專利名稱：人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶a合成酶的抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及作為人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶(ACS)抑制劑。
背景技術：
艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，能產生毒 素A和毒素B，進而導致腹瀉、假膜性結腸炎和結腸癌及其它嚴重疾病，統稱為CDAD。這種病 多發于在醫院里服用了抗生素的病人，在北美和歐洲已流行多年，病例年年增加，僅以美國 為例，CDAD的診斷病例在2001-2005的4年間增長了 1倍，2006年報道的病例高達300，000 例。近年來CDAD已經蔓延到澳大利亞和亞洲的日本、中國臺灣等地，并且有向全世界范圍 內擴散的趨勢。目前，用于治療CDAD的藥物主要是兩種口服抗生素萬古霉素和甲硝唑。萬古霉 素已經被美國FDA批準為CDAD的治療藥物，但是在其使用過程中存在嚴重副作用，對患者 的肝、腎功能等有較為嚴重的損害，而且價格昂貴。甲硝唑目前尚未獲得FDA批準，但由于 其價格低廉，是目前最普遍采用的治療藥物。其它使用的抗生素包括慶大霉素、亞胺培南 (β -內酰胺類抗生素)、紅霉素、克拉霉素和環丙沙星等。但是這些抗生素的使用已經導致 了嚴重的抗藥性問題，并且都會不同比例(15%到35%)的使已經治愈的病人復發CDAD。這 些復發的病人再使用這些廣譜抗生素治療已經沒有任何療效，如果沒有其他的治療手段， 將導致病人病情惡化甚至死亡。科學家們已經普遍意識到這個問題，有針對性的開發新的治療藥物已經迫在眉 睫，但是由于艱難梭菌極度厭氧，在該病原體的基因組序列于2006年被完全測定前，對它 的研究一度陷于困境。因此目前對艱難梭菌的研究大多數都集中在毒素A和毒素B的研究 領域中。開發藥物的方向也主要集中于如何降低甚至中和毒素A和毒素B的毒性。例如美 國健贊公司(Genzyme Corp)開發的tolevamer，已經進入三期臨床。但是這類藥物只能用 于減輕患者的癥狀，無法抑制或者殺死病原體，因此只能作為一種輔助的治療手段。要徹底 根治CDAD，必須有針對性的開發新藥物，提出新的治療思路。基因組序列的完全測定極大的方便了人們對它的研究，序列分析表明在艱難梭菌 中含有一種目前只在厭氧細菌中存在的乙酰輔酶A合成酶(ACS)。乙酰輔酶A是物質和能 量代謝的重要物質，在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。ACS催化乙酰輔酶A的合 成，是艱難梭菌乙酰輔酶A合成通路中的關鍵金屬酶。如果該酶的活性被抑制，將導致病原 體艱難梭菌不能正常進行能源和物質代謝，進而導致其生長被抑制甚至死亡。因此，對ACS 的活性抑制研究，可能找到殺死和抑制艱難梭菌的生長和疾病防治的潛在藥物，該酶可以 作為治療CDAD的一種潛在藥物靶標。
發明內容
本發明的目的是提供一種病原體艱難梭菌乙酰輔酶A合成酶(ACSed)的活性抑制齊IJ，作為抑制艱難梭菌的生長和疾病防治的用藥物。乙酰輔酶A合成酶的活性中心由Fe4S4和雙核鎳兩部分組成。研究發現該酶中的 鎳在螯合劑的作用下易被脫去，從而導致ACS的活性降低甚至被完全抑制。常用的螯合劑 有1，10_鄰菲咯啉(I)、2，2-聯吡啶(II)和8-羥基喹啉(III)。其中，8-羥基喹啉是已在
二期臨床上應用的藥物，用于治療阿爾茲海默癥。這種螯合劑的結構式如下
<formula>formula see original document page 4</formula>本發明的螯合劑作為ACS抑制劑的驗證步驟如下本發明以下操作均在厭氧手套箱中完成。首先配制一定濃度的檸檬酸鈦溶液，并 用鐵氰化鉀標定其精確濃度。然后分別配制一定體積的ΙΟμΜ的甲基鈷鐵硫蛋白(CoFeSP) 和ImM的檸檬酸鈦混合溶液以及20μ MWACSm^P ImM的檸檬酸鈦混合溶液，結合半小時以 上。使用截流分光光譜儀(Stopped-flow)檢測ACSed的甲基轉移活性，作為空白對照。用無水乙醇分別配好IM濃度的螯合劑1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯吡啶和8-羥基 喹啉。取出一定體積無水乙醇以及同等體積的上述螯合劑分別加入到ΙΟμΜ的甲基鈷鐵 硫蛋白(CoFeSP)和ImM的檸檬酸鈦混合溶液中，結合一小時以上。使用截流分光光譜儀 (Stopped-flow)檢測ACSed的甲基轉移活性，發現在ImM的濃度下，1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯 吡啶和8-羥基喹啉均能有效抑制ACS。d的甲基轉移活性，抑制率均接近100%，而同等體積 的無水乙醇沒有抑制作用。本發明使用的甲基鈷鐵硫蛋白提取自產乙酸菌Clostridium thermoaceticum ； ACScd通過基因重組得到。本發明用的檸檬酸鈦溶液為檸檬酸鈦的tris緩沖溶液(pH為8.0)，其作用是將甲 基鈷鐵硫蛋白和ACS。d還原為活性狀態，其還原能力非常適合本實驗操作，而且對反應無抑 制影響。具體配制方法為(1)稱取一定量的檸檬酸鈉配制成0. 5M的溶液；(2)配制一定量 的IM Tris緩沖溶液(pH為8. 0) ； (3)配制50mM鐵氰化鉀溶液；(4)稱取0. 02 0. 05g三 氯化鈦加3mL 0.5M的檸檬酸鈉溶液充分溶解后，加入等量的IM Tris緩沖溶液混合均勻， 用50mM鐵氰化鉀溶液標定其濃度。本發明使用了截流分光光譜儀監測抑制實驗。這是因為截流光譜儀可以監測毫秒 級別的反應，這是目前條件下其它實驗手段很少能夠實現的。
圖1為抑制劑抑制ACS。d的甲基轉移活性圖示
具體實施例方式以8-羥基喹啉為例，其具體操作過程如下首先配制檸檬酸鈦溶液，并用鐵氰化鉀標定其精確濃度為15. 8mM。稱取145mg 8-羥基喹啉，用ImL無水乙醇溶解。提取的甲基鈷鐵硫蛋白(CoFeSP)其濃度為40 μ Μ, ACScd為198 μ Μ。配制1.211^反應溶液六，其中含有2(^11 ACS。d、ImM檸檬酸鈦、以及50mM tris緩 沖溶液(pH = 8. 0)，結合半小時后加入IyL IM 8-羥基喹啉結合1小時以上；配制1. 2mL 反應溶液B，其中含有10 μ M CoFeSPUmM檸檬酸鈦以及50mM tris緩沖溶液(pH = 8. 0)。用2. 5mL的一次性注射器將反應液A和B分別轉移到截流分光光譜儀中，監測兩 者混合后在390nm處吸收值隨時間的變化曲線，該曲線即反映ACS。d的甲基轉移活性。我 們發現在ImM的濃度下，8-羥基喹啉能有效抑制ACS。d的甲基轉移活性，抑制率接近100% (如圖1所示)。1，10-鄰菲咯啉⑴、2，2-聯吡啶的實驗步驟和8-羥基喹啉的實驗步驟一致，結果表明，其抑制率也接近100%。本發明中使用的試劑和生物材料來源如下鐵氰化鉀、檸檬酸鈉、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司Tris 購自上海生工公司(Sangon，Shanghai, China)三氯化鈦、1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯吡啶和8-羥基喹啉均購自sigma-aldrich公司。
權利要求
人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶的抑制劑，其特征在于為下述三種螯合劑中的至少一種1，10-鄰菲咯啉式(I)、2，2-聯吡啶式(II)和8-羥基喹啉(III)，其結構式如下F2010100230522C00011.tif
2.人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶抑制劑驗證方法，其特征在于具體步驟為(1)配制一定濃度的檸檬酸鈦，并用鐵氰化鉀標定其精確濃度；(2)將步驟(1)所得檸檬酸鈦分別加入到ΙΟμΜ的甲基鈷鐵硫蛋白和20μΜ的ACSed 中，結合半小時以上；(3)將步驟(2)20μ MWACScit^P ImM的檸檬酸鈦混合溶液中加入抑制劑，結合一小時 以上；(4)將步驟(2)中所得甲基鈷鐵硫蛋白與步驟(3)中所得混合溶液快速混合，用截流光 譜儀檢測抑制反應。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，步驟(1)中所述檸檬酸鈦為檸檬酸鈦的 tris緩沖溶液，ρΗ為8. O。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征是，步驟(2)所述甲基鈷鐵硫蛋白提取自產乙酸 菌 Clostridium thermoaceticum0
5.根據權利要求2所述的方法，其特征是，步驟(2)中所述ACS。d是乙酰輔酶A合成酶， 通過基因重組得到。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體為以乙酰輔酶A合成酶(ACS)為靶點的人類病原體clostridium difficile抑制劑。本發明利用快速反應動力學技術成功發現了具有高度抑制活性的乙酰輔酶A合成酶抑制劑，包括1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯吡啶和8-羥基喹啉，其中已有臨床應用的藥物8-羥基喹啉在較低濃度時幾乎可以100％抑制乙酰輔酶A的甲基轉移活性。本發明方法是目前唯一報道的人類病原體clostridium difficile乙酰輔酶A合成酶的高效抑制劑。本發明在生物醫藥領域具有重大應用價值。
文檔編號A61P31/04GK101797251SQ20101002305
公開日2010年8月11日 申請日期2010年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者朱小飛, 譚相石 申請人:復旦大學