專利名稱：：N′-(3-硝基苯甲酰基)-n-水楊酰肼合銅配合物及其制法與用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼合銅及其制法與用途。
背景技術：
：多數抗腫瘤藥物主要誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用，其效能與其誘導細胞凋亡的能力密切相關。細胞凋亡是在基因調控下發生的細胞自殺行為，在各種因素作用下，細胞凋亡調控因素的表達發生改變，同時引起一系列生化變化，如ph值下降，某些蛋白酶活性增高，最終導致細胞凋亡。雙酰肼含有酰基和肼基，可以與酶相應的活性點發生作用，同時又是一種很好的螯合劑，與金屬離子配位，形成螯合環，增加了n電子的離域化作用，增強了配合物的親脂性。親脂性的增加使配合物易于滲透細胞。當配合物進入細胞內，與細胞中的微量金屬生成藥物_金屬_酶的混合配合物而阻止病毒的復制。同時，某些核酸和蛋白質又是很好的配位體，可與從配合物中解離出來的金屬離子作用，使一些活性官能團失活，因而具有明顯的細胞毒活性。異煙酰肼是一種很好的抗結核藥物，臨床應用已有幾十年的歷史，雖然反復使用具有很大的毒性和抗藥性，但至今依然被認為是化學治療的首選藥物。為了克服抗藥性，最近，人們已經合成出各種各樣的酰肼類衍生物，特別是水楊酰肼類化合物。根據文獻報道，這類化合物具有很好的生物活性，如抗菌、抗結核和抗腫瘤等。本發明在水楊酰肼的基礎上連接3-硝基苯甲酰基，合成雙酰肼類化合物N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水楊酰肼，以此為配體，合成出一類新型配合物N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼合銅，該配合物具有很好抗腫瘤活性，特別是對白血病癌細胞K562。因此，該類配合物將會成為市場上最有潛力的一類新藥之一。
發明內容本發明的目的在于提供一類新型配合物N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼合銅及其制法與作為抗腫瘤的藥物。本發明的技術方案如下—種四吡啶-二-N'-(3_硝基苯甲酰基)_二-N-水楊酰肼合三銅配合物，它有如下結構式中py為妣啶。—種制備上述配合物的方法，其制備路線圖如下它由下列步驟組成步驟i.將水楊酰肼的三氯甲烷溶液冷卻至8t:，在激烈攪拌下，滴加入與水楊酰肼等物質量的3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，繼續攪拌，讓反應混合物自然升溫至25°C，攪拌3小時后，冷卻，過濾和洗滌，得到黃色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼固體，步驟2.將步驟1得到的N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水楊酰肼溶解在甲醇中，在室溫攪拌下，加入物質的量比為2:3的醋酸銅的甲醇溶液，同時滴加2倍物質的量的吡啶，溶液變成黑色，繼續攪拌4小時，過濾，清液靜置9天后，析出黑色晶體，即為四吡啶_二-N'-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水楊酰肼合三銅配合物。上述的制備方法，步驟l中水楊酰肼的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量為每毫摩爾水楊酰肼加10-15ml，3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量為每毫摩爾3-硝基苯甲酰氯加10-15ml。上述的制備方法，步驟2中甲醇的總用量是每毫摩爾N'_(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼用無水甲醇80-120ml。上述的制備方法，步驟2中吡啶的用量是N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼的物質的量的2-2.5倍。經研究，本發明的四吡啶_二-N'_(3-硝基苯甲酰基)_二-N-水楊酰肼合三銅配合物對人胃癌細胞(BGC-823)和人白血病細胞株(K652)有明顯的抑制作用，因此可以用于制備抗癌藥物。具體實施例方式實施例l.四妣啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水楊酰肼合三銅配合物的制備1.在250mL的圓底燒瓶中，加入3-硝基苯甲酸(10.OOg，O.06mol)和的氯化亞砜(80mL)，加熱回流4h后，蒸出過量的氯化亞砜，得到淡黃色晶狀固體3-硝基苯甲酰氯。2.在lOOmL圓底燒瓶中，加入水楊酰肼(0.15g，lmmol)的的三氯甲烷(10mL)溶液，冰鹽浴冷卻至8t:以下。在激烈攪拌下，緩慢滴加3-硝基苯甲酰氯(0.19g，lmmo1)的三氯甲烷(lOmL)溶液。然后使混合溶液的溫度慢慢升到25t:左右，攪拌3h，得到黃色固體。冷卻，過濾，洗滌，得到黃色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼固體。3.將(0.030g，0.1,1)的N'-(3_硝基苯甲酰基)-^水楊酰肼溶于甲醇(10mL)溶液中，加入Cu(0Ac)2(0.018g，0.lmmol)的甲醇溶液，同時滴加吡啶(lmL)，溶液變成黑色，在室溫下繼續攪拌4h，靜置，過濾，得黑色清液。9d后析出黑色晶體，本發明的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼合銅配合物。經X-射線衍射分析其結果為Q具。^。Cu30n。其結構見圖1.實施例2.四妣啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水楊酰肼合三銅配合物體外抗腫瘤活性研究采用MTT[3-(4，5)-雙甲基_2_噻唑_(2，5)-苯基溴化四氮唑藍]法來測定N'-(3-硝基苯甲酰基)-^水楊酰肼合銅配合物對人胃癌細胞(BGC-823)和人白血病細胞株(K562)的抑制率，計算IC50闊。(1)培養液(每升)的配制掘I-翻培養粉一袋(10.4g)，新生牛血清100ml，青霉素溶液(20萬U/ml)0.5ml，鏈霉素溶液(20萬U/ml)0.5ml，加三蒸水溶解后，用5.6%的NaHC03溶液調pH值至7.2-7.4，最后定容至1000ml。過濾滅菌。(2)D-Hanks緩沖液(每升)的配制NaCl8.OOg，KC10.40g，Na2HP0412H200.06g，KH2P040.06g，NaHC030.35g。高壓滅菌。(3)胰蛋白酶液的配制利用D-Hanks緩沖液配成濃度為0.5%胰蛋白酶液。過濾除菌。(4)實驗藥液的配制將測試樣品用三蒸水和少量的匿SO溶解配成儲備液，一般按實驗最高濃度的io倍配制儲備液。匿SO在培養液中的濃度不宜過大，加藥后的每孔細胞懸液中匿SO的終濃度一般不超過0.05%-0.1%。儲備液保存于-20°〇冰箱中備用。(5)人白血病細胞K562的培養常規培養于RPMI-1640培養液內(含10%小牛血清、100U/ml鏈霉素)，置于37°C、5%C02培養箱中培養，每隔3-4天傳代一次。傳代時將原瓶中培養液轉移至離心管中，lOOOrpm離心5min，棄去原培養液，加入等量新鮮培養液，吹打均勻，移取適量至新鮮培養瓶中，再補充新鮮培養液至原體積(培養液體積約為培養瓶容量的1/10)。(6)人胃癌細胞BGC-823的培養常規培養于RPMI-1640培養液內(含10%小牛5血清、100U/ml鏈霉素)，置于37t:、5XC02培養箱中培養，每隔3_4天傳代一次。傳代時將原瓶中培養液轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去原培養液，加入等量新鮮培養液，吹打均勻，移取適量至新鮮培養瓶中，再補充新鮮培養液至原體積(培養液體積約為培養瓶容量的1/10)。(7)細胞孵育取對數生長期的2種腫瘤細胞，調細胞懸液濃度為l-1.5X105個m1—1。在96孔培養板中每孔加細胞懸液lOOiU，置37°C，5%C02培養箱中培養24h。培養24h后，分別按設計加入藥液。(8)加藥將測試藥液按照最終濃度的濃度梯度分別加入到各個孔中，每個濃度設6個平行孔。實驗分為藥物試驗組(分別加入不同濃度的測試藥)、對照組(只加培養液和細胞，不加測試藥)和空白組(只加培養液，不加細胞和測試藥)。將加藥后的96孔板置于37°C，5%C02培養箱中培養24、4S、72h。陽性對照藥物的活性按照測試樣品的方法測定。(9)存活細胞的測定在培養了24、48、72h后的96孔板中，每孔分別加MTT40iil(用D-Hanks緩沖液配成4mg/ml)。在37。C放置4h后，移去上清液。每孔加150ylDMSO，振蕩5min，使formazan結晶溶解。最后，利用自動酶標儀在570nm波長處檢測各孔的光密度(0D值)。抑制率的計算細胞生長的抑制率按照下列公式計算生長抑制率=(l-存活率)X100%=[l-(0D實驗-0D空白)/(0D對照-0D空白)]X100%(OD實驗表示測試藥物組的平均光密度，OD對gg表示對照組的平均光密度，OD空自表示對照組的平均光密度)。半數抑制濃度(IC5。)定義為當50%的腫瘤細胞存活時的藥物濃度。根據測定的光密度(OD值)，制作細胞生長抑制率的標準曲線，在標準曲線上求得其對應的藥物濃度。測得的ICs。見表l所示表1本發明所列銅配合物對腫瘤細胞的抑制IC5。值(yM)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求一種四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水楊酰肼合三銅配合物，其特征是它有如下結構式中py為吡啶。F2010100172870C00011.tif2.—種制備權利要求1所述的配合物的方法，其特征是它由下列步驟組成步驟1.將水楊酰肼的三氯甲烷溶液冷卻至8t:，在激烈攪拌下，滴加入與水楊酰肼等物質量的3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，繼續攪拌，讓反應混合物自然升溫至25t:，攪拌3小時后，冷卻，過濾和洗滌，得到黃色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼固體，步驟2.將步驟1得到的N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水楊酰肼溶解在甲醇中，在室溫攪拌下，加入等物質量的醋酸銅的甲醇溶液，同時滴加入吡啶，溶液變成黑色，繼續攪拌4小時，過濾，清液靜置9天后，析出黑色晶體，即為四吡啶_二-N'-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水楊酰肼合三銅配合物。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟1中水楊酰肼的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量為每毫摩爾水楊酰肼加10-15ml，3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量為每毫摩爾3-硝基苯甲酰氯加10-15ml。4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是步驟2中甲醇的總用量是每毫摩爾N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水楊酰肼用無水甲醇80-120ml，吡啶用量為2_2.5毫摩爾。5.權利要求l所述的四吡啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水楊酰肼合三銅配合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要一種四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水楊酰肼合三銅配合物，它有如下結構式中py為吡啶。本發明的四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水楊酰肼合三銅配合物對人胃癌細胞(BGC-823)和人白血病細胞株(K652)有明顯的抑制作用，因此可以用于制備抗癌藥物。文檔編號A61P35/00GK101747353SQ20101001728公開日2010年6月23日申請日期2010年1月8日優先權日2010年1月8日發明者仇曉陽,劉淑娟,徐茂田,趙文獻,鄭昕申請人:商丘師范學院