專利名稱：用于治療多發性硬化的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及寡肽和融合蛋白及其在多發性硬化的進展過程中參與MBP的結合和催化性降解的表位特異性抗MBP自身抗體(ESAMBPCAA)的失活中的用途。本發明也涉及包含所述寡肽、所述寡肽的組合物和由上述寡肽組成的融合蛋白的藥物組合物及其用于治療多發性硬化的用途。
背景技術：
多發性硬化(下文縮寫為MS)是具有多項病理生理學和臨床表現和非常復雜病因學的人中樞神經系統的炎性脫髓鞘疾病(Hafler等，2004. J. Clin. Invest. 113 :788-794 ；Kornek等，2003. Brain Res. Bull. 61 :321-326.)。人類中所述疾病的進展導致髓鞘破壞從而最終影響神經傳導電脈沖的能力(Schwartz, R. S. , 1993,在Fundamental Immunology, ed. Paul, ff. E. (Raven,紐約)中，第 1033-1097 頁)。設想了病毒擬態假說以解釋這個病理學的起始(Merkler等，2006. J. Clin.Invest 116:1254-1263.)。然而，目前還沒有明確確定所述疾病的真正發生機理(Hohlfeld 等，2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (SuppI. 2) 14599-14606)。已經證實MS患者中一些增殖T細胞針對MBP (Allegretto等，Science, 247,718-721,1990)并且人T細胞可以識別MBP分子上的多個表位(Richert等,J. Neuroimmun23，55-66，1989)。MBP也顯示出能夠活化一些T細胞而沒有抗原提呈細胞參與(Altman等，Eur. J. Immun. 17,1635-1640,1987)。盡管免疫T細胞參與人和所述疾病的實驗動物模型中MS的發展和進展的證據被強烈和普遍接受，但是特異B細胞反應對髓鞘破壞的貢獻的研究還較少(Klawiter等，2007. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 7 :231-238. ；Nikbin 等，2007. Int Rev. Neurobiol. 79 13-42.)。充分的數據表明大部分MS病例表征為血液中存在針對MBP成分的自身抗體(Reindl 等，1999，Brain, 122，2047-2056 ；Genain 等，1999，Nat. Med. 5，170-175)。而且，高分辨率顯微分析在人MS和絨猴MS樣疾病中的脫髓鞘斑區域檢測到髓鞘特異性自身抗體，表明其對脫髓鞘破壞的直接貢獻(Genain等，1999，Nat. Med. 5，170-175)。雖然在MS發病機理中自身抗體的作用的機制還是未知的，但是MBP和髓鞘少突細胞糖蛋白(MOG)抗體被提議為用于MS臨床預后的生物標記物(Berger等，2003，N. Engl. J. Med. 349，139-145. 10)。在作為MS動物模型的誘導的實驗性過敏性腦脊髓炎的小鼠中發現類似的免疫球蛋白(Fritz等，1983，J. Immunol. 130，191-194.)。在MS活性形式的患者的腦脊液(CSF)中觀察到MBP自身抗體滴度增加(Warren等，Ann Neurol 209 =20-25,1986)。臨床上，MS表征為疾病活動階段如急性復發或慢性進展，以及臨床緩解階段。活動期MS與鞘內出現MBP自身抗體的增加水平相關(Warren 等，Ann Neurol 209 :20-25,1986 ；Catz 等，Can J Neurol Sci 13 21-24,1986)。這些抗體在急性復發期間主要以游離(F)形式出現，而在疾病潛伏進展時主要以結合(B)形式出現(Warren等，Ann Neurol 209 :20-25,1986)。使用選擇性針對和去除CD20+B淋巴細胞的利妥昔單抗治療復發緩解型多發性硬化(RRMS)患者在一定程度上是安全和有效的(Stiive, 0.等，Long-term B-Iymphocyte depletion with rituximab inpatients with relapsing-remitting multiple sclerosis.,Arch Neurol. 2009 年 2 月；66(2) :259-61)。根據現有科學背景，近十年期間已經發展了使用完全MBP分子和MBP蛋白及其片段的多個肽代表片段和同系物的免疫調節治療MS的方法。眾所周知，人MBP由170個氨基酸組成。在科學和專利文獻中，根據MBP片段的第一個氨基酸殘基和從C末端數的最后一個氨基酸殘基在全長MBP序列(SEQ ID NO I)中的位置對MBP片段標記。在WO 9612737中，提供了多種用于預防和治療MS的具有“T-細胞活性”(即影響免疫T細胞或其亞群的活性或功能的能力)的肽(人MBP片段)，并且已經公開了所述肽適合用于治療用途。為了展示MBP中的T細胞識別表位，已經測試了 16個短的(長度各約20個氨基酸)和另外3個長的(82-100、83-105、141-165)彼此“重疊”的肽序列刺激MS患者外周血細胞體外增殖的能力。發明人提供的肽的氨基酸結構對應于下面的MBP片段
II-30；11-29 ；11-31 ；83-105 ;82_105 ;82_104 ;80_98 ;82_102 ;80_104 ;80_102 ;111_130 ；
III-129;141-165 ;101-125。而且，這些作者公開了這些肽與現有技術已知的具有MBP T細胞活性的其它肽的組合，其它肽如:13-25 ；31-50 ；61-80 ;82_92 ;82_96 ;82_97 ;82_98 ；82-100 ；82-100 ；83-100 ;83_101 ;84_97 ;84_100 ;85_100 ;86_105 ;87_99 ；87-99[91K >A] ；88-100 ；88-99 ；82-100 ;111_135 ；122-140 ；139-170 ；141-160 ;142_166 ;142_168 ；146-160 ;153-170。Wraith D. C.和共同作者提供了一種用于篩選能結合MHC I類或II類分子而不需要進一步抗原處理的致耐受肽的方法，以及在藥物組合物中使用這些肽用于治療和/或防止多發性硬化。這些作者已經合成和使用了對應于人MBP的片段1-24 ； 15-39 ;30_54 ；45-69 ；60-84 ;75_99 ;90_114 ;105_129 ;120_144 ;135_159 ;150_170 ;131_145 ;132_146 ；133-147 ；134-148 ;135_149 ；136-150 ;137_151 ;138_152 ;139_153 ；140-154 ;141_155 ；142-156 ；143-157 ； 144-158的多種肽，用于鑒定被MS患者外周血細胞識別的人MBP表位，然后用于研究這些肽結合MHC I類或II類分子的能力。選擇了對于調節免疫T細胞功能有活性的多種短肽，并且將所述短肽用于MS治療134-148 ；135-149 ;136_150 ；137-151 ；138-152 ;139_153 ;140_154 ；30-44 ;80_94 ;83_99 ;81_95 ;82_96 ;83_97 ;84_98 ； 110-124 ； 130-144 ；131-145 ;132_146 ; 133-147 (參見申請EP1918298、US 11/979，224、WO03/64464)。在US2005209156中，已經公開了選自具有氨基酸序列AGAPVVHPPLAIVTPAT包括其替代、添加或缺失的MBP片段(75-98)的肽用于MS治療。在美國專利No. 5858980中，MBP片段84-102和143-168被鑒定為包含在MS發展中有活性的MBP的免疫顯性T細胞識別表位，以及提供了包含氨基酸序列ENPVVHFFKNIVTPRT (MBP 片段 83-98)及其類似物和 AQGTLSKIFKLGGRD (MBP 片段 146-160)的肽，以及包含所述肽的藥物組合物。Warren K. G.與共同作者提供了用于中和抗MBP自身抗體、具有對應于下面的人 MBP 的氨基酸殘基61-75 ；64-78 ;69_83 ;75_95 ;69_83 ;80_97 ;91_106 ;84_93 ;85_94 ；86-95 ；87-96 ;82_98的可溶性的合成肽。這些肽與MBP序列的61-106位氨基酸殘基重疊(參見WO 98/45327)。選擇的肽之一(稱為MBP 75-95)顯示體外和體內(MS患者血液中)結合MBP游離抗體的能力。相反，不結合的對照肽MBP 35-58對MS患者中游離和結合抗體沒有作用。在臨床試驗中已經評價了一些基于MBP的肽和DNA疫苗含有完全MBP序列的基因的 Bayhill Therapeutics 的 DNA 疫苗 BHT-3009 ;來自 Neurocrine Biosciences 的改變的肽配體GP77116和NBI-5788 ;來自Autoimmune(R)的基于完全MBP序列的口服致耐受性組合物Myloral。然而，由于嚴重的不利事件或不能減慢MS進展，這些治療劑沒有取得顯著成功(Hohlfeld 等，Proc Nat Acad. Sci U S A. 2004 年 10 月 5 日，101 (Suppl. 2)14599-14606.)。現在，在臨床試驗II期中正在廣泛研究對應于MBP的氨基酸殘基82-98 (DENPVVHFFKNIVTPRT)并且編碼為MBP8298的上述合成肽用于治療進展型多發性硬化。所述肽以每6個月500mg的劑量靜脈施用。已經顯示對MBP8298治療的應答者是僅具有 HLA 亞型(heliotypes)DR2 和 / 或 DR4 的患者(Warren, K. G.等，European Journal ofImmunology, 2006, vol. 13, No 8,第 887-895 頁)。 上述MBP 84-102片段(美國專利No. 5858980)用作制備臨床試驗I期中繼發進展型MS的治療劑的活性成分。根據擴展殘疾狀態量表，九孔柱試驗，通過磁共振成像診斷的新損傷測定(Goodkin, D. E.等，Neurology 2000, vol. 54,第 1414-1420 頁)沒有檢測到治療效果。因此，尋找和選擇具有針對MS治療活性的寡肽、MBP新片段是艱巨的任務，并且，即使在廣泛的臨床前體外和/或體內試驗的基礎上，本領域技術人員預先不能預測相對于MS治療的這種寡肽的藥學性質。通過發現參與MS發展和進展的新的免疫病理學機制，可以完成這種新的有效的肽的鑒定和選擇。早期我們已經提供如下證據在MS患者血液中循環的小部分抗MBP自身抗體顯示對MBP分子的位點特異性蛋白裂解切割，并且代表髓鞘破壞和MS進展的新的免疫病理學機制(Ponomarenko 等，Immunology Letters 103, 2006,第 45-50 頁)。因此，本發明的目的是確定能中和在多發性硬化進展期間參與MBP的結合和催化性降解的表位特異性抗MBP自身抗體的新的寡肽(ESAMBPCAA-表位特異性抗MBP催化性自身抗體)，和使用這些新的寡肽治療MS的新的有效方法。通過提供中和ESAMBPCAA的新寡肽部分(寡肽、由這些寡肽和這些寡肽的片段組成的融合蛋白)、包含所述寡肽和融合蛋白的藥物組合物，可以實現這個目的。令人驚訝地，盡管ESAMBPCAA僅代表MS中小部分循環抗MBP自身抗體，本發明的發明人已經發現中和ESAMBPCAA的包含短至SEQ ID NO 2的6個氨基酸殘基的序列的寡肽在治療MS中表現意想不到的高效力。在閱讀下面本發明的詳細描述后，本發明的其它優點和方面將變得顯而易見。
發明內容
在一個實施方式中，本發明提供具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO:2)的寡肽(I)。在進一步的實施方式中，本發明提供包含SEQ ID NO :2中的一個或多個氨基酸序列改變的寡肽，其中，所述寡肽包含SEQ ID NO :2的至少6個連續的氨基酸殘基，并且能結合ESAMBPCAA。在又進一步的實施方式中，本發明提供寡肽I的片段或包含SEQ ID NO 2的一個或多個氨基酸序列改變的寡肽I的片段，其中，所述片段具有至少6個氨基酸殘基的長度并且能結合ESAMBPCAA。在進一步的實施方式中，本發明提供一種包含作為活性成分的治療有效量的寡肽和制藥學可接受載體或稀釋劑或藥物遞送系統的藥物組合物，所述寡肽是以下任意一種-具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO 2)的寡肽 I ;-包含SEQID NO :2的一個或多個氨基酸序列改變的寡肽，其中所述寡肽包含SEQID NO :2的至少6個連續氨基酸殘基并且能結合ESAMBPCAA ；-具有氨基酸SEQID NO :2的寡肽I片段或包含SEQ ID NO :2的一個或多個氨基酸序列改變的寡肽片段，其中，所述片段具有至少6個氨基酸殘基長度，并且能結合 ESAMBPCAA。在另一個實施方案中，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如上所述的作為有效成分的治療有效量的具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的寡肽I或其片段，或一種包含SEQ ID NO :2的一個或多個氨基酸序列改變的寡肽或其片段，并且進一步包含選自具有SEQ ID NO 3的寡肽II和具有SEQ ID NO 4的寡肽III的至少一種寡肽。在另一個實施方式中，本發明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白由一種或多種具有選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的序列的肽或其片段組成，所述肽或其片段以任何順序通過肽或非肽接頭彼此順序連接，其中所述融合蛋白包含至少一種SEQ IDNO 2的寡肽或其片段。在優選的實施方式中，根據本發明的融合肽由序列SEQ ID NO :2的片段組成，所述片段具有至少6個氨基酸殘基的長度，并且通過肽或非肽接頭彼此順序連接。在本發明進一步的實施方式中，提供了一種用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效劑量的本發明的寡肽或其片段或融合肽或藥物組合物。在本發明具體實施方式
中，用于治療多發性硬化的方法包括將患有多發性硬化的患者的血液暴露于有效劑量的本發明的寡肽或片段或融合蛋白或藥物組合物。在另一個實施方式中，提供了本發明的寡肽或融合蛋白用于制備用于治療多發性硬化的藥物的用途。
圖I顯示完整的人MBP分子的氨基酸序列。大寫字母代表人MBP的氨基酸殘基。也對應顯示部分MBP-對應于本發明的寡肽(SEQ ID N02)的氨基酸序列以及具有氨基酸序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的寡肽的氨基酸序列。這些部分MBP-氨基酸序列用黑線框起。圖2顯示在ESAMBPCAA存在下MBP的降解，以及在不同MBP肽片段存在下降解的抑制(圖的水平行對應于第一個氨基酸殘基和從C末端數的最后一個氨基酸殘基在全長MBP序列中的位置)。圖3說明通過包含MBP片段43-68的氨基酸序列的不同合成寡肽抑制了ESAMBPCAA活性。橫軸——抑制測定中使用的寡肽的濃度；縱軸——相對的ESAMBPCAA活性(對照測定(PBS)中ESAMBPCAA活性被視為I)。寡肽的編碼在實施例3中表明。圖4說明患有實驗性過敏性腦脊髓炎的DA大鼠通過本發明的寡肽和融合蛋白處理的MDS積分的抑制。DA大鼠中進行的EAE在第24天MDS積分抑制。各組大鼠的最大臨床積分、中位數和95%可信區間。圖5說明在進行的實驗性MS (泰勒氏病毒感染)中寡肽組合對MDS積分的抑制。
具體實施例方式定義如文中使用的，術語“寡肽”指包含通過肽鍵連接的多至約20個氨基酸殘基的任何分子，即術語“寡肽”表示長度為多至20個氨基酸的多肽。術語“寡肽”包含寡肽及其鹽。合適的鹽包括鈉鹽或鉀鹽或乙酸鹽或磷酸鹽。
如在本說明書中使用的，術語“寡肽”包含具有特定氨基酸序列的“寡肽”及其功能性變體。所述功能性變體包括特定序列的寡肽的任何片段，其中，所述片段具有6-20個氨基酸長度，條件是其保持結合ESAMBPCAA的能力。如在本說明書中使用的，術語本發明的寡肽的“片段”包含至少約6個、優選至少約8個、優選至少約12個、更優選至少約14個、以及最優選至少約16個或更多個連續氨基
酸殘基。進一步預期的是通過改變母本寡肽氨基酸序列獲得的本發明寡肽的變體。這種改變可以包含一個或多個氨基酸取代、缺失、插入或添加，條件是得到的變體包含母本序列的至少6個連續氨基酸并且能結合ESAMBPCAA。如在本說明書中使用的，術語“融合蛋白”指的是與另一種寡肽或其片段融合的寡肽或其片段，各融合部分通過肽鍵與另一部分直接連接(一種寡肽的N末端氨基基團(NH2)連接到另一種寡肽或其片段的C末端的羧酸基團(COOH))或可選地通過接頭連接。“接頭”可以選自“肽接頭”或“非肽接頭”。“肽接頭”可以由包含約I至約20個氨基酸、彼此通過肽鍵線性連接并且可以任選包括用于蛋白酶分裂位點的序列的序列組成。本文中使用的術語“非肽接頭”指的是除肽接頭外，具有兩個或更多個反應性基團的任何連接部分。優選的接頭是非肽聚合物。用作本發明的接頭的非肽聚合物是在兩端均攜帶反應性基團的聚合物，所述反應性基團均能獨立地結合寡肽的反應性基團，其中所述寡肽的反應性基團的例子包括末端氨基或末端羧基、賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱氨酸殘基。聚合物的反應性基團包括醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基、酮基、乙烯砜基、硫醇基、酰肼基、羰基二咪唑基(⑶I)、硝基苯基碳酸酯基(NPC)、trysylate基、異氰酸酯基和丁二酰亞胺衍生物。丁二酰亞胺衍生物的例子包括丁二酰亞胺基丙酸酯(SPA)、丁二酰亞胺基丁酸(SBA)、丁二酰亞胺基羧甲酯(SCM)、丁二酰亞胺基丁二酰亞胺(SSA)、丁二酰亞胺基丁二酸酯(SS)、丁二酰亞胺基碳酸酯和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)。非肽聚合物末端的反應性基團可以相同或不同。例如，所述聚合物可以在一端具有馬來酰亞胺基并在另一端具有醛基。低分子量接頭包括碳二亞胺或戊二醛。如在本說明書中使用的，術語“ESAMBPCAA”指的是在MS患者血液中循環的小部分自體免疫球蛋白分子，其結合髓鞘堿性蛋白并催化MBP分子位點特異性蛋白水解裂解。如在本說明書中使用的，術語“治療”指的是由主治醫生或任何本領域技術人員通過任何常規方法評價，向患有疾病的受試者施用療法、制劑、化合物或組合物以降低、減輕或消除正在治療的狀況的至少一種癥狀。如在本說明書中使用的，術語“中和、失活、抑制”表示如用特定合適的測試系統測定的降低特定活性。如在本說明書中使用的，“有效量”是指在施用時，能降低、減輕或消除多發性硬化的至少一種癥狀的如上所述的寡肽、其片段或融合蛋白的量。此外，有效量表示能降低或預防多發性硬化狀況的量。基于我們以前的工作(Belogurov等，The Journal of Immunology, 2008,180 1258-1267)，發現了參與MS患者中髓鞘堿性蛋白的識別和降解的自身抗體新的類型。這些催化活性抗體代表非常小部分的抗MBP抗體，然而，發現其催化活性與MS的進展狀態相關。因此，抗MBP自身抗體介導MBP蛋白質水解的量化可作為MS的新生物標記物。令人驚奇地，盡管ESAMBPCAA僅代表MS中小部分循環抗MBP自身抗體，本發明的作者已經發現對ESAMBPCAA具有強中和活性的某些寡肽證實在人和完善的多發性硬化的動物模型中的MS治療中具有意想不到的高效力。根據本發明，提供了具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO 2)的寡肽。這個序列對應于人MBP的氨基酸序列46-62， 下文稱為“MBP 46-62”。所述寡肽能抑制ESAMBPCAA。寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的片段和功能性變體組成本發明優選的實施方式之一。在使用寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的一系列截短形式進行的ESAMBPCAA抑制測定的基礎上，確定了寡肽片段為保持其生物學活性所需要的的最小數量的氨基酸。因此，根據本發明，寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的片段或功能性變體必需保持SEQ ID NO 2的至少6個連續的氨基酸殘基。基于公開內容，本領域技術人員容易經驗性地確定可以對寡肽序列GGDRGAPKRGSGKDSHH進行何種改變，而不影響肽的ESAMBPCAA抑制活性。另一方面，本發明提供了分別具有序列GFGYGGRASDYKSAHK (SEQ ID NO : 3)和QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(SEQ ID NO 4)的兩種寡肽。這些肽包含本領域公知的由免疫T細胞和/或來自MS患者的“常規”(非蛋白質水解)抗MBP自身抗體識別的MBP表位。本發明人出人意料地發現在治療人的多發性硬化和阻止(或降低)建立的MS實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)動物模型的發展中，這些寡肽(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4)協同增強本發明寡肽(SEQ ID NO 2)的效力。與寡肽(SEQ ID NO 2)相比，盡管對ESAMBPCAA具有低抑制活性，當向動物和人共施用時，這兩種寡肽增強GGDRGAPKRGSGKDSHH寡肽的治療效果。雖然不希望被任何理論限制，可以假設這是由于以下事實幾種免疫機制一免疫T細胞功能和自身抗體介導的MBP水解的同時調節，可以提供增倍的治療效果。因此，提供了包含寡肽SEQ ID NO :2、其片段或功能性變體和序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的兩種寡肽中至少一種的藥物組合物。在本發明的進一步的實施方式中，SEQ ID NO :2的寡肽、其片段或功能性變體彼此連接以形成融合肽。這種融合肽包含多個拷貝的ESAMBPCAA的失活部分。在本發明進一步的實施方式中，寡肽(SEQ ID NO 2)或其片段或功能性類似物和寡肽(SEQ ID NO 3)或其片段和寡肽(SEQ ID NO 4)或其片段以任意順序彼此連接以形成融合肽。因此，本發明的融合肽可以包含多個重復拷貝的寡肽(SEQ ID NO 2)的ESAMBPCAA失活部分和寡肽(SEQ ID NO 3)表位和寡肽(SEQ ID NO 4)表位。本發明進一步提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的本發明的寡肽(SEQ ID NO 2)或其片段或功能性變體或融合蛋白和藥學可接受載體或稀釋劑和/或藥物遞送系統。藥學可接受載體的例子是本領域公知的，包括例如生理鹽水。藥物遞送系統的例子也是本領域公知的，包括例如脂質體或合成的聚合物納米顆粒。本發明的寡肽可以根據合成具有根據公開的式子的寡肽的現有方法制備。融合蛋白可以通過重組DNA技術制備。如本發明公開的，知道選擇的融合蛋白的序列，通過常規的已知的合成DNA序列的方可以制備合適的DNA序列。可以將這樣制備的DNA序列克隆至合適的克隆載體中，并且用于轉化合適的宿主細胞以產生重組肽。上述的所有方法都是常規的并且對本領域技術人員是公知的。本發明進一步提供一種用于治療多發性硬化的方法，所述方法包括向需要的受試者施用有效劑量的寡肽或片段或融合肽、或包含寡肽或片段或融合肽的藥物組合物。用于治療MS的寡肽或融合蛋白的治療劑量可以是約0. Olmg每千克體重至約10. Omg每千克體重；所述組合物可以靜脈內、皮下、鞘內施用。在本發明的一個實施方式中，所述組合物經口向目標施用，被稱為“粘膜遞送途徑”施用。所述組合物可以根據需要，可以作為單次劑量 或連續劑量施用。本發明特別參照其優選實施方式進行了詳細描述，下述實施例用于說明但不限制本發明。實施例實施例I. ESAMBPCAA——結合多發性硬化患者血液中髓鞘堿性蛋白并且催化MBP分子的位點特異性蛋白水解裂解的自身免疫球蛋白分子的檢測使用24名沒有接受類固醇或非類固醇抗炎藥物治療的MS患者(17-54歲，平均年齡32歲)的血清進行抗MBP自身抗體的純化和表征。MS診斷被證實和確定，并且根據Poser/ s疾病進展分類，使用臨床、免疫學和MRI數據計算EDSS (擴展殘疾狀態量表)值(Poser 等，Clin Neurol Neurosurg 2001 ;103 :1-11.)。通過三次重復50%硫酸銨沉淀，接著通過在G蛋白-瓊脂糖凝膠(Amersham Biosciences)上親和層析從血清中分離免疫球蛋白(IgG)。然后對包含IgG的部分用含0. 05% NaN3的PBS或TBS于4°C進行透析。通過ELISA對IgG的量進行量化和標準化。通過電泳，接著進行銀染色、在非還原條件下免疫印跡以及通過表面增強激光解析/電離(SELDI)質譜分析法評價IgG純度。進一步在固定有MBP的NHS-瓊脂糖凝膠(Amersham)柱上通過抗原親和層析分離IgG,其純度通過電泳接著通過銀染色技術進行評價。根據Miller (Miller 等，1996. Experimental autoimmune encephalomyelitis inthe mouse.在 Current Protocols in Immunology ；J. E. Coligan, ed. Wiley,紐約，第 S19頁中)從牛腦制備MBP。產生的蛋白質通過反相HPLC在柱C410/250(Mashery-Nagel，德國)上純化。通過抗MBP自身抗體的MBP水解如下進行評價純化抗體(0. I-Imkg)在含l_2mkgMBP的終體積12. 5mkl PBS、0. 02% NaN3中于37°C孵育14小時。樣品與Laemmli ' s緩沖液混合。在Tris-甘氨酸和N-三(羥甲基)甲基甘氨酸緩沖液系統中通過SDS-PAGE觀察MBP降解的程度。對于定量MBP降解測定，將MBP (IOmkM)與在0. Iml PBS,0. 02% NaN3中的抗體(60nM)于37°C孵育12小時。通過加入10% TFA達到pH 2. 5終止反應。將樣品進一步在柱C44. 0/150 (Waters)上層析。不裂解的MBP的量通過監測280nm處吸光度進行計笪結果在表I中顯示。 表I :24名多發性硬化患者的臨床狀態和通過ESAMBPCAA的MBP水解的對應速率
權利要求
1.一種寡肽，具有氨基酸序列 GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO :2)。
2.權利要求I的寡肽，包含SEQID NO 2的一個或多個氨基酸序列變化，其中，所述寡肽包含SEQ ID NO 2的至少6個連續氨基酸殘基，并且能結合抗髓鞘堿性蛋白水解自身抗體(ESAMBPCAA)。
3.權利要求I或2任一項所述的寡肽的片段，其中，所述片段具有至少6個氨基酸殘基的長度，并且能結合抗髓鞘堿性蛋白水解自身抗體(ESAMBPCAA)。
4.一種藥物組合物，包含治療有效量的權利要求I或2任一項所述的寡肽或根據權利要求3所述的片段作為活性組分，和藥學可接受的載體、賦形劑或藥物遞送系統。
5.權利要求3所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物進一步包含選自具有SEQIDNO 3和SEQ ID NO 4序列的寡肽中的至少一種寡肽。
6.一種融合肽，由SEQ ID NO :2的片段組成，具有至少6個氨基酸殘基的長度，并且通過肽或非肽接頭彼此順序連接。
7.一種融合肽，由選自通過肽接頭或非肽接頭以任何順序彼此順序連接的選自SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4或其片段的序列的一種或多種肽組成，其中，所述融合肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 2或其片段的至少一種寡肽。
8.—種藥物組合物，包含治療有效量的權利要求6或7任一項所述的融合蛋白作為活性組分，和藥學可接受載體、賦形劑或藥物遞送系統。
9.一種治療或預防需要這種治療的受試者中多發性硬化的方法，其中，所述方法包括向受試者施用根據權利要求4、5或8中任一項所述的組合物。
10.根據權利要求4、5或8中任一項所述的組合物在制備用于治療多發性硬化的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了新的寡肽、寡肽組合物和由上述寡肽組成的融合蛋白。所述寡肽與人髓鞘堿性蛋白(MBP)的氨基酸序列的選擇部分的氨基酸序列同源，并且能通過結合并失活在多發性硬化進展過程中參與結合和催化性降解MBP的表位特異性抗MBP自身抗體(ESAMBPCAA)而改善多發性硬化的進展。
文檔編號A61K39/00GK102781465SQ200980162867
公開日2012年11月14日 申請日期2009年10月12日 優先權日2009年10月12日
發明者A·A·別洛古羅夫, A·G·哈比博夫, N·A·波諾馬連科 申請人:生命生物實驗室有限公司