化學合成序列表的序列13所示的線性多肽，置于pH7.70.1MTris-HCl緩沖液中氧化28h，然后加入醋酸終止反應，脫鹽凍干，然后與lOmM碘溶液避光反應lOmin，得到多肽VII。5.權利要求1至4中任一所述多肽的編碼基因。6.如權利要求5所述的基因，其特征在于所述多肽的編碼基因為如下七種DNA片段中的任意一種(1)序列表的序列1自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2自5'端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列3自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4自5'端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列6自5'端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表的序列7自5'端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。7.—種用于鎮痛的藥物，其活性成分為權利要求1至4中任一所述的多肽。8.權利要求1至4中任一所述的多肽在制備用于鎮痛的藥物中的應用。9.一種鎮痛劑，為權利要求1至4中任一所述的多肽。10.權利要求1至4中任一所述的多肽在制備鎮痛劑中的應用。全文摘要本發明公開了一種α型芋螺多肽及其應用。本發明提供了七種多肽多肽I氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列13所示。經過活性測定發現通式I的7個多肽具有鎮痛作用，其中α芋螺多肽T-1、T-2、T-3、T-4具有顯著的鎮痛活性，T5-T7也有明顯鎮痛活性，在鎮痛方面具有應用價值。文檔編號A61K38/10GK101792485SQ201010121879公開日2010年8月4日申請日期2010年3月10日優先權日2010年3月10日發明者于正,劉珠果,吳巧玲,孫婷,戴秋云,胡潔申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所