專利名稱：一種組織特異性兼可調控性慢病毒基因表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種慢病毒雙基因表達載體、其構建方法及應用。
背景技術：
慢病毒載體是以人類免疫缺陷1型病毒為基礎發展起來的基因治療載體.區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力.該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久件表達.在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的基因治療效果。一種有效的治療基因載體需滿足以下基本條件基因表達效率高，能達到治療效果；對靶細胞組織有特異性且基因表達水平可控性從而使其使用具有安全性。為了達到基因表達的可控性，目前常用四環素或其衍生物作用于與其相對應的啟動子達到受其控制的外源目的基因水平的調控。為了提高基因治療的安全性，在載體構建中通常使用組織特異性啟動子以達到相應組織細胞內的目的基因的表達。由于基因治療的效果很大部分取決于靶細胞內的基因表達水平。因此，為提高基因表達效率，目前在基因治療領域中常用的方法是采用兩個獨立載體聯合轉染細胞。第一個載體通常含一啟動子用于表達一種轉錄激活因子，第二個載體含一對應與第一載體所含的轉錄激活因子的啟動子用來表達目的基因，第一載體的轉錄激活因子通過加強作用于第二載體的啟動子從而增高目的基因的表達水平。 用這種方法雖能提高基因表達治療量卻增加了用于轉染細胞所需的總病毒量滴度。此外，由于慢病毒載體的基因組(genome)約8kb，只能容納有限的外源性插入DNA 序列，而且雙基因表達載體多為順式表達，對第二個基因的表達量具有一定的降低。因此， 構建一種可控性與高效率的基因表達盒于一體的載體既能提高治療效果又能增加安全性。 同時這樣一種載體不但具有聯合轉染的效果同時又降低為了能達到聯合轉染效果所需的兩個載體的總病毒量滴度，從而保證了既具使用安全性又降低了成本。
發明內容
為解決以上所述現有技術中存在的問題，本發明的構建了一種具有組織細胞特異性并兼備可調控目的基因高效表達的慢病毒雙基因表達載體。此慢病毒載體具有兩個各自獨立的基因表達盒。兩個基因表達盒呈反式方向設置并共享一個PolyA尾巴。一個基因表達盒沿5’至3’方向含有對藥物呈可調控啟動子，由其控制外源性目的基因的表達。另一個基因表達盒沿3’至5’方向含有組織細胞特異性啟動子控制一轉錄激活因子。此轉錄激活因子在四環素衍生物DoxycyclineQox)的存在并達到一定劑量下能激活并放大另一基因表達盒內的可調控啟動子從而顯著提高目的基因的表達量。在藥物不存在或低于一定劑量時，此載體由于轉錄激活因子未有效作用于可調控性啟動子而呈低基線基因表達水平。此夕卜，在特異的組織細胞內，組織細胞特異性啟動子由于該組織內源性轉錄激活因子對其的作用而活性增強，使受控于該組織細胞特異性啟動子的外源性轉錄激活因子表達提高。在非特異的組織細胞內，外源性轉錄激活因子呈基線表達水平。當此慢病毒載體感染對應與其組織特異細胞并在Dox存在一定劑量下，受控于可調控啟動子的外源性目的基因因雙重放大效應而達到最高表達水平。本發明的另一個目的在于提供上述載體的構建方法；本發明的再一個目的在于提供上述載體在基因治療領域中的應用，特別是腫瘤治療。
圖 1 是載體 TRELuc，VEcadrtTA 和 SindLuc-Al。圖2是熒光酶基因在四環素衍生藥物D0X(l/ml)調控下分別在血管特異性內皮細胞和非特異性細胞中的表達水平。圖3是TRELuc,VEcadrtTA雙載體聯合轉染和SindLuc-Al載體單獨轉染人體宮頸癌Hela細胞72小時后的慢病毒滴度量與插入基因表達盒大小的關系。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。本實施例將以SEQ IDN0. 1所示的慢病毒表達載體為例來具體描述其構建方法及應用。本發明的表達載體具有序列表SEQ ID No. 1所示的序列，其至少包括polyA60尾巴、逆式四環素反應激活因子(rtTA2s-M2)、血管內皮細胞特異性(VEcad)啟動子，四環素調控性白蛋白融合(TRE/alb)啟動子、熒光素酶基因(Iuciferase)。本發明還提供了構建上述表達載體的方法，其包括如下步驟1.以 pRRL. cPPT. PGK. eGFP. WPRE (Adogen 購買)為模版，用 BamHl-SaLl 酶切釋放 eGFP 片段，然后把含有 BamHl-Xhol-Xmal-Smal-Xbal-Mlul-Nhel-BglII-SaLl 多酶切位點的DNA片段通過BamHl-SaLl位點聯接到模版DNA載體，得到中間載體pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE ； 2.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 載體為模版，用 Xmal-Xbal 從 pG13_basic 載體(Invitrogen購買)酶切釋放熒光媒體基因片段后再通過Xmal-Xbal位點，聯結到pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE，得到中間載體 pRRL. cPPT. PGK. Luc. WPRE ；3.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 為模版，同過Xhol 酶切釋放出 PGKDNA片段，得到中間載體 pRRL. cPPT. linker. WPRE ；4.通過 Nhel-BamHl 酶切載體 pmVEcad-rtTA(Invitrogen 購買)，釋放出 mVEcad-rtTA片段，然后通過Nhel-BglII位點，聯結到pRRL. cPPT. linker. WPRE得到慢病毒載體 pRRLcPPT.mVEcad-rtTA. WIRE(VEcadrtTA)(圖 1)；5.通過 Xhol-Xbal 酶切點，從載體 pTREalb-Luc (Invitrogen 購買)釋放 TREalb-Luc 片段；聯接到 pRRL. cPPT. linker. WPRE，得到載體 pRRL. cPPT. TREalb-Luc (TRELuc)(圖 1)；6. mVEcad-rtTA-S60PA 基因表達盒從載體 pmVEcad-rtTA-S60PA (Invitrogen 購買)通過Xhol-Accl酶切位點釋放后再通過Xhol-ClaI聯接到TRELuc載體，得到pRRL. cPPT. S60PA-rtTA-mVEcad-TREalb-Luc (SindLuc-Al)(圖 1)慢病毒可控性載體。慢病毒轉染 細胞與熒光酶基因表達水平測試人體微血管內皮細胞(Humvec)，人體臍帶血管內皮細胞(Humvec)，人體臍帶血管內皮細胞(Huvec)，！fep3B細胞和人體宮頸癌細胞(Hela)分別置于24孔細胞培養板，每孔用300微升DMEM含10%牛血清的培養液。當細胞在每孔中達到50-60%克隆率后，用慢病毒載體SindLuc-Al和TRELuc,VEcadrtTA雙載體分別轉染人體微血管內皮細胞(Humvec)， 人體臍帶血管內皮細胞(Huvec)，！fep3B細胞和人體宮頸癌細胞(Hela)，感染復數(MOI) 為5次。轉染16小時后，每孔內細胞用PBS清洗以去除病毒RNA，然后再加上述培養液繼續擴增生長。至72小時，每孔內轉染細胞再次由PBS液清洗兩次后加Passive Lysis Buffer (Promega購買)溶碎，各孔內細胞提取物被系列稀釋后每20微升用100微升熒光酶基因表達測試劑Luciferase Assay Reagent (Promega購買)混合，熒光酶基因表達水平由光度計測試。慢病毒滴度量測試慢病毒滴度的定量通過測試慢病毒感染顆粒量。分別被SindLuc-Al和TRELuc， VEcadrtTA雙載體轉染后的Hela細胞被置于24-孔培養板，每孔培養液中每毫升含8微克的聚凝胺(Sigma購買)。72小時后，被各載體轉染的Hela細胞的全細胞基因組DNA用微小DNA血測試劑盒DNA Blood Mini Kit 50(Qiagen購買)提取.慢病毒顆粒滴度量用 (TU/mL)表示并通過定量聚合酶鏈式反應PCR來作定量分析。探針的5’用波長為518nm 的報告染色分子FAM標記，3’用波長為582nm的報告染色分子TAMRA標記，在PCR過程中探針的3’又被磷酸化。用于PCR作慢病毒滴度測試的引物和探針分別為正向引物 5，-CCGTTTCAGGCAACGTG-3，；反向引物5，-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3，；探針5，FAM-CCAGC CATGTACGTTGCTATCCAGGC-TAMRA-3 ‘ . PCR 的測試用 PCR Master Mix (Promega 購買)。結果組織特異性可調性慢病毒載體SindLuc-Al在轉染具血管內皮細胞特異性人體微血管內皮細胞(Humvec)，人體臍帶血管內皮細胞(Huvec)和非血管內皮細胞特異性 Hep3B細胞和人體宮頸癌細胞(Hela) 72小時后，在無Dox存在下，熒光酶基因在Humvec， Huvec, Hep3B和Hela細胞中基因表達水平與用慢病毒載體TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯合轉染的同種細胞中的表達水平無顯著差別并呈基線水平表達(圖2)。在Dox以每毫升1 微克存在的情況下同Dox不存在的條件下相比，熒光酶基因在SindLuc-Al轉染的Humvec 細胞內的表達水平與用雙載體轉染的細胞內的表達水平都有顯著提高(圖2)，且呈現藥物 Dox的可調控性。其中，在SindLuc-Al轉染的Humvec細胞內的表達水平雖低于用雙載體轉染的細胞內的表達水平，而在SindLuc-Al轉染的Huvec細胞內的表達水平卻顯著高于用雙載體轉染的細胞內的表達水平(圖2)。在非血管內皮細胞特異性H印3B和Hela細胞內，用 SindLuc-A 1載體單獨轉染和TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯合轉染后，Dox的存在于否對熒光酶基因表達水平幾乎無影響(圖2)。在用慢病毒載體SindLuc-Al和TRELuc，VEcadrtTA 雙載體聯合轉染的Hela細胞中，轉染72小時后測試出的SindLuc-Al病毒滴度比TRELuc 和VEcadrtTA的滴度要低。由此可見，慢病毒載體SindLuc-Al不但呈現顯著組織特異性和藥物可調控性而且在不需增加病毒滴度的前提下能達到TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯合轉染的基因表達水平(圖3)。
權利要求
1.一種慢病毒基因表達載體，其特征在于從5’ -3’方向至少包括以下元件i.PolyA尾巴序列；ii.轉錄激活因子編碼序列；iii.對應于組織特異性啟動子序列；iv.對應于藥物和轉錄激活因子的可調控性啟動子；v.包括編碼至少一種目的外源基因序列。
2.權利要求1所述的慢病毒基因表達載體，其特征是元件i是S60PolyA尾巴。
3.權利要求1所述的慢病毒基因表達載體，其特征是元件ii是逆式四環素反應激活因子 rtTA2s-M2。
4.權利要求1所述的慢病毒基因表達載體，其特征是元件iii是血管內皮細胞特異性啟動子VEcad。
5.權利要求1所述的慢病毒基因表達載體，其特征是元件vi是四環素調控性白蛋白融合啟動子TRE/alb。
6.權利要求1所述的慢病毒基因表達載體，其特征是元件ν是熒光素酶基因 Iuciferase0
7.權利要求1-6所述的慢病毒基因表達載體中的任何一項，其特征是元件ν是選自一種或者多種治療性基因，一種或多種報告基因。
8.權利要求7所述的慢病毒基因表達載體，其特征在于所述外源目的基因在功能與表達上受啟動子iii影響。
9.權利要求1中所述的慢病毒基因表達載體在將遺傳序列物質轉入細胞的方法中的用途。
10.權利要求9所述的用途，其中所述細胞為血管內皮細胞。
11.權利要求9所述的用途，其中所述細胞為神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞。
全文摘要
本發明涉及一種慢病毒載體。具有組織特異性兼備可調控性雙基因表達。其特征在于具有沿著5’至3’方向至少包括下列元件polyA60尾巴、逆式四環素反應激活因子(rtTA2s-M2)、血管內皮鈣啟動子(VEcad)，四環素調控性白蛋白融合啟動子(TRE/alb)、熒光素酶基因(luciferase)。本發明構建的載體的雙基因表達盒采用反式表達的方式，最大限度減少了外源性核苷酸序列片段，使其可插入有容量限制的慢病毒載體，并對插入的熒光素酶基因不作限定，可以自由選擇外源性目的基因與可調控性啟動子搭配，該載體表達盒在不需要提高慢病毒量滴度轉染細胞的同時既能保持外源性目的基因可控性表達且顯著提高外源基因的表達效率。
文檔編號A61P35/00GK102154368SQ201010110290
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月11日 優先權日2010年2月11日
發明者張文煒, 楊光華, 王 華 申請人:上海比昂生物醫藥科技有限公司