專利名稱：一種滴眼液及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種滴眼液，尤其是涉及一種用于治療角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎癥性疾病的滴眼液及其制備方法。
背景技術：
據世界衛生組織報告，角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，每年因角膜潰 瘍、眼外傷等造成的新增角膜盲為150 200萬，嚴重威脅著患者的健康。而在角膜病中，最 主要的致盲原因是的角膜血管化和瘢痕化，同時治療藥物的作用局限也是一個關鍵問題。 角膜新生血管和新生淋巴管可以繼發于多種角膜炎癥性疾病(角膜炎、潰瘍等)及各類角 膜損傷(角膜外傷、燒傷等)，是角膜對缺氧、炎癥等多種刺激因素綜合的病理反應，可能導 致角膜移植時的排斥反應和炎癥反應，嚴重影響著患者視力恢復。目前，由于參與角膜新生 血管、新生淋巴管及角膜炎癥的因素較多，有關其發生機制、病理過程、以及有效治療手段 等諸多方面的問題還尚未完全闡明。然而對于角膜新生血管、淋巴管及角膜炎癥的藥物研 究，有望解決角膜創口愈合困難和術后免疫排斥反應二大關鍵問題，是目前治療角膜盲的 新途徑。因此，如何尋找新的藥物治療這三類主要角膜疾病已經成為當前眼科界研究的一 個熱點和難點。Netrin家族是作為神經導向因子而被發現和命名的，但越來越多的研究顯示它們 在非神經組織中亦廣泛分布且在形態發生方面起著一定的作用，如哺乳動物腺體的形成、 肺分支形態發生、腫瘤發生等。最近的研究顯示，netrins在血管生成過程中還擔任了內皮 導向分子的功能。這也使Netrin家族再次成為當前國際生物醫學界的前緣、熱點研究領域 之一。然而Netrin家族在正常角膜及炎癥組織中的功能的尚無人研究，機理了解甚少，與 角膜的新生血管和新生淋巴管形成過程以及炎癥反應等角膜疾病關系還不清楚，受到了越 來越多眼科學者的重視。目前，市面上尚無抗炎、抗新生血管和抗新生淋巴管的滴眼液產品，臨床上應用的 大多數眼科藥物具有局限的治療功能，而且各種藥品成分中可能存在相互影響和制約的因 素，加上多種聯合應用眼藥中的毒性成分及防腐劑會給眼表微環境造成破壞，給本身就存 在的眼表疾患雪上加霜，對多種角膜病的治療帶來一定的困惑；此外，大多數抗炎產品多含 有激素類成分，長期使用可嚴重影響患者的眼表微環境，部分抗炎藥物還有相關的并發癥 如氯霉素滴眼液大劑量用藥可致眼瞼、角膜水腫，眼球運動受限及視盤萎縮，長期應用可致 再生障礙性貧血等；抗新生血管藥物，如青蒿琥酯(陳歡歡，周慧君.青蒿琥酯的抗血管生 成作用.藥學學報2004，39(1) 29-33)滴眼液，成分比較復雜，效果尚不夠肯定，且沒有抗 炎抗淋巴管作用；強力霉素滴眼劑是目前治療炎癥的有效藥物，但目前我國尚無正式商品 化的制劑。而目前我們發現NetriM在角膜病理情況下對于細胞的分化、遷移和增殖，炎癥 發生，新生血管形成，免疫功能的維持以及創傷愈合和組織再生等方面存在著不可估量的 作用。研究NetriM與病理角膜的關系，特別是其在角膜新生血管、新生淋巴管及角膜炎癥 中的作用及機制，可能會對角膜疾病的防治開辟一條嶄新的思路。
發明內容
本發明的目的是提供一種與現有的滴眼液相比，作用時間更短、純度更高、效果相 對較好、可同時起到抗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎癥的滴眼液及其制備方法。所述一種滴眼液的組成及其按體積百分比的含量為牛血清0. 1% 5%，增稠劑 5% 15%、酸堿調節液 5%，抗生素0. 5% 2%，重組蛋白5% 20%，余為平衡鹽 溶液。所述一種滴眼液的組成及其按體積百分比的含量最好為牛血清0. 5% 2. 5%， 增稠劑9. 5% 11. 5%、酸堿調節液2% 3%，抗生素 1. 5%，重組蛋白10% 15%， 余為平衡鹽溶液。所述牛血清最好采用胎牛血清，尤其是特級胎牛血清，特級胎牛血清是在無菌條 件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經過40nm正壓氣流過濾的胎牛血清，具有極佳的促細 胞生長作用及產品穩定性，內毒素含量彡10EU/ml，血紅蛋白含量彡10mg/dl。按體積百分 比，所述牛血清的濃度為 15%，最好為10%。所述增稠劑最好選自硫酸軟骨素、右旋糖酐、透明質酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧 甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、殼聚糖等中的至少一種。所述酸堿調節劑可選自碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖對、 HEPES (英文名為 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]ethanesii lfonic acid，中文名 為羥乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式為C8H18N204S)、硼酸-硼砂緩沖對等中的一種，最好選用作 用較強的HEPES。所述抗生素可選自慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素等中的一種，最好采用妥布霉素。所述平衡鹽溶液最好采用PBS溶液。PBS溶液是最常用的平衡鹽溶液，也是抗炎藥 物的基礎溶液，其成分包含了部分離子成分，可以滿足用藥期間陰陽離子平衡和滲透壓的需要。所述滴眼液以10ml計，含有重組Netrin4蛋白5g，pH值為7. 2 7. 4。所述一種滴眼液的制備方法包括以下步驟按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組蛋白加到平衡鹽溶液中混合均 勻，用酸堿調節劑調PH值為7. 2 7. 4，用滲透壓緩沖劑調滲透壓為350 380m0sm/L，經 膜過濾除菌，即得滴眼液；或按滴眼液的配方，將重組蛋白制成無菌重組蛋白粉末，將牛血清溶解于平衡鹽溶 液中，酸堿調節劑調節pH值為7. 2 7. 4，膜過濾除菌，然后將重組蛋白粉末溶于該溶液中， 即得滴眼液。所述滲透壓緩沖劑最好選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、 葡萄糖等中的一種。所述滲透壓緩沖劑的用量參照眼科制劑標準。與現有的滴眼液相比，本發明具有以下優點(1)制作流程簡單、可靠，且易于實 施；(2)滴眼液成分簡單，成本相對較低，配制方便；(3)本發明沒有添加激素類成分，可以 可長期使用，大大減少用藥期間并發癥和后遺癥的發生；(4)本發明添加抗生素后無污染， 病原菌培養觀察發現此滴眼液能較長時間保存(3個月)，應用于大鼠角膜堿燒傷模型后發 現不僅可以預防和治療角膜新生血管、新生淋巴管的發生，而且對控制角膜炎癥也發揮了
4一定的作用；(5)本發明加入了牛血清，無病原微生物，低內毒素，低補體，可以顯著減少使 用其他血清的不良反應；(6)本發明加入了一定劑量的增稠劑，可明顯提高藥物的舒適度； (7)同時本發明可方便臨床醫生工作，為術前控制和穩定角膜新生血管、新生淋巴管及角 膜炎癥性疾病患者的病情提供更合理的手術時機；(8)本發明不僅可以用于抗角膜新生血 管、新生淋巴管、角膜炎癥性疾病，同時將為其作用機制的進一步研究提供重要的線索和技 術支持。本發明所述的NetriM滴眼液不僅可以預防和治療角膜新生血管、新生淋巴管的 發生，而且能控制角膜炎癥，將來可能會用于各種炎癥或相關新生血管及淋巴管疾病的藥 物治療，并能被廣大患者接受而應用于臨床。
圖1為經過本發明所述Netrin4滴眼液連續作用30h，HUVEC在細胞運動修復實驗 中細胞修復情況的照片。圖2為經過PBS滴眼液連續作用30h，HUVEC在細胞運動修復實驗中細胞修復情況 的照片。圖3為經過本發明所述Netrin4滴眼液連續作用36，48，72h，HUVEC在細胞增殖實 驗中的情況。圖4為大鼠角膜堿燒傷后，經過本發明所述NetriM滴眼液和PBS滴眼液連續治 療14d的炎癥指數情況。圖5為大鼠角膜堿燒傷后，經過本發明所述NetriM滴眼液連續治療14d的裂隙 燈的照片。圖6為大鼠角膜堿燒傷后，經過PBS滴眼液連續治療14d的裂隙燈的照片。圖7為大鼠角膜堿燒傷后，經過本發明所述NetriM滴眼液和PBS滴眼液連續治 療14d內的新生血管面積變化情況。圖8為經過本發明所述Netrin4滴眼液及PBS連續治療14d的大鼠角膜堿燒傷的 VEGF, PEDF 的 Western blot 圖片。圖9為經過本發明所述NetriM滴眼液滴眼液連續治療14d的大鼠角膜堿燒傷的 TNF-α的免疫熒光圖片。圖10為經過PBS滴眼液連續治療14d的大鼠角膜堿燒傷的TNF- α的免疫熒光圖 片。圖11大鼠角膜堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述NetriM滴眼 液和PBS滴眼液連續治療14d的炎癥指數情況。圖12為大鼠角膜堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述的NetriM 滴眼液連續治療14d的的裂隙燈的照片。圖13為大鼠角膜堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過PBS滴眼液連續治療 14d的的裂隙燈的照片。圖14為大鼠角膜堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述NetriM滴眼液和PBS滴眼液連續治療14d內的新生血管長度變化情況。圖15為大鼠堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述的Netrin4滴眼液及PBS連續治療14d的VEGF、PEDF的Western blot圖片。圖16為大鼠堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述的Netrin4滴眼 液治療14d的TNF-α的免疫熒光圖片。圖17為大鼠堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過PBS滴眼液治療14d的 TNF-α的免疫熒光圖片。圖18為經過本發明所述NetriM滴眼液滴眼液連續治療14d的大鼠角膜堿燒傷 的Lyve-I和⑶34的免疫熒光圖片。圖19為經過PBS滴眼液連續治療14d的大鼠角膜堿燒傷的Lyve-I和⑶34的免 疫熒光圖片。圖20為大鼠堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過本發明所述的Netrin4滴眼 液治療14d的Lyve-I和⑶34的免疫熒光圖片。圖21為大鼠堿燒傷炎癥血管模型制作后10d，再經過PBS滴眼液治療14d的 Lyve-I和⑶34的免疫熒光圖片。
具體實施例方式以下給出一種優化的Netrin4滴眼液制作方法。實施例1以IOml滴眼液計，以7. 4ml PBS為基礎溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋糖 酐 100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素 100 μ 1，重組 Netrin4 蛋白 2ml，pH 值為 7. 2 7. 4，滲 透壓為 350 380m0sm/L。制備方法1 將50μ g重組Netrin4蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS 溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES200l·! 1及10%妥布霉素ΙΟΟμ 1混合均勻，補力口 PBS溶液于IOml，調節pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經0. 2 μ m膜過濾除 菌，即得Netrin4滴眼液。制備方法2 將50 μ g Netrin4制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ 1 胎牛血清、IM HEPES200y 1、10%妥布霉素100μ 1及9. 4ml PBS，調節pH值為7. 2 7. 4， 經0. 2 μ m膜過濾除菌，然后將Netrin4粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 380m0sm/ L，即得Netrin4滴眼液。實施例2以IOml滴眼液計，以7. 4ml HBSS為基礎溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋 糖酐 100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素 100 μ 1，重組 Netrin4 蛋白 2ml，pH 值為 7. 2 7. 4， 滲透壓為350 380m0sm/L。制備方法1 將50μ g重組Netrin4蛋白和100μ g低分子右旋糖酐溶解于2mlHBSS 溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補力口 HBSS溶液于10ml，調節pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經0. 2 μ m膜過濾 除菌，即得Netrin4滴眼液。制備方法2 將50 μ g Netrin4制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ 1 胎牛血清、IM HEPES200 μ 1、10%妥布霉素100 μ 1及9. 4ml HBSS，調節pH值為7. 2 7. 4， 經0. 2 μ m膜過濾除菌，然后將Netrin4粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 380m0sm/L，即得Netrin4滴眼液。實施例3以IOml滴眼液計，以7. 4ml生理鹽水為基礎溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子 右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素100 μ 1，重組Netrin4蛋白2ml，pH值為1.2 7. 4，滲透壓為 350 380m0sm/L。制備方法1 將SOyg重組Netrin4蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml 生理鹽水溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合 均勻，補加生理鹽水溶液于10ml，調節pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經 0. 2 μ m膜過濾除菌，即得Netrin4滴眼液。
制備方法2 將50 μ g Netrin4制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ 1 胎牛血清、IM HEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ 1及9. 4ml生理鹽水，調節pH值為7. 2 7. 4，經0. 2μ m膜過濾除菌，然后將Netrin4粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 380m0sm/L,即得 Netrin4 滴眼液。實施例4以IOml滴眼液計，以7. 4ml林格氏液為基礎溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子 右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素100 μ 1，重組Netrin4蛋白2ml，pH值為1.2 7. 4，滲透壓為 350 380m0sm/L。制備方法1 將50 μ g重組Netrin4蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml林 格氏液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES200l·! 1及10%妥布霉素ΙΟΟμ 1混合均勻，補 加林格氏液于IOml，調節pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經0. 2 μ m膜過濾 除菌，即得Netrin4滴眼液。制備方法2 將50 μ g Netrin4制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ 1 胎牛血清、IM HEPES200y 1、10%妥布霉素100 μ 1及9. 4ml林格氏液，調節pH值為7. 2 7. 4，經0. 2μ m膜過濾除菌，然后將Netrin4粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 380m0sm/L,即得 Netrin4 滴眼液。實施例5以IOml滴眼液計，以7. 4ml Hanks溶液為基礎溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子 右旋糖酐100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素100 μ 1，重組Netrin4蛋白2ml，pH值為1.2 7. 4，滲透壓為 350 380m0sm/L。制備方法1 將50yg重組Netrin4蛋白和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于 2mlHanks溶液中，然后和200μ 1胎牛血清，IM HEPES 200 μ 1及10 %妥布霉素100 μ 1混 合均勻，補加Hanks溶液于10ml，調節pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經 0. 2 μ m膜過濾除菌，即得Netrin4滴眼液。制備方法2 將50 μ g Netrin4制成無菌微粉，將100 μ g低分子右旋糖酐、200 μ 1 胎牛血清、IM HEPES200l·! 1、10%妥布霉素100μ 1及9.4ml Hanks溶液，調節pH值為7. 2 7. 4，經0. 2μ m膜過濾除菌，然后將Netrin4粉末溶于該溶液溶液中，滲透壓為350 380m0sm/L,即得 Netrin4 滴眼液。實施例6以下給出一種優化的Netrin4滴眼液在體外影響HUVEC細胞生長的初步實驗研允。目的了解5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白在體外對HUVEC的增殖和遷移的影響。方法采用原代HUVEC細胞株進行細胞培養，傳至第3代時，將3X 10_4個/cm3細 胞培養于96孔板中，待細胞鋪滿孔板后使用黃色槍頭在中央劃痕，然后在培養液中分別加 Λ PBS, 1% BSA, 0. 1 μ g/ml 重組 Netrin4 蛋白和 5. 0 μ g/ml 重組 Netrin4 蛋白，觀察培養 8h，12h，16h，20h, 24h，28h，30h后各組細胞在劃痕上的遷移情況。并以相同密度接種培養 HUVEC細胞，利用CCK8實驗觀察各組在96孔板中培養36h，48h，72h后細胞增殖情況。結果細胞運動修復實驗中，加藥培養30h后，PBS組，BSA組，0. 1 μ g/ml重組 Netrin4蛋白組HUVEC細胞已經完全鋪滿中央劃痕區域，但5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白 組仍有部分區域沒有細胞鋪滿中央劃痕，差 異有統計學意義；CCK8實驗結果顯示PBS組， 1% BSA組，0. 1 μ g/ml重組Netrin4蛋白組HUVEC細胞在36h，48h，72h增殖速度明顯快于 5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白組，差異具有統計學意義。結論5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白在體外對HUVEC的增殖和遷移均有抑制作用。參見圖1 3，HUVEC細胞在相同密度接種后，待細胞完全鋪滿平板底部時，給予 相同寬度的劃痕后，分別給予不同的培養基連續處理30h情況。其中圖1為5. 0 μ g/ml重 組NetriM蛋白對HUVEC在細胞運動修復實驗中細胞修復情況，結果顯示在濃度為5. 0 μ g/ ml重組NetriM蛋白作用下，HUVEC在細胞劃痕中央區域仍然有部分區域沒有細胞鋪滿中 央劃痕空余(圖1)，而加入相同劑量的PBS組則已全部鋪滿劃痕區域(圖2)，說明濃度為 5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白對HUVEC細胞的運動修復有明顯抑制作用。CCK8實驗結果(圖 3)顯示PBS組HUVEC細胞在36h，48h，72h增殖速度較快，而濃度為5. 0 μ g/ml重組Netrin4 蛋白組增殖速度明顯偏慢，兩者比較在各時間點均存在有統計學意義(P值均< 0.05)，說 明HUVEC細胞的增殖明顯受到濃度為5. 0 μ g/ml重組Netrin4蛋白的限制。在圖3中，a為 Netrin4滴眼液，b為PBS滴眼液；橫坐標為作用時間，縱坐標為在酶標儀下，HUVEC細胞增 殖過程中測得450nm波長的OD值。實施例7以下給出一種優化的NetriM滴眼液抑制大鼠角膜新生血管和炎癥的初步實驗 研究。目的了解5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液對大鼠角膜堿燒傷模型中新生血管和炎癥 反應的影響。方法先將30只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，然后將模型動物 平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液，連續點眼14d 后，觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和炎癥指數情況。取點藥14d后角膜，采用免疫熒光染 色和Western blot技術對比兩組TNF- α、VEGF以及PEDF表達情況。結果在連續用藥14d后，5. 0 μ g/ml Netrin4組的角膜炎癥指數和新生血管長度 和面積分別為35. 6士24. 9mm2,明顯優于PBS滴眼液組的65. 3士21. Imm2, Western blot結 果顯示，與PBS滴眼液組相比較，VEGF在5. 0 μ g/mlNetrin4組明顯下調而PEDF則明顯上 調，兩組差異有統計學意義；免疫熒光染色結果顯示TNF-α在5. 0 μ g/ml明顯下調，兩組差 異有統計學意義。結論.5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液能顯著抑制大鼠堿燒傷角膜的新生血管形成和炎癥反應發生。參見圖4 10，大鼠角膜堿燒傷模型制作后，給予濃度為5. 0μ g/ml Netrin4和 PBS滴眼液連續點眼14d，大鼠角膜新生血管和炎癥反應的改變情況，圖4為濃度為5. 0 μ g/ ml NetriM滴眼液(a)和PBS滴眼液(b)在堿燒傷后1，4，7，14d角膜炎癥指數的變化情況， 結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4炎癥指數明顯少于PBS滴眼液組，兩者比較在各時間 點均存在有統計學意義(P值均< 0. 05)，說明濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液能有效控 制炎癥.圖5 8為濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液㈧和PBS滴眼液⑶在堿燒傷后 l，4，7，14d角膜新生血管長度和面積的變化情況，結果顯示NetriM滴眼液組(圖5)角膜 新生血管面積(圖7)明顯少于PBS滴眼液組(圖6)，兩者比較在各時間點均存在有統計學 意義(P值均<0.05)，說明了濃度為5.0yg/ml NetriM滴眼液能顯著抑制大鼠堿燒傷角 膜的新生血管形成，圖8為在堿燒傷后連續應用濃度為5. 0 μ g/ml NetriM滴眼液和PBS滴 眼液14d時角膜VEGF和PEDF的變化情況，結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4組VEGF明 顯下調而PEDF明顯上調，兩者比較存在有統計學意義(P < 0. 05)，說明了濃度為5. 0μ g/ ml NetriM滴眼液是通過使VEGF表達下降而使PEDF表達升高而抑制大鼠堿燒傷角膜新生 血管形成的。圖9和10為堿燒傷后連續應用濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液和PBS滴 眼液14d時角膜TNF- α (白)的變化情況，結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4組TNF- α 明顯下調，兩者比較存在有統計學意義(P <0.05)，說明了濃度為5.0 μ g/ml Netrin4滴眼 液也通過使TNF-α表達下降而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的。實施例8以下給出一種優化的NetriM滴眼液在大鼠角膜新生血管回退中的初步作用研允。目的了解5.0yg/ml NetriM滴眼液對大鼠角膜新生血管形成后的影響。方法先將30只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，待新生血管形成 IOd后，將這些大鼠平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予5. 0μ g/ml Netrin4滴 眼液，分別連續點眼14d后，觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和情況。取點藥14d后角膜， 采用免疫熒光染色和Western blot技術對比兩組TNF- α、VEGF以及PEDF表達情況。結果新生血管形成IOd后連續用藥14d顯示，5. 0 μ g/ml Netrin4組的角膜新生 血管長度分別為0. 72士0. 39mm,明顯優于PBS滴眼液組的1. 52士0. 42mm ；Western blot結 果顯示，與PBS滴眼液組相比較，VEGF在5. 0 μ g/ml Netrin4組明顯下調而PEDF則明顯上 調，兩組差異有統計學意義；免疫熒光染色結果顯示TNF-α在5.0 μ g/ml明顯下調，兩組差 異有統計學意義。結論5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液能使大鼠堿燒傷模型中已經形成的角膜新生血
管回退。參見圖11 17，大鼠角膜堿燒傷模型制作IOd后，給予濃度為5.0 μ g/ml Netrin4 和PBS滴眼液連續點眼14d，大鼠角膜新生血管的改變情況.圖11為濃度為5. 0 μ g/ml NetriM滴眼液(a)和PBS滴眼液(b)在堿燒傷后10，14，17，24d角膜炎癥指數的變化情 況，結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4炎癥指數明顯少于PBS滴眼液組，兩者比較在各 時間點均存在有統計學意義(P值均< 0. 05)，說明濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液在此 過程中抗炎作用·圖12-14為濃度為5.0 μ g/ml Netrin4滴眼液(A)和PBS滴眼液(B)在堿燒傷后10，14，17，24d角膜新生血管長度和面積的定量變化，結果顯示NetriM滴眼液組 (圖12)角膜新生血管長度(圖14)明顯少于PBS滴眼液組(圖13)，兩者比較在各時間點 均存在有統計學意義(P值均<0.05)，說明了濃度為5.0 μ g/ml NetriM滴眼液能使大鼠 堿燒傷模型中已經形成的角膜新生血管回退。圖15為大鼠角膜堿燒傷模型制作IOd給予 濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4和PBS滴眼液連續點眼14d后，大鼠角膜VEGF和PEDF的改變 情況。結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4組VEGF明顯下調而PEDF明顯上調，兩者比較 存在有統計學意義(P < 0. 05)，說明了濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液是通過使VEGF表 達下降而使PEDF表達升高而使已經形成的角膜新生血管回退，圖16，17為對應的24d角膜 TNF- α (白)變化情況，結果顯示濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4組TNF- α明顯下調，兩者比較 存在有統計學意義(P < 0. 05)，說明了濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液也通過使TNF- α 表達下降而使已經形成的角膜新生血管回退。實施例9以下給出一種優化的NetriM滴眼液抑制大鼠角膜新生淋巴管的初步實驗研究。目的了解5. 0μ g/ml Netrin4滴眼液對大鼠角膜堿燒傷模型中新生淋巴管的影 響。方法先將30只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，然后將模型動物 平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液，連續點眼14d 后，觀察兩組大鼠角膜新生淋巴管情況。取點藥14d后角膜，采用免疫熒光染色技術對比兩 組以Lyve-I (白)的表達情況。結果在連續用藥14d后，5. 0 μ g/ml Netrin4組的角膜新生淋巴管長度明顯短于 PBS滴眼液組，兩組差異有統計學意義。結論5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液能顯著抑制大鼠角膜新生淋巴管的形成。參見圖18和19，大鼠角膜堿燒傷模型制作后，給予濃度為5. 0 μ g/ml Netrin4 和PBS滴眼液連續點眼14d，大鼠角膜新生淋巴管的改變情況，圖18為濃度為5. 0 μ g/ ml Netrin4滴眼液在堿燒傷后14d角膜新生淋巴管的變化情況，相比PBS滴眼液組(圖 19)，NetriM滴眼液組新生淋巴管長度明顯短于PBS滴眼液組，說明了濃度為5. 0 μ g/ml NetriM滴眼液能顯著抑制大鼠堿燒傷角膜的新生淋巴管形成。實施例10以下給出一種優化的NetriM滴眼液在大鼠角膜新生淋巴管回退中的初步作用 研究抑制。目的了解5.0yg/ml NetriM滴眼液對大鼠角膜新生淋巴管形成后的影響。方法先將30只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，待新生血管形成 IOd后，將這些大鼠平均分為兩組，一組給予PBS滴眼液，另一組給予5. 0μ g/ml Netrin4滴 眼液，分別連續點眼14d后，觀察兩組大鼠新生淋巴管生長情況。取點藥14d后角膜，采用 免疫熒光染色技術對比兩組Lyve-I (白)的表達情況。結果新生血管形成IOd后連續用藥14d顯示，5.0 μ g/ml Netrin4組的新生淋巴 管長度明顯短于PBS滴眼液組，兩組差異有統計學意義。結論5. 0 μ g/ml Netrin4滴眼液能使大鼠堿燒傷模型中已經形成的角膜新生淋 巴管回退。
參見圖20和21， 大鼠角膜堿燒傷模型制作IOd后，給予濃度為5. 0 μ g/mlNetrin4 和PBS滴眼液連續點眼14d，大鼠角膜新生淋巴管的改變情況，圖20為5. 0 μ g/ml Netrin4 滴眼液組在堿燒傷后24d角膜新生淋巴管的變化情況，圖21為PBS滴眼液組，結果顯 示NetriM滴眼液組新生淋巴管長度明顯短于PBS滴眼液組，說明了濃度為5. 0 μ g/ml NetriM滴眼液能能使大鼠堿燒傷模型中已經形成的角膜新生淋巴管回退。
權利要求
一種滴眼液，其特征在于其組成及其按體積百分比的含量為牛血清0.1％～5％，增稠劑5％～15％、酸堿調節液1％～5％，抗生素0.5％～2％，重組蛋白5％～20％，余為平衡鹽溶液。
2.如權利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于其組成及其按體積百分比的含量為牛 血清0.5% 2.5%，增稠劑9. 5% 11. 5%、酸堿調節液2% 3%，抗生素 1.5%， 重組蛋白10% 15%，余為平衡鹽溶液。
3.如權利要求1或2所述的一種滴眼液，其特征在于所述牛血清為胎牛血清。
4.如權利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述牛血清為特級胎牛血清，特級胎 牛血清是在無菌條件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經過40nm正壓氣流過濾的胎牛血 清，內毒素含量彡10EU/ml，血紅蛋白含量彡10mg/dl ；按體積百分比，所述牛血清的濃度為 15%。
5.如權利要求1或2所述的一種滴眼液，其特征在于所述增稠劑選自硫酸軟骨素、右旋 糖酐、透明質酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、 殼聚糖中的至少一種。
6.如權利要求1或2所述的一種滴眼液，其特征在于所述酸堿調節劑選自碳酸鈉-碳 酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉_磷酸二氫鈉緩沖對、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸_硼砂緩沖對中 的一種。
7.如權利要求1或2所述的一種滴眼液，其特征在于所述抗生素選自慶大霉素、鏈霉 素、妥布霉素中的一種。
8.如權利要求1或2所述的一種滴眼液，其特征在于所述平衡鹽溶液為PBS溶液。
9.如權利要求1所述的一種滴眼液的制備方法，其特征在于包括以下步驟按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和重組蛋白加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調節劑調PH值為7. 2 7. 4，用滲透壓緩沖劑調滲透壓為350 380m0sm/L，經膜過 濾除菌，即得滴眼液；或按滴眼液的配方，將重組蛋白制成無菌重組蛋白粉末，將牛血清溶解于平衡鹽溶液中， 酸堿調節劑調節PH值為7. 2 7. 4，膜過濾除菌，然后將重組蛋白粉末溶于該溶液中，即得 滴眼液。
10.如權利要求9所述的一種滴眼液的制備方法，其特征在于所述滲透壓緩沖劑選自 氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一種。
全文摘要
一種滴眼液及其制備方法，涉及一種滴眼液。提供一種作用時間短、純度高、效果相對較好、可同時起到抗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎癥的滴眼液及制備方法。滴眼液的組成及其按體積百分比的含量為牛血清0.1％～5％，增稠劑5％～15％、酸堿調節液1％～5％，抗生素0.5％～2％，重組蛋白5％～20％，余為平衡鹽溶液。滴眼液含有平衡鹽溶液、增稠劑、牛血清、抗生素、酸堿調節液和重組蛋白。將增稠劑、牛血清、抗生素和重組蛋白加到平衡鹽溶液中，用酸堿調節劑調pH值，用滲透壓緩沖劑調滲透壓，經膜過濾除菌；或將重組蛋白制成無菌微粉，將牛血清溶解于平衡鹽溶液中，調節pH值，膜過濾除菌，將重組粉末溶于該溶液中，即得滴眼液。
文檔編號A61K9/08GK101829048SQ201010044868
公開日2010年9月15日 申請日期2010年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者劉祖國, 李煒, 瞿楊洛娃, 邵毅, 韓云 申請人:廈門大學