專利名稱：真菌免疫調節蛋白之用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及真菌免疫調節蛋白使用于降低血糖的用途。
背景技術：
靈芝屬植物(Genus Ganoderma)是稀有且珍貴的中藥材，在中國泛稱為〃靈芝〃 已經使用5000年，目前使用中的靈芝包括G. lucidum(紅色)、G. applanatum(棕色)、 G. tsugae (紅褐色)、G. sinense (黑色)及 G. oregonense (深棕色)。靈芝有抗過敏(ChenH. Y et al.，J. Med. Mycol. 1992 ；33 :505_512)、保肝(Lin J. M. et al.，Am J Chin Med. 1993 ；21(1) :59_69)、抗癌(ffasser SP, CritRev Immunol 1999. 19 65-96)與增加免疫力等功能(Kino, J Biol. Chem. 1989. 264(1) :472_8)。然而， 靈芝在利用上，都以直接萃取(Horner ff. E. etal.，Allergy 1993 ；48 :110_116)或是利用 萃取之小分子(Kawagishi H.，et al.，Phytochemistry 1993 ；32 :239_241)的方式為之。由可食菌類(例如靈芝 Ganoderma Lucidium，草 Volvariella Volvacea，金針 菇Flammulina Velutipes)分離出具有免疫調節功能的蛋白質，有相似的氨基酸序列，這些 蛋白質被命名為真菌免疫調節蛋白(FIPs，Fungal Immunomodulatory Proteins, Ko J. L.， Eur.J.Biochem. 1995；228 :224_249)。Lin與其同仁由松杉靈芝(Ganoderma tsugae)菌絲中純化出命名為FlP-gts之免 疫調節蛋白(Lin,ff. H.，et al.，J Biol Chem. 1997.272，20044-20048)；實驗發現，只有從 松杉靈芝菌絲體中純化的FlP-gts有免疫調節之功效，松杉靈芝子實體純化的FlP-gts則 無；選殖FlP-gts基因后發現其脫氧核醣核酸序列(DNA sequence)與靈芝中發現的LZ_8 一樣，同時因此二分子皆具有免疫調節功效，顯示為同一蛋白質。以Garnier分析法預測FlP-gts之二級結構發現，此蛋白有兩個a -螺旋，七個 折片與一個轉折，以SDS-PAGE分析，此分子之分子量為13kDa，以20yM戊二醛
(glutaraldehyde)進對亍蛋白質與蛋白質|、司的結合方式(protein-protein conjugates)分 析，FlP-gts為兩個相同亞基所組成的雙聚體結構(homo dimer)，分子量為26kDa。此夕卜，以芽細胞形成活性分析(Blast-formation stimulatory activity assay, BFSA)發現三個真菌蛋白具有活性，除了由靈芝發現的蛋白外，由金針菇(Flammulina velutipes)與草菇(Volvariella volvacea)中發現的凝血蛋白都具有部分免疫調節功 能(Hsu, C. -I. , Study on the Fungal ImmunomodulatoryProteins. 1996. Department of Medical Technology,College of medicine. NTU，Taipei)。這些蛋白之分子量都差不多是 13kDa而且其凝血功能并不是通過組氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸三種氨基酸所造成，它們屬 于與碳水化合物(carbohydrates)連結的凝集素(Lectin)。
自然殺手細胞是另一種致死淋巴球，就如同細胞毒性T細胞，他們皆包含充滿有 毒化學物質的顆粒，他們之所以被稱為"自然"殺手細胞是因為不像細胞毒性T細胞，他 們在展開攻擊前，不需要去辨識一個特異的抗原。他們以腫瘤細胞作為目標，并保護正常細 胞對抗很多種類之具感染力的細菌或微生物，在許多免疫缺失的疾病中，包括艾滋病，自然 殺手細胞的功能是異常的。自然殺手細胞亦可能通過分泌高濃度、具有影響力的淋巴因子， 促進免疫調節。細胞毒性T細胞及自然殺手細胞都靠接觸時進行目標消滅。殺手細胞結合到它的 目標，以它的武器瞄準，隨后傳遞將可產生致死爆裂的化學物質使目標細胞膜產生破洞，使 得液體流進流出，最后導致細胞爆裂。直到最近，免疫抗癌的治療方法仍存在著三種形式手術、化學治療或放射性治 療。然而，在所有這些形式中，會導致經常性及有害的副作用。因此，這三種治療方式對癌 癥病人言，并不是最佳的治療方式，特別是那些癌癥末期的病患。例如，化療及放射性治療 的劑量過度，常會導致傷害并縮短生命。最近幾年，一個第四種抗癌的免疫治療方法開始流行。這第四種方法可實際加強 每個病人體內的天然抗癌免疫力。此第四種方法使用的是自身體內的自然殺手(natural killer,NK)細胞，它是身體內最強、最有效的免疫細胞，比殺手T細胞要強約5萬倍。NK免 疫治療法無疑地在未來會變得越來越流行。自然殺手細胞是先天免疫系統的重要成份，監視并對抗特定病毒、細胞內細菌及 轉型細胞(Trinchieri G. Adv Immunol 1989 ；47 187-376 ；FrenchAR, Yokoyama WM. Curr Op in Immunol 2003 ；15 :45_51 ； Smyth MJ et al.，Nat Immunol 2001 ；2 :293_299)。自然 殺手細胞運用細胞媒介的毒性作用通過不同細胞激素(例如IFNg、GM-CSF及TNF-h)及化 學激素(例如MlP-lfamily及RANTES)的釋放，而做為先天及后天免疫反應的橋梁(Biron CA. Curr Op in Immunol 1997 ；9 24~34. ；Biron CA et al. ， Annu Rev Immunol 1999 ；17 189-220)。一來不像T細胞，自然殺手細胞殺死病毒感染或惡性轉型細胞，不需要事先活 化，并且也不受MHC的限制。因此自然殺手細胞被認為惡性腫瘤，特別是位于造血起源的 惡性腫瘤，實行轉移治療時，最可能的治療方法(Robertson MJ, Ritz J. Blood 1990 ；76 2421-38)。失去或表現變化的第1類MHC抗原的腫瘤細胞，可以逃離細胞毒性⑶8+T細胞 的檢測。但他們很可能輕易的被自然殺手細胞消滅。然而，惡性腫瘤細胞經常會發展對抗 宿主免疫監視系統的策略，包括抑制第1類MHC細胞來避開免疫檢測、增加Fas-L的表達 來殺死反應性淋巴細胞，以及產生抑制性的激素如TGF-h(GarCia-L0ra A et al. , J Cell Physiol 2003;195:346-55. ；Kim R et al.，Cancer 2004;100:2281-91.)。所以，移動 的自然殺手細胞對增加宿主限制惡性腫瘤發展的能力是重要的，尤其當后天免疫系統處于 “無反應性”(anergy)及“耐受”(tolerance)的狀態時。在腫瘤發展上，巨噬細胞及嗜中性細胞皆能同時視為英雄及惡棍。這些細胞 皆能對腫瘤細胞進行吞噬作用及依賴抗體的細胞毒性(ant ibody-cbpendent ce 11 u 1 ar cytotoxicity, ADCC)以及腫瘤生長抑制細胞激素的分泌(Marek Jakobisiak et al.， Immunology Letters December 15,2003pp : 103-122)。最近，草藥治療已越發被認為是對付惡性腫瘤的另一種可行的療法(Risberg T et al. , J Clin Oncol 1998 ；16(1) :6_12.)。在這些治療方法中，藥用蘑菇在全世界民俗醫學中有悠久的歷史。在亞洲，靈芝(Ganoderma tsugae, G. tsugae)，一種擔子菌綱蘑菇， 是最受歡迎的化學防癌用的蘑菇之一。很多生物活性的組成部分已經從這個蘑菇的不同的 部分鑒定出來，包括子實體，菌絲，孢子和培養基。G. lucidum的兩個主要的生物活性成分是多糖體和三帖類(triterpenes)。其 多糖體具有在試管內和在活體內的抗癌效應，這是通過一個免疫調節的機制(Wang SY et al. Int J Cancer 1997 ；70 (6) :699_705.)。一些研究人員表示三帖類一般擁有抗氧化作 用(Zhu M, Chang Q, et al.，Phytother Res 1999 ；13(6) :529_531.)、保肝作用以及抗高 血壓的生物活性(Kim DH et al.，Biol Pharm Bull 1999 ；22(2) 162-164.) 最近，有研 究報告指出靈芝Ganoderma spp.具有預防腫瘤的細胞毒性之活性。一種靈芝Ganoderma tsugae的三帖類，在人類肝癌細胞H印3B中，被發現會引起細胞凋亡和使細胞循環中止，但 是分子機制尚未經調查(Gan KH et al.，JNat Prod 1998 ；61 (4) :485_487.)。端粒酶是一種反轉錄酶，在細胞內催化端粒DNA的合成及延長(Greider Cff, et al. , Nature 1989 ；337 (6205) =331-337) 這個酶在大多數的惡性腫瘤里會專一的被活化， 但是在正常體細胞里經常是不活化的，因此在正常細胞的細胞分裂期間，端粒會逐漸的縮 短(Kim NW,et al.，Science 1994 ；266(5193) :2011_2015.)。細胞需要一個機制維持端粒 穩定性來克服因復制所導致的衰老。端粒酶的活性可能因此成為細胞不朽或致癌生成的速 率決定步驟或關鍵步驟，且超過90%活體內的人類癌細胞表達出端粒酶活性(Harley CB， et al.，Curr Op in Genet Dev 1995 ；5 (2) =249-255.) 做為核醣核蛋白的復合體，端粒酶 在人體內由兩個主要的亞單位組成。這些是RNA的模板及反轉錄酶亞單位，分別由hTR及 hTERT基因編碼。值得注意的是，沒有端粒酶活性的肺癌病患，比有端粒酶活性的，活在明顯 較佳的預后狀態(Wu TC，et al. , Lung Cancer 2003 ；41 (2) :163_169.)。這顯示對肺癌患 者言，端粒酶的活性是重要的預后因子。
發明內容
除非特別定義，所有的技術與科學名詞與現有認知與公知技術相同。雖然本發明 的材料與方法與公知技術類似或相同，然而以下將詳述或測試本發明的較佳方法與材料。 以下將定義本發明中使用之專有名詞。本發明提供一個真菌免疫調節蛋白用來進行免疫治療的用途，該蛋白質內含氨基 酸序列 SEQ ID No 1 MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVES DGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No 3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPS GGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。本發明之真菌免疫調節蛋白可從 Ganoderma species, Volvariellavolvacea 或重組微生物中獲得(例如重組大腸桿菌或酵母菌)。較佳的Ganoderma species實施例為 Ganoderma tsugae。本發明之真菌免疫調節蛋白的用途能用來做為緩和癌癥病患的疼痛或副作用的輔佐物。本發明之真菌免疫調節蛋白的用途能用刺激或活化免疫功能。因此，本發明之免疫功能是由挑選自下列群組之機制所造成，此群組是由自然殺 手細胞之活化、巨噬細胞之活化以及血清抗體之增殖所組成。而本發明較佳具體化之功能 是通過自然殺手細胞之活化以及端粒酶之抑制所造成。本發明之真菌免疫調節蛋白可以拿來設計成下列劑型，其中包括口服溶液、口服 膠囊、口服藥片或是口服藥丸，是以口服方式服用。本發明發現FlP-gts的互補脫氧核醣核酸(cDNA)序列與LZ-8完全相同(SEQ ID NO :1)，并且有抗癌作用。本發明同時披露以FlP-gts處理的癌細胞會降低細胞活性，顯示 FlP-gts可當成抗癌藥物。本發明并且發現以FlP-gts處理的癌細胞會降低基質金屬蛋白酶-2(MMP_2， metalloproteinases-2)之表達，MMP-2是肺癌細胞轉移(metastasis)有關的重要酶。 MMP-2的抑制是抑制腫瘤細胞轉移的前兆。名詞“免疫調節”不限于刺激或活化免疫功能(例如活化自然殺手細胞及巨噬細 胞或增加血清里IgG或IgM抗體的生成)，或治療或預防因轉移而成的癌癥，或通過抑制端 粒酶催化亞單位來壓抑端粒酶活性的癌癥。真菌免疫調節蛋白所能治療的癌癥是選自下列群組，包含肺癌、骨癌、乳癌、肝癌、 非小細胞肺癌、卵巢癌及腸胃道癌。在其它的實施例中，依據本發明的FlP-gts能融合至一個抗腫瘤藥劑或一個檢測 標簽。如此可允許FlP-gts導向藥劑或檢測卷標到腫瘤細胞，并因此能做到腫瘤的傷害/ 摧毀或檢測。因此，FlP-gts適合用于利用化療或外科手術進行的人類或動物身體的治療 方法(例如，放射免疫引導之外科方法，RIGS)，或實施在人類或動物身體的治療方法。特別 的是，FlP-gts適合用于腫瘤的外科手術或治療，或腫瘤的診斷等方面的治療。連結FlP-gts的抗腫瘤藥劑可以是任何破壞或傷害FlP-gts已經結合的腫瘤，或 在FlP-gts已經結合的細胞環境。例如，抗腫瘤藥劑可以是具毒性的化療藥劑或放射性同 位素、可以活化前驅藥或細胞激素的酶。已為在所屬技術領域的技術人員所知之適當的化療藥劑，包括anthracycline (例 如 daunomycin 及 doxorubicin)、 vindesine、 neocarzinostatin、 cis-platinum、 chlorambucil、 cytosine arabinoside、5_fluorouridine、 melphalan、 ricin 及 calicheamicin0適當的放射性同位素被用來做為抗病毒藥劑已為在所屬技術領域的技術人員所 知。接上FlP-gts的抗腫瘤藥劑可能也是活化前驅藥的酶。這會使得失活的前驅藥活 化，在指引的部位形成細胞毒性的形式。在臨床的運用上，FlP-gts-酶的給合體注射入病 患體內，可聚積在目標腫瘤的區域。被注射入體內的前驅藥因此轉變成具細胞毒性的藥物， 在區域性酶的影響下，聚積在目標腫瘤的區域。因此，本發明也提供一個用于免疫治療的方法，其成份為注射入病患體內，達有效 劑量的本發明之片段或各種多肽。基于本發明之FlP-gts含有可用來做RIGS以及診斷的檢測標簽。RIGS包含注射一個標定的蛋白質進入病患體內，之后以外科手術移除任何該蛋白質所結合之組織。因此， 貼上標簽之FlP-gts可引導外科醫師找到組織。此接合FlP-gts的檢測標簽可能是一個成像的藥劑，用來做出圖像的諸如半衰期 短的放射性同位素，例如mn、125I或"mTc。目前，端粒酶抑制的研究聚焦于(1)直接導向核心端粒酶的組成物(Hahn WC et al, . Nat Med 1999 ；5(10) :1164_1170) ； (2)端粒導向(Zhang RG etal.，Cell Res 2002 ； 12(1) 55-62) ； (3)作為端粒酶抑制物的天然組成及小分子(Naasani I et al.，Biochem Biophys Res Commun 1998 ；249 (2) 391-396)和(4)端粒酶調節機制的干擾(Kawagoe J et al.J Biol Chem2003 ；278 (44) :43363_43372)。所屬技術領域的技術人員可以合理推斷此醫藥組合物之施與對象，可以為脊椎動 物，適當的對象為患癌癥或是有罹癌風險之人類。然而，實施例中之敘述，將含有FlP-gts 之醫藥組合物施用在體外培養的脊椎動物癌癥細胞，并以簡單的細胞侵蝕分析(cellular invasion assay)與傷害/復原分析(heal wounded assay)證實具體有效；這些結果，可 以合理推及治療脊椎動物。可以將包含FlP-gts之用藥組合物以任何公知路徑注入脊椎動物體內，包括通過 靜脈，皮下，腫瘤內，肌肉，穿皮貼片，脊髓內或是顱內等路徑進入體內，施行之方法可以快 速的以注射施行，或是通過浸潤或緩釋劑長期釋放藥效。包含FlP-gts之用藥組合可預期以公知方法調制成適當的醫藥組合物，其中之一 是將其溶在生理食鹽水中，另外也預期可以以適當的載體例如符合生理濃度之無毒鹽溶 液，百分之五的葡萄糖溶液，滅菌水等，都可以配制適當含FlP-gts的醫藥組合物。適當的 緩沖溶液也可以調置成含FlP-gts的醫藥組合物，如果需要，可進一步冷凍干縮于注射瓶 中，等需要用時再以滅菌水還原，并注射。主要的溶劑為水，或是非水溶劑二者擇其一。含FlP-gts的醫藥組合物的載體可包含醫藥允許之賦形劑(excipients)，以調整 適當之酸堿值，含水量，粘稠度，干凈度，色澤，滅菌度，穩定度，溶解速度或是配方之味道。 相同的，此藥學上可接受載體可包含醫藥允許之賦形劑，以調整藥物吸收，與穿過血腦障壁 (blood-brainbarrier)之能力；這些賦形劑是以習慣上制備非腸胃用藥的方式，以單劑， 多重劑量或是以持續或間隔直接浸潤之劑型制備。組成含有FlP-gts醫藥組合物的特定口服配方也是需要深思熟慮的。這些配方最 好與適當的物體結合，包括載劑、賦形劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、芳香劑、緩釋劑 及壓縮成藥錠或包裝成固體形式或軟件形式的膠囊。或可思量將這些配方設計成下列劑 型，如口服液、口服膠囊或口服藥丸。或者除了口服方法外，也可考慮將這些配方設計成灌 腸劑、栓劑、植入物、貼布、乳液或藥膏。一些適當載劑、賦型劑及稀釋劑的例子包括乳糖、 葡萄糖、蔗糖、山梨醇(sorbitol)、甘露蜜醇(marmitol)、淀粉、阿拉伯膠(gum acacia), 磷酸鈣(calcium phosphate)、褐藻膠(alginates)、硅酸鈣(calcium silicate)、微晶 ^fi^M (Microcrystalline cellulose)、胃 2^希口比口^"；^11 (polyvinylpyrrolidone) > 維素(cellulose)、明膠(gelatin)、糖漿(syrup)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥 苯甲酯及羥基安息香酸鹽(methyl-andpropyl-hydroxybenzoates)、滑石粉(talc)、鎂 (magnesium)、硬酯酸(stearate)、水、礦物油與其它適當物質。此配方可以額外加入潤滑 劑、保濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑與香料。此醫藥組合可以依公知技術制備成將
7活性物質FlP-gts制成施行后可以迅速、持久或是緩釋劑型，此配方同時包括可以減少蛋 白質分解、核酸或其它分解的物質，或是可以加速吸收的物質，如接口活性劑。此醫藥組合 物也可以包括與聚乙二醇(PolyethyleneGlycol，PEG)、白蛋白(albumin)或是其它可以增 進FlP-gts在血液中的穩定性的物質。包含FlP-gts之用藥組合可以在脊椎動物中以有效抑制癌細胞生長的劑量施用， 專一的劑量以適當的體重、體表面積或是病人體積估算。此劑量同時依施用方法估算。近 一步的計算用藥劑量可依公知技術者決定，這樣的計算可以由公知方法合理推演。例如，以 明膠-酶譜法分析(gelatin-zymography assay)推算。此劑量同時依熟悉公知之醫師估 算，依個別病人之特性包括年齡、體重、對藥物反應、病人之病況與投藥方法決定。投藥之劑 量可以依據藥物動力學數據、劑型與投藥路徑決定。含有FlP-gts的組合物喂食給BALB/c老鼠，測試其對自然殺手細胞活性、巨噬細 胞活性及血清抗體生成的效應。與不同劑量群組比較，實驗結果證實FlP-gts可促進自然 殺手細胞、巨噬細胞及血清抗體生成的活化。本發明提供一個真菌免疫調節蛋白用來降低病患之血糖之用途，該蛋白質內含氨 基酸序列SEQ ID No 1 MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVES DGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No 3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPS GGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。本發明中，該病患不限第一或二型糖尿病病患，特指針對遭受第二型糖尿病患。下列實施例將進一步說明此發明之具體施行，而非限制此發明之范圍。
圖1是A549細胞以FlP-gts處理過后的形態改變。A549細胞以不同濃度(0、1、 2、4及10ii g/ml)的FlP-gts處理并在不同時間(6、12、24&72hrs)觀察之結果。圖2是人類黑色素瘤細胞株A375在以FlP-gts處理過后的形態改變。細胞以0、 4及16 ii g/ml的FlP-gts處理0、24及48小時，并在以相位差照相機照相(xlOO)。圖3是A549以FlP-gts處理后的細胞生長速度。A549細胞以不同濃度(0、1、2、 4及lOyg/ml)的FlP-gts處理并在48小時后以錐蟲藍染劑染色，估算存活之細胞。數據 以中位數加三重復之標準差(顯著性學生T檢驗，*p < 0. 05)圖4是A549以FlP-gts處理后的細胞群落形成(Colony forming)效應(A)以細 胞群落形成分析不同濃度(0、0. 4、1及2 y g/ml)的FlP-gts處理后，A549細胞在無法固定 的培養基上之生長狀況。(B)細胞群落數量以解剖顯微鏡觀察并計數，每細胞群落最少要有 50顆細胞。數據以中位數加三重復之標準差(顯著性學生T檢驗，*p<0.05)圖5是以FlP-gts處理后A549在不同時間點的細胞周期進程。以10%之DMEM使 細胞再懸浮(A)以流式細胞儀檢測細胞并以Cellquest軟件搜集數據。(B)資料以ModFit LT 3. 0分析。數據以中位數加三重復之標準差(顯著性學生T檢驗，*p < 0. 05)
圖6是A549細胞分別以0、2、4及10iig/ml后的p21及procaspase-3表達。細 胞溶解產物在48小時后及表達時收集，并以Western印跡法做分析。圖7是以FlP-gts處理后A549的移行能力分析。以移液器之藍色尖頭在長滿 的A549上刮一道傷痕(箭頭指示原始傷口之大小)，培養72或96小時后固定細胞并以 Giemsa染劑染色。圖8是以FlP-gts處理后A549中MMP-2之活性。(A)A549細胞以不同濃度(0、1、 2、4及10 y g/ml)的FlP-gts處理24小時后，收集培養液，以明膠-酶譜法分析MMP-2之活 性。(B)MMP_2的活性以密度分析儀量化(densitomertic analysis)，量化之數據以中位數 加三重復之標準差(顯著性學生T檢驗，*p < 0. 05)
圖9是以喂食第二型糖尿病小鼠FlP-gts或FlP-fve后，使用流血試驗測小鼠血糖的 變化。
具體實施例方式實施例一改變細胞形杰A549細胞株屬于人類肺癌表皮細胞，此肺癌細胞株因為具有高度移行能力 (migratory capability)而相當惡性。本發明以A549肺癌細胞株當癌癥模型，研究癌細胞 對FlP-gts之反應。首先，本發明以顯微鏡觀察以FlP-gts處理過后的細胞形態改變，A549細胞分別 以不同濃度(0、1、2、4及lOyg/ml)的FlP-gts處理并在不同時間觀察并以照相紀錄其細 胞形態變化(圖一)。A549細胞在2、4或10 i g/ml的FlP-gts處理之下，細胞形態在6小時后就有顯 著變化，細胞形態由觸角狀的緊貼(adhering with little tentacles)狀態，變成圓形且 貼附性差(round and loosly-attached)的形態，這些圓形細胞會因為輕微搖動培養皿而 漂起。72小時之后，沒有藥物處理或是以低濃度FlP-gts處理的A549細胞形態攤平擴散 并完全覆蓋培養皿的表面，相反的以高濃度FlP-gts處理的A549細胞無法覆蓋培養皿的表 面，而且許多細胞呈現圓形的形態(圖二)；正常肺組織細胞株BEAS-2B在0、2、4或lOiig/ ml的FlP-gts處理之下并不會有細胞形態的改變，沒有藥物處理或是以FlP-gts處理的 BEAS-2B細胞在24小時里有相同的生長速度，而且幾乎同時完全覆蓋培養皿的表面(圖 二 )。以正常肺組織細胞株BEAS-2B當對照組實驗發現，正常細胞不會被FlP-gts影響，可 以在生長24小時后完全覆蓋培養皿的表面。使用人類黑色素惡性腫瘤細胞株A357進行試驗，發現以松杉靈芝蛋白處理之 A357細胞，似乎失去細胞與細胞之間的附著力，細胞不再是緊密地互相接觸，而是雜亂地散 布(圖2)。分別以0、4以及16 y g/ml松杉靈芝蛋白處理A357細胞，并觀察24、48以及72 小時，發現所用的松杉靈芝蛋白濃度愈高，有愈多的細胞變成圓形(圖2)，圖2顯示16 y g/ ml的松杉靈芝蛋白能夠大大地抑制細胞附著性以及細胞成長。如前文所述，證實松杉靈芝 蛋白是通過重組細胞架構，而改變細胞之移動性與附著性。實施例二 細胞存活能力分析(Cell viability assay)進一步證實上述之實驗結果，本發明以錐蟲藍(trypan blue)染色以檢查細胞存 活能力。本發明以與前述實驗相同的FlP-gts濃度(0、1、2、4與10iig/ml的FlP-gts)處理細胞48小時，然后加入錐蟲藍，活細胞不會被錐蟲藍染色，本發明以計算沒被染色的細 胞(活細胞)數量當成細胞之存活能力。 本發明在6厘米培養皿中分別接種(inoculated) 2 X 10SH1355與A549細胞，H1355 細胞株是一般研究新陳代謝之細胞模型，在37°C培養16小時后，更換新的培養液，同時分 別加入不同濃度的FIP-gts(0、l、2、4與10 u g/ml)。在48小時后收集FlP-gts藥物處理的細胞，把舊的培養液移除并將細胞收 集在15ml離心管中，細胞以1XPBS清洗兩次，于室溫下離心1分鐘后，將細胞再懸浮 (resuspended)于0. 5ml的TE緩沖溶液中，以原來之培養液中和此溶液，將細胞移到15ml 離心管，以800rpm離心5分鐘，上清液去除并丟棄，細胞以0. 5ml之1 XPBS打散，取出20 yl 細胞，并加入5 u 1錐蟲藍溶液染色，再以細胞計數器算出細胞數量。細胞之存活率以48小時后沒有處理FlP-gts (Oil g/ml FlP-gts)之細胞數為基準 (100% )，而48小時后，不同濃度的FIP-gts(l、2、4與10iig/ml)處理的細胞存活率分別 為98. 2%、94. 8%、80. 0%與60. 3% (圖三)，此結果與下述之MTS細胞活性分析法分析結 果一致，這兩個實施例證實FlP-gts對A549肺癌細胞株有毒殺作用，并且會抑制細胞生長 與降低細胞存活率。實施例三i十算細朐數量一細朐群落形成(Colony forming)本實驗將以細胞群落形成(Colony forming)法分析FlP-gts對癌細胞之毒殺作 用，A549細胞以不同濃度的FIP-gts(0、0. 4、2與10 y g/ml)，FlP-gts藥物處理24小時后， 再將處理后之細胞以每6cm培養皿殖入400顆細胞培養12天。首先，本發明在6厘米培養皿中分別接種(inoculated) 2 X105A549細胞，在37°C 培養16小時后，更換新的培養液，同時分別加入不同濃度的FIP-gts(0、0. 4、1、2與10ii g/ ml)(圖四)。處理24小時后細胞以1XPBS清洗兩次，藥物處理的細胞再重新置入，lml的 TE緩沖溶液加入并在37°C靜置1分鐘，以打散細胞。序列稀釋以精準估算細胞數，在以每 6cm培養皿殖入400顆細胞，在37°C培養12天后，細胞以1XPBS清洗兩次，再以0°C，2ml 95%乙醇加入個別培養皿中，在室溫靜置20min，再將乙醇倒掉，個別培養皿中再加入2ml 10% Giemsa染色，室溫靜置30min，將10% Giemsa染劑倒掉并收集，以清水沖洗染色的細 胞，晾干并觀察。A549細胞之存活率以沒有處理FIP-gts(0iig/ml FlP-gts)之細胞數為基準 (100% )，不同濃度的FIP-gts(0.4、l、2與10iig/ml)處理的A549細胞存活率分別為 97. 3%、91.5%、69. 6%及 39.0% (圖四 A、圖四 B)，除了以 1 y g/ml FlP-gts 處理的細胞 外，其它實驗組的存活率皆顯著下降(標準T檢驗，p<0. 05)，與本發明的細胞計數結果相 似，因此本發明認為，FlP-gts對A549癌細胞有毒殺作用，并抑制其細胞群落形成。實施例四流式細胞儀本發明發現以FlP-gts處理的細胞會降低存活率，而其可能機制也許是FlP-gts 抑制細胞生長或是FlP-gts誘導細胞凋亡(apoptosis)；為了進一步了解FlP-gts之抑癌 機制，本發明以流式細胞儀分析FlP-gts對細胞之影響。首先，本發明在6厘米培養皿中分別接種(inoculated) 5X105細胞，加入5ml培 養液，在37°C培養16小時后，以1XPBS清洗兩次，更換新的培養液，同時分別加入不同濃 度的FIP-gts(0、2、4與10ii g/ml)，處理24與48小時后以下列程序收集細胞
a.將舊的培養液移入15ml離心管。b.以冷的1XPBS清洗兩次。c.將細胞以lXTrypsin-EDTA處理，由培養皿分離下來。d.將舊的培養液加入，停止IX胰蛋白酶-EDTA反應，將細胞沖下并移入15ml離心管。e.以800rpm離心5min，倒掉上清液，以1 XPBS清洗兩次。f.加入冷的lml 70%乙醇，一面加一面搖晃，置入4°C冰箱隔夜處理，以安定細 胞。g.以800rpm離心5min，倒掉上清液。h.以冷的1XPBS清洗兩次，倒掉上清液，并盡可能干燥。i.在避光狀態下在每離心管加入lml碘化丙啶(propidium iodide)混合物1XPBS550 ill5% Triton X-100200 u 1250 u g/ml 碘化丙啶200 u 1lOmg/ml RNase A50 u 1最終濃度為Triton X-100,0. 5mg/ml RNase A and 4 u g/ml PIj.室溫靜置 30min。k.將過大的細胞塊以40 iim尼龍網過濾，將單細胞懸浮液置入流式細胞儀分析管中。為了分析細胞中的DNA含量，本發明以FACSCalibur(BECTONDICKINSON)細胞流速 儀檢測被PI染到的DNA釋放出波長617nm的紅色熒光，再將檢測之數據以CELL Quest程 序收集，并以Mod Fit 3.0程序分析細胞周期。以流式細胞儀分析，本發明發現以FlP-gts處理的細胞，最少有30%會停在細胞 周期的G1期。停在細胞周期的G1期細胞數量增加，會讓分布于細胞周期的S期細胞數量 減少，換句話說，FlP-gts抑制細胞生長。少數細胞停在次G1期，以FlP-gts處理的細胞第 二天，有最大量的細胞比例(大約1.6% )停在次G1期，此現象顯示，FlP-gts降低細胞存 活率主因為使細胞停在細胞周期的G1期，然而同時有部分細胞會進入細胞凋亡。實驗結果顯示，細胞G1期現象隨著FlP-gts處理濃度提高而增加，所有分布于各 細胞周期之細胞數為100%，24小時后，不同濃度的FIP-gts(0、l、2、4與10iig/ml)處理 的A549細胞產生G1期之比率分別為58. 2%,59. 1%,62. 0%,64. 0%R 75. 5%，停在細胞 周期的G1期細胞數量增加，會讓分布于細胞周期的S期細胞數量減少，相同FlP-gts處理 條件下，A549細胞分布于細胞周期的S期之比率分別為32. 8 %、30. 9 %、30. 1 %、27. 2 %及 18.2% (圖五A，圖五B)。實驗結果同時顯示，細胞G1期現象隨著FlP-gts處理時間增加而 增加，48小時后，相同FlP-gts處理條件下的A549細胞產生G1中止之比率分別為60. 2 %、 68. 8%,72. 6%,76. 及82. 1%，停在細胞周期的G1期細胞數量增加，會讓分布于細胞周 期的S期細胞數量減少，相同FlP-gts處理條件下，A549細胞分布于細胞周期的S期之比 率分別為=31.8%,25. 1%、23.0%、20.0%及13. 8%，此實驗結果證明，FlP-gts會使A549 細胞停在細胞周期的G1期(圖五A，圖五B)。我們同時發現，當A549細胞以10 i! g/ml的FlP-gts處理后，少數細胞會停在次G1期，意指部分細胞會進行細胞凋亡，10 u g/ml的FlP-gts處理24與48小時后，分別有0. 9% 與1. 6% A549細胞會停在次G1期(圖五B)。實施例五Western印跡法細胞中的p53蛋白會受到胞外刺激(如UV照射，化療藥物順鉬(cisplatin)處 理)活化而穩定，P53會進一步活化其下游基因，包括p21與Bax。p21基因主要抑制細胞 周期進入G1期(Zhong，X et. al.，2004. Int. J. Cancer)，本發明以Western印跡法發現，以 FlP-gts處理細胞48小時后，p53基因蛋白會被誘導表達，同時也會誘導p21基因之蛋白 質。此結果顯示FlP-gts會使A549細胞中的p21活化而停在細胞周期的G1期。目前已知有三個與細胞凋亡相關的途徑，分別是經過內質網(Endoplasmic Reticulum, ER)，死亡受體(death receptor)與線粒體(mitochodria)，這三個途徑都會 造成半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶-3(prOCaspase-3，32kDa)被切割，產生活化型 caspase-3 (17kDa)。Caspase-3是caspase序列反應的最終執行者，它會造成細胞凋亡，DNA 斷裂，細胞核聚集與形成核涵體(nuclear inclusions) (Di Pietro, R.，et al. (2004) Int JImmunopathol Pharmacol 17(2)181-190)。本發明發現當細胞以高濃度FlP-gts處理時， H procaspase-3Mr'^^ft.W caspase-3 本發明從流式細胞儀結果發現FlP-gts會讓培養的細胞停在細胞周期G1期，同時 會造成一部分的細胞凋亡，因此本發明將進一步檢驗細胞以FlP-gts處理后相關蛋白質表 達量的改變。a.檢體制備本發明在6厘米培養皿中分別以5X105細胞密度接種(inoculated)A549細胞， 加入5ml培養液，在37°C培養16小時后，分別加入不同濃度的FlP-gts (0，2，4與10 y g/ ml)處理48小時后將細胞由培養皿移至離心管，以1XPBS清洗兩次，到去上清液，再加入 細胞緩沖液(10mM EDTAUOmM EGTA、5mM NaF、10%甘油(glycerol)、ImM DTT、400mM KC1、 0. 4 % Triton X_100、20mM 鈉 甘油磷酸、0. ImM Na3V04、lmMPMSF/DMS0、3 ii g/ml 蛋白 酶抑制劑(apr0tinin)、2iig/ml胃蛋白酶抑制劑(p印statin A)、2 y g/ml亮抑蛋白酶 肽(Leup 印 tin)、IX 磷酸水解酶抑制者組成物 I (phosphatase inhibitor cocktail I) (Sigma, P2850) ；IX磷酸水解酶抑制者組成物II (Sigma，P5726))以溶解細胞。將細胞溶 解反應混合物至于冰上，并以超音波均質機(ultrasonic homogenizer)在4°C將細胞均質 化，重復此動作兩次，每次間隔超過10分鐘；以12000rpm，4°C進行20min條件離心后，將上 清液移至已滅菌1. 5ml離心管，并檢測蛋白質含量。將檢體加入2X SDS樣本緩沖液(200mM Tris pH6. 8、8% SDS、40%甘油、2. 86M 2-mercaptoethenol 及適量的溴酚藍(bromophenol blue))，并以95°C加熱。上述步驟須再兩小時間完成。b.蛋白質定量本發明以Bio-Rad溶液定量蛋白質，Bio-Rad試劑首先以H20以4 1稀釋，此為 Bio-Rad蛋白質檢測試劑，將2iU檢體加入498 ill Bio-Rad蛋白質檢測試劑，37 °C反應 20min，以光度計(spectrophotometer)檢測595nm波長之吸收，檢測值與以牛血清白蛋白 (BSA，bovine serum albumin)當標準樣品繪出之曲線比較，算出蛋白質含量(Pg/yl)； BSA 標準曲線繪制取 2、4、6、8、10ii g BSA 分別置入 498、496、494、492 與 490 yl 之 Bio-Rad 蛋白質檢測試劑，以光度計(spectrophotometer)檢測595nm波長之吸收，繪制出光吸收與
12蛋白質含量的相關曲線。由此方法，可以計算檢體蛋白質之含量。
0109]c. SDS-PAGE (十二烷基磺畫B內-聚丙烯酰胺凝膠電泳)0110]表1以下列配方制備分離膠體(Running/s印arating gel)0111]
0128]0129]總量6ml0130]將檢體以SDS-PAGE電泳分析時準備轉漬膜Hybond-Pmembrane(Pharmacia),將
膜以甲醇浸泡15秒，以ddH20清洗lOmin，再將膜以轉漬溶液中浸泡(transfer buffer 20%甲醇、192mM甘氨酸、25mM Tris_HCl，pH 9. 2) lOmin。SDS-PAGE電泳后將電泳膠小心移 出，置于Hoefer Semiphor Transfer以標準程序將蛋白質轉漬至轉漬膜上，轉漬后，將轉漬 膜浸入封閉緩沖液(Blocking buffer) (5%脫脂奶粉在TTBS緩沖液中:50mM Tris,0. 2% Tween 20,150mM NaCl, pH 7. 5) 37°C反應一小時。抗體檢測將具專一性的抗體加入在上述封閉過的轉漬膜上(blocked Hybond-Pmembrane), 以含3%BSA的IX TTBS緩沖液稀釋下列一級多株抗體(primary polyclonal antibody) anti-caspase-3(l 500, Cayman) > anti-C0X-2(l 1000， C￡iym￡m#160106)，以 * 5 % 脫脂速溶奶粉的IX TTBS緩沖液稀釋下列一級多株抗體anti-BAX(l 8000，R&D)、 p53(l 500，DAK0)、p21(l 500，Zymed)，將轉漬膜置入含稀釋抗體之緩沖溶液，4°C 搖晃反應16小時，將轉漬膜以100ml含3%脫脂速溶奶粉IX TTBS緩沖液洗兩次，以含 3%脫脂速溶奶粉的IX TTBS緩沖液稀釋的二級抗體(anti-rabbit IgG_HRP(l 5000， Cell Signaling#7074)，抗-老鼠 IgG-HRP(l 10000，Chemicon AP124P))，再將轉漬 膜分別置入含稀釋二級抗體之緩沖溶液，室溫搖晃反應一小時，重復清洗步驟。準備冷 光呈色劑(NEN、NEL 105,1 1與強化發光劑(Enhanced luminol reagent)及氧化劑(Oxidizingreagent)，混合5min)將轉漬膜呈色，并以X-ray底片顯像。G1期中最重要的檢查者是p21蛋白，本發明發現以不同濃度的FIP_gts(0、2、4 與10yg/ml)處理48小時后p21表達量顯著增加(圖六)，已知p21會被p53活化，Western 印跡法結果顯示P53表達量會被FlP-gts誘導(圖六)，因此本發明認為的細胞存活率分別 為FlP-gts會誘導p53表達，進一步增加p21的量與造成G1期。進一步分析FlP-gts是否會抑制細胞分化或是對細胞有毒殺作用，本發明以 Western印跡法檢驗caspase-3表達量。本發明發現以10 u g/ml濃度的FlP-gts處理48 小時后procaspase-3減少(圖六),而FlP-gts處理后procaspase-3會活化成caspase-3, 讓細胞進行細胞凋亡，意指細胞數的降低不是因為細胞凋亡的增加，而是細胞分化被抑制。實施例六傷害/復原分析(Wound healing assay)利用傷害/復原分析，本發明發現FlP-gts可以有效抑制肺癌細胞的移行能力。本發明在24孔培養皿中分別以2X105細胞密度接種(inoculated)A549細胞，讓 細胞生長致幾乎完全覆蓋培養皿，更換含0. 5% FBS培養液培養24小時，以抑制細胞生長； 用移液器之藍色尖頭在長滿的A549上刮一道傷痕，以1XPBS清洗，更換新的培養液，同時 分別加入不同濃度的FIP-gts(0、l、2、4與10ii g/ml)處理，每24小時照一次相紀錄細胞生 長。一般而言，癌癥細胞在其轉移之前，他會有移行能力(正常細胞不太會移動)，本 發明以傷害/復原分析檢驗細胞以不同濃度的FIP-gts(0、l、2、4與10 y g/ml)處理后，其 移行能力是否增加。實驗發現，當細胞以FlP-gts處理48小時后，移行能力并沒有顯著的 變化；當分別以0、1、2 y g/ml的FlP-gts處理72小時后，細胞可以往被劃開的區域生長，而 分別以4、10 y g/ml的FlP-gts處理72小時后，細胞移行能力幾乎沒有顯著的變化；96小 時后，沒有FlP-gts藥物處理的細胞可以覆蓋大約1/3的劃開區域，以低濃度FlP-gts藥物 處理的細胞有些微移行能力，然而高濃度FlP-gts藥物處理的細胞不會移行(圖七)。利用傷害/復原分析，本發明發現FlP-gts可以有效抑制肺癌細胞的移行能力；當 FlP-gts藥物處理濃度達4、10 u g/ml時細胞不會移行。實施例七明膠-酶譜法(Gelatin ZymoRraphy)分析當細胞轉移(metastasis)時，基質金屬蛋白酶(metaloproteinase, MMP)將細 胞間質(extracellular matrix)消化，將細胞與細胞間質分開，并提供其移行能力，目前 已知 MMP-2 與 MMP-9 大量表達于惡性癌癥(Johnsen, M.，etal.，Curr Op in Cell Biol, 1998. 10，pp. 667-671)。MMP-2與MMP-9之表達量與癌癥細胞轉移(metastasis)有密切之 關聯(Curran, S. and Murray, G. I. (2000) Eur J Cancer, Vol. 36, pp. 1621-1630. , Liabakk, N. B.，et al.，Cancer Res,1996. 56，pp.190—196)。為了避免培養液血清(Serum)中的MMP-2與MMP-9干擾，本發明已無血清培養液 將A549細胞饑餓處理后，再加FlP-gts藥物處理，以分析其MMP蛋白質之活性；為了進一步 確認明膠-酶譜法分析的細胞密度結果，本發明以Bio-Rad試劑檢測蛋白質濃度。本發明發現以高濃度的FlP-gts藥物處理可以抑制MMP-2表達量，而此FlP-gts 藥物處理抑制效應隨劑量增加而顯著。本發明在24孔培養皿中分別以IX 105細胞密度接種(inoculated)A549細胞，隔 天更換無血清培養液，并以不同濃度的FlP-gts (0、2、4與10 y g/ml)處理，培養24小時，移除培養液培養并以1XPBS清洗兩次。以CE緩沖溶液收集細胞并以Bio-Rad試劑檢測蛋白 質濃度。在55°C下，以2g明膠溶于100m 二次水中來制備2%明膠。
表 3 以 0. 明膠來制備 8% SDS-PAGE gel。8%_dd H203.0ml1. 5M Tris pH 8. 82.0ml(38.67 1. 33)Acrymide Bis 2.2ml10% SDS0.08mlAPS(10mg/ml)0.4ml2% Gelatin0.4mlTEMED10 u 1_總量8ml將凝膠以Western印跡法制備，置于電泳槽中，將培養液與5X染劑(0. 1 % SDS、 104mM Tris-HCl pH 6.8、50%甘油(或25g庶糖)，0. 125%溴酚藍)混合，加在電泳膠上并 開始進行電泳；電泳結束后以清洗液(40mMTris-HCl pH 8. 5、0. 2M NaClUOmM CaCl2、2. 5% Triton X-100)于室溫清洗電泳膠30分鐘兩次，再與反應緩沖溶液(40mM Tris-HCl pH 8. 5、0. 2MNaCl、10mM CaCl2、0. 01% NaN3)37°C反應 12 小時，以考馬斯藍(0. 2% Coomassie blue R-250、50%甲醇、10%醋酸)染色30分鐘，再以10%醋酸及20%甲醇退染。退染后， 以50% ddH20、50%甲醇及0. 33%甘油干燥，并將電泳膠以年糕紙封在Plexiglas板并風 干。細胞的移行能力與MMP蛋白質分泌有關，在此，本發明以明膠-酶譜法分析細胞以 FIP-gts藥物處理后MMP-2的活性是否被改變；本發明發現FlP-gts濃度升高，MMP-2表達 量顯著的下降(學生T檢驗，p< 0.05)，以沒有處理FIP-gts (Oil g/ml FIP-gts)之MMP表 達量為基準(100%)，不同濃度的FIP-gts(l、2、4與10iig/ml)處理的MMP表達量分別為 95. 7%、90. 3%、73. 6%與29. 8% (圖八)，因此本發明認為FIP-gts可以通過調控MMP-2 蛋白而抑制癌細胞的移行能力。實施例八反轉錄聚合酶連鎖反應分析(Reverse Transcriptase PolymeraseChain Reactions, RT-PCR)以高濃度FIP-gts處理細胞會造成MMP蛋白表達量減少，本發明以RT-PCR以檢測 金屬蛋白酵素的組織抑制因子-1(TIMP-1，Tissue Inhibitorof MetalloProteinase)與血 纖維蛋白溶原活化抑制劑-l(PAI-l，PlasminogenActivator Inhibitor-1)的基因轉錄，本 發明發現，當細胞以不同濃度的FIP-gts(0、2、4與10iig/ml)處理24小時后，TIMP-1 (圖 十)與PAI-1 (圖十三)之信使核醣核酸(mRNA)下降，而TIMP-2不被影響(圖十二 )，因此 本發明認為，FIP-gts可以通過調控MMP-2mRNA減少(圖i^一 )而通過增加TIMP-1抑制其 它的MMP蛋白(例如MMP-9)，進而抑制癌細胞的轉移能力。以 Promega RT-PCR kit 進行 RT-PCR liig全部RNA以70°C加熱lOmin.，再置于冰上冷卻。然后以下列配方進行反應25mM MgC12 4 yl、5 XMMLV緩沖液4 yl、10mM dNTP混合物2 yl核糖核酸酶抑制劑 (Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor) 0. 5y 1、MMLV 反轉錄Bl 1 y 1、寡(dT) 15 弓丨物及加入不含核酸酶的水，直到總量達到20 yl。表4 RT-PCR所需之核酸引物(Primer) 實施例九增加細胞激素的表汰人類周邊血液單核球細胞(PBMCs)以0、1. 25,2. 5、5及10 ii g/ml FIP-gts處理。 在48小時后以ELISA測量人類PBMCs的細胞激素表達。發現到當增加FIP-gts處理的濃 度后，細胞激素IL-2、IFN- y、TNF- a及IL_4的表達會跟著增加(表5)。表5 人類PBMCs以FIP-gts處理的細胞激素表達的增加
FlP-gto (昭/ml)01.252.5510IL-2 (pg/ml)1163162724251218IFN-y (pg/ml)704135457843784372TNF-a (pg/ml)891174207635252219IL-4 (pg/ml)5371339實施例十比較在三種不同細胞株上的FIP效應用來看FIP效應的三種癌細胞株人類前列腺癌細胞株PC3、人類乳癌細胞株 MDA231及人類黑色素瘤癌細胞株A375(表6)。FIP-gts效應的評估，遵循著實施例1所披 露的實驗步驟，是以觀察受FIP-gts處理后的細胞形態改變進行；遵循著實施例3所披露的 實驗步驟，是以測量細胞增殖的抑制進行；及遵循著實施例4所披露的實驗步驟，是以測量 菌落形成的抑制進行。表6在不同癌細胞株上FIP-gts的效應
細胞株細胞株起源形態變化細胞生長抑制菌落生長抑制PC3人類前列腺癌n. d.++MDA231人類乳癌n. d.++A375人類黑色素瘤+++實施例H材料與方法動物品系
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自巾云力(National Laboratory Animal Center inTaiwan) pjf 購買之4 5周大的BALB/c公鼠。FIP-gts 劑量低劑量200微克/公斤重/天，高劑量600微克/公斤重/天；陽性對照組劑量 (以臺灣市售之靈芝粉為對照組)300毫克/公斤重/天喂食周期，喂食途徑與喂食期間初期，以高劑量FIP-gts為喂食配方，接著以中劑量與低劑量稀釋高劑量的配方； 從測試第一天起，每一試驗組每天由口部喂食持續6星期。分析方法1.自然殺手細胞(natural killer cells)活性分析(非專一性免疫調節功能測 試)小鼠喂食FIP-gts六周后，取出其胰臟，以流式細胞儀分析喂食FIP-gts不同劑量 實驗組與陰性對照組間自然殺手細胞(natural killer cells)活性的差異。2.巨噬細胞(Macrophages)活性分析(非專一性免疫調節功能測試)小鼠喂食FIP-gts六周后，由其腹部取出巨噬細胞(Macrophages)，以巨噬細胞吞 噬以熒光標定的大腸桿菌(E. coli.)，再以流式細胞儀分析喂食FIP-gts不同劑量實驗組 與陰性對照組間巨噬細胞(Macrophages)活性的差異。3.血清抗體的制造(非專一性免疫調節功能測試)小鼠喂食FIP-gts前與被宰殺后，采取其血液以分析血液中免疫球蛋白濃度變 異，以分析喂食FIP-gts不同劑量實驗組與陰性對照組間的差異。4.細胞激素之分泌量分析(專一性免疫調節功能測試)在經過10星期之服用松杉靈芝蛋白以及兩次之注射卵蛋白素(0VA，ovalbumin) 之后，宰殺該實驗動物，以洋刀豆血球凝集素(Con A, Concanavalin A)、脂多醣(LPS， Lipopolysaccharide)或是卵蛋白素刺激其脾臟細胞，在經過48 72小時培養后，以〃酶 聯免疫吸附實驗(ELISA)“測量細胞激素之含量，把每一組劑量所測得的數值與陰性對照 組作比較，若P值小于0. 05，即代表有顯著差異。5.血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白分析(專一性免疫調節功能測試)在研究松杉靈芝蛋白之前，先將該實驗動物進行免疫、再激活，并在宰殺該實驗動 物前，自后眼窩采取血液樣本。以酶聯免疫吸附實驗測量血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白 生成量。把每一組劑量所測得的數值與陰性對照組作比較，若P值小于0. 05，即代表有顯著差異。結果1.自然殺手細胞(natural killer cells)活性分析(非專一性免疫調節測試)小鼠宰殺后，取出其胰臟以分析其自然殺手細胞(natural killer cells)活性； 與陰性對照組比較，實驗組在E/T比值(Effector/Target ratio)小于12. 5不具有顯著性， 與陰性對照組比較，喂食高劑量FIP-gts實驗組與陽性對照組在E/T比值小于25具有顯著 性，與陰性對照組比較，喂食低、高劑量FIP-gts實驗組與陽性對照組在E/T比值小于50具 有顯著性。實驗顯示FIP-gts增加自然殺手細胞的活性。(表7)表 7 此試驗以流式細胞儀分析自然殺手細胞之細胞毒殺活性(cytotoxicityassay)。0表示與陰性對照組之統計分析之顯著性E:反應者細胞，T:目標細胞A 陰性對照組B 喂食低劑量FlP-gts實驗組C 喂食高劑量FlP-gts實驗組D 陽性對照組2.巨噬細胞(Macrophages)活性分析(非專一性免疫調節測試)小鼠宰殺后，由其腹部取出巨噬細胞，以FITC綠色熒光標定的大腸桿菌(FITC-E. coli)加在取出之巨噬細胞，讓其吞噬，再以流式細胞儀分析巨噬細胞活性；與陰性對照組 比較，喂食低、高劑量FlP-gts實驗組的感染劑量(M01，multiplicity of infection) =30 時具有顯著性；實驗顯示FlP-gts增加巨噬細胞的活性。(表.8)表8. 此試驗以流式細胞儀分析巨噬細胞之吞噬活性。0表示與陰性對照組比較之統計分析之顯著性M0I multiplicity of infection，感染齊[J量A 陰性對照組 B 喂食低劑量FlP-gts實驗組C 喂食高劑量FlP-gts實驗組 C 陽性對照組3.血清抗體的獲得(非專一性免疫調節測試)小鼠喂食FlP-gts前與被宰殺后，采取其血液以分析血液中免疫球蛋白濃度變 化，以分析喂食FlP-gts不同劑量實驗組與陰性對照組間的差異。血清中免疫球蛋白 G(IgG)的濃度在喂食FlP-gts前顯示與陰性對照組比較，喂食高劑量FlP-gts與陽性對照 組都有統計顯著差異，而血清中免疫球蛋白M(IgM)的濃度在喂食不同劑量FlP-gts實驗組 與陰性對照組間無統計顯著差異。(表.9)表9 此實驗以酶聯免疫吸附實驗分析(ELISA，enzyme-link immunosorbentassay)血 清中的免疫球蛋白。O表示與陰性對照組比較之統計分析之顯著性(p < 0. 05)A 陰性對照組B 喂食高劑量FlP-gts實驗組4.細胞激素之分泌量(專一性免疫調節測試)以刺激物(洋刀豆血球凝集素或脂多醣或卵蛋白素)刺激脾臟細胞，在經過48 72小時培養之后，以酶聯免疫吸附實驗測量細胞激素之含量。在經過洋刀豆血球凝集素 之刺激后，介白質素_2于低濃度的松杉靈芝蛋白組之分泌量，明顯高于陰性對照組之分泌 量；在經過卵蛋白素之刺激后，介白質素_2于每一種濃度的松杉靈芝蛋白組與陽性對照組 之分泌量，明顯高于高于陰性對照組之分泌量。在經過洋刀豆血球凝集素之刺激后，腫瘤壞死因子_ a (TNF- a )于每一種濃度的 松杉靈芝蛋白組與陽性對照組之分泌量，明顯高于高于陰性對照組之分泌量。在經過卵蛋 白素之刺激后，干擾素-Y (IFN-y)于高濃度的松杉靈芝蛋白組與陽性對照組之分泌量， 明顯高于高于陰性對照組之分泌量。上述結果呈現于表10，松杉靈芝蛋白能夠促進細胞機素之分泌表10、脾臟之細胞激素分泌量 以酶聯免疫吸附實驗測量脾臟細胞激素之含量。* 表示與陰性對照組比較之統計分析之顯著性A 陰性對照組 B 喂食低劑量FlP-gts實驗組C 喂食高劑量FlP-gts實驗組 D 陽性對照組5.血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量(專一性免疫調節)在研究松杉靈芝蛋白之前，將該實驗動物先進行免疫、再激活，并在宰殺該實驗動 物前，自后眼窩采取血液樣本。以酶聯免疫吸附實驗測量血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白 生成量。在研究、先免疫以及再激活前，抗卵蛋白素之免疫球蛋白G(IgG)、抗卵蛋白素之免 疫球蛋白M(IgM)以及抗卵蛋白素之免疫球蛋白E(IgE)于每一組的條件下，并無顯著差異。在宰殺動物前，抗卵蛋白素之免疫球蛋白G于每一種濃度的松杉靈芝蛋白組與陽 性對照組之生成量，明顯高于高于陰性對照組之生成量。抗卵蛋白素之免疫球蛋白M于高 濃度的松杉靈芝蛋白組與陽性對照組之生成量，明顯高于高于陰性對照組之生成量。但是 卵蛋白素之免疫球蛋白E于每一組之生成量，沒有明顯差異。上述結果表示于表11中，松衫靈芝蛋白可以促進血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋 白的生成量。表11、血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量(特異性免疫調節測試) 以酶聯免疫吸附實驗測量抗血清中卵白質素之免疫球蛋白生成量。* 表示與陰性對照組比較之統計分析之顯著性EU = (A樣本_k陰性對照組)/ (A陽性對照組陰性對照組)A 陰性對照組 B 喂食低劑量FlP-gts實驗組C 喂食高劑量FlP-gts實驗組 D 陽性對照組實施例十二 FIP-gts或FlP-fve對第二型糖尿病小鼠血糖之影響(圖9)每六只雄鼠一組，分別接受以下測試；分組一沒有注射Strptozotocin(100mg/kg)分組二 注射 Strptozotocin(100mg/kg)分組三注射 Strptozotocin (100mg/kg)及 FlP-gts 2 u g/200 u 1/ 只分組四注射Strptozotocin (100mg/kg)及 FlP-fve 50 u g/200 u 1/ 只FlP-fve 是由 Flammulina velutipes (金針菇)中所制得。流血試驗測血糖。F 喂食 FlP-gts (2 u g/200 u 1/ 只)或 FlP-fve (50 u g/200 u 1/ 只)血糖測試之實驗結果如下(mg/dl)；分組一分組二分組三分組三七天141. 7 士 2 238. 3 士 91 146. 3 士 35 150. 3 士 40十四天125. 3士8 270. 7士80 207. 7士75 176. 7士59以上結果證實，FlP-gts或FlP-fve明顯降低由化學物質引發第二型糖尿病的小 鼠的血糖值。
權利要求
一種真菌免疫調節蛋白在制備降第二型糖尿病的患者血糖的口服劑型藥物中的用途，該蛋白質內含氨基酸序列SEQ ID No1MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于此蛋白是自靈芝屬中所獲得。
3.根據權利要求1所述的用途，其特征在于此蛋白是自金針菇中所獲得。
4.根據權利要求1所述的用途，其特征在于此蛋白是由重組的大腸桿菌或酵母菌所提
全文摘要
本發明涉及真菌免疫調節蛋白在制備降血糖的藥物中的用途，具體涉及其制備用于降第二型糖尿病的患者血糖的口服劑型藥物中的用途。
文檔編號A61P3/10GK101926979SQ20101011201
公開日2010年12月29日 申請日期2006年9月21日 優先權日2005年9月23日
發明者柯俊良, 陳子智 申請人:益生生技開發股份有限公司