專利名稱：重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體及其制備方法、重組病毒、藥物組合物及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組Ii型單純皰疹病毒載體及其制備方法、包括該重組Ii型單純皰 疹病毒載體的重組病毒、包括該重組II型單純皰疹病毒載體藥物組合物及所述重組II型 單純皰疹病毒載體和重組病毒在制備治療腫瘤的基因藥物中的應用。
背景技術：
單純皰疹病毒載體(Herps simplex virus,HSV)是一種長約IMkb的雙鏈DNA病 毒，可在受染宿主細胞核中復制。HSV載體具有以下優點1)宿主細胞廣泛；幻病毒滴度高； 3)外源基因容量大。HSV載體的缺點在于它的毒性。例如，ICP47蛋白影響與抗原處理相關的轉運蛋白(TAP1和TAP2)的功能，阻礙MHC I分子的抗原表呈過程。所以剔除ICP47基因有利于增強免疫反應。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表達增加，USll可對抗PKR對病毒生長繁殖的抑制。ICP34. 5為神 經毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能選擇性地殺傷腫瘤細胞，其機理為ICP34. 5能對抗I3KR 對翻譯起始因子eIf-加的滅活，使病毒順利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒進入正常 細胞后，誘導干擾素/PKR通路活化，進而導致eIf-加失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多數腫瘤細胞的干擾素/PKR信號通路受損。因此，失去了 ICP34.5的病毒可以在 腫瘤細胞內生長繁殖。以及ICP6基因編碼核糖核苷酸還原酶，該酶為病毒DNA復制提供必 需的前體，在分裂細胞(如腫瘤細胞)中為非必需基因，剔除該基因可以增加病毒載體的載 量。現有的單純皰疹病毒載體都是由野生型I型單純皰疹病毒通過剔除以上基因獲 得的。例如CN 1283803C公開了一種的減毒HSV-I基因治療載體，該載體剔除了 ICP47、 ICP6和ICP34. 5三個基因。現有的由野生型I型單純皰疹病毒制備的單純皰疹病毒載體存 在生產周期長、溶瘤活性不足的問題；野生型II型單純皰疹病毒是否能用做單純皰疹病毒 載體，目前還沒有報到。
發明內容
本發明的目的是克服現有的由野生型I型單純皰疹病毒制備的單純皰疹病毒載 體，生產周期長、溶瘤活性不足的缺點，提供一種生產周期短、溶瘤活性高的重組II型單純 皰疹病毒載體。現有技術一般認為野生型II型單純皰疹病毒(多寄生在生殖道內)比野生型I型 單純皰疹病毒(多感染口腔及口周皮膚粘膜)安全性差，因此不選擇野生型II型單純皰疹 病毒制備單純皰疹病毒載體。但是本發明的發明人發現，由野生型II型單純皰疹病毒僅剔 除ICP47和ICP34. 5得到的重組II型單純皰疹病毒載體，安全性好。此外，現有技術還認 為，ICP6基因在非分裂細胞(如正常細胞)中為必需基因，在分裂細胞中為非必需基因，因 此剔除ICP6可以增加病毒載體的載量和靶向分裂細胞的選擇性。本發明的發明人發現實際上剔除ICP6以后使病毒的生長繁殖受到很大影響，溶瘤活性下降，并且很難生產出高滴 度的病毒；反而使保留ICP6的情況下，病毒生長繁殖好，容易生產出高滴度的病毒，并且減 少了剔除ICP6的步驟可以大大提高生產重組II型單純皰疹病毒載體的效率，而且由于剔 除了 ICP34. 5，本發明重組II型單純皰疹病毒載體的腫瘤選擇性殺傷并未受到顯著影響。本發明提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體剔除了野生II型 單純皰疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。本發明提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體剔除了野生II型 單純皰疹病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因，并且所述載體在被剔除的ICP34. 5基 因的位置上插入了人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)表達盒。本發明還提供了一種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其中，該方法包括 以下步驟(1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構建HG52dICP47重 組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長病毒DNA ；b.構建含有ICP47基因上游側翼區序列和下游側翼區序列的質粒pdICP47H2 bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長病毒DNA為模板，PCR擴增ICP47 基因上游側翼區序列和下游側翼區序列；表 權利要求
1.一種重組II型單純皰疹病毒載體，其特征在于，所述載體剔除了野生II型單純皰疹 病毒HG52株的ICP34. 5基因和ICP47基因。
2.根據權利要求1所述的重組II型單純皰疹病毒載體，其中，所述載體在被剔除的 ICP34. 5基因的位置上插入了人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達盒。
3.—種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構建HG52dICP47重組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長病毒DNA；b.構建含有ICP47基因上游側翼區序列和下游側翼區序列的質粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長病毒DNA為模板，PCR擴增ICP47基因 上游側翼區序列和下游側翼區序列； 表1
4.根據權利要求3所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟(3)插入人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達盒，構建重組II型單純皰疹病毒載體 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF i.提取步驟C5得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34. 5的全長病毒DNA ； .將巨細胞病毒IE啟動子控制的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達盒插入到步 驟B3獲得的pH2d34. 5質粒的EcoRV位點，得到pH2d34. 5-hGMCSF質粒；iii.將步驟i得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34.5全長病毒DNA與 步驟ii得到的pH2d34. 5-hGMCSF質粒共轉染BHK細胞，發生同源重組的病毒的毒斑表達人 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；iv.挑選酶聯免疫吸附測定陽性的毒斑，純化出重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF。
5.根據權利要求3所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟I.提取步驟C2獲得的重組II型單純皰疹病毒HG52dICP47d34.5-GFP的全長病毒DNA ；II.將巨細胞病毒IE啟動子控制的人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達盒插入到步 驟B3獲得的pH2d34. 5質粒的EcoRV位點，得到pH2d34. 5-hGMCSF質粒；III.將步驟I得到的重組II型單純皰疹病毒載體HG52dICP47d34.5-GFP全長病毒DNA 與步驟II得到的pH2d34. 5-hGMCSF質粒共轉染BHK細胞，發生同源重組的病毒的毒斑表達 人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子但不發熒光；IV.挑選無熒光毒斑，純化出重組II型單純皰疹病毒載體 HG52dICP47dICP34. 5-hGM-CSF
6.根據權利要求3-5中任意一項所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特 征在于，所述方法還包括對所有涉及的質粒進行測序以證實無突變發生的步驟。
7.—種重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)從野生型II型單純皰疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，構建HG52dICP47重組II型單純皰疹病毒a.提取II型單純皰疹病毒HG52株的全長病毒DNA；b.構建含有ICP47基因上游側翼區序列和下游側翼區序列的質粒pdICP47H2bl.使用表1所示的引物，以步驟a得到的全長病毒DNA為模板，PCR擴增ICP47基因 上游側翼區序列和下游側翼區序列； 表1
8.根據權利要求7所述的重組II型單純皰疹病毒載體的制備方法，其特征在于，所述 方法還包括對所有涉及的質粒進行測序以證實無突變發生的步驟。
9.一種重組II型單純皰疹病毒載體，其特征在于，所述載體為由權利要求3-8中任意 一項所述的方法所制備的重組II型單純皰疹病毒載體。
10.一種重組病毒，所述重組病毒包括作為載體的病毒和目的基因，其特征在于，所述 作為載體的病毒為權利要求1-2和9中任意一項所述的重組II型單純皰疹病毒載體。
11.一種藥物組合物，所述組合物包括權利要求1-2和9中任意一項所述的重組II型 單純皰疹病毒載體和/或權利要求10所述的重組病毒，以及藥物可接受的載體或賦形劑。
12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液 包括藥學上可接受的載體以及權利要求1-2和9中任意一項所述的重組II型單純皰疹病 毒載體和/或權利要求10所述的重組病毒，每毫升所述注射液中含有IO2-IOki病毒噬斑形 成單位的所述病毒和/或重組病毒。
13.根據權利要求12所述的藥物組合物，其中，所述藥學上可接受的載體為PH值為 4. 0-9. 0的磷酸緩沖液。
14.根據權利要求12所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護劑和/或滲透 壓調節劑；以所述注射液為基準，所述保護劑的含量為0. 01-30重量％，所述保護劑選自 肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓為 200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
15.根權利要求1-2和9中任意一項所述的重組II型單純皰疹病毒載體和權利要求 10所述的重組病毒在制備治療腫瘤的基因藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體，其剔除了野生Ⅱ型單純皰疹病毒HG52株的ICP34.5基因和ICP47基因，優選在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了hGM-CSF表達盒。本發明還提供了前述重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體的制備方法，以該重組Ⅱ型單純皰疹病毒為載體的重組病毒，由該重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體和藥物可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物，以及所述的重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體在制備治療腫瘤的基因藥物中的應用。本發明提供的重組Ⅱ型單純皰疹病毒載體，剔除了ICP34.5的基因，使溶瘤病毒更安全且能選擇性地在腫瘤細胞內生長繁殖；剔除ICP47基因以促進免疫應答及增強溶瘤活性；療效好于現有重組Ⅰ型單純皰疹病毒載體且安全性高。
文檔編號A61P35/00GK102146418SQ20101011627
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者劉濱磊 申請人:武漢濱會生物科技有限公司