專利名稱：含有幾丁質或殼聚糖的可降解復合材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖的可降解復合材料。更具體地，本發明涉及一種可降解復合材料，其含有至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖并在水分存在的環境例如生命體中緩慢降解。
背景技術：
因為幾丁質和殼聚糖不會對生態系統產生不利影響，其被用于各種醫用材料(參見專利文件1)。例如，用幾丁質和殼聚糖作原材料而制備的片材被用作創傷敷料材料，并且用幾丁質和殼聚糖作原材料而制備的纖維被用作醫用修復材料。已知當幾丁質和殼聚糖降解時，它們變成在體內被吸收的可溶性糖類，并且已經知道其降解產物是高度生物相容性的。然而，也有一些問題，因為幾丁質和殼聚糖不能被人體內的酶分解，因此使用這些物質作原材料而制備的醫用材料難以以其留在體內的方式來進行使用。使用后長時間留在身體組織內的醫用材料具有安全和使用方便的優勢，因為如果其在手術之后組織損傷已愈合到一定程度的階段被體內吸收并且消失，就沒有必要將已實現其目的的醫用材料移除。因此，如果能夠對幾丁質和殼聚糖賦予自降解能力，則可以提供具有更高實用性的醫用材料。然而，至今為止，尚未確立出能夠使幾丁質和殼聚糖具有這樣的自降解能力的技術。引用列表專利文獻專利文件1 日本專利申請特開平第2003-265591號
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種可降解的復合材料，其包含至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖并且具有自降解能力。解決向題的方案發明人進行了密集的研究來解決上述問題，他們發現，通過將能夠水解幾丁質和殼聚糖的酶承載在含有至少一種從中選擇的多糖的成型品上，該多糖可以在水分存在的環境例如生命體中緩慢降解，由此可提供具有自降解能力的可降解復合材料。具體而言，發明人發現，通過使用熱穩定性酶作為上述的降解酶，其對多糖的降解活性可在長時間內穩定保持，并且使得復合材料可以在水分存在的環境中持續安全降解。基于這些認知，通過進一步的改變和改進而完成本發明。更具體地，本發明提供具有以下特征的可降解復合材料第1)項一種可降解的復合材料，其包括能夠水解至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖并承載在含有該多糖的成型品上的降解酶。第2~)項根據權利要求1所述的可降解復合材料，其中含有多糖的成型品為片狀。
第幻項根據第1)項所述的可降解復合材料，其中含有上述多糖的成型品為纖維狀。第4)項根據第1)項所述的可降解復合材料，其中降解酶是在4°C或更高時表現出活性并且具有95°C或更高的最適溫度的熱穩定性幾丁質酶。第幻項根據第1)項所述的可降解復合材料，其中降解酶是源于強烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩定性幾丁質酶。第6)項根據第1)項所述的可降解復合材料，其為醫用材料。第7)項根據第1)至幻項中任一項所述的可降解復合材料用于制備醫用材料的用途。第8)項根據第6)項所述的用途，其中醫用材料是創傷敷料或醫用修復材料。第9)項一種治療創傷的方法，其中患者的受傷部位涂覆有第2、項所述的可降解復合材料。第10)項一種縫合切口部位或裂傷部位的方法，其中患者的切口部位或裂傷部位用第幻項所述的可降解復合材料進行縫合。發明的有益效果在水分存在的環境中，本發明的幾丁質和/或殼聚糖的可降解復合材料可以自降解成高度生物相容且可溶的糖類。結果，當本發明的可降解復合材料作為醫用材料施用到受傷組織時，其在受傷組織上保留期望的時間后消失，從而不需要在術后對該醫用材料進行移除，因此可以使患者的負擔減輕。此外，通過使用在4°C 100°C的寬范圍溫度下表現出活性的降解酶作為本發明的可降解復合材料中的能夠水解幾丁質和/或殼聚糖的降解酶，可以在多種溫度條件下于水分存在的環境中引發自降解，其使得本發明能夠用于廣泛的用途。另外，通過使用熱穩定性酶作為本發明的可降解復合材料中的降解酶，由于該酶的高度穩定性，可降解復合材料的自降解能力可以得到穩定保持，由此使得可降解復合材料可以在水分存在的環境中持續穩定分解。而且，該特征提供長期的儲存穩定性。
圖1是示出當在醋酸緩沖液中于60°C的溫度在包含幾丁質的薄片中進行崩解評估的結果的照片。
具體實施例方式本發明的可降解復合材料的特征在于，能夠水解至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖的降解酶被承載在含有該多糖的成型品(在下文中，有時簡單表示為“幾丁質成型品”)上。實施本發明的最佳方式在以下詳細說明。通常，幾丁質是其中N-乙酰葡糖胺結構單元通過β _1，4糖苷鍵連接的多糖，但是在用于本發明的幾丁質中，少于50 %的乙酰基可以是脫乙酰化的。此外，殼聚糖是脫乙酰多糖，并且倘若幾丁質中50%或更多的乙酰基已經脫乙酰化，用于本發明的殼聚糖可以包括還未被脫乙酰化的部分。用于本發明可降解復合材料中的幾丁質成型品可以包括幾丁質或殼聚糖作為多糖，或者可以包括其組合。此外，用于本發明可降解復合材料中的幾丁質成型品可以僅由上述多糖組成，或者按照需要，也可以包括其它可降解的樹脂、添加劑等。在使用本發明的可降解復合材料的幾丁質成型品中，上述多糖的含量比并未具體限定，但從提高可降解復合材料的自降解能力的角度而言，基于幾丁質成型品的總重，多糖的總重優選為30wt% IOOwt %，更優選為50wt% IOOwt %，甚至更優選為70wt% IOOwt %。本發明可降解復合材料的幾丁質成型品的構型可以根據可降解復合材料的擬定方式來適當確立，并且本文中并未作具體限定。實例包括片狀、纖維(線)狀、無紡布狀、棉狀、海綿狀等。其中優選片狀和纖維狀形式，因為它們是容易用作醫用材料等的構型。幾丁質成型品可以通過公知的制備方法來生產，或者可以作為商業產品而獲得。用于本發明可降解復合材料的降解酶在本文中未作具體限定，只要其能夠水解多糖并且是藥學上可接受的。這樣的降解酶的具體實例包括幾丁質酶、殼聚糖酶等。例如，如果多糖是幾丁質，則使用幾丁質酶，如果多糖是殼聚糖，則使用殼聚糖酶。用于本發明可降解復合材料的降解酶可以是單獨使用的一種酶，或者可以是組合使用的兩種或更多種酶。用于本發明的降解酶的有效溫度在本文中并未具體限定，只要其在可降解復合材料將被使用的溫度下和環境中表現出活性，優選該降解酶在4°C 100°C的寬范圍溫度下表現出活性。通過使用在如此高溫度的范圍內表現出活性的酶，可以在多種溫度條件下于水分存在的環境中引發可降解復合材料的自降解，由此可降解復合材料發明可用于廣泛的應用。而且，用于本發明的降解酶的優選實例是熱穩定性酶。使用此種熱穩定性酶不僅能在高溫條件下賦予本發明的可降解復合材料以自降解能力，而且還可以提高其儲存穩定性。該熱穩定性酶的例子是一種最適溫度為60°C或更高，且更優選為約90°C的酶。 用于本發明的熱穩定性酶的優選實例是在4°C或更高時表現出活性并且最適溫度為95°C 或更高的熱穩定性幾丁質酶。該熱穩定性幾丁質酶的一個具體實例是源于強烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩定性幾丁質酶。源于強烈火球菌的熱穩定性幾丁質酶已為公眾所知，且可以通過在日本專利申請特開平第2004-344160中公開的方法來制備。本發明的可降解復合材料的優選方式是將幾丁質酶承載在含幾丁質的成型品上； 更優選的方式是將幾丁質酶承載在含幾丁質的片狀或纖維狀成型品上；特別優選的方式是將熱穩定性幾丁質酶承載在含幾丁質的片狀或纖維狀成型品上。本發明的可降解復合材料中的降解酶可以通過物理吸附或化學結合而承載在含多糖的成型品上。可以，例如通過將含有降解酶的溶液涂覆至含有多糖的成型品或者用該溶液來浸漬成型品，來制備本發明的可降解復合材料。此外，可以通過將降解酶揉捏至含有多糖的成型品中來進行制備。在本發明的可降解復合材料中，承載在含有多糖的成型品上的降解酶的量在本文中沒有具體限定，并且可以根據多糖的類型、可降解復合材料的形式、其用途等等來適當設置。降解酶的承載量的實例是每1克多糖有100U 100，000U的降解酶，優選1，000U 10，000U,并且更優選2，000U 5，000U。對于本文中使用的降解酶的活性單位，將IU定義為在下列條件下于1分鐘內釋放1 μ mol N-乙酰葡糖胺或葡糖胺所需要的酶活量。
底物溶液將幾丁質粉末或殼聚糖粉末加到200mM醋酸緩沖液(pH 5. 6)中使其為 0. 5wt%然后使其懸浮。降解酶溶液將待測定的降解酶溶解于蒸餾水中，至濃度為0. 8mg/mL。測量規程(1)首先，將ImL的底物溶液置于測試管中并于37°C培育5min至lOmin。(2)接著，將0.2mL的降解酶溶液加到測試管中，并于37°C在輕柔的攪動下培育降解酶1小時。(3)在混合物冷卻后，加入1000 μ L DMAB (對-二甲氨基苯甲醛)試劑，并于37°C 加熱20min后，在585nm測量光吸收以確定還原端的增加，從而量化N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的釋放量。通過將IOg的DMAB加到含有12. 5襯％的ION鹽酸的IOOmL醋酸中來制備 DMAB試劑，并在使用前即刻用醋酸稀釋10倍。本發明可降解復合材料的用途在本文中沒有具體限定，其可以用于很多領域。本發明可降解復合材料的用途的優選實例是創傷敷料材料、醫用修復材料、或其它醫用材料。 當將本發明的可降解復合材料施用到患部時，其上承載的降解酶通過與患部的水分接觸而活化，從而開始自降解。因此，由于本發明的可降解復合材料進行自降解并在體內被吸收， 其可以用作長時間留存在體內組織中的醫用材料(例如，創傷輔料或醫用修復材料)。在這種情況下，當本發明的可降解復合材料被用作醫用材料時，可將其應用到人類醫療用途或哺乳動物(非人類)醫療用途。如果本發明的可降解復合材料以例如片狀使用，其會非常適合用作創傷敷料材料。如果本發明的可降解復合材料將被用作創傷敷料材料，受傷區域僅需要涂布創傷敷料材料。施用到受傷區域的創傷敷料材料是有益的，因為它將在創傷愈合到一定程度的階段降解并在體內被吸收，創傷愈合后不需要將其移除。此外，如果本發明的可降解復合材料被用作創傷敷料材料，可以通過其在創傷愈合的過程中逐漸降解而使對于創傷的療效增加。此外，如果本發明的可降解復合材料以例如纖維的形式進行使用，其會非常適合用作醫用修復材料。如果將本發明的可降解復合材料用作醫用修復材料，患者的切口或裂傷區域僅需要用醫用修復材料進行縫合。因為用于縫合切口或裂傷區域的醫用修復材料隨著縫合區域的愈合而在體內被吸收，不需要在術后將縫線移除，從而可以減輕患者的負擔。實施例以下通過實施例來詳細描述本發明，但本發明并不限制于此。實施例11.幾丁質酶的制備使用LB培養基(含10g/L多聚蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/L氯化鈉)于37°C 對攜帶有質粒的大腸桿菌進行振蕩培養，該質粒中已導入編碼源于強烈火球菌的幾丁質酶的DNA(日本專利申請特開平第2004-344160號中由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列)， 并在對數生長期(600nm處的光密度為0.2至0.4)時加入異丙基β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使得最終濃度為0. 2mM。繼續不變地培養過夜，然后通過離心分離(6，000Xg， 7min)來收集大腸桿菌細胞。將從1升培養液中回收的大腸桿菌細胞懸浮于20mL的緩沖液A(25mM Tris-HCl[pH 7. 5] UmM EDTA、25mM NaCl)中，并通過超聲處理來裂解。在裂解之后，通過高速離心(13，000Xg，15min)來獲得提取液。將提取液于85°C加熱30min，再次進行高速離心(13，000Xg，15min)，并收集上清液。將收集的上清液加到Hi1TrapQ陰離子交換柱(Amersham，5mL)中。使用 AKTAprime (Amersham)將上清液加到柱中并進行洗脫。使用濃度梯度(25mM 1M)的包含于緩沖液A中的鹽(NaCl)來進行洗脫。收集洗脫出目標幾丁質酶的級分，并且使幾丁質酶于4°C在80%的飽和硫酸銨中沉淀過夜。通過高速離心(13，000Xg，15min)來回收沉淀物并將其再溶解于緩沖液A中。將溶解的樣品加到已用緩沖液A平衡的HiLoad ^/60Superdex-200pg凝膠過濾柱(Amersham)中，以除去低分子量的蛋白質和殘留的硫酸銨。收集幾丁質酶洗脫級分并用Centrift^p YM-IO(Amicon)濃縮。以這種方式得到的幾丁質酶在37°C具有18，000U/g(干重當量)的幾丁質酶活性。2. /1,丁質酶對包含幾丁質的薄片的降解能力的評測將包含幾丁質的薄片(Beschitin W, Unitika)切成20mmX20mm的方塊(約 0. 0125g)，并將方塊浸入20mL的50mM醋酸緩沖液(pH4. 5)或50mM Tris緩沖液(pH 7. 4) 中。之后向兩種溶液中加入0.0006g通過上述方式得到的幾丁質酶，靜置溶液同時將溫度保持在37°C或60°C。在一段固定的時間后，將薄片移除并檢查崩解量。出于比較的目的， 進行相同的測試而不添加幾丁質酶。圖1示出在60°C的溫度于醋酸緩沖液中對薄片崩解的評測結果。如圖1所示，可以清楚看出包括幾丁質的薄片因與幾丁質酶共存而降解。在37°C的醋酸緩沖液、37°C的Tris 緩沖液、和60°C的Tris緩沖液中也得到相似的結果。包含幾丁質的薄片在幾丁質酶的存在下于37°C降解，因而以上結果證實，其上承載有幾丁質酶的幾丁質薄片將在體內自降解并且可用于醫療應用。3.可降解復合材料的制備于4°C將包含幾丁質的薄片(Beschitin W, Unitika, IOOmmX 120mm,0. 4g)浸入 IOmL的50mM Tris緩沖液(pH 7. 5)中30min，該Tris緩沖液含有通過上述方式得到的濃度為0. 011g/mL的幾丁質酶。之后，通過移除薄片并在50°C將其干燥而得到其上承載有幾丁質酶的幾丁質薄片(可降解復合材料)。
權利要求
1.一種可降解復合材料，包括能夠水解至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖并承載在含有所述多糖的成型品上的降解酶。
2.根據權利要求1所述的可降解復合材料，其中所述含有多糖的成型品為片狀。
3.根據權利要求1所述的可降解復合材料，其中所述含有多糖的成型品為纖維狀。
4.根據權利要求1所述的可降解復合材料，其中所述降解酶是在4°C或更高時表現出活性并且具有95°C或更高的最適溫度的熱穩定性幾丁質酶。
5.根據權利要求1所述的可降解復合材料，其中所述降解酶是源于強烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩定性幾丁質酶。
6.根據權利要求1所述的可降解復合材料，其為醫用材料。
7.根據權利要求1 5中任一項所述的可降解復合材料用于制備醫用材料的用途。
8.根據權利要求6所述的用途，其中所述醫用材料是創傷敷料或醫用修復材料。
9.一種治療創傷的方法，其中患者的受傷部位涂覆有根據權利要求2所述的可降解復合材料。
10.一種縫合切口部位或裂傷部位的方法，其中患者的切口部位或裂傷部位用根據權利要求3所述的可降解復合材料進行縫合。
全文摘要
本發明的目的是提供一種可降解復合材料，其包含至少一種選自幾丁質和殼聚糖的多糖，并且具有自降解能力。通過將能夠水解幾丁質和殼聚糖的酶承載在含有至少一種從中選擇的多糖的成型品上，該多糖可以在水分存在的環境例如生命體中緩慢降解。
文檔編號A61L15/64GK102573937SQ20098016182
公開日2012年7月11日 申請日期2009年10月7日 優先權日2009年10月7日
發明者奧崇, 野口武 申請人:東袋株式會社, 株式會社耐熱性酵素研究所