專利名稱：全人TNFa單克隆抗體及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及TNFa結合蛋白及其應用。
背景技術：
自身免疫性疾病是繼癌癥和心血管疾病的第三大類疾病。類風濕性關節炎(RA) 是最常見的自身免疫病之一，我國類風濕關節炎患病率約為0. 32-0. 36%，在60歲以上人 群發病率高達30 % 40 %。面對每人每年幾十萬元的進口藥物治療費用，患者往往只能長 期忍受痛苦的化學治療，卻又收效甚微。RA的患病人群多，用藥量大，使其治療性藥物的市場巨大，2005年全球市場達到 60億美元。目前臨床治療RA的方案很多，首選用大劑量非留體抗炎藥可控制癥狀，如無效， 則臨床首選氨甲蝶呤等免疫抑制藥治療。約四分之一的患者首次發病后經及時治療可終生 不再復發，約二分之一的患者經治療后癥狀暫時得以緩解，但仍會反復發作，部分最終發展 為關節功能障礙；約四分之一的患者對目前所有的常規治療均無效。腫瘤壞死因子- α (TNF-α)是類風濕性關節炎病變過程中起主要作用的細胞因 子，實驗和臨床結果均證實TNF是治療該病的適合靶點。國外對RA的發病機理進行了充 分的研究，發現腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α )在該疾病的病理 進程中起十分關鍵的作用，患者或動物模型病變關節腔內的TNF水平異常升高。TNFa和 TNF^是哺乳動物細胞中的一類同源分泌型蛋白質，它們相互之間具有很高的同源性，二者 都可以對許多細胞類型造成多方面的影響。這兩種蛋白都可以通過與細胞膜上的受體作用 而影響細胞的生物學功能。腫瘤壞死因子TNF α能夠引起腫瘤組織出血壞死并具有多方面 功能。成熟分子由157個氨基酸組成，含有兩個二硫鍵，沒有糖基化位點。其前體為233個 氨基酸組成的多肽，N-端76個氨基酸組成的多肽不是信號肽，它可以把前體固定在細胞膜 上，使成熟的分泌型保留在細胞膜上。前體的成熟mRNA長度為1.71Λ。在體內主要由單核 巨噬細胞產生。針對TNF-α的抑制劑成為迄今為止最為成功的RA治療藥物。代表藥物 如 Wyeth/Amgen 公 司 Enbrel(etanercept)， Johnson & Johnson, Schering Plough/ Centocor 公 司 Remicade(infliximab), Cambridge Antibody Technology/Abbott 的 Humira(adalimumab)。Enbrel為Amgen公司開發的制劑，是TNF-α受體和Fc的融合蛋白， 不僅對風濕性關節炎有非常不錯的療效，且對牛皮癬及牛皮癬型關節炎也有明顯的治療作 用，同時在促進脊椎炎愈合的研究上，Enbrel也進入了二期臨床。2004年銷售額是25億美 元，預計2008年可達34億美元。Remicade是一種人鼠嵌合性的抗TNF-α單克隆抗體，可 特異性結合可溶性及膜結合型TNF-α，其適應癥包括Crohn’病，風濕性關節炎(RA)，重癥 強直性脊柱炎(AQ。在2003年和2004年全球銷售額分別是22. 7億和28. 9億美元，是生 物醫藥領域的“重磅炸彈”。2002年12月Abbott公司的Humira成為第一個獲準用于減輕 成人中到重度活動期RA的病征和癥狀及抑制關節結構損傷進展的全人單克隆抗體。由于 是全人抗體，避免了 Remicade會產生免疫反應的缺點。Humira與Remicade及Enbrel相比的另一個優勢是給藥方法的便利上。Humira每月只需注射兩次，而Remicade和Enbrel必 須每周注射兩次。Humira市場占有率正逐年提高，2003年和2004年的銷售額分別是2. 8 億和8. 5億美元。2006年，全球三大抗TNF- α拮抗劑Humira與Remicade及Enbrel 3個 藥物已近 80 億美元，2008 年 Enbrel (64. 9)、Remicade (53. 3)、Humira (45. 2)、Cimzia 合計 為163億美元。這三個代表藥物的療效均比較確定，并且隨著大規模臨床試驗的不斷開展，除RA 以外的克隆氏病、強直性脊柱炎、銀屑病等其他自身免疫病也相繼成為新的適應癥，使其 市場更加龐大。這些生物產品的特異性高，靶向性好使其副作用較其他同類藥物明顯降 低，逐漸地與甲氨蝶呤合用作為RA的一線用藥，并增強它們對目前中至重度的風濕性疾 病等其他自身免疫病市場的滲透。目前處于開發末期階段的新藥主要有UCB/Celltech 公司的⑶P-870(PEG化人源化抗TNF抗體Fab片段)和⑶P571 (人源化抗TNF單抗)， Bristol-Myers Squibb 公司的 CTLA41g(Abatac印t)，Roche 公司的 Rituxan 和 MRA 等。其 中進展最迅速的是⑶P-870，目前已經進入臨床III期，⑶P-870于2006年底進入市場， ⑶P-870應用大腸桿菌進行生產，使其成本降低至其他TNF抑制劑藥物的四分之一。雖然現有的TNF抗體類藥物被認為較其它任何藥物的效果都好，但它們也存在很 大的缺點。第一，它們均來自哺乳動物細胞表達和純化，由于表達水平較低和生產能力有 限遠遠不能滿足市場的需求，即便是Amgen斥資5億美金創建了全球最大的20，000升細 胞培養生物反應器，這一問題依然存在(據2004年美國biopharma報告)；第二，這些抗體 的高昂成本使很大一部分患者被拒之門外，據估計，常規應用Enbrel、Remicade和Humira 治療RA —年的費用分別是11400、14200和16776美金，且需反復使用(據2004年美國 biopharma報告)；第三，這些抗體所攜帶的Fc段具有結合補體和ADCC等活性，體內應用 會導致表達TNF的細胞的凋亡，會產生一系列副作用；第四，Remicade是人鼠嵌合性單抗， 含有1/3的鼠源蛋白成分，連續注射可以在10%以上的病人中激發人抗鼠源蛋白抗體反應 或人抗嵌合蛋白抗體反應，影響治療效果并可能導致嚴重的不良反應。即將上市的CDP870 是PEG化人源化抗TNF抗體Fab段[17]，其鼠源蛋白成分下降到10%，但仍然有免疫原性。 而Humir的可變區的氨基酸序列和相應的DNA序列來自于CAT公司開發的人源抗體庫，其 Fc片段的編碼區來自人的IgGl。由此可見，該產品的可變區序列并非直接來自人，而是來 自起源于人B細胞的抗體庫。此外，雖然人類免疫系統能夠產生種類極其龐大的抗體，但是人或全人抗體技術 卻遇到了瓶頸人體內產生特異性抗體的前體細胞豐度很低，即使在抗體陽性的個體中，能 夠產生特異性抗體的前體細胞也遠遠低于人雜交瘤技術所需要的能夠產生特異性抗體細 胞數量。因此，分離、純化和富集特異性分泌抗體的B細胞成為建立全人抗體平臺的關鍵技 術之一。
發明內容
本發明用全人抗體技術從類風濕關節炎病人體的B細胞中獲得抗人TNFa單克隆 抗體，發酵、純化后，采用聚乙二醇化(PEG化)方法體外改造和修飾，在保持其抗TNF活性 的同時，使之更適合體內應用。本發明第一方面公開了一種抗人TM^a單克隆抗體，包括重鏈與輕鏈，其輕鏈具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列，其重鏈具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。進一步的，所述抗人TNFa單克隆抗體經PEG化修飾。本發明第二方面公開了一種多核苷酸，該多核苷酸含有編碼前述抗人TM^a單克 隆抗體的重鏈和/或輕鏈的多核苷酸序列。進一步的，編碼前述抗人TNi^a單克隆抗體的輕鏈的多核苷酸的序列為SEQ ID NO 1，編碼前述抗人TNiia單克隆抗體的重鏈的多核苷酸的序列為SEQ I0 NO :2或SEQ ID NO 5，編碼抗人TNFa單克隆全長抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的序列同時含有SEQ ID NO=I 與 SEQ IDNO 2 或者同時含有 SEQ ID NO :1 與 SEQ ID NO :5。本發明第三方面公開了一種遺傳工程化的宿主細胞，它被含有編碼前述抗人 TM^a單克隆抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的載體所轉化或轉導。任何適用于對表達盒 進行表達的細胞都可以作為宿主細胞。例如，酵母、昆蟲、植物等的細胞。優選的，所述宿 主細胞為真核細胞，可采用不會產生抗體的哺乳動物宿主細胞系，具體可以是中國倉鼠 的卵巢細胞CH0;幼倉鼠的腎臟細胞(BHK, ATCC CCL 10)；幼鼠的塞爾托利細胞(Sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴的腎臟細胞(COS 細胞)；通過 SV40 (C0S-7,ATCC CRL 165 1)轉化的猴的腎臟CVI細胞；人的胚腎細胞(HEK-293, Graham et al. J. GenVirol.36 :59(1977))；猴腎臟細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴的腎臟細胞 (VER0-76,ATCCCRL-1587)；人的子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)等。其他細胞系在本學 科領域的文獻中也比較常見。從美國模式菌種收集中心(ATCC)可以獲得多種細胞系。把核酸導入細胞的方法有許多種。比較常用的方法包括電穿孔技術、粒子槍技術、 磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等等。具體方法的選擇一般取決于被轉化的細胞類型，以及進行 轉化所處的具體環境。在某些情況下，可以采用多陰離子轉染脂質體和鈣離子調節的細胞 質基因轉化技術。本發明第四方面公開了抗人TM^a單克隆抗體的制備方法，包括下列步驟1)在適 合表達抗人TM^a單克隆抗體的條件下培養所述宿主細胞；幻分離純化獲得所述單克隆抗 體。在獲得編碼本發明的抗體的核酸序列后，可按照以下方法制備生產目的抗體。例 如將含有編碼目標抗體的核酸的載體直接導入宿主細胞，細胞在適當的條件下進行培養， 從而誘導出被編碼抗體的表達。一旦獲得本發明所說的單克隆抗體，就可以采用本領域技術人員所知的常規方法 對抗體分子進行純化。具體純化方法包括色譜法，比如，離子交換，親和層析，尤其與蛋白質 A的特定抗原進行親和層析，以及尺寸柱層析、離心過濾法、差異溶解度等。在很多情況下， 細胞分泌的抗體進入培養液，并在培養液中收獲。本發明第四方面對抗人TNFa單克隆抗體通過體外活性測定和動物實驗研究了該 抗體在動物體內的治療有效性，進一步公開了上述抗人TM^a單克隆抗體的制藥用途。抗人 TM^a單克隆抗體可用于制備治療與TM^a相關的炎癥的藥物，如制備治療類風濕性關節炎 的藥物。將本發明的抗人TNFa抗體用于治療類風濕性關節炎等與TNFa相關的炎癥時的用 法用量，可參照現有的TNFa抗體的常規用法用量。本發明第五方面，還提供了一種醫藥組合物，其包含治療有效量的本發明的單克 隆抗體以及醫藥學上可接受的載體。可作為醫藥學上可接受的載體及其組分的物質包括糖類；纖維素及其衍生物；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑；多元醇；海藻酸；乳化劑；潤濕劑； 著色劑；調味劑；壓片劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；磷酸鹽緩沖液等。藥 物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水 或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組 合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制 造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明有益效果本發明采用了全人抗體技術，獲得了抗人TNFa全人抗體，對該抗體的理化及生物 活性的初步分析表明，該抗體與TNF有較好的親和力，體外能有效中和TNF對細胞的 殺傷。一方面，由于其全部氨基酸序列均與人抗體完全一致，使其對人體的免疫原性降低到 最低。其次，采用PEG化表面改性技術，以減小其被內皮系統吞噬的概率，延長在血液循環 系統中的時間，同時又實現在體內緩釋的目的，避免了小分子抗體半衰期短的缺點，在保持 其抗TM^aS性的同時，使之更適合體內應用。與現有的單抗藥物相比，可以大大降低用藥 頻率。這不但進一步降低了病人的經濟負擔，而且大大減少了病人注射的痛苦，減少了勞動 力損失。
具體實施例方式以下列舉具體實施例進一步闡述本發明，應理解，實施例并非用于限制本發明的 保護范圍。實施例1抗人TNFa抗體基因的獲得取活動性類風濕關節炎病人外周血5毫升，用淋巴細胞分離液分離白細胞，進行 培養，根據ELISA結果鑒定陽性克隆。1.選擇血樣為了獲得分泌抗人TNFa的人B細胞，首先用人TNFa (購自深圳晶美公司)常規包 被96孔板，每孔用該蛋白250ng，包被過夜。然后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，奶粉用 pH7. 2PBS配制。洗滌后，加入不同病人血清100微升，室溫溫育1小時。然后加入過氧化 物酶標記的羊抗人IgG，室溫放置1小時。洗滌至少5遍后，加入含TMD或其他顯色劑，室 溫或37度處理20分鐘。最后，加入終止液。加入的過氧化物顯色底物加入10分鐘后，用 50 μ IlN的硫酸終止反應，讀取450nm光密度值。選取陽性且OD值高的血清作為獲選血樣。2.分離并富集分泌抗TNF抗體的人B-細胞3.在適當條件下對分泌抗TNF抗體的人B-細胞進行培養4.抗體-反應ELISA篩選用ELISA檢測抗TNFa IgG的分泌。對人B細胞培養液上清的樣品進行篩選。其 中，選擇出具有最好的結合能力的兩個陽性克隆，且為IgGl。取陽性克隆細胞各5000-10000個，分別用Trizol (GIBCO)分離總RNA，用MMLV反 轉錄酶(Promega公司產品)以獲取cDNA。上述操作均按照廠家說明書進行。用下述引物 和條件進行PCR，所用擴增酶為ClonTech的Pfu以確保擴增過程中減少可能的突變。輕鏈上游引物GAAATTGTGCTCACACAGTC(SEQID NO 7)輕鏈下游引物CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQID NO 8)
重鏈上游引物GAAGTCCAGCTGGTCGAGAG(SEQ ID NO 9)重鏈下游引物GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTC(SEQ ID NO :10) PCR條件a)反應體系的組成
權利要求
1.一種抗人TNi^a單克隆抗體，包括重鏈與輕鏈，其輕鏈具有SEQ ID NO 3的氨基酸序 列，其重鏈具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述抗人TNFa單克隆抗體，其特征在于，所述抗人TNFa單克隆抗體經 PEG化修飾。
3.一種多核苷酸，該多核苷酸含有編碼權利要求1所述抗人TM^a單克隆抗體的重鏈和 /或輕鏈的多核苷酸序列。
4.如權利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述編碼抗人TNFa單克隆抗體的輕鏈 的多核苷酸序列為SEQ ID NO :1，編碼抗人TM^a單克隆抗體的重鏈的多核苷酸序列為SEQ IDNO :2或SEQ ID NO :5，編碼抗人TNFa單克隆抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸序列同時含有 SEQ ID NO 1 與 SEQ ID NO 2 或者同時含有 SEQ ID NO 1 與 SEQ ID NO :5。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，它被含有編碼權利要求1所述抗人TM^a單克隆抗體的 重鏈和輕鏈的多核苷酸的載體所轉化或轉導。
6.如權利要求5所述遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述編碼抗人TNFa單克隆 抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的序列同時含有SEQ ID NO :1與SEQ ID NO :2或者同時含有 SEQ ID NO :1 與 SEQ ID NO :5。
7.如權利要求5或6所述遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為真核細胞。
8.如權利要求7所遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述真核細胞為CHO細胞。
9.一種抗人TM^a單克隆抗體的制備方法，包括下列步驟1)在適合表達抗人TM^a單 克隆抗體的條件下培養權利要求5-8任一權利要求所述宿主細胞；2)分離純化獲得所述單 克隆抗體。
10.如權利要求1或2所述抗人TNFa單克隆抗體的用途，為用于制備治療與TNFa相關 的炎癥的藥物。
11.如權利要求10所述抗人TNFa單克隆抗體的用途，其特征在于，所述治療與TNFa相 關的炎癥的藥物為治療類風濕性關節炎的藥物。
12.一種醫藥組合物，其包含權利要求1或2所述抗人TNFa單克隆抗體以及醫藥學上 可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種全人TNFa單克隆抗體及其制備與應用。本發明采用了全人抗體技術，獲得了抗人TNFa全人抗體，對該抗體的理化及生物活性的初步分析表明，該抗體與TNF有較好的親和力，體外能有效中和TNF對L929細胞的殺傷。本發明的全人TNFa單克隆抗體對人體的免疫原性降低到最低。采用PEG化表面改性技術，避免了小分子抗體半衰期短的缺點，在保持其抗TNFa活性的同時，使之更適合體內應用。
文檔編號A61K39/395GK102127167SQ20101002284
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月15日 優先權日2010年1月15日
發明者倪健 申請人:蘇州工業園區晨健抗體組藥物開發有限公司