專利名稱：一種新的脂質體制備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，確切地說它是一種新的脂質體(liposomes)(包括類脂體，niosomes)制備方法。
背景技術：
脂質體是由磷脂雙分子層形成的閉合囊泡狀結構。脂質體根據其結構的不同可以分為單層脂質體(unilamellar yesicles)、多層脂質體(multilamellar yesicles)和多囊脂質體(multivesicular liposomes)。脂質體由英國人Alec D. Bangham在1965年首先發現。此后，人們發現脂質體作為物質載體，尤其是藥物載體，有著巨大的應用價值，于是便對脂質體進行了系統而廣泛的研究。經過了二十多年的探索，科研人員已經提出了許多很有價值的脂質體制備方法。 目前脂質體主要通過分散技術(dispersion technique)制備，其方法可分為三大類1)以機械分散技術為基礎。如薄膜分散法(film dispersion)，即將用于形成脂質體的磷脂溶于有機溶媒中——通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在減壓的條件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。將磷脂膜水化即可形成多層脂質體(multilamellar vesicles) 0該方法雖是最經典、應用最廣的方法，但是卻存在一些缺點。例如使用毒性很大的有機溶媒；無法實現工業化生產；當用含藥水溶液水化時，形成的多層脂質體(multilamellar vesicles) 層與層之間藥物分布不均一，必須通過反復凍融處理等。2)以表面活性劑分散技術為基礎。如去左污劑透析法，但難以工業化生產，且不適合包封水溶性藥物。幻以溶劑或共溶劑(cosolvent)分散技術為基礎。例如，逆相蒸發法(reverse evaporation vesicles, REV)，此種制備方法對水溶性藥物的包封率及載藥量相對較高；而乳劑法制備多囊脂質體 (multivesicular liposome)目前可以實現大規模生產(skyepharma StJ depofoam 技術平臺)，但是僅限于制備微米級具有緩釋功能的多囊脂質體；乙醇注入法(ethanol injection)，已經實現大規模生產(請參見alza公司的技術和polymun的crossflow技術)，可采用被動載藥法制備脂質體，但包封率較低，且需要在較高溫度下制備(60°C左右)，通常會引起易氧化、易水解和易變性的藥物失去活性，而采用主動載藥法制備脂質體， 包封率雖有所提高，但不適用于對酸堿敏感的藥物，同時也容易引起磷脂分解變性。而概括起來，目前脂質體制備方法主要存在如下缺陷1.制劑的穩定性問題。通過已有方法得到的脂質體制劑通常為液體制劑，往往不夠穩定，主要表現在如下三個方面(1)脂質體屬于熱力學不穩定分散系。脂質體混懸于水相時，常常會出現聚集、融合等現象，導致粒徑變大，嚴重的還有可能出現分層。(2)磷脂存在于水相時，通常容易出現水解、氧化等現象。由于磷脂水解后會形成溶血磷脂，一方面增加制劑的毒性，另一方面也容易使脂質體解體，造成被包封藥物的滲漏。(3)脂質體混懸在水相中，在儲存過程中，藥物可能會滲漏，導致藥物包封率改變，從而影響制劑療效。如果藥物本身容易水解，制劑的穩定性問題更顯突出。2.包封率問題。通過已有方法得到的脂質體制劑，水溶性藥物包封率往往較低。 包封率低不但會造成原料浪費，還可能達不到有效劑量，不能夠體現脂質體制劑的優勢。目前常用主動載藥法(remote loading)來提高水溶性藥物包封率。但無論是pH梯度還是硫酸銨梯度主動載藥法，均需要在脂質體膜內外提供較大差別的PH環境，不僅不適用于對酸堿敏感的藥物，也容易引起磷脂分解變性。此外，主動載藥法僅適用于可解離的藥物，應用范圍相對有限。3.脂質體制劑滅菌問題。由于磷脂本身的性質，一般不能夠對最終的制劑加熱滅菌，這樣就要求整個生產過程必須采用無菌操作。這對某些脂質體制備工藝來說可能無法實現。4.脂質體的粒徑控制問題。獲得小粒徑脂質體(小于200nm)通常有利于靜脈給藥。這是因為(1)大粒徑的脂質體很容易被體內的單核巨噬系統所吞噬，從而被迅速清除。(2)小粒徑的脂質體可以被動靶向腫瘤組織和缺血心肌。為了獲得小粒徑脂質體， 通常需要對已得到的脂質體進行超聲、研磨或擠出。這往往又會導致藥物進一步滲漏，影響制劑質量。5.藥物釋放問題一些藥物(如拓撲替康等喜樹堿類藥物)包封入脂質體后釋放過快，無法達到藥物的病灶濃集作用；而一些藥物(如鉬類制劑)包封入脂質體后釋放過慢，脂質體達到病灶部位后卻由于釋藥過慢而無法達到有效治療濃度。為了能夠解決上述問題，我們發明了新的脂質體制備方法。
發明內容
為了克服上述脂質體制備技術的不足，我們發明了一種新的脂質體制備方法。通過此方法，可以解決目前脂質體制劑所面臨的一些難題。我們將該方法稱為乳化-凍干法 (emulsification-lyophilization)。該制備方法包括以下步驟a、將用于形成脂質體的脂類物質、凍干品支撐劑和待包封的親脂性物質溶于有機溶劑形成油相(0)，將待包封的親水性物質和凍干保護劑溶于水形成內水相(W)，將油相 (0)、內水相(W)按合適的比例混合并乳化得到W/0型乳劑；b、將得到的W/0型乳劑冷凍干燥除去溶媒；C、將得到的凍干產物水化得到脂質體。下面我們將就該技術的具體操作和優勢進行詳細描述。步驟a優選的有機溶媒為環己烷或環己烷一氯仿混合溶液，用于形成脂質體的脂類物質主要包括磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)和調節磷脂膜性質的膽固醇(cholesterol)；具有類似磷脂性質的兩性物質司盤(Span)可用于形成類脂體 (niosomes)。此外，為了提高特包封物質的包封率、減小脂質體粒徑、增加脂質體穩定性，可加入適量的荷電脂類物質在包封荷負電物質時，可加入荷正電的脂類物質，如1，2_ 二酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰膽堿等。在包封荷正電的水溶性藥物時，可加入荷負電的脂類物質，如磷脂酰甘油和磷脂酰絲氨酸等。為了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化劑如vitamin E等。本發明的成功實施，要求步驟a中必須得到穩定的W/0型乳劑。ff/Ο型乳劑指的是澄明、半透明或乳白色均一穩定乳劑。如果環己烷溶液和水溶液的比例不合適，則乳劑不穩定，分層沉淀，可能會出現相反0/W型乳劑，無法使待包封物質包封于內水相，從而導致形成的脂質體包封率大大下降。
步驟b優選的去除溶媒的方法為冷凍干燥法，ff/Ο乳劑可以先置于液氮或低溫度裝置中迅速凍結，然后在凍干機中凍干。步驟c為水化凍干產物以形成脂質體，可采用內水相相同溶液或合適的緩沖液在適宜的溫度下完成，為加速水化，也可在機械力的作用下完成，如可以進行攪拌或振蕩等。為了得到無菌制劑，可將步驟a中得到的W/0乳劑(包括微乳、反膠束)可以濾過除菌(但并非所有W/0乳劑都可以濾過除菌，如果粒徑大于200納米則難以濾過除菌)，其它步驟在無菌條件下完成。實施本發明的時候，通過步驟a得到的W/0型乳劑，內水相(W)中可加入水溶性凍干保護劑，如海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等物質，外油相中可加入油、水兩溶性支撐劑(如 PEG1000，PEGl500，PEG2000，PEG3000，PVP等)。這些物質，有如下幾個作用1、可以作為凍干保護劑，確保形成的脂質體具有合適的粒徑及較高的包封率；2、使得到的凍干產物穩定， 可以長期儲存，臨用前再進行水化形成脂質體；3、顯著加快凍干產物的水化速度，使凍干產物可以立即水化形成脂質體；4、使凍干產物具有良好的形態。本發明中提到的待包封物質，可以是各種藥物藥物也可以是其它物質。若為水溶性藥物，則將藥物、凍干保護劑溶于內水相(W)，脂類物質、支撐劑溶于有機相，通過乳化法得到W/0型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯存，臨用前水化形成脂質體制劑。為了改變藥物釋放速率可以加入能夠與藥物形成不同晶型沉淀或絡合物的不同物質(如拓撲替康(topotecan)與硫酸根(S042_)形成沉淀，與銅離子(Cu2+)、鎳離子(Ni2+)形成絡合物等)以制備控釋脂質體。待包封物質若為脂溶性藥物，則與脂類物質、支撐劑溶于有機相，凍干保護劑溶于內水相，通過乳化法得到W/0型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯存，臨用前水化形成脂質體制劑。本發明也可以采用主動載藥法，待包封物質可以為硫酸銨、醋酸鈉等物質。例如， 采用硫酸銨梯度法進行主動載藥時，可以將硫酸銨溶于內水相，凍干保護劑溶于內水相，月旨類物質(及支撐劑)溶于有機相，通過乳化法得到W/0型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯存，待到使用時，加水水化形成包封硫酸銨的脂質體，之后加入藥物，即實現主動載藥過程。采用PH梯度法進行主動載藥時，可以將檸檬酸溶于內水相，凍干保護劑溶于內水相，脂類物質溶于有機相，通過乳化法得到W/0型乳劑后凍干。得到的凍干產物可長期貯存，臨用前先加入水水化形成包封檸檬酸的脂質體，之后加入生物堿類藥物，孵育得到含藥脂質體，實現主動載藥過程。從上述步驟中我們可以看出，我們發明的制備工藝具有如下優點1.該制備工藝適用于大規模生產。脂質體工業化生產必須解決幾個問題，例如 滅菌、除熱源、生產工藝簡單便于放大，保證脂質體在儲藏期內穩定等。我們發明的制備工藝可以解決上述問題1)可以將a步驟得到的W/0型乳劑過濾滅菌(粒徑小于200納米的乳劑)，其他步驟采用無菌操作，得到無菌制劑；2)工藝相對簡單，只需乳化設備及凍干設備，均為常用設備，比較容易放大；3)為了保證脂質體在儲藏期內穩定，可以將凍干物在使用前水化形成脂質體，實驗表明得到的凍干物可以長期儲存，使用時水化立即形成脂質體。2.本制備方法的顯著特點是可以明顯提高水溶性藥物包封率。由于水溶性藥物始終包含于乳劑內水相、有序磷脂內部、形成的脂質體內部，因此有較高包封率。3.易于制備控釋脂質體。將能夠與藥物形成穩定晶型沉淀或絡合物等的物質與藥物共同包封于脂質體，可以有效控制藥物釋放速度。4.本發明可以有效地控制脂質體粒徑。如前所述，通過調整凍干保護劑、支撐劑、 脂類物質的比例及乳化過程等條件，可以有效地控制脂質體的粒徑。由于可以得到粒度均一的小粒徑脂質體，增加了本發明的應用價值。5.該制備工藝可以充分保證某些敏感藥物的活性。由于制備工藝在低溫下完成， 這樣就避免了藥物的水解和氧化。水溶性藥物在W/0型乳劑中僅存在于內水相，且存在的時間很短，可以避免有機溶媒使藥物的變性失活。脂溶性藥物在W/0型乳劑中雖存在于油相，但有機溶媒對于脂溶性藥物一般無變性失活作用。6.可以徹底除去殘留溶媒也是本發明的一個優點。由于凍干機的真空度很低(可小于IOpa)，所以得到的凍干產物中檢查不出溶媒殘留。簡而言之，本發明不同于傳統的脂質體制備工藝(如REV)，其實質是通過凍干的手段去除W/0型乳劑中的溶媒并得到凍干產物，再水化形成脂質體，從而具備了上述顯著優勢。通過下列實施實例舉例說明本發明的具體制備方法，但本發明的保護范圍，不局限于此。
具體實施例方式實施例1 支撐劑及凍干保護劑蔗糖對凍干特性的影響將以5%蔗糖水溶液為內水相，支撐劑1%PEG1500、1%大豆卵磷脂溶于乙醚一氯仿一環己烷(1 1 4，ν/ν/ν)溶液為油相，內水相與油相按1 3體積比混合，通過探頭超聲(80w，30s)乳化，得到W/0型乳劑，分裝Iml/瓶，置入-80低溫冰箱冷凍后，轉入冷凍干燥機凍干，發現支撐劑PEG2000、凍干保護劑蔗糖加入明顯改善凍干產物的形態，加快水化速率，并且得到的水化產物為粒徑小于200 納米的脂質體。凍干品儲存1年以上仍可以形成脂質體。實施例2 脂質成分對脂質體粒徑的影響將以5%乳糖水溶液為內水相，2% PEG2000溶于氯仿一乙醚(1 1，ν/ν)油相，通過渦旋振蕩(2000rpm, 3min)乳化，得到W/0型乳劑后， 分裝Iml/瓶，置入充滿液氮的液氮灌冷凍后，轉入凍干機凍干，凍干產物中脂質成分為PC， PC/CH0L(4 1，質量比)，PC/PS(9 1，質量比)，加入5%蔗糖水溶液后形成磷脂濃度均為 1 %的脂質體，用LS230 (Beckmann公司)測定粒徑，脂質體的平均粒徑分別為176nm，158nm, 123nm(number mean diameter)。這說脂質成分對于脂質體粒徑有一定的影響。實施例3
用透射電子顯微鏡觀察實施例1和2中得到的脂質體。采用負染法進行觀察。即將脂質體用的磷鎢酸(PH= 7)染色。在電子顯微鏡下發現脂質體為單層或寡層、近球形囊泡，大小與用粒度儀測定的結果相吻合。實施例4
鈣黃綠素脂質體的制備將3ml含0. 5%大豆卵磷脂、0. 5% PEG3000的乙醚一環己烷(1 4, ν/ν)溶液與Iml含10%海藻糖的0. ImM鈣黃綠素水溶液混合，以高速混勻器乳化(26000rpm，lmin)，得到W/0型乳劑，分裝Iml/瓶，置入-80低溫冰箱冷凍后，轉入冷凍干燥機凍干。用Iml 10%蔗糖溶液水化凍干品，用LS32 (Beckmarm公司)測定粒徑，脂質體的平均粒徑為102nm(number mean diameter)。用熒光猝滅法測包封率，為75. 1%。實施例5 本實施例是將非甾體抗炎藥物Flurbiprofen制成脂質體。將3ml含 Flurbiprofen (ImM)、1 % SPC、1 % PVP (聚乙烯吡咯烷酮)的環己烷溶液與Iml含2. 5 %葡萄糖、2. 5%甘露醇水溶液混合，水浴超聲乳化(21kHz，120w,2min)得到W/0型乳劑，分裝Iml/ 瓶，置入-80低溫冰箱冷凍后，轉入冷凍干燥機凍干。每瓶凍干品用Iml 5%蔗糖水溶液水化,用LS230(LS32version 3. 19 software，Beckmann公司)測定粒徑。脂質體的平均粒徑為122nm(number meandiameter) 0用微柱離心分離法分離脂質體和游離藥物，測得包封率為 91. 2%。實施例6:本實施例是制備具有控釋特性的拓撲替康脂質體。將3ml含2% SPC,2% PEG1500 的環己燒一氯仿(3 1，ν/ν)溶液與Iml 5%蔗糖水溶液(不同處方分別含有300mM枸櫞酸鈉、300mM Na2SO4,300mM CuSO4)混合后高壓乳勻機乳化(200psi，3 cycles)，得到W/0型乳劑，分裝Iml/瓶，置入-80低溫冰箱冷凍后，轉入冷凍干燥機凍干。凍干品用5%蔗糖水溶液水化，得到小粒徑脂質體，測得包封率為60%-70%,含有300mM枸櫞酸鈉脂質體釋藥速率約為含300mM CuSO4脂質體的3倍，為300mM Na2SO4脂質體的2倍。實施例7 本實施例是將乳化一凍干法與主動載藥法結合制備拓撲替康脂質體。將3ml含 2% SPC,4% PEG2000乙醚一環己烷(1 4，ν/ν)溶液與Iml 5%蔗糖水溶液(含硫酸銨)混合，混勻器乳化(6000rpm，3min)，得到W/0型乳劑，分裝Iml/瓶，置入充滿液氮的液氮灌冷凍后，轉入凍干機凍干，凍干品用5%蔗糖水溶液水化，得到小粒徑脂質體，用G-50 SEPHADEX葡聚糖凝膠柱分離去除游離硫酸銨，加入拓撲替康(藥物/磷脂=1 4)，在 40-50°C保溫10分鐘，得到包封拓撲替康的脂質體，測得包封率為99. 7%。實施例8 本實施例是將乳化一凍干法制備5-FU類脂體(niosomes)。將3ml含2% SPAN60、 4%PEG2000的乙醚一環己烷(1 l，v/v)溶液與Iml 5%葡萄糖水溶液(含5mg/ml 5-FU) 混合，混勻器乳化(6000rpm，3min)，得到W/0型乳劑，分裝Iml/瓶，置入_80°C低溫冰箱冷凍后，轉入凍干機凍干。凍干品用5%蔗糖水溶液水化，得到粒徑為230納米的類脂體，測得包封率為25. 7%。
權利要求
1.一種新的脂質體制備方法，其特征在于a、將用于形成脂質體的脂類物質和待包封的親脂性物質溶于有機溶劑形成油相(0)， 將待包封的親水性物質溶于水形成內水相(W)，將油相(0)、內水相(W)按合適的比例混合并乳化得到W/0型乳劑(包括微乳、反膠束)；b、將得到的W/0型乳劑冷凍干燥除去溶媒得到凍干產物；c、將得到的凍干產物水化得到脂質體。
2.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步驟a中的有機溶劑指環己烷、氯仿、乙醚等與水不混溶易揮發除去的有機溶劑，或其混合物，優選與水凝固點接近的有機溶劑。
3.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步驟a中的乳化 (emulsification)指的是攪拌，或振蕩，或渦旋振蕩，或勻乳，或高壓勻乳，或超聲等機械做功操作，或為攪拌、渦旋振蕩、勻乳、高壓勻乳、超聲等組合操作，或為處方成分自動乳化，等等。
4.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步驟a中用于形成脂質體的脂類物質主要為磷脂(phospholipid)，如磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine， PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，ΡΕ)或聚乙二醇修飾磷脂酰乙醇胺(PEGylatedPE)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰甘油 (Phosphatidylglycerol,PG)等，以及調節磷脂膜性質的膽固醇(cholesterol)；也可以為具有磷脂類似性質的其它兩性物質(如司盤類等，以形成類脂質體，niosomes)；以及不同脂類適當配比的混合物；為了提高待包封物質的包封率、減小脂質體粒徑及增加穩定性，可加入適量的荷電脂類物質在包封負電荷物質時，可加入荷正電的脂類物質，在包封正電荷物質時，可加入荷負電的脂類物質；為了提高脂質體在體內外穩定性可以加入親水性高分子修飾磷脂，如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；為了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化劑。
5.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步驟a中待包封的物質可以為藥物，也可以為其它物質，如核酸，DNA等。
6.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于為了使凍干產品易于水化及改善凍干品外形，可以在油相中加入能夠同時溶于有機溶劑及水的支撐劑(supportagents)，如聚乙二醇類(polyethylene glycol, PEG，如 PEG1000，PEG1500, PEG2000，PEG3000，等溶于鹵代烴，水)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP易溶解于水，醇，胺以及鹵代烴中)。
7.根據權利要求1所述的一種脂質體制備新方法，其特征在于在步驟a內水相(W)中可加入適當的凍干保護劑(cryoprotectant)，包括二糖(disaccharide)，如海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)等，或單糖 (monosaccharide),如葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose),或其它寡聚糖(oligosaccharide)，如三糖(trisaccharide)、四糖(tetrose)、五糖等，或甘露醇 (mannitol)等具有凍干保護等作用的物質；或者為幾種凍干保護劑的混合物；為了改變藥物釋放速率可以加入能夠與藥物形成不同晶型沉淀或絡合物的不同物質(如拓撲替康 (topotecan)與硫酸根(S042_)形成沉淀，與銅離子(Cu2+)、鎳離子(Ni2+)形成絡合物等)以制備控釋脂質體。
8.根據權利要求1所述的一種脂質體制備新方法，其特征在于為了得到無菌制劑，可將步驟a中得到的W/0型乳劑(粒徑小于200納米，包括微乳、反膠束)過濾滅菌，其它步驟在無菌條件下完成。
9.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其特征在于步驟b中W/0型乳劑可以在液氮或低溫裝置凍結，然后在凍干機中凍干；也可以直接在凍干機中凍干。
10.根據權利要求1所述的一種新的脂質體制備方法，其待征在于步驟C為水化凍干產物以形成脂質體，可采用水或合適的緩沖液在適當的溫度下完成，為加速水化，也可在機械力的作用下完成，如可以進行攪拌或振蕩等；如采用被動載藥法時，水化時可以采用水或合適的緩沖液；如采用硫酸銨或醋酸鈉或醋酸鈣梯度法主動載藥時，可以用水水化形成脂質體后，加入待包封的藥物孵育形成含藥脂質體；如采用PH梯度法主動載藥時，用水水化形成脂質體后，再加入藥物孵育得到含藥脂質體。
全文摘要
本發明是一種新的脂質體制備方法，它解決了易氧化、易水解和易變性的藥物制備成脂質體過程中出現的一些難題，并且對于各類藥物均具有較高包封率。制備工藝過程包括如下步驟a、將用于形成脂質體的脂類物質、親脂性物質溶于有機溶劑形成油相溶液(O)；b、將待包封的水溶性物質溶于水中形成水相溶液(W)；c、將上述兩種溶液按合適的比例混合并乳化得到W/O型乳劑(包括微乳、反膠束)；d、將得到的W/O型乳劑冷凍干燥除去溶媒，得到凍干產物；e、將得到的凍干產物水化，即得到脂質體。本工藝過程簡單，容易實施。
文檔編號A61K47/24GK102151246SQ20101011220
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月11日 優先權日2010年2月11日
發明者周亞球, 王汀 申請人:周亞球, 王汀