專利名稱：重組人類偏肺病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及病毒疫苗，具體涉及重組人類偏肺病毒疫苗。
背景技術(shù)：
人類偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)為荷蘭學者于2001年首次在兒童 呼吸道感染標本中分離得到的一種新的呼吸道病原體。hMPV是長約131Λ的單負鏈非節(jié)段 RNA病毒，包含編碼核衣殼蛋白(N)、核包膜磷酸化蛋白(P)、非糖化基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白
(F)、轉(zhuǎn)錄延長因子(M2.1)、RNA合成調(diào)節(jié)因子(M2. 2)、小疏水表面蛋白(SH)、主要粘附蛋白
(G)、主要聚合酶亞單位(L)基因，順序為3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。hMPV基因結(jié)構(gòu)和序 列均與禽偏肺病毒(APV)相似，最接近于APV-C亞型，氨基酸同源性高達80%。該病毒可導致人的上下呼吸道感染，其臨床特征類似于RSV(呼吸道合胞病毒)， 主要癥狀包括咳嗽、咽痛、呼吸困難、缺氧、喘息等。有報道hMPV是老人、兒童、免疫缺陷者 嚴重呼吸道感染疾病的常見病原體。人類偏肺病毒已發(fā)現(xiàn)之后，亞洲、北美洲、歐洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染 的流行病學報告，呈現(xiàn)全球流行趨勢。在中國重慶和北京也有關(guān)于hMPV感染的報道。血 清學研究表明hMPV已經(jīng)在人群流行50年以上，大多數(shù)人在5歲時均已感染過hMPV，4 10. 8%的呼吸道感染住院患兒與hMPV有關(guān)。hMPV可同其他一些病原體合并感染，如RSV， SARS-CoV (嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒)。由此可見，hMPV是一種常見的呼吸道病原體， 該病毒疫苗對于預防該病毒感染具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供重組人類偏肺病毒疫苗，它能用于預防人類感染人類偏肺病 毒，特別是老人、兒童、免疫缺陷者感染人類偏肺病毒。本發(fā)明所述的重組人類偏肺病毒疫苗，包括對人類偏肺病毒F基因的第57位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得 的重組人類偏肺病毒活疫苗N57H ；即將人類偏肺病毒F基因的第57位相對應的氨基酸_天 冬酰胺(Asn，N)變?yōu)榻M氨酸(His，H)，氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC ；對人類偏肺病毒F基因的第172位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲 得的重組人類偏肺病毒活疫苗W72H ；即將人類偏肺病毒F基因的第172位相對應的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)變?yōu)榻M氨酸(His，H)，氨基酸密碼子由AAT變?yōu)镃AT ；對人類偏肺病毒F基因的第353位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲 得的重組人類偏肺病毒活疫苗N353H ；即將人類偏肺病毒F基因的第353位相對應的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)變?yōu)榻M氨酸(His，H)，氨基酸密碼子AAC變?yōu)镃AC ；上述氨基酸密碼子中的A代表腺嘌呤脫氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脫氧核苷酸、G代表鳥嘌呤脫氧核苷酸；還包括對人類偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位中的任意兩位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得的重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H， N57H+N353H, N172H+N353H ；還包括對人類偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位同時進行體外定點 突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得的重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。所述的重組人類偏肺病毒疫苗，是將獲得的7種人類偏肺病毒分別在Vero-E6細 胞(非洲綠猴腎細胞株)培養(yǎng)繁殖而獲得的病毒純化液，每Iml疫苗含有不少于IO5蝕斑 形成單位(PFU)的人類偏肺病毒。所述的重組人類偏肺病毒疫苗，為N57H、N172H, N353H、N57H+N172H、N57H+N353H、 N172H+N353H.N57H+N172H,N57H+N353H,N172H+N353H7 種重組人類偏肺病毒疫苗中的一種， 或者為其中兩種以上的重組人類偏肺病毒疫苗組合而成的混合病毒疫苗。所述的重組人類偏肺病毒疫苗的制備方法如下(1)從臨床病人的鼻咽分泌液中分離獲得人類偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml標本轉(zhuǎn)移液中，置于冰上，2小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室； 混勻分泌物，在離心機上以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心10分鐘，棄去上清，再加入2ml硫酸 緩沖液重新懸浮沉淀；將上述2ml重懸液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取試劑(德 國 QIAGEN 公司)提取 RNA，再用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本 TAKARA 公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后，擴增獲得人類偏肺病毒F基因；(2)對人類偏肺病毒F基因進行體外定點突變；采用美國Mratagene公司的定點突變檢測試劑盒，將人類偏肺病毒F基因的第57 位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺(Asn，N)變?yōu)榻M氨酸(His，H)；即人類偏肺病毒F基 因的第57位相對應的氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC、人類偏肺病毒F基因的第172位相對 應的氨基酸密碼子由AAT變?yōu)镃AT、人類偏肺病毒F基因的第353位相對應的氨基酸密碼子 由AAC變?yōu)镃AC ；上述氨基酸密碼子中的A代表腺嘌呤脫氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脫氧核苷酸、G代表鳥嘌呤脫氧核苷酸；通過以上步驟，獲得上述位點的人類偏肺病毒F基因體外定點突變，即需要改變 的氨基酸；通過第一輪的PCR反應，獲得改變后的F基因一N57H，W72H，N353H。然后， 在此基礎上進行第二輪的PCR反應獲得改變后的F基因一N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；最后，在第二輪產(chǎn)物的基礎上再進行PCR反應獲得3個點均突變的改變后的 F 基因一N57H+N172H+N353H ；將上述體外定點突變后獲得的含有7種改變后的F基因轉(zhuǎn)入荷蘭Erasmus Institute的Rmchier教授處獲得的人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體(該表達
=Herfst S, De Graaf Μ, Schickli JH, et al. Recovery of human metapneumovirus geneticlineages A and B from cloned cDNA. J Virol,2004,78(15) 8264-8270.)。(3)利用反向遺傳系統(tǒng)獲得重組人類偏肺病毒疫苗；采用上述獲得的7種改變后的人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體，再利用反向 遺傳系統(tǒng)(Reverse Genetics Systems)或稱為病毒拯救(Virus Rescue)的方法獲得7種重組人類偏肺病毒，作為人類偏肺病毒的活疫苗。本發(fā)明為預防人類感染人類偏肺病毒提供了疫苗，特別適用于老人、兒童、免疫缺 陷者預防感染人類偏肺病毒。每年在冬春季節(jié)，即人類偏肺病毒感染的高發(fā)季節(jié)，作為預防 人類偏肺病毒感染使用。
具體實施例方式本發(fā)明所述的重組人類偏肺病毒疫苗的制備方法如下(1)從臨床病人的鼻咽分泌液中分離獲得人類偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml標本轉(zhuǎn)移液中，置于冰上，2小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室； 混勻分泌物，在離心機上以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速，鐘離心10分鐘，棄去上清，再加入2ml硫酸 緩沖液重新懸浮沉淀；(標本轉(zhuǎn)移液即用于收集鼻咽分泌物的病毒運送介質(zhì)。配制方法1、加入IOg牛 肉湯和2g牛血清蛋白到的400ml的重蒸餾水中。2、加入0. 8ml慶大霉素硫酸鹽溶液(50mg/ ml)和3. 2ml兩性霉素B Q50 μ g/ml)。3、過濾消毒。)將上述2ml重懸液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取試劑(德國QIAGEN公 司生產(chǎn))提取RNA，再用PrimeScriptTM RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa公司) 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后，用下述引物擴增人類偏肺病毒F基因；其上下游引物分別為上游引物MPVF 5' -ATGTCTTGGAAAGTGATG-3‘下游引物MPVR 5' -CTAACTATGCGGTATAAAAC-3‘PCR反應體系為北京天根生化科技有限公司的PCR反應預混試劑QXTaq PCRMasterMix,目錄號KT201_02) 25 μ L，上、下游引物(10pmol/yL)各 2 μ L，cDNA 5μ L, 滅菌超純水補足50 μ L ；PCR 反應條件94°C預變性 5min ;94°C 30s,55°C 45s, 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 終延伸lOmin。取5yL PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果，獲得的產(chǎn)物即為人類 偏肺病毒F基因；其序列為atgtcttggaaagtgatgattatcatttcgttactcataa cacctcagcatggactaaaa60gaaagttatttagaagaatcatgtagtactataactgaag gatatctcagtgttttaaga120acaggttggtacaccaatgtctttacattagaagttggtg atgttgaaaaccttacatgt180actgatggacctagcttaatcaaaacagaacttgacctaa ccaaaagtgctctaagagaa240ctcaaaacagtttctgctgatcagttagcgggagaagaacaaattgaaaatcccagacaa300tcaaggtttgtcctaggtgcaatagctctcggtgttgccacagcagcagcagtcacagca360ggcattgcaatagccaaaaccataaggcttgagagtgaagtgaatgcaatcaaaggtgct420ctcaaaacaaccagcgaggcagtatccacactaggaaatggagtgcgagtcctagccacc480gcagtaagagagctgaaagaatttgtgagcaaaaacctgactagtgcaattaacaagaac540aaatgtgacattgctgatctgaagatggctgtcagcttcagtcaattcaacagaaggttc600ctaaatgttgtgcggcagttttcagacaatgcagggataacaccagcaatatcattggac660ctaatgactgatgctgagctggccagagctgtatcatacatgccaacatcagcaggacag720ataaaactaatgttagagaaccgtgcaatggtgaggagaaaaggatttggaatcttgata780
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gatcaagtctttgaaagcattgaaaacagtcaagcactagtggaccagtcaaacaaaatt1440
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cttgggttaaccatgatttcagtgagcatcatcatcataatcaaaaaaacaaggaaaccc1560
acaggggcacctccagagctgaatggtgttaccaacggcggttttataccgcatagttag1620 ο
上述人類偏肺病毒F基因翻譯成F蛋白后的序列為
MSffKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGffYTNVFTL 50 EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100 SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150 LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200 LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250 VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300 CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350 NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400 KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450 FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500 LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
(2)對人類偏肺病毒F基因進行體外定點突變；
通過前期的生物信息學方法預測和實驗研究，發(fā)現(xiàn)通過將人類偏肺病毒F基因的 第57位、第172位和第353位氨基酸突變后并利用反向遺傳系統(tǒng)獲得重組人類偏肺病毒， 再經(jīng)過對其抗原性和免疫原性進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過以上3個位點的改變后的病毒，適合用 作活疫苗。所以，選取了以上3個位點來進行體外定點突變；將人類偏肺病毒F基因的第57位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺(Asn，N)變 為組氨酸(His，H)；即人類偏肺病毒F基因的第57位相對應的氨基酸密碼子由AAC變?yōu)?CAC、人類偏肺病毒F基因的第172位相對應的氨基酸密碼子由AAT變?yōu)镃AT、人類偏肺病毒 F基因的第353位相對應的氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC ；上述氨基酸密碼子中的A代表腺嘌呤脫氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脫氧核苷酸、G代表鳥嘌呤脫氧核苷酸；然后，采用美國Mratagene公司的定點突變檢測試劑盒，對獲得的人類偏肺病毒 F基因體外定點突變(該試劑盒可對某個已知基因的特定堿基進行定點突變，從而可以改變對應氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu))，獲得上述需要改變的氨基酸；具體體外定點突變方法如下針對人類偏肺病毒F蛋白第57位、第172位和第353 位的氨基酸，突變使用 QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) 進行定點突變，設計3對引物進行反應(加粗為突變后的堿基)第57位突變引物為00-57 F :5’ -GGTAGGCGATGTAGAGCAGCTTACATGTGCCGATGG-3，00-57 R :5’ -CCATCGGCACATGTAAGCTGCTCTACATCGCCTACC-3，第172位突變引物為00-172 F :5’ -GATTTTGTGAGCAAGCAGCTAACACGTGCAATCAAC-3，00-172 R :5’ -GTTGATTGCACGTGTTAGCTGCTTGCTCACAAAATC-3’第353位突變引物為00-353F :5’ -GCAGTCAAAGGAGTGCAACATACAGATATCTACTACTAATTACCC-3’00-353R :5’ -GGGTAATTAGTAGTAGATATCTGTATGTTGCACTCCTTTGACTGC-3’PCR反應體系為北京天根生化科技有限公司的PCR反應預混試劑QXTaq PCRMasterMix,目錄號KT201_02) 25 μ L，上、下游引物(10pmol/yL)各 2 μ L，cDNA 5μ L, 滅菌超純水補足50 μ L ；PCR 反應條件94°C預變性 5min ;94°C 30s,55°C 45s, 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 終延伸lOmin。取5μ L PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果；通過第一輪的PCR反應，獲得改變后的F基因一Ν57Η，W72H，Ν353Η。然后， 在此基礎上進行第二輪的PCR反應獲得改變后的F基因一N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；最后，在第二輪產(chǎn)物的基礎上再進行PCR反應獲得3個點均突變的改變后的 F 基因一N57H+N172H+N353H ；通過上述方法即獲得7種改變后的F基因(F基因的改變位點分別為N57H， N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H)；在以上方法的基礎上，將從荷蘭Erasmus Institute的Rmchier教授處獲得的 人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體(該表達載體的具體情況參見=Herfst S，De Graaf M, Schickli JH, et al. Recovery of human metapneumovirus genetic lineages A and B fromcloned cDNA. J Virol, 2004, 78 (15) :8264-8270.)，通過上述體外定點突變后獲得 含有7種改變后的F基因(F基因的改變位點分別為:N57H, N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H)的人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體。這7種人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體，其中含有的F基因的蛋白序列為以 下7種第一種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300
CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第二種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第三種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第四種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGN GVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350
9
NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第五種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHITCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NI HISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第六種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第七種MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
(3)利用反向遺傳系統(tǒng)獲得重組人類偏肺病毒疫苗；采用上述獲得的7種改變后的人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體，再利用反向 遺傳系統(tǒng)(Reverse Genetics Systems)或稱為病毒拯救(Virus Rescue)的方法獲得7種 重組人類偏肺病毒，作為人類偏肺病毒的活疫苗，用于預防感染人類偏肺病毒；具體的病毒拯救辦法如下所述細胞與質(zhì)粒BSR_T7細胞(穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的細胞株)培養(yǎng)于含0. 5mg/ mL G418( —種氨基糖類抗生素)和5% (體積百分比)胎牛血清的DMEM(DulbeCC0 ‘ s Modified EagleMedia)培養(yǎng)基中；VeroE6細胞(非洲綠猴腎細胞)培養(yǎng)于含100IU/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素的 和5%胎牛血清的DMEM中；病毒培養(yǎng)液為含5% (體積百分比)胎牛血清和0. 25mg/mL胰酶的DMEM ；7種偏肺病毒全基因組cDNA表達載體及其N、P、L和M2. 1基因的4個表達載體 (pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L 和 pCITE_M2. 1)由荷蘭 Erasmus Institute 的 Fouchier 教 授惠贈；表達載體的具體情況及相關(guān)方法參考以下文獻=Herfst S，De Graaf M，Schickli JH,et al. Recoveryof human metapneumovirus genetic lineages A and B from cloned cDNA.J Virol,2004,78 (15) :8264_8270。主要試劑DMEM培養(yǎng)基、G418和胎牛血清、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、 opti-MEM I培養(yǎng)基(低血清培養(yǎng)基)均購自美國^witrogen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒 (QIAGEN Plasmid MidiKit)為德國QIAGEN公司產(chǎn)品；鼠源hMPV F蛋白單克隆抗體購自美 國Chemicon公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；取3μ g全基因組cDNA表達載體，輔助蛋白質(zhì)粒pCITE_N、pCITE_L、pCITE_P、 PCITE-M2. 1 分另Ij 0· 3 μ g、0. 15 μ g、0. 3 μ g 和 0. 24 μ g,稀釋到 250 μ L opti-MEM I 培養(yǎng)基 中，混合均勻；另將10μ L Lipofectamine 2000稀釋到250 μ L opti-MEM I培養(yǎng)基中，室 溫下混合5min ；然后，將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000溶液混合Q50 μ L+250 μ L)， 室溫結(jié)合20min，以形成DNA-Lipofectamine 2000復合物；將6孔板中培養(yǎng)的BSR-T7 細胞吸去培養(yǎng)液，用無血清、無抗生素的DMEM液洗板2次，隨即向每一孔中加入質(zhì)粒和 Lipofectamine 2000的混合液500 μ L，搖勻。在37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)約5小時，吸掉 含有質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的混合液，換為病毒培養(yǎng)液^il，繼續(xù)在37°C、5% CO2孵 箱中培養(yǎng)，獲得重組人類偏肺病毒疫苗。重組人類偏肺病毒疫苗的使用和儲存條件-80°C，避光保存。疫苗使用前，仍應在 2-8°C避光保存。且在1小時內(nèi)使用。使用人群適用于出生15個月以上的人群，免疫預防人類偏肺病毒感染。用法用量0. Iml/次，滴鼻。每年在冬春季節(jié)，即人類偏肺病毒感染的高發(fā)季節(jié)， 作為預防人類偏肺病毒感染使用。疫苗名稱通用名重組人類偏肺病毒疫苗英文名禾爾Recombinant Human Metapneumovirus Vaccine漢語拼音Chongzu Renlei Pianfei Bingdu Yimiao成份和性狀疫苗由重組人類偏肺病毒F蛋白57位、172位和353位氨基酸改變 后獲得的 N57H，N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H, 7種重組病毒單個或相互混合組成。重組病毒經(jīng)在Vero-E6細胞(非洲綠猴腎細胞株)培養(yǎng) 繁殖、病毒液收獲、病毒液濃縮、病毒純化等工序配制而成。用于預防人類偏肺病毒感染。接種對象適用于出生15個月以上的人群，特別是兒童、成人及老年人。作用與用途用于預防人類偏肺病毒感染。規(guī)格每支0.Iml。0. Iml含人類偏肺病毒不少于104蝕斑形成單位(PFU)。免疫程序和劑量接種部位鼻腔。接種劑量免疫為2次，每次免疫劑量分別為 0. 05ml,0. 1ml,間隔 21 天。禁忌1.對本疫苗其他成分過敏者或有其它過敏史者禁用本品。2.發(fā)熱、患急性 疾病、慢性疾病的急性發(fā)作者及感冒者禁用本品。3.有格林巴利綜合征病史者禁用本品。 4.嚴禁靜脈注射。5.嚴禁分次使用。注意事項疫苗必須避光_80°C保存，疫苗使用前，仍應在2_8°C避光保存，且在1 小時內(nèi)使用。孕婦及哺乳期婦女用藥孕婦及哺乳期婦女應慎用。藥物相互作用可與其他疫苗同時接種，但應接種在不同部位。使用免疫抑制劑 可能影響接種后的免疫效果，為避免可能的藥物間相互作用，最好不同時使用。貯藏_80°C，避光保存。疫苗使用前，仍應在2_8°C避光保存。且在1小時內(nèi)使用。包裝1支/盒。低密度聚乙烯塑料瓶包裝，0.Iml/支。序列表SEQUENCE LISTING<110>重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院趙曉東趙耀<120>重組人類偏肺病毒疫苗<160>9<210>1<211>1620<212>DNA<213>偏月市病毒屬(Metapneumovirus genus.)<220><22DHuman Metapneumovirus<400>1atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaagaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaagaacaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgtactgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaactcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaatcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagcaggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgctctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccaccgcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac
60 120 180 240 300 360 420 480 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggacag 720
ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840
acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900
tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg1020
atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct1 140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc1200
aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga1320
ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt1380
gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt1500
cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc1560
acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag1620
<2 10>2
<211>539
<2 l 2>PRT
<213>偏肺病毒屬(Metapneum。ViruS genus．)
<22l>Human MetaDneum。ViruS
<400>2
MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGwYTNVFTL50
EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100
SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKK／NEAVS／150
LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200
LNVVRQFSDNAGI／PAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250
VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCwIVKAAPSCSGKKGNYA300
CLLREDQGwYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350
NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400
KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450
FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVI ILIAV500
LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
<2 10>3
<211>539
<2 l 2>PRT
<213>人I序列
<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>3MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>4<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>4MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>5<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>5MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150
LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>6<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>6MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>7<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>7MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400
KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>8<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>8MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>9<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重組人類偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>9MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHITCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
權(quán)利要求
1.重組人類偏肺病毒疫苗，包括對人類偏肺病毒F基因的第57位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得的 重組人類偏肺病毒活疫苗N57H ；即將人類偏肺病毒F基因的第57位相對應的氨基酸_天 冬酰胺變?yōu)榻M氨酸，氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC ；對人類偏肺病毒F基因的第172位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得的 重組人類偏肺病毒活疫苗W72H ；即將人類偏肺病毒F基因的第172位相對應的氨基酸-天 冬酰胺變?yōu)榻M氨酸，氨基酸密碼子由AAT變?yōu)镃AT ；對人類偏肺病毒F基因的第353位進行體外定點突變和反向遺傳(病毒拯救)獲得的 重組人類偏肺病毒活疫苗N353H ；即將人類偏肺病毒F基因的第353位相對應的氨基酸_天 冬酰胺變?yōu)榻M氨酸，氨基酸密碼子AAC變?yōu)镃AC ；上述氨基酸密碼子中的A代表腺嘌呤脫氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、C代表 胞嘧啶脫氧核苷酸、G代表鳥嘌呤脫氧核苷酸；還包括對人類偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位中的任意兩位進行 體外定點突變和反向遺傳獲得的重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；還包括對人類偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位同時進行體外定點突變 和反向遺傳獲得的重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人類偏肺病毒疫苗，其特征是將分別獲得的7種人類偏肺 病毒分別在Vero-E6細胞培養(yǎng)繁殖而獲得的病毒純化液，每Iml疫苗含有不少于IO5蝕斑 形成單位的人類偏肺病毒。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組人類偏肺病毒疫苗，為N57H、N172H,N353H、 N57H+N172H、N57H+N353H、N172H+N353H、N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H7 種重組人 類偏肺病毒疫苗中的一種，或者為其中兩種以上的重組人類偏肺病毒疫苗組合而成的混合 病毒疫苗。
4.重組人類偏肺病毒疫苗，其制備方法如下(1)從臨床病人的鼻咽分泌液中分離獲得人類偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml標本轉(zhuǎn)移液中，置于冰上，2小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室；混勻 分泌物，在離心機上以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速，鐘離心10分鐘，棄去上清，再加入2ml硫酸緩 沖液重新懸浮沉淀；將上述2ml重懸液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取試劑提取 RNA，再用PrimeScriptTM RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后，擴增獲得人類 偏肺病毒F基因；(2)對人類偏肺病毒F基因進行體外定點突變；將人類偏肺病毒F基因的第57位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺變?yōu)榻M氨酸；即 人類偏肺病毒F基因的第57位相對應的氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC、人類偏肺病毒F基 因的第172位相對應的氨基酸密碼子由AAT變?yōu)镃AT、人類偏肺病毒F基因的第353位相對 應的氨基酸密碼子由AAC變?yōu)镃AC ；上述氨基酸密碼子中的A代表腺嘌呤脫氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、C代表 胞嘧啶脫氧核苷酸、G代表鳥嘌呤脫氧核苷酸；再采用定點突變檢測試劑盒，獲得上述位點的人類偏肺病毒F基因體外定點突變，即需要改變的氨基酸；通過第一輪的PCR反應，獲得改變后的F基因——N57H, N172H, N353H。然后，在此基礎上進行第二輪的PCR反應獲得改變后的F基因——N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H ； 最后，在第二輪產(chǎn)物的基礎上再進行PCR反應獲得3個點均突變的改變后的F基因—— N57H+N172H+N353H ；將上述體外定點突變后獲得的含有7種改變后的F基因轉(zhuǎn)入人類偏肺病毒全基因組 cDNA表達載體；(3)利用反向遺傳系統(tǒng)獲得重組人類偏肺病毒疫苗；采用上述獲得的7種改變后的人類偏肺病毒全基因組cDNA表達載體，再利用反向遺傳 系統(tǒng)或稱為病毒拯救的方法獲得7種重組人類偏肺病毒，作為人類偏肺病毒的活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開的重組人類偏肺病毒疫苗，包括重組人類偏肺病毒活疫苗N57H，重組人類偏肺病毒活疫苗N172H，重組人類偏肺病毒活疫苗N353H，重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H、N57H+N353H和N172H+N353H，重組人類偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。本發(fā)明為預防人類感染人類偏肺病毒提供了疫苗，特別適用于老人、兒童、免疫缺陷者預防感染人類偏肺病毒。每年在冬春季節(jié)，即人類偏肺病毒感染的高發(fā)季節(jié)，作為預防人類偏肺病毒感染使用。
文檔編號A61K39/155GK102145167SQ20101010667
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者張金輝, 竇穎, 趙曉東, 趙耀, 陳昕 申請人:趙曉東, 趙耀, 重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院