蛋白質賴氨酸乙酰化修飾對代謝的調控及其應用的制作方法

專利名稱：蛋白質賴氨酸乙酰化修飾對代謝的調控及其應用的制作方法
技術領域：
本申請涉及生物技術領域。具體地說，本申請涉及通過蛋白質(如酶)賴氨酸乙酰化修飾對代謝的調控及其應用。
背景技術：
乙酰化修飾是通過乙酰基轉移酶(Acetyltransfearases)將乙酰基團加到蛋白質內部賴氨酸殘基的ε-NH2上，通過去乙酰化酶(Deacetylases)移去乙酰基團，是一種可逆的動態的修飾，通過改變被修飾蛋白質的電荷和空間結構來改變蛋白活性(Yangand Seto 2007)。自1958年第一次在組蛋白上發現乙酰化修飾以來，有將近200種蛋白質被發現并實驗證實有乙酰化修飾，包括許多重要的轉錄調控因子，如p53、RB、NF-K B、E2F1和 HIF-I α等，因而乙酰化修飾參與調控細胞凋亡、亞細胞定位、DNA和蛋白質相互作用、DNA 復制和修復、DNA轉錄活性及蛋白質穩定性等眾多重要的生命活動，乙酰化修飾逐漸被認為是一種重要的翻譯后修飾而被廣泛研究。近年來，人們采用質譜和免疫沉淀等新技術與新方法研究鼠肝線粒(Kim SC, S. R. et al. 2006)和人肝組織乙酰化修飾的底物蛋白，篩選得到一系列的乙酰化底物蛋白， 發現乙酰化修飾同生物體內的各種代謝酶類的活性調控密切相關，并且在體外和體內試驗都證明了這一點。同樣，在原核生物中也發現乙酰化修飾同代謝酶類的活性密切相關。真核生物的乙酰化酶與去乙酰化酶真核生物蛋白質的乙酰化最先在酵母(hast)等模式生物的組蛋白中被發現。乙酰化的生物功能最先被確定為調節組蛋白的結構進而影響相關基因的轉錄。參與組蛋白乙酰化修飾的調節酶分為乙酰基轉移酶(Histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDACs) 其中 HAiTs 包括 P300、CBP、GCN5 等。已知的 HDACs 有多種，在調節細胞組蛋白乙酰化的過程中有不同的功能。HDACs的共同特征是受一類抑制劑TSA(Tricostatin A)及其類似物小分子的抑制。乙酰化后來被發現也修飾組蛋白之外的蛋白。P53是最先被發現的受乙酰化調控的非組蛋白轉錄調控因子之一。后來陸續發現的其他很多轉錄調控因子活性也受乙酰化修飾調控。和組蛋白一樣，轉錄調控因子也是核內蛋白，它們的乙酰化與去乙酰化也是受到 HATs與HDACs的調控。在對酵母的代謝研究過程中人們發現酵母的代謝也受到乙酰化修飾的調控。參與酵母乙酰化修飾的乙酰化酶包括GCN5等，而其去乙酰化酶則是一類與HDACs完全不同的酶，其中最著名的去乙酰化酶是Sir2。Sir2參與的去乙酰化過程需要NAD+與乙酰輔酶 A(Acetyl-CoA)的參與，Zn2+離子也是必不可少的輔基。TSA等抑制組蛋白去乙酰化酶的抑制劑不能抑制Sir2的酶活力，其去乙酰化產物之一的NAMfcicotimamide)則被通常用于抑制Sir2的催化活力。調節Sir2活力可以明顯影響酵母代謝活性。在人鼠等脊椎動物細胞內發現了至少7個Sir2蛋白的類似物，分別被命名為 SirTl-7。盡管到目前它們是否都具有去乙酰化酶活力還沒有完全被確定，但是至少可以肯定它們都與細胞能量代謝相關，它們的酶活力也都能夠被NAM所抑制。目前開發的很多NAM 分子結構類似物不但可以抑制SirT，還能夠對一些SirT具有特異性。通過抑制劑或激活劑調節HATs，HDACs與SirT活力可以調節細胞的能量代謝與細胞分裂，用于治療包括腫瘤、延長壽命及減緩衰老等醫用目的。已經用于臨床與實踐的 SirTl激活劑包括Resveraltol，用于腫瘤治療的HDACs抑制劑等。原核生物的乙酰化酶與去乙酰化酶乙酰-CoA 合成酶(Acetyl-Coenzyme Synthetases，ACQ 是原核生物中發現的第一個受乙酰化修飾調控的代謝酶(V. J.Marai 2002)，此后在原核生物中又發現 Escherichia coli的趨化調節蛋白CheY (Barak R 2004)和古細菌硫礦硫化葉菌P2的染色質蛋白AlbaGt印hen D.Bell 2002 ；Victoria L. Marsh 2005)等也是受賴氨酸的乙酰化修飾調控。其中，以對Mlmonella enterica的ACS研究最為透徹，并且在真核生物的ACS中也得到了印證。在S. enterica中，負責對ACS乙酰化修飾的酶分別是乙酰基轉移酶Pat (V. J. Starai and Escalante-Semerena 2004)和去乙酰化酶 CobB (V. J. Marai 2002)，其中 Pat負責對ACS進行乙酰化修飾，CobB負責對其進行去乙酰化修飾，這是目前Mlmonella enterica中唯一已知的一對乙酰化修飾酶。Starai等人發現，Pat的乙酰基轉移酶作用可以有效的阻斷ACS的腺苷化作用，當 ACS的609位賴氨酸被乙酰化修飾時，ACS的活力就被關閉，不能合成乙酰-CoA。而CobB則能夠使609-賴氨酸去乙酰化，通過控制ACS的乙酰化狀態進而調控它的活力(V. J. Starai, Jeffrey G. Gardner et al. 2005)。Marai等人進一步認為乙酰化修飾能夠調節所有 AMP-生成酶家族，包括非核糖肽合成酶、熒光素酶、芳基-CoA和乙酰-CoA合成酶，并推測賴氨酸的乙酰化修飾是在真核和原核生物中都普遍存在的一種調節機制。在表型試驗方面， 當ACS在乙酰基轉移酶Pat的作用下被修飾，處于乙酰化失活狀態，不能夠利用乙酸鹽合成乙酰-CoA，也就不能利用乙酸鹽而不能在乙酸鹽培養基上生長；而CobB的去乙酰化作用能夠激活ACS，使其保持一定去乙酰化狀態，恢復ACS的活力，進而調控乙酰-CoA的合成，促使S. enterica能利用乙酸鹽和丙酸鹽形成乙酰-CoA滿足自身生長的需要。如果敲除掉去乙酰化酶CobB (cobB-)，這時就可以觀察CobB缺失的S. enterica菌株不能在以低濃度乙酸鹽(< IOmM)為唯一碳源和能源的基本培養基上生長(V. J. Starai, Jeffrey G. Gardner et al. 2005)。Stephen D. Bell等在研究古細菌硫礦硫化葉菌P2時發現，古細菌DNA結合蛋白Alki存在乙酰化和去乙酰化兩種狀態，對DNA轉錄有調節作用，而且它能夠被古細菌的 Sir2同源蛋白去乙酰化，如用Sir2同源蛋白處理體外重建轉錄系統，可以觀察到轉錄抑制現象。深入研究發現，Alki是在Lysl6上被乙酰化修飾而受調控的，對該位點進行乙酰化修飾的是乙酰基轉移酶I^at，并指出Pat的功能是很保守的，不僅在古細菌中存在，而且在真細菌中也存在(St印hen D.Bell 2002)。Barak R等人在研究Ε. coli的化學趨化蛋白CheY時發現，CheY的乙酰化是受ACS 修飾的，這與已經發現的ACS和Alki的乙酰化修飾酶均不同。在ACS的乙酰化修飾反應中， 乙酸鹽或乙酰-CoA可能是ACS乙酰化的底物，且發現CheY的乙酰化位點集中在C末端附近，主要包括91，92，109，119，122和126的賴氨酸。因此CheY同一些真核的信號蛋白比較類似，同樣經歷了蛋白的磷酸化和多乙酰化，只是乙酰化的位點集中在特定的區域(Barak R 2004)。Ε. coli的Rim蛋白被發現能對核糖體蛋白進行乙酰化修飾Woshikawa A，Isono Set al. 1987 ；Tanaka S,Matsushita Y et al. 1989)。已有研究發現Ε. coli 中的核糖體蛋白S18、S5和L12能夠被Rim蛋白乙酰化修飾，包括RimI，RimJ，RimL等。另有研究表明，在 E. coli中表達真核生物的α -1胸腺素，發現它是被乙酰化修飾的，而RimJ敲除的E. coli 表達的α -1胸腺素則是沒有乙酰化修飾的，這說明了 RimJ能對真核生物的α _1胸腺素起乙酰化修飾作用，同時也進一步說明了乙酰基轉移酶的功能是比較保守的(Hongqing Fang, Xu Zhang et al. 2009)。

發明內容
本發明人發現對位于真核細胞的細胞質和線粒體中的催化中間體代謝的酶類和對于細菌細胞中參與中心代謝的酶類而言，賴氨酸乙酰化是一種主要的修飾方式。實驗顯示，賴氨酸乙酰化代表了一種在進化上保守的、響應營養獲取量和代謝狀態的代謝調控機理。它及時地感受胞內的能量狀態、靈活地調節全局酶的反應方向、反應速度或穩定性，以保證細胞能夠因此合理地響應外部環境的變化。這樣一種即時、靈活、雙向、全局地調控細胞代謝的機制，是從細菌到人在進化上保守的一種代謝調控網絡。因此，本發明涉及調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于調節生物能量代謝的物質中的應用。本發明另一方面涉及調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于改善或緩解與代謝相關的疾病或失調的物質中的應用。本發明的其它優選技術方案和優點將在下文結合附圖和實施例作進一步詳細描述。


圖1 S. enterica中心代謝酶類的乙酰化修飾。(A) S. enterica中心代謝酶類整體水平的乙酰化修飾；⑶S. enterica中西代謝酶類乙酰化修飾的SILAC相對定量結果。圖中酶類縮寫如下AceA =Isocitrate Lyase (異檸檬酸裂解酶)；AceK IsocitrateDehydrogenase Kinase/Phosphatase (異檸檬酸脫氫酶激酶 / 磷酸酯酶)； ACO =Aconitase (烏頭酸酶)；ACS =Acetyl-CoA Synthetase (乙酰 CoA 合成酶)；AE Aldosel-印imerase (酸糖 1_ 表異構酶)；ALD :Fructose_bisphosphate Aldolase (果糖二磷酸醛縮酶)；APase =Acylphosphatase (酰基磷酸酯酶)；CS =Citrate Synthase (檸檬酸合成酶)；ENL :Enolase (烯醇酶)；FBPase :Fructose_l，6-bisphosphatase (果糖 _1， 6_ 二磷酸酶)；FH:Fumarate Hydratase (延胡索酸水合酶)；GapA :Glyceraldehyde-3_P hosphateDehydrogenase (磷酸甘油酸脫氫酶)；GK :Glucose Kinase (葡萄糖激酶)；GPI Phosphohexose Isomerase (磷酸己糖異構酶)；ICDH Isocitrate Dehydrogenase (異梓檬酸脫氫酶)；MDH:Malate Dehyrogenase (蘋果酸脫氫酶)；MS :Malate Synthase (蘋果酸合成Sl ) ；PDH pyruvate Dehydrogenase (丙||酸月兌S1SI) ；PEPCase :Phosphoenolpyruvate Carboxylase (磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)；PEPCK :Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (磷
5酸烯醇丙酮酸羧激酶)；Pi7K =Phosphofructokinase (磷酸果糖激酶)；PGK Phosphoglycerate Kinase (磷酸甘油酸激酶)；PGM :Phosphoglycerate Mutase (磷酸甘油變位酶)；PK =Pyruvate Kinase(丙酮酸激酶)；PTS =Glucose-Specific Phosphotransferase Enzyme IIA Component (葡萄糖特異性磷酸轉移酶 IIA 組分)；SCS Succinyl-CoA Synthetase (A ^j^BI) ；SDH =Succinate Dehydrogenase ( M
珀酸脫氫酶)；TPI Triose Phosphate Isomerase (磷酸丙糖異構酶)；50S L4 :ribosomal protein (核糖體蛋白)50S L4 ；50S Lll :ribosomal protein (核糖體蛋白)50S Lll ；50S L14 :ribosomal protein (核糖體蛋白)50S L146 ；50S35 :ribosomal protein (核糖體蛋白)50S L35.圖2 S. enterica乙酰基轉移酶Pat敲除突變株(Δ pat)和去乙酰化酶CobB敲除突變株(AcobB)的生長表型。(A)wt(^)，Apat(A), Δ cobB ( ■ ), Δ pat/Δ cobB (〇) 在5. OmM葡萄糖和檸檬酸基本培養基上的生長表型；(B)野生型S. enterica在葡萄糖(紅色，左上)和檸檬酸(藍色，右下)基本培養基含有(▲)或沒有(眷)煙酰胺的生長曲線；(C) S. enterica在1 標記的葡萄糖和檸檬酸基本培養基上的體內代謝流。胞內的代謝流分布同13C標記和GC-MS來測定，箭頭表示凈代謝流的方向，箭頭寬度與代謝流的大小對應；(D) Δ pat和Δ cobB代謝流比值變化結果。糖酵解(用vGapA表示)，糖異生(用vP。kA表示)，乙醛酸旁路(用^cek表示)和TCA循環(用Vioti表示)的代謝流均被定量，并計算 VGapA/VpckA和VA。eA/VlmH的代謝流比值，每個數據均是三次獨立試驗的平均結果，并加上標準偏差SD。圖3乙酰化修飾激活EHHADH和MDH。(A)脫乙酰化酶抑制劑提高EHHADH的乙酰化水平。免疫沉淀異源表達的EHHADH，再用乙酰化賴氨酸抗體進行免疫印跡驗證。(B)用 iTRAQ對EHHADH乙酰化修飾進行定量分析。肽段定量根據iTRAQ標簽相對密度計算。(C) 脫乙酰化酶抑制劑刺激胞內EHHADH活力。此實驗以及后續實驗結果圖都是來源于3次重復結果。(D)脂肪酸誘導EHHADH乙酰化修飾和活力。用HEK293T細胞內表達異源EHHADH 來檢測EHHADH乙酰化修飾和活力。(E) MDH乙酰化修飾。在HEK293T細胞內表達帶Myc標簽的MDH，然后用免疫印跡檢測乙酰化修飾。(F)MDH定量質譜分析。在HEK293T細胞內表達帶FLAG標簽的MDH，免疫沉淀后用傅立葉變換-離子回旋共振質譜法(FTICR)檢測。(G) 葡萄糖增強MDH乙酰化修飾。(H)乙酰化修飾激活MDH。以Actin為內參檢測Chang，s和 HEK293T細胞內的內源和異源表達的MDH乙酰化修飾與活力。(I)體外脫乙酰化處理導致 MDH失活。用脫乙酰化酶CobB處理免疫沉淀獲得的MDH，然后檢測MDH酶活力。陰性對照為不添加CobB必需輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。(J)葡萄糖激活MDH。實驗設計依照本圖H部分，只是用葡萄糖處理培養的細胞。圖4乙酰化修飾(A和B)導致ASL失活。ASL乙酰化修飾。在HEK293T細胞中表達FLAG標記的ASL或ASLI^88R，免疫沉淀后用乙酰化賴氨酸抗體(A)或乙酰化K288抗體 (B)進行免疫印跡檢測。(C)外源氨基酸抑制ASL的乙酰化修飾。HEK293T細胞用不同濃度氨基酸處理，然后通過免疫沉淀獲得ASL。(D)曲古抑菌素A和煙酰胺抑制ASL。在經曲古抑菌素A和煙酰胺處理的HEK293T細胞內表達野生型ASL和突變體ASL_D88R(活力為野生型的132%)。以全蛋白為參照檢測免疫沉淀獲得的ASL活力。(E)氨基酸激活ASL依賴于ASL第288位賴氨酸的乙酰化修飾。在用不同濃度氨基酸培養的HEK293T細胞內表達野生型ASL和突變體。(F，G)葡萄糖對ASL乙酰化修飾和酶活力的影響。在用不同濃度葡萄糖培養的HEK293T細胞內表達ASL，經免疫沉淀后檢測ASL的乙酰化修飾和酶活力。(H)體外脫乙酰化修飾激活ASL。體外脫乙酰化修飾系統類似于圖21。圖5乙酰化修飾破壞PEPCKl穩定性。(A)葡萄糖誘導PEPCKl乙酰化修飾水平。(B) 氨基酸降低PEPCKl乙酰化修飾水平。(C)葡萄糖誘導胞內PEPCKl含量下降。采用PEPCKl 抗體檢測胞內PEPCKl含量。(D)曲古抑菌素A和煙酰胺處理降低了胞內PEPCKl含量。(E) 葡萄糖降低PEPCKl穩定性。在實驗起始時加入放線菌酮，抑制HEK293T細胞的蛋白質翻譯。 用免疫印跡檢測胞內PEPCKl蛋白質豐度。(F)抑制脫乙酰化酶可使野生型PEPCKl不穩定性增加，但對乙酰化修飾缺陷突變體不起作用。圖6乙酰化修飾調控中心代謝酶類的活性。㈧中心代謝關鍵酶在wt，Δ cobB和 Apat菌株中表達的乙酰化水平的差異。帶有His標簽的GapA，AceA和AceK蛋白分別在 wt, AcobB和Δ pat菌株中過表達并純化。使用等量的每種蛋白并檢測乙酰化修飾的水平。 (B)和(C)用Pat進行乙酰化處理和CobB進行脫乙酰化處理后GapA，AceA和AceK的活力。 帶有His標簽GapA，AceA和AceK蛋白分別在野生型的S. enterica中表達并純化，并在體外用Pat進行乙酰化處理或CobB進行脫乙酰化處理。(B)通過Pat和CobB處理來交互調控GapA的糖酵解和糖異生活力。(C)通過體外的Pat和CobB處理來交互調控AceA的活力和調控AceK控制I⑶H的活力。
具體實施例方式鑒于Kim等人在鼠線粒體乙酰化底物蛋白的篩選結果，發明人設想S. enterica體內也應該存在這廣泛的乙酰化修飾現象。發明人嘗試將免疫沉淀的高靈敏和質譜分離的高分辨率相結合，首次對S. enterica的Lys乙酰化底物蛋白進行了蛋白組學水平上的掃描， 結果發現有191個蛋白的235個肽段是被乙酰化的，其中約有50%的蛋白是代謝相關的，且發現90%的中心代謝蛋白是被乙酰化修飾的，也有相當一部分蛋白與S. enterica的毒性相關。根據以往的研究結果，發明人設想Pat和CobB是目前唯一已知的一對乙酰化修飾酶，故分別構建了 S. enterica的乙酰基轉移酶Pat敲除突變株(pat null mutant)、去乙酰化酶CobB敲除突變株(cobB null mutant)、乙酰基轉移酶Pat和去乙酰化酶CobB雙敲除突變株(pat/cobB double null mutant)，分別將野生型的S. enterica及這些衍生菌在LB 營養培養基、葡萄糖和檸檬酸基本培養基中培養，并且分別在對數期中期和穩定期收菌，考察在不同培養條件下，不同菌體內的乙酰化修飾會有如何的變化。結果發現，S. enterica的賴氨酸-乙酰化底物蛋白幾乎覆蓋了 S. enterica所有的代謝過程。這些蛋白或與中心代謝有關，或與毒性相關，或與能量代謝有關，或與碳骨架的合成有關，包括糖酵解、糖異生、 檸檬酸循環、乙醛酸循環、氨基酸代謝、尿素循環、電子氧化呼吸傳遞鏈、碳水化合物代謝、 脂多糖生物合成、tRNA生物合成、核苷酸代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、外膜蛋白代謝、維生素代謝和卟啉代謝等。如果考慮方法本身存在的不足而漏掉的沒有被檢測鑒定到的蛋白，乙酰化底物蛋白的范圍將大大超出上述代謝蛋白的范疇，其覆蓋范圍之廣超乎想象。尤其是，發明人發現S. enterica的中心代謝相關酶類絕大部分都是受到乙酰化修飾調控的，如TCA循環相關的蛋白有7個，糖酵解相關的蛋白有9個，糖異生相關的蛋白有9個，這與在鼠肝線粒體和肝組織中的研究結果相似，從而進一步證明了賴氨酸乙酰化修飾可能是從真核生物到原核生物都十分保守的調控方式，而且賴氨酸乙酰化修飾在原核生物S. enterica中是一種非常廣泛的調控方式，它可能是通過對中心代謝關鍵酶類的“微調”進而實現從整體水平上的調控。上述試驗還為發明人未來乙酰化的研究向遺傳學和分子生物學縱深方向發展提出了很多新的研究方向，比如至今為止尚只在S. enterica中發現一種乙酰基轉移酶I^at 和去乙酰化酶CobB，面對如此眾多的乙酰化底物蛋白，發明人有理由相信在S. enterica 中肯定還存在其他的乙酰基轉移酶和去乙酰化酶。Driscoll等人在酵母中新發現了一種與Sir2沒有任何同源的乙酰基轉移酶就是一個很好的例子(RobertDriscoll 2007)； Jeffrey G. Gardner等人在研究B. subtilis的AcsA的乙酰化修飾時發現，AcsA的乙酰化由乙酰基轉移酶AcuA負責修飾，而AcuC和SrtN則負責對AcsA進行去乙酰化來保持其乙酰-CoA合成的活性，其中SrtN則需要NAD+作為輔酶，而AcuC的活性發揮不需要NAD+，且在 S. enterica中沒有發現有AcuC的同源蛋白(Jeffrey G. Gardner and Escalante-Semerena 2009)。為了進一步確認代謝酶的乙酰化修飾酶，發明人又克隆了其他的已經報道的乙酰化修飾酶SpeG，RimI，YjgM和^icA,并在體外對GapA，AceA和AceK進行了乙酰化修飾處理， 發現這些乙酰化酶并不能對代謝酶類進行乙酰化修飾，在S. enterica體內到目前為止只存在一對乙酰化修飾酶Pat和CobB負責對代謝酶類的乙酰化修飾。根據結果，發明人認為賴氨酸乙酰化在原核生物S. enterica和哺乳動物細胞之間在進化上是很保守的。雖然早已有很多的實驗事實表明可能存在這種關系，但發明人是第一次在原核生物S. enterica中證明了乙酰化修飾是一種廣泛存在調控方式。綜合本說明書中生長表型、生化試驗和定量RT-PCR分析試驗結果，認為 S. enterica在不同碳源和不同生長時期，胞內的乙酰化水平最終是由乙酰基轉移酶Pat和去乙酰化酶CobB的共同轉錄水平決定的，從而完成了在不同碳源條件下不同代謝通路的轉換。雖然對Pat和CobB轉錄的具體機制還不清楚，但胞內乙酰-CoA的水平及乙酰-CoA/ CoA-SH的比值可能是調節碳源和能量代謝一個重要的信號。本發明一個方面提供了調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于調節生物能量代謝的物質中的應用。在一個優選的實施方案中，所述調節酶乙酰化水平的物質選自乙酰化酶或脫乙酰化酶、增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶基因轉錄、翻譯或表達的物質、增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶的酶活性的物質。在一個更優選的實施方案中，所述乙酰化酶或脫乙酰化酶選自賴氨酸乙酰轉移酶、依賴NAD的脫乙酰化酶、組蛋白脫乙酰酶或SIRT家族脫乙酰酶。“增強或抑制某基因轉錄、翻譯或表達”是本領域技術人員已知的技術。例如，可采用編碼乙酰化酶或脫乙酰化酶基因的反義序列來實現反義抑制。對于反義核酸的長度沒有特別的限制，但通常反義核酸片段的長度為lO-lOObp，較佳地為15-50bp，更佳地為 20-2^p。所用的反義核酸片段可以是一種或多種反義核酸片段，如果使用多種反義核酸片段，各反義核酸片段之間可以不存在重迭區域，也可存在重迭區域。另一種抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶基因轉錄及/或翻譯的物質可以是基因的(小)干擾RNA(SiRNA)。RNA干擾 (RNA interference)也是近年來發展起來的一種封閉基因表達的有效方法。它采用與目的基因同源的21-23核苷酸長的小干擾RNA轉染至靶細胞。RNA干擾的作用過程包括兩個步驟一起始步驟和效應步驟。在起始步驟中，導入的dsRNA被特異性識別dsRNA的RNaseIII 家族成員消化成21-23nt大小的小干擾RNA，每個siRNA的3’端都有2 3個突出核苷酸， 5’端帶磷酸基團。在效應步驟中，siRNA與核酸酶復合物(包括核酸外切酶，核酸內切酶，解旋酶和類RecA蛋白等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA induced silence complex, RISC)，RISC在ATP存在的情況下將siRNA解鏈成單鏈從而激活RISC，激活后的RISC通過堿基配對特異性識別目的基因的mRNA，繼而將mRNA降解。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈 RNA復合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產生合成的雙鏈RNA復合物。另外，調控乙酰化酶或脫乙酰化酶表達的調控蛋白或順式作用位點序列也包含在本發明的范圍內。本領域技術人員也可以采用增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶的酶活性的物質來實現對能量代謝的調控。這些物質是本領域技術人員已知的，例如組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)或SIRT家族脫乙酰酶抑制劑煙酰胺(NAM)，或者是本領域技術人員根據常規篩選實驗所能確定的。該篩選實驗包括使乙酰化酶或脫乙酰化酶與候選物質接觸， 然后測定乙酰化酶或脫乙酰化酶的活性，如果乙酰化酶或脫乙酰化酶的酶活性有上調或下調，則確定該候選物為增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶酶活性的試劑。在一個優選的實施方案中，蛋白是參與糖酵解、糖異生、三羧酸循環、尿素循環、月旨肪酸代謝、糖元代謝的酶。在更優選的方案中，所述酶選自磷酸甘油醛脫氫酶、烯酰輔酶A 水合酶/3-羥酰基-輔酶A脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、精氨基琥珀酸裂解酶、酸磷烯醇丙酮酸羧激酶、異檸檬酸裂解酶、或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酯酶。本發明不僅適用于原核生物，也適用于真核生物。在優選的實施方案中，本發明所述的生物是細菌，例如沙門氏菌。在另一個優選的實施方案中，本發明所述的生物宜為哺乳動物，包括人、家畜和農場動物、非人靈長類、以及動物園、運動場動物，或寵物，如狗、馬、 貓、奶牛等。在發現的所有這些乙酰化底物蛋白中，有很多是與代謝相關的，因此通過調節底物蛋白的乙酰化水平，就能夠實現對細胞代謝的調控，進而改善或緩解與代謝相關的疾病或失調。能通過本發明來改善或緩解的疾病或失調例如包括不受控細胞增殖性疾病如癌癥(因為已知慢性炎癥反應是不受控細胞增殖性疾病的一個因素)，例如包括但不局限于， 癌、淋巴瘤、胚母細胞瘤、肉瘤和白血病。更特定的癌癥例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、腸胃癌、胰癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、 肝細胞癌和各種類型的頭頸癌。能通過本發明來改善或緩解的糖類代謝和/或脂類代謝相關的失調或疾病，例如包括但不局限于，I型糖尿病、II型糖尿病、不當葡萄糖耐受性、胰島素抗性、高血糖癥、高脂血癥、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、血脂異常等。能通過本發明通過抑制病原微生物的代謝來抑制病原微生物的生長或休眠，所述病原微生物可以是例如大腸桿菌、鉤端螺旋體、葡萄球菌等胞外感染菌或結核桿菌、沙門氏菌、萊姆氏菌、李斯特菌等胞內感染菌，具體包括，但不局限于，葡萄球菌(金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和鏈球菌(無乳鏈球菌、糞鏈球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌)；革蘭氏陰性球菌(淋病雙球菌)和革蘭氏陰性桿菌如腸桿菌，例如大腸桿菌、流感桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌屬；克雷白氏桿菌屬(肺炎桿菌)、腸桿菌屬(產氣腸桿菌、聚團腸桿菌)、粘質沙雷氏桿菌、變形桿菌屬(奇異變形桿菌、雷特格氏變形桿菌、普通變形桿菌)、普羅威登斯桿菌、耶爾森菌、不動桿菌、假單胞菌屬(綠膿假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌)、脆弱擬桿菌、 消化鏈球菌、梭狀芽胞桿菌、支原體屬、分枝桿菌(結核分枝桿菌)、萊姆氏菌、李斯特菌、鉤端螺旋體等。能 通過本發明通過調節微生物的代謝來改良實驗室或工業菌種，例如包括但不局限于大腸桿菌、放線菌、枯草桿菌等細菌；黑曲霉、啤酒酵母、甲醇酵母等工業真菌。下面結合具體實驗，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另有描述，本發明的實施將采用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。這些技術在下列文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷 (D. N. Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B. D. Hames 和S. J. Higgins編輯· 1984)；《蛋白質純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag, N. Y.)， 以及《實驗免疫學手冊》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。一.以人肝為模型的研究工作利用質譜技術鑒定了 1，300多條乙酰化短肽，并與1047條不同的人類蛋白相對應，其中包括以前尚未報道發現乙酰化的703個蛋白(實驗1. 1)。進一步分析發現，人肝組織中參與糖酵解(glycolysis)、糖異生(gluconeogenesis)、三羧酸循環(tricarboxylic acid (TCA) cycle)、尿素循環(urea cycle)、脂肪酸代謝(fatty acidmetabolism)和糖元代謝(glycogen metabolism)的幾乎所有的酶都是被乙酰化的(實驗1. 2)。進而鑒定了其中四條途徑(脂肪酸氧化、三羧酸循環、尿素循環和糖異生)上各一個代表性的酶(實驗見第三部分)。其中對這些蛋白脫乙酰化起主要作用的有組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase HDAC I and II)(抑制劑 trichostatin A，TSA)和 SIRT 家族脫乙酰酶(SIRT family deacetylases)(抑制劑煙酰胺，NAM)(實驗1. 3)。發明人進而發現，代謝燃料如葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的濃度影響代謝酶的乙酰化狀態(實驗1. 4)。實驗1. 1 人肝蛋白質“乙酰化組”為了研究非核蛋白乙酰化修飾，發明人對人肝組織進行了亞細胞分級分離，獲得了細胞核、線粒體和細胞質三種組分。線粒體和細胞質蛋白先用胰蛋白酶處理，然后用乙酰化賴氨酸抗體進行富集和純化，得到乙酰化肽段。隨后，利用多維色譜-串聯質譜聯技術 (LC/LC-MS/MS)進行鑒定，結果鑒定了 1300多個乙酰化肽段，這些肽段代表了 1047個不同蛋白，其中703個蛋白首次發現乙酰化修飾現象。Kim等人在小鼠肝臟中鑒定了 195個乙酰化蛋白，其中135個(70%)也被發明人的實驗所證實，說明發明人的蛋白質組實驗的覆蓋率較高。Choudhary等在人白血病細胞株中發現了 1750個乙酰化的蛋白，但只有240個出現在發明人的質譜數據中。這三組數據的比較結果表明蛋白乙酰化修飾在人和小鼠的肝臟中比較類似，但在肝臟和白血病細胞中差異較顯著。實驗1. 2 人肝蛋白中參與中間代謝的酶絕大部分被乙酰化
本實驗比較了乙酰化蛋白和肝臟全蛋白質組，發現較多的參與中間代謝的酶蛋白被乙酰化修飾。事實上，糖酵解、糖異生、三羧酸循環、尿素循環、脂肪酸代謝以及糖原代謝途徑的所有酶都存在乙酰化修飾。這可能是由于只有少量的核糖體蛋白被乙酰化修飾(80 個胞質核糖體蛋白只有7個被乙酰化修飾)，降低了核糖體蛋白在總乙酰化修飾蛋白中的豐度，使得其他乙酰化修飾蛋白能被鑒定。這些結果表明發明人發現的乙酰化修飾不僅在細胞內普遍存在，而且在細胞代謝中很可能有很廣泛的調節作用。因此發明人研究了四個代謝途徑上的一些關鍵酶的乙酰化修飾作用。實驗1. 3 人肝組蛋白脫乙酰酶histone deacetylase HDAC I and II (抑制劑 trichostatin A，TSA)和 SIRT 家族脫乙酰酶 SIRT family deacetylases (抑制劑煙酰胺， NAM)對代謝酶的脫乙酰化作用酰輔酶A水合酶/3-羥酰基-輔酶A脫氫酶(巴豆酸酶，enoyl-Coenzyme Ahydra tase/3-hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase,EHHADH,EC 1.1.1.35)是被乙酰化修飾的。用人肝組蛋白脫乙酰化酶HDAC I and II抑制劑曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA) 和SIRT家族脫乙酰化酶抑制劑煙酰胺(nicotinamide，NAM)處理細胞后，EHHADH的乙酰化水平增加了 80% (圖3A)。曲古抑菌素A和煙酰胺處理可使EHHADH的第171位賴氨酸乙酰化水平從43. 5% 增加到62%，第346位賴氨酸乙酰化水平從46. 8%增加到77. 8% (圖3B)。同時相應的非乙酰化肽段由于曲古抑菌素A和煙酰胺的處理而降低。EHHADH突變體(四個推測的乙酰化修飾賴氨酸殘基都被替換成谷胺酰胺， EHHADH4KQ)的乙酰化修飾水平降低，而且活力不再受曲古抑菌素A和煙酰胺的調節(圖 3C)。另外，曲古抑菌素A和煙酰胺處理細胞可使蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH, ECl. 1. 1. 37)的乙酰化水平從26. 9%增加到67. 4%，而且出現三重和四重乙酰化修飾現象(圖3E和3F)。在HEK293T細胞中，曲古抑菌素A和煙酰胺處理可激活野生型MDH，但不能激活突變體(四個乙酰化修飾賴氨酸殘基都被替換成精氨酸)(圖3H)。免疫印跡分析顯示曲古抑菌素A和煙酰胺處理使精氨(基)琥珀酸裂解酶 (argininosuccinate lyase, ASL, EC4. 3. 2. 1)第 288 位賴氨酸乙酰化水平增加了 2. 8 倍 (圖4B)。培養基中添加氨基酸降低了 ASL總體乙酰化水平以及第288位賴氨酸乙酰化水平(圖4C)。曲古抑菌素A和煙酰胺處理導致ASL活力下降，而添加氨基酸會使其活力上升，表明乙酰化修飾抑制了 ASL的活力(圖4D和圖4E)。ASL突變體(第288位賴氨酸殘基替換成精氨酸)則沒有類似的現象(圖4D和圖4E)。曲古抑菌素A和煙酰胺處理HEK293T和Chang肝細胞導致酸磷烯醇丙酮酸羧激酶 (phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCKl，EC4. 1. 1. 32)含量下降 70% (圖 5)。即使在不含葡萄糖培養基或添加氨基酸條件下，曲古抑菌素A和煙酰胺處理 都會導致PEPCKl失去穩定性。此外，曲古抑菌素A和煙酰胺處理不能改變突變體PEPCK13KR(3 個賴氨酸殘基都被突變成精氨酸)的穩定性。實驗1. 4 人肝細胞中代謝酶乙酰化與代謝燃料的關系培養基中添加脂肪酸可使EHHADH的乙酰化水平和活力分別增加1. 7倍和1. 3倍(圖3D)。因此，EHHADH的乙酰化水平能被細胞外燃料調節，說明乙酰化修飾在生理方面具有調節EHHADH和脂肪酸代謝的作用。高濃度的葡萄糖提高細胞內MDH的乙酰化水平約60% (圖3G)。因此外源氨基酸可能通過對第288位的賴氨酸殘基脫乙酰化修飾來激活ASL。發明人檢測了葡萄糖對ASL活力和乙酰化水平的影響，發現葡萄糖使ASL乙酰化水平增加了 2. 7倍(圖4F)，同時使其活力降低了 50% (圖4G)。ASL受氨基酸和葡萄糖共同調節現象說明乙酰化修飾在不同代謝途徑協調過程中具有非常重要的作用。高濃度的葡萄糖提高細胞PEPCKl乙酰化水平(圖5A)，但不含葡萄糖培養基中添加氨基酸則降低PEPCKl乙酰化水平(圖5B)。PEPCKl在不含葡萄糖培養基生長的細胞中較穩定，但在高糖培養基中不穩定(圖 5E)。二.以鼠傷寒沙門氏菌為模型的研究工作 利用質譜技術鑒定了 235條乙酰化短肽，并與191條不同的沙門氏菌蛋白相對應(表2，僅僅要說明部分)發明人的結果顯示鼠傷寒沙門氏菌的中心代謝酶被廣泛地乙酰化(90% )([實驗2. 1])。進一步生理和遺傳研究證明在沙門氏菌中，對中心代謝酶起乙酰化和脫乙酰化修飾的是一對乙酰化酶(Pat)和NAD依賴的脫乙酰化酶(CobB)[實驗 2. 2]，其生理功能是協同調控細菌對不同碳源轉換的適應[實驗2. 3]，而這一調控的結果得到細胞代謝流實驗的佐證[實驗2. 4]。總之，響應不同的碳源(發酵型碳源葡萄糖經酵解(glycolysis)相對于氧化型碳源檸檬酸經糖異生(gluconeogenesis))，細菌細胞中心代謝途徑酶的乙酰化、細胞的生長和細胞中中心代謝物的代謝流的狀態，這三者又表現出一些一致的差異。進一步的實驗還說明，Pat和CobB的轉錄在不同的碳源上具有不同特征 (Pattern)[實驗2. 5]，說明其表達有可能受碳源的差異調控。為得到乙酰化調控的直接證據，發明人進一步鑒定了其中控制糖酵解和糖異生方向的關鍵酶(磷酸甘油醛脫氫酶-glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GapA))以及決定三羧酸循環和乙醛酸旁路分叉點方向的兩個關鍵酶(異檸檬酸裂解酶-isocitrate lyase (AceA)和異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酯酶-isocitrate dehydrogenase (ICDH) kinase/phosphatase (AceK))。總之，代謝酶的可逆乙酰化，保證了細胞能夠通過及時地感受細胞內部的能量狀態和靈活地改變反應速度或方向來響應外部環境的變化。它代表了一種從細菌到人類都保守的代謝調控機理。實驗2. 1沙門氏菌在不同碳源上生長條件下的蛋白質“乙酰化組”為了研究原核生物中賴氨酸乙酰化修飾對代謝的整體調控機理，發明人分別在發酵性碳源葡萄糖和非發酵性碳源檸檬酸兩種生長狀態下檢測了 S. enterica蛋白總的乙酰化狀態。利用乙酰化賴氨酸特異性抗體來免疫沉淀分離被乙酰化修飾的肽段，并結合高分辨率的質譜技術，共鑒定到S. enterica中191個蛋白的235個肽段是被乙酰化修飾的。其中有50%的乙酰化蛋白是各種代謝相關的，且發現中心代謝90%以上的酶類是被乙酰化修飾的(圖1A)。利用SILAC定量分析技術發現15個中心代謝相關酶在響應不同碳源時它們的乙酰化狀態發生了改變，這些結果表明S. enterica在以葡萄糖為碳源時其乙酰化水平要高于以檸檬酸為碳源(圖1B)，這一點與發明人計數檢測到的乙酰化肽段結果相一致。實驗2. 2生理和遺傳實驗證明Pat和CobB是沙門氏菌中負責對代謝酶乙酰化和脫乙酰化修飾的一對酶在以葡萄糖為碳源時，相對于野生型的S.enterica，Δ pat (乙酰基轉移酶敲除突變株)菌株中心代謝酶類的乙酰化水平是降低的，而AcobB(去乙酰化酶敲除突變株)菌株中心代謝酶類的乙酰化水平則是上升的(圖1B)。當以檸檬酸為碳源時，AcobB菌株中心代謝酶類的乙酰化水平也比野生型高(圖1B)。另一方面，AcobB和Apat菌株的核糖體蛋白的乙酰化水平則沒有發生變化，這支持了一個概念——Pat和CobB是負責對S. enterica 的中心代謝酶進行可逆乙酰化和脫乙酰化修飾的一對主要修飾酶。 實驗2. 3 Pat和CobB的生理功能適應碳源的轉換一生長實驗通過比較野生型，Apat和AcobB菌株在不同碳源下的不同生長狀態，揭示了乙酰化修飾酶類在調控細胞適應不同碳源時的生理功能(圖2)。在葡萄糖基本培養基中， Δ cobB菌株(高乙酰化水平)的生長要比野生型快，在檸檬酸基本培養基中卻要比野生型長得慢(圖2Α)，而Apat菌株(低乙酰化水平)卻有著相反的生長狀態(圖2Α)，Apat/ Δ cobB雙突變株的生長表型與Δ pat菌株比較相似，這說明了脫乙酰化酶CobB不能對沒有被Pat乙酰化修飾的目標蛋白進行去乙酰化修飾(圖2A)。用脫乙酰化酶CobB的抑制劑 (6)NAM(煙堿)對野生型菌株進行處理，這類似于脫乙酰化酶突變，發現菌株在檸檬酸基本培養基上的生長抑制比較明顯，而在葡萄糖基本培養基上的生長受抑制則要輕微得多(圖 2B)，這與S. enterica在葡萄糖為碳源時體內代謝酶類的乙酰化水平要高于檸檬酸為碳源時的結論相一致(圖1)。實驗2. 4 Pat和CobB的生理功能適應碳源的轉換一代謝流實驗發明人以13C標記的葡萄糖或檸檬酸為碳源，結合GC-MS技術來檢測了 Pat和CobB 對S. enterica體內的代謝流分布調控的生理功能。發明人發現在葡萄糖和檸檬酸為碳源時，S. enterica具有不同的代謝流分布模式。在檸檬酸為碳源時，乙醛酸旁路被激活，且糖異生途徑更活躍。發明人也定量比較了野生型，Δ pat和Δ cobB菌株的糖酵解(vGapA)，糖異生(vPckA)，三羧酸循環(vICDH)和乙醛酸旁路(vAceA)的代謝流來評價不同的代謝流和乙酰化狀態。發現在葡萄糖為碳源時，AcobB菌株的糖酵解/糖異生代謝流比值要比Apat 菌株高出2. 07倍(圖2D)，而野生型菌株的糖酵解/糖異生的代謝流比值要比AcobB菌株低47%，但要比Δ pat菌株高40. 7% (圖2D)。以檸檬酸為碳源，Δ pat菌株的乙醛酸旁路 /三羧酸循環的代謝流比值要比Δ cobB菌株高出2. 21倍(圖2D)，而野生型菌株的乙醛酸旁路/三羧酸循環的代謝流比值要比Apat菌株低55%，但要比AcobB菌株高43% (圖 2D)。這些結果加上上述葡萄糖對中心代謝酶類乙酰化水平影響的結果(Fig 1)說明了碳源相關的乙酰化修飾會影響各種代謝酶的活力，進而調控代謝流分布。實驗2. 5 Pat和CobB的轉錄在不同的碳源上具有不同特征(Pattern)發明人也研究了在不同碳源情況下pat和cobB的表達。通過實時反轉錄PCR分析，以16S rRNA為內參，發明人發現pat和cobB兩個基因不管是在葡萄糖還是檸檬酸為碳源時，它們在對數期的轉錄要比其它生長時期活躍(Fig 4A)。同樣，Pat和CobB的蛋白水平在對數期也是上升的(圖4B，fig. S6)。在穩定期的情況下，S. enterica在葡萄糖和檸檬酸為碳源時的pat mRNA/cobB mRNA的比值相似。當將豐富培養基培養的菌轉入葡萄糖基本培養基時，乙酰化水平在對數中期達到頂峰(圖4A)，而將豐富培養基培養的菌轉入檸檬酸基本培養基時，乙酰化在對數前期和早對數期均是下降的，然后逐漸回升并在對數后期和穩定期達到穩定(圖4A)。這說明低水平的乙酰化對細胞高效利用檸檬酸是有利的。雖然其機理Pat和CobB的轉錄調控機理仍待發明人探究，但這些結果表明，Pat和CobB通過不同水平的蛋白表達(或相對于總細胞的活力)來響應不同的碳源，以轉換不同代謝通路。三.乙酰化酶和脫乙酰化酶在代謝調控中的作用及其自身的表達調控和乙酰化靶點酶的功能驗證

前述實驗證明了對于中間(中心)代謝酶的可逆乙酰化是由乙酰化酶和脫乙酰化酶完成的，因此它們也就有可能成為控制代謝的重要操縱靶點，包括調控這些酶表達的調控蛋白或順式作用位點序列。這些酶的抑制劑是已有的公共試劑，但是，也說明了為特殊作用，可以設計特殊的抑制劑。乙酰化相關酶類賴氨酸乙酰轉移酶(Pat)依賴NAD的脫乙酰化酶(CobB) :Sir2家族酶。histone deacetylase HDAC I&II (抑制劑 trichostatin A，TSA)-組蛋白脫乙酰酶SIRT family deacetylases (抑制劑煙酰胺，NAM)-SIRT 家族脫乙酰酶2.靶點酶(被乙酰化和被脫乙酰化的代謝酶)和乙酰化位點，它們直接在代謝中發揮作用1).細菌的三個重要的酶細菌糖酵解/糖異生[實驗3. 2. 1. 1]glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GapA)-磷酸甘油醛脫氫酶(K331)， 乙酰化調整酶反應方向乙酰化加強糖酵解，脫乙酰化加強糖異生。發明人將GapA在沙門氏菌pat、cobB突變菌株中表達并純化，在體外用賴氨酸乙酰化修飾多克隆抗體進行免疫印跡檢測，并以沙門氏菌野生型菌株中表達的目的蛋白作為對照。結果顯示，GapA在cobB突變菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突變株中的最低。利用在沙門氏菌野生型菌株中表達的GapA蛋白，發明人在體外分別用乙酰基轉移酶Pat和去乙酰化酶CobB進行乙酰化和去乙酰化處理，以考察由于乙酰化修飾程度的變化所引起的酶活力的變化。結果顯示，當用Pat提高GapA的乙酰化水平時，GapA的糖酵解方向的酶活性增加了 100%，而糖異生方向的酶活性降低了 30%。當用CobB對GapA進行去乙酰化后，GapA的糖異生方向的酶活性增加了 30%，而糖酵解方向的酶活性降低了 27%。此外，發明人結合質譜的結果，對GapA可能的乙酰化位點進行點突變，并考察對酶活力的影響。考慮到空間結構的緣故，由于谷氨酰胺Q的空間結構在質譜檢測時類似于乙酰化修飾，所以發明人將賴氨酸K位點突變為Q，在體內模擬蛋白的乙酰化修飾，而將K位點突變為精氨酸R時，則該位點不能夠被乙酰化修飾。結果顯示，當GapA的K331位點突變為Q以模擬乙酰化修飾時，GapA的糖酵解方向的酶活力上升。細菌糖異生[實驗3. 2. 1.2]isocitrate lyase (AceA)-異檸檬酸裂解酶(K308)乙酰化抑制乙醛酸途徑
發明人將AceA在沙門氏菌pat、cobB突變菌株中表達并純化，在體外用賴氨酸乙酰化修飾多克隆抗體進行免疫印跡檢測，并以沙門氏菌野生型菌株中表達的目的蛋白作為對照。結果顯示，AceA在cobB突變菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突變株中的最低。而且，比較菌體在葡萄糖或檸檬酸培養基上生長的狀況，前者的AceA乙酰化水平要比后者的高。利用在沙門氏菌野生型菌株中表達的AceA蛋白，發明人在體外分別用乙酰基轉移酶Pat和去乙酰化酶CobB進行乙酰化和去乙酰化處理，以考察由于乙酰化修飾程度的變化所引起的酶活力的變化。結果顯示，當用Pat提高AceA的乙酰化水平時，AceA的酶活性降低了 30%。當用CobB對AceA進行去乙酰化后，AceA的酶活性增加了 24%。此外，發明人結合質譜的結果，對AceA可能的乙酰化位點進行點突變，并考察對酶活力的影響。考結果顯示，當AceA的K308位點突變為Q以模擬乙酰化修飾時，導致AceA 的酶活力下降。細菌三羧酸循環[實驗3. 2. 1. 3] isocitrate dehydrogenase (ICDH) kinase/phosphatase (AceK) _ 胃月兌激酶/磷酸酯酶(K3)乙酰化抑制激酶，激活ICDH發明人將AceK在沙門氏菌pat、cobB突變菌株中表達并純化，在體外用賴氨酸乙酰化修飾多克隆抗體進行免疫印跡檢測，并以沙門氏菌野生型菌株中表達的目的蛋白作為對照。結果顯示，AceK在cobB突變菌株中的乙酰化水平最高，野生型其次，pat突變株中的最低。而且，當菌體在葡萄糖或檸檬酸培養基上生長時，前者的AceK乙酰化水平要比后者的高。利用在沙門氏菌野生型菌株中表達的AceK蛋白，發明人在體外分別用乙酰基轉移酶Pat和去乙酰化酶CobB進行乙酰化和去乙酰化處理，以考察由于乙酰化修飾程度的變化所引起的酶活力的變化。AceK的酶活力通過它對異檸檬酸脫氫酶IDH的磷酸化使IDH 失活來測定，IDH是TCA循環中的一個關鍵酶，催化異檸檬酸生成alpha酮戊二酸。結果顯示，當用Pat提高AceK的乙酰化水平時，AceK對IDH的失活能力下降60%。而用CobB對 AceK進行去乙酰化，增強了 AceK對IDH的失活能力。2).人肝的四個重要酶脂肪酸氧化烯酰輔酶A水合酶/3-羥酰基-輔酶A脫氫酶(巴豆酸酶)(K165，171，346，584) 乙酰化激活[實驗 3. 2. 2.1]烯酰輔酶A水合酶/3-羥酰基-輔酶A脫氫酶(巴豆酸酶，enoyl-Coenzyme Ahy dratase/3-hydroxyacyI-Coenzyme A dehydrogenase, EHHADH, EC 1. 1. 1. 35)在月旨肪酸氧化過程中催化2個步驟反應，此酶的缺陷導致脂肪酸代謝異常。發明人在EHHADH中發現了 4個賴氨酸殘基被乙酰化修飾，免疫沉淀細胞內表達的帶FLAG標簽EHHADH后，利用免疫印跡驗證了這4個乙酰化修飾位點。用人肝組蛋白脫乙酰化酶HDAC I and II抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)和SIRT家族脫乙酰化酶抑制劑煙酰胺(nicotinamide，NAM) 處理細胞后，EHHADH的乙酰化水平增加了 80% (圖3A)。為了再次確認EHHADH的乙酰化修飾，發明人換用同位素標簽技術結合免疫沉淀方法獲得了胞內表達的EHHADH，并通過質譜(iTRAQ)進行了相對定量和絕對定量分析。結果表明曲古抑菌素A和煙酰胺處理可使 EHHADH的第171位賴氨酸乙酰化水平從43. 5%增加到62%，第346位賴氨酸乙酰化水平從 46. 8%增加到77. 8% (圖3B)。同時相應的非乙酰化肽段由于曲古抑菌素A和煙酰胺的處理而降低。這些結果表明相當部分的EHHADH存在乙酰化修飾，而且此種修飾在體內是動態變化的。為了研究EHHADH乙酰化修飾與其酶活力的關系，發明人用曲古抑菌素A和煙酰胺處理Chang肝細胞，發現胞內EHHADH的活力增加了 2倍(圖3C)。換用HEK293T細胞也獲得了類似的結果(圖3C右側)。EHHADH突變體(四個推測的乙酰化修飾賴氨酸殘基都被替換成谷胺酰胺，EHHADH4KQ)的乙酰化修飾水平降低，而且其活力不再受曲古抑菌素A和煙酰胺的調節(圖3C)。培養基中添加脂肪酸可使EHHADH的乙酰化水平和活力分別增加 1. 7倍和1. 3倍(圖3D。因此，EHHADH的乙酰化水平能被細胞外燃料調節，說明乙酰化修飾在生理方面具有調節EHHADH和脂肪酸代謝的作用。三羧酸循環 蘋果酸脫氫酶(K185，K301, K307 and K314)，乙酰化激活[實驗 3. 2. 2. 2]三羧酸循環中的全部7個酶都被乙酰化修飾，其中在蘋果酸脫氫酶 (malatedehydrogenase，MDH，ECl. 1. 1.37)中有 4個賴氨酸殘基(第 185、301、307 和 314位， 表S2和表3)都被乙酰化修飾。細胞中表達外源的MDH同樣被乙酰化修飾，而且用曲古抑菌素A和煙酰胺處理后導致其乙酰化水平升高2.4倍(圖3E)。為了驗證MDH的乙酰化修飾， 發明人用傅立葉變換_離子回旋共振質譜法(FTICR)對MDH進行進一步分析。結果發現除了未修飾的全長的MDH峰還有2個額外的峰，這兩個額外的峰質量分別遞增了 42. OlDa，表明MDH存在相應的單乙酰化修飾和雙乙酰化修飾(圖3F)。曲古抑菌素A和煙酰胺處理細胞可使MDH的乙酰化水平從26. 9%增加到67. 4%，而且出現三重和四重乙酰化修飾現象。 隨后的二級質譜分析確認了 MDH的4個乙酰化修飾賴氨酸殘基中的3個。這些數據表明乙酰化修飾是MDH最主要的修飾，而且大部分MDH蛋白分子在細胞內能被乙酰化修飾。高濃度的葡萄糖提高細胞內MDH的乙酰化水平約60% (圖3G)。抑制肝細胞脫乙酰化酶活力，導致胞內MDH活力增加2倍。在HEK293T細胞中，曲古抑菌素A和煙酰胺處理可激活野生型MDH，但不能激活突變體(四個乙酰化修飾賴氨酸殘基都被替換成精氨酸) (圖3H)。在體外用脫乙酰化酶(CobB)處理免疫沉淀獲得的MDH導致其MDH活力下降(圖 31)，表明乙酰化修飾直接激活MDH。此外高濃度葡萄糖刺激內源以及胞內誘導表達的野生型MDH活力，但對MDH突變體(MDH4KR，4個乙酰化修飾賴氨酸殘基都被突變成精氨酸)卻沒有作用(圖3J)。這些實驗結果表明葡萄糖激活MDH部分原因是通過對MDH乙酰化修飾來進行的。尿素循環精氨(基)琥珀酸裂解酶(K69 and K288)，乙酰化抑制[實驗 3. 2. 2. 3]尿素循環是解毒氨基酸代謝產物氨的必需途徑。精氨(基)琥珀酸裂解酶 (argininosuccinate lyase, ASL, EC4. 3. 2. 1)發生突變導致尿素循環故障，進而使得精氨 [基]琥珀酸尿的產生發生紊亂。發明人鑒定了 ASL的2個乙酰化修飾位點(第69和288位)，并通過胞內表達外源ASL進行了驗證(圖4A)。免疫印跡分析顯示曲古抑菌素A和煙酰胺處理使ASL第288位賴氨酸乙酰化水平增加了 2. 8倍(圖4B)。培養基中添加氨基酸降低了 ASL總體乙酰化水平以及第288位賴氨酸乙酰化水平(圖4C)。曲古抑菌素A和煙酰胺處理導致ASL活力下降，而添加氨基酸會使其活力上升，表明乙酰化修飾抑制了 ASL的活力(圖4D和圖4E)。ASL突變體K288R(第288位賴氨酸殘基替換成精氨酸)則沒有類似的現象(圖4D和圖4E)。限制性蛋白水解和圓二色譜分析表明ASL突變體K288R并沒有改變ASL蛋白結構，因此外源氨基酸可能通過對ASL第288位的賴氨酸殘基脫乙酰化修飾來激活ASL (圖4E)。尿素循環產生的延胡索酸鹽能進入三羧酸循環進而產生能量或進行糖異生 (RefS)。發明人檢測了葡萄糖對ASL活力和乙酰化水平的影響，發現葡萄糖使ASL乙酰化水平增加了 2. 7倍(圖4F)，同時使其活力降低了 50% (圖4G)。體外用脫乙酰化酶CobB 處理哺乳動物細胞表達的ASL會導致其活力升高，表明乙酰化修飾直接使ASL失活。ASL受氨基酸和葡萄糖共同調節現象說明乙酰化修飾在不同代謝途徑協調過程中具有非常重要的作用。當葡萄糖供應充分，為能量產生的氨基酸代謝合糖異生途徑則受到抑制。當氨基酸供應充足而葡萄糖缺乏的情況下，細胞將通過增強尿素循環途徑來利用氨基酸來產生能量。細胞可以利用乙酰化修飾協調各種代謝途徑以獲得在代謝方面的適應。糖異生酸磷烯醇丙酮酸羧激酶(K70，K71和K594).乙酰化降低酶穩定性[實驗 3. 2. 2. 4] 酸磷烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK 1， EC4. 1. 1. 32)是糖異生途徑中關鍵的受調節的酶。通過質譜分析，發明人發現PEPCKl有3個賴氨酸殘基被乙酰化修飾(分別為第70、71和594位)。高濃度的葡萄糖提高細胞PEPCKl 乙酰化水平(圖5A)，但不含葡萄糖培養基中添加氨基酸則降低PEPCKl乙酰化水平(圖 5B)。這些結果表明細胞可能根據胞外燃料的情況通過調節PEPCKl乙酰化修飾來調節糖異生途徑。發明人發現內源PEPCKl的表達受胞外高濃度葡萄糖抑制。此外用曲古抑菌素A 和煙酰胺處理HEK293T和Chang肝細胞導致PEPCKl含量下降70% (圖5D)。PEPCKl在不含葡萄糖培養基生長的細胞中較穩定，但在高糖培養基中不穩定(圖5E)。即使在不含葡萄糖培養基或添加氨基酸條件下，曲古抑菌素A和煙酰胺處理都會導致PEPCKl失去穩定性。 這些結果表明乙酰化修飾可以調節PEPCKl的穩定性。發明人分別將質譜鑒定的3個乙酰化修飾位點的賴氨酸殘基全部突變成精氨酸(PEPCK13KR)或者谷胺酰胺(PEPCK13KQ)，以此來去除或者是模仿乙酰化修飾。結果顯示突變體PEPCK13KR穩定性高于野生型PEPCK1， 而突變體PEPCK13KQ仍然不穩定(圖5F)。此外，曲古抑菌素A和煙酰胺處理不能改變突變體PEPCK13KR的穩定性。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均納入本文作參考。參考文獻
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權利要求
1.調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于調節生物能量代謝的物質中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述調節酶乙酰化水平的物質選自乙酰化酶或脫乙酰化酶、增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶基因轉錄、翻譯或表達的物質、增強或抑制乙酰化酶或脫乙酰化酶的酶活性的物質。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述乙酰化酶或脫乙酰化酶選自賴氨酸乙酰轉移酶、依賴NAD的脫乙酰化酶、組蛋白脫乙酰酶或SIRT家族脫乙酰酶。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述蛋白是參與糖酵解、糖異生、三羧酸循環、尿素循環、脂肪酸代謝、糖元代謝的酶。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述酶選自磷酸甘油醛脫氫酶、烯酰輔酶A 水合酶/3-羥酰基-輔酶A脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、精氨基琥珀酸裂解酶、酸磷烯醇丙酮酸羧激酶、異檸檬酸裂解酶、或異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酯酶。
6.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述生物是細菌或哺乳動物。
7.調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于改善或緩解與代謝相關的疾病或失調的物質中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述與代謝相關的疾病或失調是不受控細胞增殖性疾病、或與糖類代謝和/或脂類代謝相關的失調或疾病。
9.調節蛋白乙酰化水平的物質在制備用于抑制病原微生物的生長或休眠的物質中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述病原微生物選自胞外感染菌或胞內感染菌。
11.調節蛋白乙酰化水平的物質用于改良實驗室或工業菌種的應用。
12.如權利要求11所述的應用，其特征在于，所述實驗室或工業菌種選自工業細菌或工業真菌。
全文摘要
本發明涉及蛋白質賴氨酸乙酰化修飾對代謝的調控及其應用。通過調節底物蛋白的乙酰化水平，能夠實現對細胞代謝的調控，進而改善或緩解與代謝相關的疾病或失調，或者抑制致病菌的生長，提高工程菌對目標產物的表達水平。
文檔編號A61K45/00GK102151335SQ20101010992
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月12日 優先權日2010年2月12日
發明者姚玉峰, 張雅坤, 徐薇, 曾嶸, 李亦學, 楊琛, 熊躍, 王啟軍, 管坤良, 蔣文卿, 趙世民, 趙國屏 申請人:上海交通大學, 上海人類基因組研究中心, 中國科學院上海生命科學研究院, 復旦大學