一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA及其應用的制作方法

專利名稱：一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因領域，涉及小RNA干擾及其應用，具體涉及抑制人及大鼠的 Caspase-3表達的小RNA及其在制備治療慢性疼痛藥物的應用。
背景技術：
慢性疼痛是神經元可塑性變化的表現形式之一，其生理學特點是痛覺的反應性增 高，主要表現為痛覺過敏(hyperal gesia)禾口超敏反應(allodynia)。此類疼痛治療困難，主
要是由于其機制不明。目前在治療上，主要是以嗎啡為代表的阿片類受體阻滯劑，但存在眾 多的副作用以及成癮、耐受等反應，從而限制了其長期使用。 Joachim Scholz、 Hassanzadeh P在2005年、2006年分別有神經病理性疼痛及炎 癥性疼痛模型上發現神經元凋亡有的報道，推測神經元凋亡可能是引起神經病理性疼痛的 原因之一。細胞凋亡(即optosis)是一個細胞自我破壞的程序性生化過程，最終都通過蛋 白酶Caspases介導蛋白裂解起作用，Caspases —部分是對前凋亡信號作出反應的啟動者 (initiators)，主要包括caspase-2、8、9、 10，另一部分作為凋亡的效應者(effectors)，主 要包括caspase-3、6、7，而在神經系統中，caspase-3起關鍵作用。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源 的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因沉默的現象，是生物體內抑制特定基因表達的 一種現象。外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA將被RNase 111家 族中的一個能夠特異性識別雙鏈RNA的酶Dicer，以ATP依賴的方式逐步切割為19 23nt 的小分子干擾RNA片段(smallinterfering RNAs，siRNA)。 siRNA雙鏈在RISC作用下雙鏈 解開，同源的靶目標RNA結合，在核酸內切酶的作用下，將靶目標mRNA切斷，從而阻斷了基 因表達。RNA干擾是目前最有效的基因"沉默"技術，從理論上講，在慢性疼痛通路中興奮性 增高的基因都可能成為RNA干擾靶位，從而降低其興奮性，達到治療目的。但是，干擾效率 高，特異性強的小RNA的獲得較難，不同序列的差異即可導致有效性的喪失，從而影響其藥 理學的價值。

發明內容
本發明的目的在于提供一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA，以及它在制備治療 慢性疼痛藥物中的應用 我們經過篩選，獲得人及大鼠同源性的caspase-3小RNA，可同時對人及大鼠的 caspase-3mRNA進行降解，從而抑制人及大鼠的Caspase-3蛋白的表達，通過抑制細胞凋亡 減輕疼痛，可以成為治療慢性疼痛的一種新的藥物。 具體技術方案是大鼠caspase-3基因序列由Gene bank獲得，序號為NM 004346， 全長為2484bp。人的caspase-3基因序列由Gene bank獲得，序號為NM 004346，全長 為2689bp。再將其相同序列中的開放讀框部分輸入http:〃i.cs.hku.hk/ sirna/ sof tware/sirna. php網站所提供的RNAi設計軟件進行在線篩選，而后選擇GC比在40 % -60 %之間的，位于開放讀框內的5個不同的序列，如下 AGCCGAAACTCTTCATCAT GATACCAGTGGAGGCCGAC TACCAGTGGAGGCCGACTT GTCGATGGACTCTGGAATA ACCTCCGTGGATTCAAAAT 我們從中選出三個序列構建表達載體pShuttleHl-siCas3，同時構建 含caspase-3基因的pEGFPCl報告質粒，用脂質體方法將pShuttleHl-siCas3和 pEGFPCl-Cas3共轉染293細胞，進行RNA干擾效率的檢測，進而篩選出RNA干擾效率最高的 序列GATACCAGTGGAGGCCGAC，對應的RNA序列為GAUACCAGUGGAGGCCGAC。
本發明提供了 一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA，其序列是 GAUACCAGUGGAGGCCGAC (如SEQ ID NO : 1所示)。 本發明通過含caspase-3基因的pEGFPC 1報告質粒對進行RNA干擾效率進行 檢測，得到干擾效率最高小RNA ;又通過小RNA作用于內毒素誘導的人神經細胞HN，發現 小RNA具有良好的抑制人源性神經元凋亡；又通過caspase3小RNA蛛網膜下腔注射，發現 對神經病理性疼痛大鼠的痛覺過敏具有抑制作用。本發明的工作原理caspase-3是細胞 凋亡的一種蛋白酶，而細胞凋亡與慢性疼痛有關，因此下調脊髓caspase-3表達具有抑制 慢性疼痛的作用。RNA干擾技術可降解mRNA從而抑制蛋白的表達，那么，采用該技術抑制 caspase-3的表達就可達到治療疼痛的目的。 因此本發明還提供了上述人鼠同源性的caspase-3的小RNA在制備治療慢性疼痛 藥物中的應用。 本發明的應用可采用小RNA經蛛網膜下腔的直接注射的方式，可達到治療慢性疼 痛的目的，且給藥途徑方便，效果良好。同時，由于本發明不是傳統的阿片類受體阻滯劑，不 存在成癮、耐受等反應，可長期使用。


圖1是流式細胞術測定RNA干擾效率 圖2是RT-PCR檢測凋亡神經細胞caspase-3mRNA 其中1.錯配的RNA組(MM組)；2.小干擾RNA組(siRNA組)； 3.生理鹽水組(NS組)；4. Marker 圖3是不同時間內毒素誘導凋亡的神經元細胞活力比較 圖4是CCI大鼠機械痛閾及熱痛閾的變化 其中A為機械痛閾的變化；B為熱痛閾的變化 圖5是CCI大鼠脊髓Caspase-3 mRNA表達的變化
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。
實施例1 :人鼠同源性的caspase-3的小RNA序列的篩選過程
— .構建3個表達caspase-3小RNA的載體pShuttleHl-siCas3
4
大鼠caspase-3基因序列由Gene bank獲得，序號為NM 004346，全長為2484bp，人 的caspase-3基因序列由Gene bank獲得，序號為NM 004346，全長為2689bp。我們據RNA 干擾的原理選擇了 3個不同的干擾耙基因，據此設計目的基因如下 正向5 ，-gatcccAGCCGAAACTCTTCATCATttcaagagaATGATGAAGAGTTTCGGCTttttt
t-3， (如SEQ ID NO :2所示) I反向5' -agctaaaaaaAGCCGAAACTCTTCATCATtctcttgaaATGATGMGAGTTTCGGCTgg-3'
(如SEQ ID NO :3所示) 正向5， -gatcccGATACCAGTGGAGGCCGACttcaagagaGTCGGCCTCCACTGGTATCtttttt-3' (如SEQ ID NO :4所示) II 反向5' -agctaaaaaaGATACCAGTGGAGGCCGACtctcttgaaGTCGGCCTCCACTGGTATCgg-3'
(如SEQ ID NO :5所示) 正向5， _gatcccACCTCCGTGGATTCAAAATttcaagagaATTTTGMTCCACGGAGGTtttttt-3， (如SEO IDNO :6所示) III反向5' -agctaaaaaaATTTTGMTCCACGGAGGTtctcttgaaACCTCCGTGGATTCAAAATgg-3'
(如SEQ IDNO :7所示) 目的序列兩端分別含BamH I和Hindi 11酶切位點。質粒pShutt 1 eHl (購自美 國Invitrogen公司)用Bgl II和HindIII雙酶切，利用Bgl II與BamH I相同的粘端， 用1V)NA連接酶16t:與退火后的目的基因連接過夜，命名為pShuttleHl-siCas3。轉化 E. coli.DH5a感受態細胞(購自加拿大MicrobixBiosystems公司)，挑克隆抽提質粒DNA， 用Hindi 11和Nde I雙酶切正確后進一步測序鑒定。1、pShuttleHl酶切反應體系
pShuttleHl30 ii 1Bgl II2ii 1HindIII2ii 1Buffer25 ii 1ddH2011 ii 1Total50 ii 1 混勻后，短暫離心，37t:溫育6小時。 2、 1 %瓊脂糖凝膠電泳，用QIAgen公司的Gel Extraction試劑盒回收，產物溶解 于30 ill ddH20中，-20。C保存備用。
3、連接反應體系 pShuttleHl 3ul dsDNA 4 u 1 T4DNA連接酶1 y 1 Buffer 1 ii 1 ddH20 1 ii 1 _
Total 10 ii 1 混勻后，16t:溫育過夜。
4、重組質粒轉化DH5a菌 取連接產物5 ii 1加入氯化鈣法制備的大腸桿菌E. coli. DH5 a感受態細胞50 y 1
中，冰浴1小時后42 °C熱休克90秒，再冰浴4分鐘后加入無抗性的LB培養液200 ， 37 °C
搖床內溫和振搖1小時，鋪預熱的卡那霉素抗性(Kan+)LB瓊脂平板。倒置于37t:生化培養
箱內培養12小時后挑取平板上的單克隆菌株到Kan+LB中，37。C劇烈振搖到細菌中對數期，
挑克隆抽提質粒DNA。 克隆稱為pShuttleHl-siCas3。 5、 Hindi 11和Nde I雙酶切鑒定 pShuttleH 1-siCas3 3ul Hindi 11 0. 5 ii 1 Nde I 0. 5 u 1 Buffer 1 u 1 BSA 1 ii 1 ddH20 4 ill _ Total 10 ii 1 混勻后，短暫離心，37t:溫育3小時，1 %瓊脂糖凝膠電泳。電泳條帶與預計相符的 克隆送上海生工生物工程公司測序鑒定。 二、含大鼠caspase-3基因的pEGFPCl報告質粒的構建及鑒定
據caspase-3序列，設計引物 5， -CGGAGCTCGACAACAACGAAACCTCCGTG-3'(如SEQ ID NO :8所示)； 5， -CGCGTCGACGGCCACCTTCCGGTTAACAC-3，(如SEQ ID NO :9所示)。 引物兩端分別含Sac I和Sal I酶切位點。取正常SD大鼠腎組織抽提總RNA，行
RT-PCR，獲取含有干擾靶序列的caspase-3表達框內的部分序列，長度為741bp。將此片段
與pEGFPCl質粒(購自美國Invitrogen公司)分別用Sac I和Sal I酶切，而后用T4DNA
連接酶16t:過夜連接成pEGFPCl-Cas3。轉化E. coli. DH5 a感受態細胞，挑克隆抽提質粒
DNA，進行PCR擴增出正確的條帶后進一步測序鑒定。1、PCR鑒定體系cDNA2. 5ii 1上游引物1 ii 1下游引物1 ii 1dNTPs(2. 5,1/L)2ii 1MgCl2(25,l/L)2ii 1T叫DNA聚合酶(5u/ ii 1)0. 5ii 1lOXTaq緩沖液2. 5ii 1ddH2016 ii 1Total 25 u 1
0091] 94°C 5min解鏈；94。C 50s，55。C 50s，72。C 90s共30個循環；72。C 10min延伸。取 5 iU， 1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。用QIAgen公司的PCR回收試劑盒回收，進行下一 步Sac I酶切。
0092] 2、 PCR產物Sac I酶切 0093] PCR產物 22. 5 ii 1
0094] Sac I 1. 5u 1
0095] Buffer 1 3 ii 1
0096] BSA 3 ii 1
0097] ddH20 0 ii 1
0098] _
0099] Total 30 ii 1
0100] 混勻后，短暫離心，37t:溫育6小時。1 %瓊脂糖凝膠電泳，用QIAgen公司的Gel Extraction試劑盒回收，產物溶解于30 ill ddH20中，進行下一步Sal I酶切。 0101] 3、PCR產物Sal I酶切
22. 5ii 1
0102] 0103] 0104] 0105] 0106] 0107] 0108] 0109] 0110]
PCR產物(Sac I酶切 后)
Sal I 1. 5ii 1
Buf f er3 3 ii 1
BSA 3 ii 1
d迅O 0 ii 1
Total
30 ii 1
混勻后，短暫離心，37t:溫育6小時。1 %瓊脂糖凝膠電泳，用QIAgen公司的Gel Extraction試劑盒回收，產物溶解于30 ddH20中，-20°〇保存備用。4、 pEGFPCl質粒Sac I酶切
pEGFPCl30 ii 1Sac I2. 5ii 1Buffer15ii 1BSA5ii 1ddH207. 5ii 1Total50 ii 1混勻后，短暫離心，37t:溫育6小時。
5、 1 %瓊脂糖凝膠電泳，用QIAgen公于30ii 1ddH20中，進行下一步Sal I酶切。6、回收產物SalI酶切Sac I酶切產物22. 5ii 1Sal I1. 5ii 1
7
Buffer3 3 ii 1 BSA 3 ill ddH20 Oiil _ Total 30 ill 混勻后，37t:溫育6小時，1%瓊脂糖凝膠電泳，用QIAgen公司的GelExtraction
試劑盒回收，產物溶解于30iU ddH20中，用于下一步與RT-PCR產物連接。 7、連接反應體系 pEGFPCl (酶切后) 3 ill RT-PCR產物(酶切后)4 ill T4DNA連接酶 liil Buffer 1 ii 1 ddH20 liil _ Total 10 ill 混勻后，16t:溫育過夜。 8、重組質粒轉化DH5a菌 取連接產物5 ii 1加入氯化鈣法制備的大腸桿菌E. coli. DH5 a感受態細胞50 y 1 中，冰浴1小時后，42 °C熱休克90秒，再冰浴4分鐘后加入無抗性的LB培養液200 ， 37 °C 搖床內溫和振搖l小時，鋪預熱的卡那霉素抗性(Kan+)LB瓊脂平板。倒置于37t:生化培養 箱內培養12小時后挑取平板上的單克隆菌株到Kan+LB中，37。C劇烈振搖到細菌中對數期， 挑克隆抽提質粒DNA。克隆稱為pEGFPCl-Cas3。 9、HindIII和Nde I雙酶切鑒定 pEGFPCl-Cas3 3 ii 1 Xbal I 0. 5ii 1 Xho I 0. 5ii 1 Buffer2 1 ii 1 BSA liil ddH20 4 ill _ Total 10 ill 37t:溫育3小時，1 %瓊脂糖凝膠電泳。電泳條帶與預計相符的克隆行PCR鑒定。 10、PCR鑒定體系 pEGFPCl-Cas3 2. 5 ii 1 上游引物 liil 下游引物 liil dNTPs(2. 5mmol/L) 2 ii 1 MgCl2(25mmol/L) 2 ii 1 Taq DNA聚合酶 0. 5 ii 1
(5u/ul) 10XTaq緩沖液 2. 5 ii 1 ddH20 16 ill _ Total 25 ill 94°C 5min解鏈；94。C 50s，55。C 50s，72。C 90s共30個循環；72。C 10min延伸。取
5ia，l^瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。電泳條帶與預計相符的克隆送上海生工生物工程
技術公司測序鑒定。 三、RNA干擾效率的檢測 用六孔板常規培養293細胞(購自中國科學院上海細胞生物學研究所)，用脂質體
方法(參見脂染介導的DNA轉染.J.莎姆布魯克著，黃培堂譯.分子克隆實驗指南.第3
版 科學出版社出版 2002， 1276-1288.)將pShuttleHl-siCas3和pEGFPCl-Cas3各2 ii g
共轉染293細胞，并設空白組為陰性對照及pEGFPCl-Cas32ii g轉染組為陽性對照。次日觀
察綠色熒光的強度，胰酶消化細胞，流式細胞儀進一步分析。 1 、 pShuttleHl-siCas3和pEGFPC 1-Cas3共轉染HEK-293細胞株 (1)轉染前24h，將處于對數生長期的細胞用0. 25%的胰酶消化后，按一定的密度
接種于6孔板中，繼續培養18-24h，待細胞長滿底面積約80%時進行轉染。 (2)用無血清無抗生素的DMEM培養液將細胞清洗兩遍，加入適量無血清無抗生素
的DMEM培養液培養備用。 (3)6孔板中的每個孑L pShuttleHl-siCas3(表達3個不同小RNA)
和pEGFPCl-Cas3的用量各為2 y g，陽性對照只加2 y g pEGFPCl-Cas3而不加
pShuttleHl-siCas3，空白組為陰性對照，兩者都不加。將pShuttleHl-siCas3和
pEGFPCl-Cas3共同與200 y 1 Opti-MEM I混合，配成A液，室溫放置5min。 (4)將5ii 1 Lipofectamin 2000試劑在另一管中與200 ii 1 Opti-MEM I混合，配
成 B液，室溫下溫育5min。 (5)把200 iil B混合液加入到200 iil A混合液中，充分混勻，室溫放置20min。
(6)棄六孔板中的無血清培養液。 (7)將AB混合液每孔lml加入六孔板中，培養細胞，輕柔前后推搖培養板以混勻液
體，使之均勻覆蓋在細胞層上。 2、熒光相差倒置顯微鏡觀察 轉染24，48，72h后在熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP在HEK-293細胞株中的表達情 況，同時在物鏡和目鏡放在倍數分別為X100時，用數碼攝像機(LeicaTCS-TN，美國)拍攝 成像。 3、流式細胞儀檢測GFP熒光強度 24h后0. 25X胰蛋白酶常規消化HEK293細胞后收集細胞，PBS洗滌兩次，用流式 細胞儀檢測每孔細胞的平均熒光強度(MFI)和EGFP表達細胞陽性率，定量分析各siRNA對 EGFP熒光蛋白表達的影響。 流式細胞術測定結果如圖l，與陽性對照相比，pShuttleHl-siCas3干預組熒光明顯減弱，以pShuttleHl-siCas311減弱最明顯。說明pShuttleHl-siCas3能夠較好干擾 pEGFPCl-Cas3的中的Cas3片段，從而影響與之同時轉錄的EGFP，導致綠色熒光的強度減 弱，從而確定2號小RNA即本發明的高干擾效率的小RNA。
實施例2 :本發明的小RNA對人神經細胞HN凋亡的抑制作用 采用常規培養人神經細胞HN(購自中國科學院上海細胞生物學研究所)，分為三 組錯配的RNA組(匪組)；Caspase-3小干擾RNA組(siRNA組)及生理鹽水組(NS組)， 采用脂質體方法(參見脂染介導的DNA轉染.J.莎姆布魯克著，黃培堂譯.分子克隆實 驗指南.第3版.科學出版社出版.2002， 1276-1288.)將錯配的RNA和Caspase-3小干擾 RNA各5 ii g(20 ii 1)轉染人神經細胞HN，生理鹽水組加入等量生理鹽水。轉染后后12h，培 養液中加入內毒素至終濃度為5 ii g/ml ， 0 、 6 、 12 、 24、 36h后分別行RT-PCR及四唑鹽比色實 驗(MTT)。 1、四唑鹽比色試驗(MTT)，是一種通過測定細胞能量代謝水平用以間接反映細胞 增殖情況的檢測方法。基本原理及方法參見文獻吳軍正、司徒鎮強，四唑鹽比色試驗中有 關條件的探討.第四軍醫大學學報，1991，12(4) :304-306.
2 、 RT-PCR鑒定體系 cDNA 2. 5 iil 上游引物 下游引物 liU dNTPs(2. 5,1/L) 2 ii 1 MgCl2(25,l/L) 2 ii 1 Taq DNA聚合酶 0. 5 ii 1 (5u/ul) lOXTaq緩沖液 2. 5 ii 1 ddH20 16 ill _ Total 25 ill 上下游引物同前，94。C 5min解鏈；94 °C 50s，55。C 50s，72。C 90s共30個循環； 72°C 10min延伸。取5 y 1， 1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。電泳條帶與預計相符的克隆 送上海基康公司測序鑒定。 結果發現，神經細胞內毒素誘導后細胞內出現凋亡小體，而未加內毒素的細胞藍 染，細胞壁完整。誘導凋亡RT-PCR結果見圖2， Caspase-3小RNA組(siRNA組)神經細胞 HN caspase-3 mRNA明顯弱于對照組。 四唑鹽比色實驗(MTT)結果見圖3，siRNA組內毒素誘導凋亡的人神經細胞活力明
顯強于錯配小RNA組(匪組)、生理鹽水組(NS組)。說明Caspase-3小RNA能夠較好抑
制caspase-3 mRNA的表達，抑制內毒素誘導的人神經細胞HN凋亡，具有良好的神經保護作
用，為今后在人體內的臨床實驗抑制神經細胞凋亡，治療慢性疼痛打下基礎。 實施例3 :本發明的caspase3小RNA蛛網膜下腔注射對該大鼠熱痛閾、機械痛閾
的影響 采用大鼠右側坐骨神經結扎構建神經病理性疼痛模型，觀察caspase3小RNA蛛網
10膜下腔注射對該大鼠熱痛閾的影響。大鼠采用PE-10導管經蛛網膜下腔置管，大鼠分為假 手術組(Sham組)、坐骨神經結扎組(CCI組)、小RNA組及匪組，小RNA在術前Id開始鞘 內注射，20 ii g/d，連續7d。匪組給錯配小RNA。假手術組不結扎坐骨神經。
1、CCI模型的構建 大鼠在動物房休養3天后開始模型手術。采用戊巴比妥(40ml/kg)腹腔注射麻 醉，需要時增加40mg左右。右側大腿中后部背皮后四肢稍捆綁張開于手術臺上，碘氟消毒 后，切開大腿中后部皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經上中段，游離神經到腓神經分叉處， 用4-0的羊腸線依次輕輕地捆扎4個結，結的間距大約lmm，打結的力度為出現大腿肌肉抽 動或發生蹬腿反射為止。假手術組不捆扎坐骨神經，其他的步驟都相同。依次縫合肌肉和 皮膚，對合皮膚后碘氟消毒，腹腔注射0. 3ml氨芐青霉素(濃度100mg/ml)。麻醉醒前單獨 置于塑料籠中，籠中鋪3-6cm的碎木屑，水和食物應能輕易獲得。
2、熱痛閾測定 觀察大鼠在輻射熱照射下出現縮爪反射的潛伏時間作為熱痛閾。大鼠放置于透明 的有機玻璃籠中，籠子無底壁，將籠子放在一塊3mm厚的玻璃板上(小木柜子，上層為玻璃 板，測定儀擺在柜中間)，這樣動物的足底直接接觸玻璃板，而測定探頭緊挨著玻璃板的下 面測定，減少系統誤差。照射源為8v，50w的燈泡，內有凹透鏡聚焦，外罩金屬外殼，上端有 一直徑5mm的孔。這樣燈泡離前端為40mm。探頭連接精確計時器，計時期與照射源電源同 步，記錄開始照射到出現縮爪反應的時間區間。以大鼠在輻射熱照射下出現縮爪反射的潛 伏時間作為熱痛閾，測定值精確到0. 1S，所有動物照射內側第1足趾的著力點，每個時點測 定3次，每次間隔5min，取平均值為熱痛閾。單次照射時間不超過20S，以免損傷照射部位。 所有測定由一個不知情的實驗人員在相同時間點和相同實驗條件下完成。
3、大鼠蛛網膜下腔置管及小RNA注射 大鼠麻醉后，PE-10導管延穿剌孔插入，插入時可見動物嘶叫或甩尾或蹬腿，置入 約lcm，可見腦脊液流出或注入生理鹽水可見水回流，即可封閉管口 。小RNA在術前Id開始 鞘內注射，20iig/d，連續7d。 NS組只給等量的生理鹽水。結果發現在坐骨神經結扎前，注 射本發明的caspase3小RNA(由上海生工生物技術有限公司合成，加入脂質體1 P g/iU)， 大鼠的熱痛閾及機械痛閾未見改變(P>0.05);結扎后生理鹽水組的熱痛閾及機械痛閾明 顯下降(見圖4)，與假手術組相比具有顯著差異(P<0.05)。在小RNA組的第1、3、7d時 間點內，siRNA組的熱痛閾明顯增高，與生理鹽水組相比差異顯著(P < 0. 05)。而第10d與 生理鹽水組相比無顯著差異(P < 0. 05)，說明caspase3小RNA具有抑制坐骨神經結扎的熱 痛覺過敏作用。 為了檢測RNA干擾是否影響脊髓caspase-3的表達，我們采用實時定量PCR的方
法，對脊髓L4-6 caspase-3 mRNA的水平進行測定，結果顯示，在小RNA注射后ld、3d、7d、
10d時間點上caspase-3mRNA的水平明顯低于匪組(見圖5)，說明caspase-3小RNA可明
顯抑制caspase-3 mRNA的表達。 SEQUENCE LISTING 〈110〉中國人民解放軍第二軍醫大學 〈120〉 一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA及其應用 〈130〉說明書，權利要求書
〈160>9〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>19<212>腿〈213〉人工序列〈400>1gaimccagug gaggccgac〈210>2〈211>59〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2gatcccagcc gaaactcttc atcatttcaa gagaatgatg aagagtttcg gcttttttt〈210>3〈211>59〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>33gcte朋朋a agccga朋ct cttcatcatt ctcttg朋at gatg朋g3gt ttcggctgg〈210>4〈211>59〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gatcccgata ccagtggagg ccgacttcaa gagagtcggc ctccactggt atctttttt〈210〉5〈211>59〈212>DNA〈213>人工序列<400>5agcteaaaaa gateccagtg gaggccgact ctcttgaagt cggcctccac tggtatcgg〈210>6〈211>59〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gatcccacct ccgtggattc aaaatttcaa gagaattttg aatccacgga ggttttttt〈210>7
〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉7agctaaaa朋attttgaatc c3cgg3ggtt ctcttga朋c ctccgtggat tc朋朋tgg59〈210>8〈211>29<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉8cggagctcga c朋c朋cg朋acctccgtg29〈210>9〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>9cgcgtcgacg gccaccttcc ggtteacac29
1權利要求
一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA，其特征在于該小RNA的序列如SEQID NO1所示。
2. —種如權利要求1所述的人鼠同源性Caspase-3的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應用。
3. 根據權利要求2所述的人鼠同源性Caspase-3的小RNA在制備治療慢性疼痛藥物中的應用，其特征在于治療慢性疼痛藥物為注射劑。
全文摘要
本發明屬于生物基因領域。慢性疼痛是神經元可塑性變化的表現形式之一，其生理學特點是痛覺的反應性增高，治療困難且機制不明，治療上多用阿片類受體阻滯劑，存在較多副作用。有研究表明Caspase-3上調與慢性疼痛的發生有關，因此，本發明提供了一種人鼠同源性Caspase-3的小RNA，其序列如SEQ ID NO1所示。本發明還提供了該小RNA在治療慢性疼痛藥物中的應用。本發明的小RNA可采用直接注射的方式，可在體內外抑制人及大鼠的Caspase-3的表達，達到治療慢性疼痛的效果，且給藥途徑方便，并且不存在成癮、耐受等反應，可長期使用。
文檔編號A61K48/00GK101792765SQ20101002267
公開日2010年8月4日 申請日期2010年1月12日 優先權日2010年1月12日
發明者俞衛鋒, 吳飛翔 申請人:俞衛鋒;吳飛翔