使用抗lgr7抗體的癌癥的診斷和治療的制作方法

專利名稱：使用抗lgr7抗體的癌癥的診斷和治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及與LGR7蛋白結合的抗體、癌癥的診斷方法、治療方法和抗癌藥。
背景技術：
LGR7分子是由人染色體4q32的Ensembl ID的ENSG00000171509基因編碼的蛋白，該分子是G蛋白偶聯七次跨膜結合蛋白的激素受體家族的LGR家族(富含亮氨酸GPCR 家族，以下稱作LGR家族)的成員，這由其氨基酸序列的特征即可明確(非專利文獻1)。其在RefSeq中以NM_021634/NP_067647注冊。還有人報道了第70位的氨基酸由Leu變成 Met的序列(專利文獻1)。并且，有人報道了 3個剪接變體，LGR7. 1(AY899848. 1)在外顯子 6和外顯子7之間插入有外顯子6a，并且在外顯子15和外顯子16之間插入有外顯子15a。 LGR7. 2 (AY899849. 1)形成了缺失外顯子 12、13 的基因結構。LGR7. 10 (AY899850. 1)缺失外顯子3。LGR家族的成員被分成3組，第一組為FSHR(LGRl)、LHCGR(LGR2)或TSHR (LGR3) 的激素受體，第二組為配體不明確的LGR4、LGR5或LGR6，第三組為以松弛素、胰島素樣肽 3(INSL3)等為配體的LGR7或LGR8(非專利文獻2)。已知均以兩個雜肽為配體，主要向細胞內傳遞由cAMP介導的信號。LGR家族具有由七次跨膜蛋白區和N末端長的胞外區形成的結構，在胞外區存在9-17個由約25個氨基酸殘基形成的、富含亮氨酸的區的重復 (leucine-rich r印eat丄冊)。LGR7具有10次LRR(非專利文獻1)。此外，其他LGR家族分子中所沒有的LDL-A結構域存在于緊挨在LRR之前的N末端(非專利文獻幻。有報道稱LDL-A是信號傳遞所必需的，還參與LGR7的膜內輸送(trafficking)(非專利文獻4)。 由TSHR等分析可知在LGR家族分子中配體高親和性地與其胞外的LRR結合，并且與第2 胞外環狀區結合，從而進行與G蛋白偶聯的信號傳遞(非專利文獻5)。關于與LGR7結合的配體，已知有松弛素，當為人時，有松弛素2、松弛素3，但具有更高的結合能力的配體是松弛素2，認為其在生物體內發揮LGR7的配體的作用(非專利文獻6、7)。關于作為配體的松弛素，有關于其與甲狀腺癌(Thyroid carcinoma)和前列腺癌 (prostate cancer)的關系的報道(非專利文獻8)。有報道稱在前列腺癌中，在導入有第 273位的氨基酸的R突變成H的p53的前列腺癌細胞株LNCaP中，促進不依賴于雄激素的增殖(非專利文獻9)。在該細胞中H2松弛素上升，由此暗示其參與H2松弛素的表達和前列腺癌的進展，R273H的p53直接與H2松弛素的啟動子結合，經由雄激素受體誘導PSA的表達。但報道LGR7與癌癥的關系的論文尚不存在。另一方面，在專利文獻中，有LGR7基因表達在子宮癌、卵巢癌中較在正常組織中高的報告、或關于LGR7與癌癥的關聯的報道，但在所有文獻中，使用抗體的抗癌作用均未得到確認，能否利用抗體進行表達LGR7的癌癥的治療尚不明確(專利文獻2 5)。即使在卵巢癌中，明細胞腺癌也作為化學療法不易起效的癌癥種類而已知(非專利文獻10、11)。杉山等人報道了 對于作為標準療法的包含順鉬、紫杉烷化合物的化學療法的應答率在漿液性腺癌中為72.5%，相對于此，在明細胞腺癌中為11. 的低反應性(非專利文獻10)。另一方面，近年來明細胞腺癌的患者數增加，據日產婦志57卷11號1711 (2005)報道，在日本明細胞腺癌占卵巢癌全體的22%。這與海外的報告FIGO Annual Report 1998中報道為6%的數字相比大有不同。另外，根據日產婦報道，在卵巢癌中，明細胞腺癌相對于全上皮性惡性腫瘤的比例在1971-1977年為4%、在1978-1983年為約10%， 相對于此，在2002年超過20%并日趨增加，因此人們希望開發抗明細胞腺癌的療法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 :W0 9948921專利文獻2 :US 2005107595專利文獻3 :W0 2003016487專利文獻4 :W0 2003093827專利文獻5 :W0 2005107396非專利文獻非專利文獻1 :Hsu, S. Y.等人，Molec. Endocr.，14，1257-1271 (2000)非專禾Ij文獻 2 :Hsueh A. J. W.等人，Journal of Endocrinology, 187, 333-338(2005)非專利文獻3 :Bathgate RA.等人，Pharmacol Rev, 58, 7-31 (2006)非專利文獻4 :Kern Α.等人，Endocrinology，148，1181-1194 (2007)非專禾丨J 文獻 5 :Kristiansen K. , Pharmacology & Therapeutics,103, 21-80(2004)非專禾O 文獻 6 =Halls Μ. L.等人，British Journal of Pharmacology, 150， 677-691(2007)非專禾U 文獻 7 :Van Der ffesthuizen, Ε. Τ.等人，Current Drug Targets, 8， 91-104(2007):Hombach-Klonisch S. ^A, American Journal of Pathology, 169,617-632(2006)非專利文獻9 =Vinall R. L.等人，Oncogene, 25，2082-2093 (2006)非專利文獻10 =Sugiyama T 等人.Cancer, 88，2584 (2000)非專利文獻 11 =Enomoto T st al. Proceedings of ASC0. 2003 ； 1797，Chicago

發明內容
發明所要解決的課題本發明的目的在于提供與LGR7蛋白結合的新型抗體、診斷癌癥的新方法、治療癌癥的新方法、新的細胞增殖抑制劑和抗癌藥。解決課題的方法本發明人等發現在卵巢癌中的明細胞腺癌細胞中，不僅LGR7的基因就連其蛋白也高度表達。即使在卵巢癌中，LGR7也只限于與明細胞腺癌這一種癌癥密切相關，迄今為止這未見報道。另外，本發明人等制作了抗LGR7蛋白的單克隆抗體。并且，本發明人等在測定抗LGR7抗體的抗體依賴性細胞毒(antibody-cbpendentcell-mediated cytotoxicity ；ADCC)活性時，發現抗LGR7抗體對LGR7表達細胞具有 ADCC活性。并且，在測定補體依賴性細胞毒(complement-cbpendent cell-mediated cytotoxicity ；CDC)活性時，還發現抗LGR7抗體對LGR7表達細胞具有CDC活性。而且，在對異種移植腫瘤模型小鼠給予該抗LGR7抗體時，明確了該抗LGR7抗體顯示出腫瘤縮小效果。根據以上的認識，本發明人等發現抗LGR7抗體對原發性的或轉移性的卵巢明細胞腺癌的診斷、預防和治療有效，從而完成了本發明。更具體而言，本發明人等發現抗LGR7抗體作為用于治療或診斷以卵巢明細胞腺癌為代表的、LGR7表達亢進的癌癥的手段是有效的，從而完成了本發明。S卩，本發明提供與LGR7蛋白結合的抗體。本發明還提供與LGR7蛋白結合、且對表達LGR7蛋白的細胞具有細胞毒活性的抗體。優選該細胞毒活性為ADCC活性。本發明還提供結合有細胞毒性物質的抗LGR7抗體。本發明還提供含有與LGR7蛋白結合的抗體作為有效成分的藥物組合物。本發明還提供含有與LGR7蛋白結合的抗體作為有效成分的細胞增殖抑制劑。本發明還提供含有與LGR7蛋白結合的抗體作為有效成分的抗癌藥。或者，本發明提供含有與LGR7蛋白結合的抗體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。更具體而言，本發明提供下述[1] [23]的發明。[1]抗體，該抗體與LGR7蛋白結合、且對表達LGR7蛋白的細胞具有細胞增殖抑制活性。[2] [1]所述的抗體，其中，細胞增殖抑制活性為細胞毒活性。[3] [2]所述的抗體，其中，上述細胞毒活性為抗體依賴性細胞毒活性。[4] [2]所述的抗體，其中，上述細胞毒活性為補體依賴性細胞毒活性。[5] [1] [4]中任一項所述的抗體，該抗體為細胞毒性物質所結合的抗體。[6] [5]所述的抗體，該抗體為具有內化活性的抗體。[7] [1] W]中任一項所述的抗體，該抗體為抑制癌細胞增殖的抗體。[8] [7]所述的抗體，其中，上述癌細胞為卵巢癌明細胞。[9]以下(1) 09)中任一項所述的抗體(1)抗體(22DA6重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 6記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列；(2)抗體(22DA6輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 10記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 11記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID N0:12記載的氨基酸序列；(3)抗體(22DA6)，該抗體含有(1)所述的H鏈和⑵所述的L鏈；(4)抗體(22DA7重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 15記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 16記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID N0:17記載的氨基酸序列；(5)抗體(22DA7輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 20記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :21記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 22記載的氨基酸序列；
(6)抗體(22DA7)，該抗體含有(4)所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(7)抗體(22DA17重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 25記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO ,21記載的氨基酸序列；(8)抗體(22DA17輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 30記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :31記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 32記載的氨基酸序列；(9)抗體(22DA17)，該抗體含有(7)所述的H鏈和⑶所述的L鏈；(10)抗體(22DA22重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 35記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 37記載的氨基酸序列；(11)抗體(22DA22輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 40記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 41記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 42記載的氨基酸序列；(12)抗體(22DA22)，該抗體含有(10)所述的H鏈和(11)所述的L鏈；(13)抗體(22DA23重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 45記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 47記載的氨基酸序列；(14)抗體(22DA23輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 50記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 52記載的氨基酸序列；(15)抗體(22DA23)，該抗體含有(13)所述的H鏈和(14)所述的L鏈；(16)抗體(22DAM重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 55記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 56記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 57記載的氨基酸序列；(17)抗體(22DAM輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 60記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 61記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 62記載的氨基酸序列；(18)抗體(22DAM)，該抗體含有(16)所述的H鏈和(17)所述的L鏈；(19)抗體02SD7重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 65記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 66記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 67記載的氨基酸序列；(20)抗體Q2SD7輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 70記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :71記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 72記載的氨基酸序列；(21)抗體(22SD7)，該抗體含有(19)所述的H鏈和Q0)所述的L鏈；(22)抗體Q2SD11重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 75記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 76記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 77記載的氨基酸序列；
(23)抗體Q2SD11輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 80記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 81記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 82記載的氨基酸序列；(24)抗體Q2SD11)，該抗體含有02)所述的H鏈和Q3)所述的L鏈；(25)抗體(22SD48重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 85記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 86記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 87記載的氨基酸序列；(26)抗體(22SD48輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 90記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 91記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 92記載的氨基酸序列；(27)抗體Q2SD48)，該抗體含有05)所述的H鏈和Q6)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體與(1) (XT)中任一項所述的抗體具有同等活性；(29)抗體，該抗體識別與(1) (XT)中任一項所述的抗體所識別的表位相同的表位。[10] [1] [9]中任一項所述的抗體，該抗體具有人恒定區。[11] [10]所述的抗體，該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[12] [1] [11]中任一項所述的抗體，該抗體是巖藻糖缺失的抗體。[13]藥物組合物，其中含有[1] [12]中任一項所述的抗體作為有效成分。[14]細胞增殖抑制劑，其中含有[1] [12]中任一項所述的抗體作為有效成分。[15]抗癌藥，其中含有[1] [12]中任一項所述的抗體作為有效成分。[16] [15]所述的抗癌藥，其中，作為治療對象的癌癥為卵巢癌。[17] [16]所述的抗癌藥，其中，上述卵巢癌為明細胞腺癌。[18]癌癥的診斷方法，其特征在于檢測LGR7蛋白或編碼LGR7蛋白的基因。[19]癌癥的診斷方法，其特征在于檢測LGR7蛋白。[20] [19]所述的診斷方法，其中LGR7蛋白的檢測使用與LGR7蛋白結合的抗體來進行。[21]癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟(a)提供從受試者采集的試樣的步驟；(b)使用與LGR7蛋白結合的抗體檢測(a)的試樣中所含的LGR7蛋白的步驟。[22]癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟(a)將與LGR7蛋白具有結合活性、且用放射性同位素標記的抗體給予受試者的步驟；(b)檢測上述放射性同位素的累積的步驟。[23] [18] [22]中任一項所述的診斷方法，其中，作為診斷對象的癌癥為卵巢癌。[24] [23]所述的診斷方法，其中，上述卵巢癌為明細胞腺癌。


圖1-1是表示在10例卵巢癌的組織型的明細即4例明細胞癌、2例漿液性腺癌、3例類內膜腺癌、1例癌肉瘤以及10種正常組織、4種胎兒組織、4種卵巢癌細胞株、由 International Genomics Consortium(IGC)公開的包含3例明細胞癌的87例卵巢癌的 U133 Plus2.0表達數據中，LGR7(1552715_a_at)的表達分布圖的圖。IGC的樣品名下記載的記號分別表示以下意思。C 明細胞腺癌；E 類內膜性腺癌；S 漿液性腺癌；M 粘液性腺癌；0 其他癌癥；B 良性境界菜液性囊腺瘤(Benign serous cystadenoma of borderline malignancy)。JH0C-5、MCAS、RMG-l、RMUG-S、TKY_nu 為卵巢癌細胞株，其中 RMG-1 為來自明細胞腺癌的細胞株。圖1-2是表示LGR7(1552715_a_at)的表達分布圖的圖。圖1-3是表示LGR7(1552715_a_at)的表達分布圖的圖。圖2是顯示將細胞溶解液進行SDS-PAGE電泳，利用抗HA抗體(HA_7)通過WB檢測HA-LGR7/BaF3#48、HA-LGR7/DG44把4中的LGR7的表達的結果的照片。各泳道如下，泳道 1 :BaF3 ；泳道 2 :HA-LGR7/BaF3#48 ；泳道 3 :DG44 ；泳道 4 :HA_LGR7/DG44#24。圖3是顯示通過Cr釋放測定以HA-LGR7/DG44為靶細胞、以NK92mFcR3作為效應細胞的ADCC活性的結果的圖。圖4是顯示以HA-LGR7/DG44作為靶細胞，使抗LGR7抗體和幼兔補體同時發生反應，來測定補體依賴性細胞毒活性的結果的圖。將使各抗體作用的細胞中攝入了 7-AAD的細胞的比例視為CDC活性的強度。圖5是顯示以HA-LGR7/DG44作為靶細胞，使Mab-ZAP (Saprin標記抗小鼠抗體) 與各單克隆抗體作用后，通過WST8分析測定活細胞數的結果的圖。縱軸的值越高，則顯示活細胞數越多。圖6是顯示根據相對于HA-mLGR7/BaF3的FACS反應性，表明22DA17、22DA23與小鼠LGR7具有交差性的圖。縱軸表示GeoMean的值。圖7是顯示使用生物素化抗體Bio-22DA17、Bio_22DA22進行競爭FACS分析的結果的圖。根據非標記抗體是否競爭表位，來分析其是否是識別不同表位的抗體。明確了 22DA12、22DA22是識別與其他抗體不同的表位的抗體。實線為使生物素化抗體發生作用的結果，帶黑影的峰表示使FITC標記抗小鼠抗體反應的結果。圖8顯示使用小鼠異種移植模型的藥效試驗的結果。將抗體給藥所引起的腫瘤體積的變化對腫瘤移植后的天數作圖。實線為陰性對照的PBS給藥組的結果，正方形虛線為抗體FTK0DA23的10mg/kg給藥組的結果，三角虛線為抗體FTK0DA23的ang/kg給藥組的結^ ο
具體實施例方式LGR7本發明中，LGR7是七次跨膜型的LGR家族成員的蛋白。人LGR7的氨基酸序列和編碼該序列的基因序列分別公開在NCBI檢索號NP_067647(SEQ ID NO 1)和NM_021634 (SEQ ID NO 2)中。本發明中使用的LGR7可以是剪接變體或突變體。在本發明中，LGR7蛋白的含義包括全長蛋白及其片段兩者。片段是指含有LGR7蛋白的任意區域的多肽，可以不具有天然LGR7蛋白的功能。片段的例子有包括LGR7蛋白的胞外區的片段。LGR7蛋白的胞外區在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中相當于第1-404位、第462-485位、第M9-581位、以及第648-661位。跨膜區在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中相當于第405-427位、第439-461 位、第486-508位、第5四-548位、第582-604位、第625-647位、以及第662-681位。抗LGR7抗體的制作本發明中使用的抗LGR7抗體只要與LGR7蛋白結合即可，不限定其來源、種類、形狀等。具體可以使用非人動物的抗體(例如小鼠抗體、大鼠抗體、駱駝抗體)、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體等公知的抗體。本發明中，可以使用單克隆抗體或多克隆抗體作為抗體， 但優選為單克隆抗體。抗體與LGR7蛋白的結合優選為特異性結合。另外，當本發明中使用的抗LGR7抗體為識別人LGR7的抗體時，可以是特異性識別人LGR7的抗體，也可以是同時識別來自其他動物的LGR7(例如小鼠LGR7)的抗體。本發明中使用的抗LGR7抗體，可以利用公知的方法，以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。本發明中使用的抗LGR7抗體特別優選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括由雜交瘤產生的單克隆抗體；以及利用基因工程的方法，由用含有抗體基因的表達載體轉化的宿主產生的單克隆抗體等。產生單克隆抗體的雜交瘤基本上可以采用公知技術如下制備。首先，使用LGR7蛋白作為致敏抗原，按照常規的免疫方法對其進行免疫。按照常規的細胞融合法使由免疫動物得到的免疫細胞與公知的親本細胞融合，得到雜交瘤。再利用通常的篩選法，從該雜交瘤中篩選產生目標抗體的細胞，從而可以選擇產生抗LGR7抗體的雜交瘤。具體而言，單克隆抗體的制備例如可如下進行。首先，通過表達LGR7基因，可以獲得用作取得抗體的致敏抗原的LGR7蛋白。LGR7基因的核苷酸序列公開在NCBI檢索號 NM_021634(SEQ ID N0:2)等中。即，將編碼LGR7的基因序列插入公知的表達載體中，轉化適當的宿主細胞，之后按照公知的方法，可以從其宿主細胞中或培養上清中純化目標人 LGR7蛋白。純化的天然LGR7蛋白也可同樣使用。另外，象本發明所使用的那樣，還可以利用使LGR7蛋白的所需的部分多肽與不同的多肽融合的融合蛋白作為免疫原。為了制造作為免疫原的融合蛋白，例如可以利用抗體的Fc片段或肽標簽等。表達融合蛋白的載體可如下制作通過使所需的編碼兩種或兩種以上多肽片段的基因進行符合讀框的融合，將該融合基因插入表達載體中來制作。融合蛋白的制作方法記載在Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook，J等人，Molecular Cloning 2nd ed. , 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)中。如此操作而純化的LGR7蛋白可以用作用于對哺乳動物進行免疫的致敏抗原。 LGR7的部分肽也可用作致敏抗原。例如，可以以下述肽作為致敏抗原。根據人LGR7的氨基酸序列通過化學合成獲得的肽；將LGR7基因的一部分插入到表達載體中，使其表達而獲得的肽；利用蛋白分解酶分解LGR7蛋白而獲得的肽。對用作部分肽的LGR7的區域和大小沒有限定。優選的區域可以從構成LGR7的胞外結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO :1的氨基酸序列中第1-404位、第462-485位、第 549-581位、以及第648-661位)中選擇。構成作為致敏抗原的肽的氨基酸數目優選為至少 3以上、例如5以上或6以上。更具體而言，可以以8 50、優選10 30個殘基的肽作為致敏抗原。對用該致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別限定。為了利用細胞融合法得到單克隆抗體，優選考慮與用于細胞融合的親本細胞的適合性來選擇免疫動物。通常作為免疫動物， 優選嚙齒類動物。具體可以以小鼠、大鼠、倉鼠或兔作為免疫動物。此外，猴等也可作為免疫動物。可以按照公知的方法，利用致敏抗原免疫上述動物。例如常規方法為通過腹腔內或皮下注射致敏抗原，可以對哺乳動物實施免疫。具體而言，每4 21天對哺乳動物多次給予該致敏抗原。致敏抗原用PBS(磷酸緩沖鹽)或生理鹽水等按適當的稀釋倍率稀釋后用于免疫。并且，可以將致敏抗原與佐劑一同給藥。例如，可以將致敏抗原與弗氏完全佐劑混合、乳化，作為致敏抗原。另外，用致敏抗原進行免疫時可使用適當的載體。特別是使用分子量小的部分肽作為致敏抗原時，優選將該致敏抗原肽與白蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白 (keyhole limpet hemocyanin)等載體蛋白結合后進行免疫。另一方面，單克隆抗體還可以通過DNA免疫(DNA Immunization)而獲得。所謂 DNA免疫，是指將在免疫動物中以編碼抗原蛋白的基因(例如SEQ ID NO 2)能夠表達的方式構建的載體DNA給予該免疫動物，使免疫抗原在免疫動物體內表達，從而賦予免疫刺激的方法。與給予蛋白抗原的普通免疫方法相比，在DNA免疫中有望獲得下述優勢。-可以維持LGR7這樣的膜蛋白結構不變而賦予免疫刺激-不必純化免疫抗原但另一方面，在DNA免疫中難以與佐劑等免疫刺激手段組合。由于LGR7具有七次跨膜型立體結構這樣的結構特征，所以預料難以在體內保持天然存在的結構不變的情況下引發免疫反應。與由于這樣的結構特征而難以獲得抗體的、屬于LGR家族的蛋白LGR7結合的單克隆抗體通過DNA免疫而實際獲得，這是出乎意料的成果。通過DNA免疫獲得本發明的單克隆抗體時，首先，對免疫動物給予表達LGR7蛋白的DNA。編碼LGR7的DNA可以通過PCR等公知方法來合成。將得到的DNA插入適當的表達載體中，之后給予免疫動物。作為表達載體，例如可以使用pcDNA3. 1等市售的表達載體。 對生物體給予載體的方法也可采用通常使用的方法。例如，將吸附有表達載體的金顆粒通過基因槍(gene gun)打入細胞內，從而可以進行DNA免疫。如此地對哺乳動物進行免疫，確認血清中所需抗體量升高后，從哺乳動物采集免疫細胞用于細胞融合。特別優選使用脾細胞作為免疫細胞。與上述免疫細胞融合的細胞使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。優選骨髓瘤細胞具備用于篩選的適當的選擇標志物。選擇標志物是指，可以(或者不可以)在特定的培養條件下生存的特性。選擇標志物中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷(以下簡記為HGPRT 缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下簡記為TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺陷的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下簡記為HAT感受性)。HAT感受性的細胞在HAT選擇培養基中無法進行DNA合成而死亡，但與正常細胞融合時，利用正常細胞的補救途徑可以繼續進行DNA的合成，所以在HAT選擇培養基中也能夠增殖。HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞，各自可以在含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡記為8AG)或5’ -溴脫氧尿苷的培養基中進行選擇。正常細胞由于將上述嘧啶類似物攝入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的細胞由于不攝入上述嘧啶類似物，所以可以在選擇培養基中生存。此外，被稱作G418耐性的選擇標志物通過新霉素耐性基因，提供對2-脫氧鏈霉胺類抗生素(慶大霉素類似物)的耐性。適于細胞融合的各種骨髓瘤細胞是公知的。例
P3(P3x63Ag8. 653)(J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)P3x63Ag8U. 1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)NS-I (Kohler. G.和 MiIstein，C. Eur. J. Immunol. (1976)6,511-519)MPC-Il (Margulies.D. H.等人，Cell (1976) 8，405-415)SP2/0(Shulman, M.等人，Nature (1978) 276，269-270)FO (de St. Groth, S. F.等人，J. Immunol. Methods (1980) 35，1-21)S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)R210(Galfre, G.等人，Nature (1979) 277，131-133)等基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler. G.和 Milstein, C. ,Methods Enzymo 1. (1981) 73，3-46)等，進行免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融
口 O更具體而言，例如在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養培養液中，可以實施細胞融合。融合促進劑例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。為了進一步提高融合效率，根據需要，還可以添加二甲基亞砜等輔助劑。免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，優選相對于骨髓瘤細胞， 使免疫細胞為1 10倍。用于細胞融合的培養液例如可以使用適合骨髓瘤細胞株增殖的 RPMI1640培養液、MEM培養液、以及用于該種細胞培養的常規培養液。并且，可以在培養液中添加胎牛血清(FCQ等血清補液。細胞融合可如下形成將規定量的免疫細胞和骨髓瘤細胞在培養液中充分混合， 再混合預先加熱至37°C左右的PEG溶液，從而形成目標融合細胞(雜交瘤)。在細胞融合法中，通常可以以30 60% (w/v)的濃度添加例如平均分子量為1000 6000左右的PEG。 接著，依次添加上述例舉的適當培養液，離心以除去上清，通過重復該操作，可除去不利于雜交瘤生長的細胞融合劑等。如此操作而得到的雜交瘤，可以通過使用選擇培養液而進行選擇，所述選擇培養液對應于用于細胞融合的雜交瘤所具有的選擇標志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的細胞， 可通過在HAT培養液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養液)中培養來進行選擇。 即，將HAT感受性的骨髓瘤細胞用于細胞融合時，在HAT培養液中，成功與正常細胞進行細胞融合的細胞能夠選擇性地增殖。為了使目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡，使用上述HAT培養液繼續培養足夠的時間。具體而言，通常通過培養數天至數周，可以選擇目標雜交瘤。接著，通過實施常規的極限稀釋法，可以實施產生目標抗體的雜交瘤的篩選和單一克隆。或者，還可以按照國際公開WO 03/104453中所述的方法制備識別LGR7的抗體。目標抗體的篩選和單一克隆可優選按照基于公知的抗原抗體反應的篩選方法來實施。例如，使抗原與用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等載體結合，再與雜交瘤的培養上清反應。然后清洗載體，之后與用酶標記的二次抗體等反應。當培養上清中含有與致敏抗原反應的目標抗體時，二次抗體經由該抗體與載體結合。最終，通過檢測與載體結合的二次抗體，可以確定培養上清中是否存在目標抗體。利用極限稀釋法等可以克隆能與抗原結合的產生所需抗體的雜交瘤。此時，抗原不僅可以使用用于免疫的抗原，還可以適當使用實質上為相同性質的LGR7蛋白。例如，可以使用表達LGR7的細胞株、LGR7的胞外結構域、或者包含構成該區的部分氨基酸序列的寡肽作為抗原。除通過用抗原對人以外的動物進行免疫而獲得上述雜交瘤的方法外，對人淋巴細胞進行抗原致敏，也可得到目標抗體。具體而言，首先，在體外用LGR7蛋白致敏人淋巴細胞。然后，使免疫致敏的淋巴細胞與適當的融合配偶體融合。融合配偶體可以使用例如來自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞(參照日本特公平1-59878號公報)。通過該方法得到的抗LGR7抗體是與LGR7蛋白具有結合活性的人抗體。并且，通過對具有完全人抗體基因的所有組成成分的轉基因動物給予作為抗原的 LGR7蛋白、或者用按照在該動物中表達LGR7的方式構建的DNA進行免疫，也可得到抗LGR7 人抗體。免疫動物的抗體產生細胞通過與適當的融合配偶體進行細胞融合、或者通過EB病毒感染等處理，可以使之無限增殖。可以從如此操作而得到的無限增殖細胞中分離抗LGR7 蛋白的人抗體(參照國際公開 WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602) 并且，通過克隆無限增殖的細胞，也可以克隆產生具有目標反應特異性的抗體的細胞。以轉基因動物作為免疫動物時，該動物的免疫系統將人LGR7識別為異物。因此，可以容易地得到抗人LGR7的人抗體。如此操作而制備的產生單克隆抗體的雜交瘤可在常規培養液中繼代培養。還可以在液氮中長期保存該雜交瘤。按照常規方法培養該雜交瘤，從其培養上清中可以獲得目標單克隆抗體。或者，還可以將雜交瘤給予與其具有適合性的哺乳動物以使其增殖，以其腹水的形式獲得單克隆抗體。前一種方法適合獲得高純度的抗體。本發明中，還可以利用由抗體產生細胞克隆的抗體基因所編碼的抗體。將克隆的抗體基因插入到適當的載體中，再導入宿主中，從而可以以抗體的形式表達。用于抗體基因的分離、載體的導入、以及宿主細胞的轉化的方法已經確立(例如參照Vandamme，A.M.等人·，Eur. J. Biochem. (1990) 192，767 775)。例如，可以從產生抗LGR7抗體的雜交瘤細胞中得到編碼抗LGR7抗體的可變區(V 區)的cDNA。因此，通常首先從雜交瘤中提取總RNA。作為用于從細胞中提取mRNA的方法， 例如可以采用以下方法。胍超離心法(Chirgwin,J.Μ.等人·，Biochemistry (1979) 18，5294 5299) ；AGPC 法(Chomczynski, P.等人.，Anal. Biochem. (1987) 162，156 159)。所提取的mRNA可以用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare Biosciences制備)等進行純化。或者，象QuickPr印mRNA純化試劑盒(GE Healthcare Biosciences制備)等那樣，用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒也有市售。使用這種試劑盒，也可以從雜交瘤中得到總mRNA。可以使用逆轉錄酶，由所得mRNA合成編碼抗體V區的cDNA。可以使用從與小鼠的抗體基因共通的序列中選出的任意15 30個堿基的序列作為引物。具體而言，通過使用具有SEQ ID NO 97 100所示的DNA序列的引物，得到編碼抗體V區的cDNA。cDNA可以通過AMV逆轉錄酶第一鏈 cDNA合成試劑盒(AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化學工業公司制備)等來合成。為了進行cDNA的合成和擴增，可以采用5，-Ampli FINDERRACE試劑盒(Clontech制備)和使用PCR的5，-RACE法 (Frohman,M. Α.等人.，Proc. Natl. Acid. ki. USA(1988)85，8998 9002、Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919 四32)。并且，在上述cDNA的合成過程中，可以向cDNA的兩個末端導入后述的適當的限制酶切位點。由所得的PCR產物純化目標cDNA片段，接著與載體DNA連接。如上制備重組載體， 將其導入大腸桿菌等中，選擇集落后，可以由形成該集落的大腸桿菌制備所需的重組載體。 而且，cDNA的核苷酸序列可以通過公知的方法、例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認。此外，為了得到編碼抗體可變區的基因，還可以利用cDNA文庫。首先，以從抗體產生細胞中提取的mRNA為模板合成cDNA，得到cDNA文庫。在cDNA文庫的合成中，使用市售的試劑盒是便利的。實際上，由于僅由少數細胞得到的mRNA極其微量，所以若將其直接純化則收率低。因此，通常是添加已明確不含抗體基因的載體RNA后再純化。或者，在可以提取一定量的RNA時，即使僅是抗體產生細胞的RNA，也可以高效率地提取。例如從10以上、 或30以上、優選50以上的抗體產生細胞中提取RNA時，有時不必添加載體RNA。已所得cDNA文庫為模板，利用PCR法擴增抗體基因。用于通過PCR法擴增抗體基因的引物是公知的。例如，可以根據論文(J. Mol. Biol. (1991)222,581-597)等公開的內容，設計人抗體基因擴增用的引物。這些引物在每一免疫球蛋白的亞類都形成不同的核苷酸序列。因此，以亞類不明確的cDNA文庫為模板時，考慮所有可能性后再進行PCR法。具體而言，例如為了取得編碼人IgG的基因時，可以使用可擴增編碼作為重鏈的 Yl Y 5、作為輕鏈的κ鏈和λ鏈的基因的引物。為了擴增IgG的可變區基因，通常3’ 側的引物中使用在相當于鉸鏈區的部分退火的引物。而5’側的引物中可以使用對應于各亞類的引物。將由重鏈和輕鏈的各亞類的基因擴增用引物得到的PCR產物制成各自獨立的文庫。利用如此合成的文庫，可以重構包含重鏈與輕鏈的組合的免疫球蛋白。以重構的免疫球蛋白與LGR7的結合活性為指標，可以篩選目標抗體。例如，為了獲取抗LGR7抗體時，進一步優選抗體與LGR7的結合為特異性的。與 LGR7結合的抗體例如可以如下篩選。(1)使抗體與LGR7接觸的步驟，所述抗體含有由所得的cDNA編碼的V區；(2)檢測LGR7與抗體的結合的步驟；以及(3)選擇與LGR7結合的抗體的步驟。檢測抗體與LGR7的結合的方法是公知的。具體而言，使被檢抗體與固定在載體上的LGR7反應，接下來使之與識別抗體的標記抗體反應。清洗后檢測出載體上的標記抗體時，可以證明該被檢抗體與LGR7結合。標記中可以使用過氧化物酶或半乳糖苷酶等酶活性蛋白、或FITC等熒光物質。為了評價抗體的結合活性，還可以使用表達LGR7的細胞的固定標本。作為以結合活性為指標的抗體的篩選方法，還可采用利用了噬菌體載體的淘選法。按上述方式獲取抗體基因作為重鏈和輕鏈的亞類的文庫時，利用噬菌體載體的篩選法是有利的。編碼重鏈和輕鏈的可變區的基因通過以適當的接頭序列連接，可以形成單鏈 Fv(SCFV)。將編碼scFv的基因插入噬菌體載體中時，可以得到在表面表達scFv的噬菌體。 使該噬菌體與目標抗原接觸，回收與抗原結合的噬菌體時，可以回收編碼具有目標結合活性的scFv的DNA。根據需要重復該操作，可以濃縮具有目標結合活性的scFv。本發明中，編碼抗體的多核苷酸可以編碼抗體的全長、或者可以編碼抗體的一部分。抗體的一部分是指抗體分子的任意部分。以下，作為表示抗體的一部分的用語，有時使用抗體片段。本發明中優選的抗體片段包括抗體的互補鏈決定區(complementarity determination region ；⑶R)。進一步優選本發明的抗體片段包括構成可變區的全部的3 個 CDR。獲得編碼目標抗LGR7抗體V區的cDNA后，通過識別插入到該cDNA的兩個末端的限制酶切位點的限制酶消化該cDNA。優選的限制酶識別、消化在構成抗體基因的核苷酸序列中出現的可能性低的核苷酸序列。為了進一步將單拷貝的消化片段按正確方向插入載體中，優選提供粘性末端的限制酶。通過將上述被消化的編碼抗LGR7抗體V區的cDNA插入適當的表達載體中，可以得到抗體表達載體。此時，通過使編碼抗體恒定區(C區)的基因與編碼上述V區的基因進行符合讀框的融合，可以得到嵌合抗體。此處的嵌合抗體是指恒定區和可變區的來源不同。因此，除小鼠-人等的異種嵌合抗體外，人-人同種嵌合抗體也包括在本發明的嵌合抗體中。預先將上述V區基因插入整合有編碼恒定區的DNA的表達載體中，也可構建嵌合抗體表達載體。具體而言，例如在保持有編碼所需抗體恒定區(C區)的DNA的表達載體的5’側， 可以預先配置消化V區基因的限制酶的限制酶識別序列。用相同組合的限制酶消化兩者， 使之進行符合讀框的融合，從而構建嵌合抗體表達載體。為了制備本發明中使用的抗LGR7抗體，可以將抗體基因插入到表達載體中，使之在表達控制區的控制下表達。用于表達抗體的表達控制區例如包括增強子和啟動子。接著， 使用該表達載體轉化適當的宿主細胞，由此可以獲得表達編碼抗LGR7抗體的DNA的重組細胞。表達抗體基因時，可以將編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA分別插入到另一表達載體中。將插入有H鏈和L鏈的載體同時轉化(共轉染，co-transfect)到相同的宿主細胞中，從而可以使具備H鏈和L鏈的抗體分子表達。或者，可以將編碼H鏈和L鏈的DNA插入到單一的表達載體中，來轉化宿主細胞(參照國際公開WO 94/11523)。用于將分離的抗體基因導入適當的宿主中以制備抗體的宿主與表達載體的多個組合是公知的。這些表達系統均可應用于本發明。使用真核細胞作為宿主時，可以使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，可用于本發明的動物細胞可以例示下述細胞(1)哺乳類細胞:010、0)5、骨髓瘤、8服(幼倉鼠腎)、拖13、￥61~0、昍1(293、83/^3、 HL-60、Jurkat、SK-HEP 1 等；(2)兩棲類細胞非洲爪蟾卵細胞等；以及(3)昆蟲細胞sf9、sf21、Tn5 等。或者，作為植物細胞，來自煙草(Nicotiana tabacum)等煙草屬(Nicotiana)的細胞產生的抗體基因的表達系統是公知的。在植物細胞的轉化中，可以使用進行了愈傷組織培養的細胞。并且，作為真菌細胞，可以使用下述細胞。## IISSI# (Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces) Μ、甲酉享營養型酵母(Pichia pastoris，巴斯德畢赤酵母)等畢赤酵母(Pichia)屬；絲狀菌黑曲霉(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)屬。或者，使用原核細胞的抗體基因的表達系統也是公知的。例如，使用細菌細胞時， 可以將大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌等細菌細胞用于本發明。
使用哺乳類細胞時，可以使polyA信號與常用的有效啟動子、要表達的抗體基因、 其3’側下游進行功能性結合來表達。例如，啟動子/增強子可以是人巨細胞病毒早期啟動子/增強子。此外，可以將病毒啟動子/增強子、或人延伸因子la (HEFla)等來自哺乳類細胞的啟動子/增強子等用于抗體表達。作為可以利用啟動子/增強子的病毒，具體可以例示 逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。使用SV40啟動子/增強子時，可以采用Mulligan等人的方法(Nature (1979) 277， 108)。另外，利用 Mizushima 等人的方法(Nucleic Acids Res. (1990) 18，5322)，可以容易地將HEFl α啟動子/增強子用于目標基因的表達。當為大腸桿菌時，使常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號序列和要表達的抗體基因功能性結合，可以表達該基因。啟動子例如有IacZ啟動子、araB啟動子。使用IacZ 啟動子時，可以采用 Ward 等人的方法(Nature (1989) ；341，544 546 ； FASEB J. (1992)6， 2422 2427)。或者，利用 Better 等人的方法(Science (1988) 240,1041 1043)，可以將 araB啟動子用于目標基因的表達。用于抗體分泌的信號序列在大腸桿菌的周質中產生時，可以使用pel B信號序列 (Lei, S. P.等人，J.Bacteriol. (1987) 169,4379)。接著，分離在周質中產生的抗體，之后通過使用尿素的胍鹽酸鹽這樣的蛋白改性劑，可重折疊抗體的結構，使其具有所需的結合活性。使用動物細胞來產生抗體時，作為用于向細胞外分泌所必需的信號序列，優選使用抗體的重鏈基因或輕鏈基因的信號序列。此外，還可以使用IL-3或IL-6等的分泌蛋白所具有的信號序列。插入到表達載體中的復制起點可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起點。并且，為了在宿主細胞體系中擴增基因拷貝數，可以向表達載體中插入選擇標志物。具體可以使用下述選擇標志物氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因；胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因；大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因；二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。將這些表達載體導入宿主細胞中，接下來，將轉化的宿主細胞在體外或體內進行培養，產生目標抗體。宿主細胞的培養可以按照公知的方法進行。例如，培養液可以使用 DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，還可以結合使用胎牛血清(FCS)等血清補液。如上表達并產生的抗體，可以通過將常規蛋白純化中使用的公知方法單獨使用或適當組合來進行純化。例如，可以通過適當選擇并組合蛋白A柱等親和柱、色譜柱、濾器、超 ii>iki/r>IiT^, Jfe^v 1 >(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。另外，在重組型抗體的產生中，除了使用上述宿主細胞外，還可以使用轉基因動物。即，將編碼目標抗體的基因導入動物體內，可以由該動物得到該抗體。例如，通過將抗體基因符合讀框地插入到編碼乳汁中特性產生的蛋白的基因內部，可以構建融合基因。作為乳汁中所分泌的蛋白，例如可以使用山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基
1因的DNA片段注入到山羊胚胎中，再將該注入胚胎導入雌山羊體內。接受了胚胎的山羊生出轉基因山羊，從該轉基因山羊(或其后代)產生的乳汁中，可以以與乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式獲得所需抗體。另外，為了增加由轉基因山羊產生的含有所需抗體的乳汁量，可以將激素適當用于轉基因山羊(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology (1994) 12，699 702)。本發明的重組抗體的C區可以使用來自人以外的動物的抗體的C區。例如，小鼠抗體的 H鏈 C 區可以使用 Cy 1、C γ 2a、C γ 2b、Cy 3、Cμ、CS、Cal、Ca2、Ce，L 鏈 C 區可以使用Ck Χλ。另外，除小鼠以外的動物的抗體可以使用大鼠、兔、山羊、綿羊、駱駝、猴等的抗體。它們的序列是公知的。為了改善抗體或其產生的穩定性，可以對C區進行修飾。本發明中，將抗體給予人時，為了降低對人的異種抗原性等，可以制成人工修飾的基因重組型抗體。基因重組型抗體例如包括嵌合抗體、人源化抗體等。這些修飾抗體可以采用公知的方法進行制備。嵌合抗體是指將來源互不相同的可變區和恒定區連接而成的抗體。例如，包含小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區的抗體是小鼠-人-異種嵌合抗體。將編碼小鼠抗體可變區的DNA與編碼人抗體恒定區的DNA連接，將其插入到表達載體中，從而可以制備表達嵌合抗體的重組載體。培養通過該載體轉化的重組細胞，使插入的 DNA表達，從而可以獲得培養中所產生的該嵌合抗體。在嵌合抗體和人源化抗體的C區使用人抗體的C區。例如，在H 鏈中，可以使用 Cy 1、Cy2、Cy3、Cy4、Cp、CS、Ca l、Ca 2和 C ε 作
為C區。在L鏈中，可以使用Ck和CX作為C區。上述C區的氨基酸序列以及編碼該氨基酸序列的核苷酸序列是公知的。為了改善抗體本身或抗體產生的穩定性，可以對人抗體 C區進行修飾。通常，嵌合抗體由來自人以外的動物的抗體的V區和來自人抗體的C區構成。相對于此，人源化抗體由來自人以外的動物的抗體的互補性決定區(CDR)和來自人抗體的構架區(FR)、以及來自人抗體的C區構成。由于人源化抗體在人體內的抗原性降低，因此可用作本發明的治療藥的有效成分。抗體可變區通常由夾在4個構架區(FR)中的3個互補性決定區(OTR)構成。⑶R 實質上是決定抗體的結合特異性的區。CDR的氨基酸序列富有多樣性。一方面，構成FR的氨基酸序列即使在具有不同結合特異性的抗體間往往也顯示出高度同源性。因此，通常通過移植CDR，可以將某抗體的結合特異性移植到其它抗體中。人源化抗體也稱作重構(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于得到人源化抗體的常規基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，例如重疊序列延伸PCR(0verlap Extension PCR)是公知的。在重疊序列延伸PCR中，將該移植的編碼小鼠抗體CDR的核苷酸序列附加在用于合成人抗體FR的引物上。分別準備4個FR的引物。通常，向人FR中移植小鼠CDR時，選擇與小鼠的FR同源性高的人FR，這對維持CDR的功能有利。即，通常優選利用包含與該移植的小鼠CDR相鄰的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的人FR。另外，被連接的核苷酸序列設計成彼此符合讀框地進行連接。利用各自的引物分別合成人FR。其結果，得到在各FR中附加有編碼小鼠CDR的DNA的產物。各產物的編碼小鼠CDR的核苷酸序列設計成相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產物的重疊 ⑶R部分相互退火，進行互補鏈合成反應。通過該反應，人FR經由小鼠⑶R序列進行連接。最終，連接有3個⑶R和4個FR的全長V區基因使用下述引物進行擴增，所述引物為對其5’末端和3’末端退火且附加有適當的限制酶識別序列。將如上得到的DNA與編碼人抗體C區的DNA插入表達載體中，使符合讀框地融合，從而可以制備人型抗體表達用載體。將該載體導入宿主中，建立重組細胞，之后培養重組細胞，使編碼人源化抗體的DNA表達，從而在培養細胞的培養物中產生人源化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開 WO 96/02576)。通過定性或定量測定并評價如上制備的人源化抗體與抗原的結合活性，可以適當選擇經由⑶R連接時該⑶R形成良好的抗原結合位點的人抗體的FR。根據需要，還可以置換FR的氨基酸殘基，使重構人抗體的⑶R形成適當的抗原結合位點。例如，應用用于向人 FR中移植小鼠CDR的PCR法，可以向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，可以向對FR 退火的引物中導入一部分核苷酸序列的突變。利用這樣的引物合成的FR中，導入了核苷酸序列的突變。通過用上述方法測定并評價取代了氨基酸的突變型抗體與抗原的結合活性， 可以選擇具有所需性質的突變FR序列(Sato, K.等人，Cancer Res，1993，53，851 856)。另外，人抗體的獲得方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原或表達所需抗原的細胞致敏人淋巴細胞。接著，使致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞融合，從而可以獲得與抗原具有結合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878)。在作為融合配偶體的人骨髓瘤細胞中，例如可以使用U266等。通過用所需抗原對具有完全人抗體基因的所有組成成分的轉基因動物進行免疫，可以獲得所需的人抗體(參照國際公開WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585,WO 96/34096,WO 96/33735)。并且，還已知使用人抗體文庫，通過淘選獲得人抗體的技術。例如，利用噬菌體展示法，使人抗體的V區作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面表達，可以選擇與抗原結合的噬菌體。通過分析所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結合的人抗體V區的DNA序列。確定了與抗原結合的scFv的DNA序列后，使該V區序列與所需人抗體C區序列進行符合讀框的融合，之后插入適當的表達載體中，從而可以制備表達載體。將該表達載體導入上述例舉的優選的表達細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，從而可以獲得該人抗體。這些方法已經公知(國際公開WO 92/01047.W0 92/2079UW0 93/06213, WO 93/11236,WO 93/19172, WO 95/01438,WO 95/15388)。因此，作為本發明中使用的抗體的優選方式之一，可以列舉具有人恒定區的抗體。本發明的抗體，只要與LGR7蛋白結合即可，不僅包括IgG所代表的二價抗體，還包括一價抗體或IgM所代表的多價抗體。本發明的多價抗體包括具有完全相同的抗原結合位點的多價抗體、或具有一部分或完全不同的抗原結合位點的多價抗體。本發明的抗體并不限于抗體的全長分子，只要與LGR7蛋白結合即可，可以是低分子抗體或其修飾物。低分子抗體包括全長抗體(whole antibody，例如全長IgG等)的一部分缺失的抗體片段。只要與LGR7抗原具有結合能力即可，允許抗體分子的部分缺失。本發明中的抗體片段優選含有重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)。此外，本發明中的抗體片段優選含有⑶R。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加和/或插入。并且，只要與LGR7抗原具有結合能力即可，可以缺失VH和/或VL的一部分。另外，可變區可以進行嵌合化或人源化。抗體片段的具體例子例如有Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。低分子抗體的具體例子例如有Fab、Fab，、F(ab，) 2、Fv、scFv (單鏈 Fv)、雙抗體、sc (Fv) 2 (單鏈(Fv) 2)、scFv-Fc 等。這些抗體的多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、多聚體)也包含在本發明的低分子抗體中。抗體片段可以通過用酶處理抗體生成抗體片段而得到。作為生成抗體片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纖溶酶等是公知的。或者，構建編碼這些抗體片段的基因，將其導入表達載體中，之后可以在適當的宿主細胞中表達(例如參照 Co，M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976、Better，M.和 Horwitz， Α. H. Methods in Enzymology (1989) 178，476—496、Plueckthun，Α·禾口 Skerra，A. Methods inEnzymology(1989) 178,476-496> Lamoyi, Ε. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663> Rousseaux, J. 入，Methods in Enzymology (1989) 121,663-669> Bird, R. E.等人，TIBTECH(1991)9,132-137)。消化酶切斷抗體片段的特定位置，給予下述特定結構的抗體片段。對上述酶解得到的抗體片段應用基因工程方法時，可以使抗體的任意部分缺失。木瓜蛋白酶消化F(ab) 2或Fab胃蛋白酶消化F (ab，)2或Fab，纖溶酶消化Facb因此，本發明中的低分子抗體只要與LGR7具有結合親和性即可，可以是缺失了任意區的抗體片段。并且，特別是在本發明的癌癥等細胞增殖性疾病的治療中，優選抗體維持其效應子活性。即，本發明中優選的低分子抗體具有與LGR7的結合親和性和效應子功能兩者。抗體的效應子功能包括ADCC活性和CDC活性。本發明中的治療用抗體，特別優選具有 ADCC活性和/或⑶C活性作為效應子功能。雙抗體(Diabody)是指通過基因融合構建的二價抗體片段(HolligerP等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444 6448 (1993) ；EP 404，097 號；WO 93/11161 號等)。雙抗體是由兩條多肽鏈構成的二聚體。通常，構成二聚物的多肽鏈，各自在同一條鏈中VL和 VH通過接頭進行結合。雙抗體中的接頭通常短至VL和VH無法相互結合。具體而言，構成接頭的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，編碼在同一條多肽鏈上的VL和VH無法形成單鏈可變區片段，而是與另一單鏈可變區片段形成二聚體。其結果，雙抗體具有兩個抗原結合位點。scFv可通過連接抗體的H鏈V區和L鏈V區而得到。在scFv中，H鏈V區和L鏈V 區經由接頭、優選肽接頭進行連接(Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acid. Sci. U. S. Α. 1988， 85，5879 5883.)。scFv中的H鏈V區和L鏈V區可以是來自本說明書中記載的任何抗體。對連接V區的肽接頭沒有特別限定。例如可以使用包含3 25個殘基左右的任意單鏈肽作為接頭。具體而言，例如可以使用后述的肽接頭等。兩鏈的V區例如可以按照上述PCR法進行連接。為了利用PCR法連接V區，首先， 在下述DNA中，使用編碼全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作為模板。編碼抗體H鏈或H鏈V區的DNA序列；以及編碼抗體L鏈或L鏈V區的DNA序列。
編碼H鏈和L鏈的V區的DNA分別利用PCR法進行擴增，所述PCR法使用具有與應擴增的DNA兩端的序列對應的序列的一對引物。接著，準備編碼肽接頭部分的DNA。編碼肽接頭的DNA也可利用PCR來合成。在此時使用的引物的5’側附加可與另外合成的各 V區的擴增產物連接的核苷酸序列。接著，利用[H鏈V區DNA]-[肽接頭DNA]-[L鏈V區 DNA]的各DNA和裝配PCR用的引物進行PCR反應。裝配PCR用的引物包含在[H鏈V區DNA]的5，側退火的引物和在[L鏈V區DNA] 的3’側退火的引物的組合。即，裝配PCR用引物是指可以擴增編碼應合成的scFv的全長序列的DNA的引物組。另一方面，[肽接頭DNA]中附加有可與各V區DNA連接的核苷酸序列。其結果，連接上述DNA，再利用裝配PCR用引物，最終以擴增產物的形式生成scFv的全長。暫且制作編碼scFv的DNA，按照常規方法可以獲取含有上述DNA的表達載體和通過該表達載體轉化的重組細胞。其結果，培養所得的重組細胞，使編碼該scFv的DNA表達，從而可獲得該scFv。scFv-Fc是使Fc區與包含抗體的H鏈V區和L鏈V區的scFv融合得到的低分子抗體(Cellular & Molecular Immunology 2006 ；3 :439-443)。對 scFv-Fc 中使用的 scFv 的來源沒有特別限定，例如可以使用來自IgM的scFv。此外，對Fc的來源也沒有特別限定， 例如可以使用小鼠IgG(小鼠IgG2a等)、人IgG(人IgGl等)。因此，作為scFv-Fc的優選方式的例子，可以列舉=IgM抗體的scFv片段和小鼠IgGh的CH2 (例如C γ 2)和CH3 (例如C γ 3)通過小鼠IgGh的鉸鏈區(H y )連接而成的scFv-Fc、或IgM抗體的scFv片段和人IgGl的CH2和CH3通過人IgGl的鉸鏈區連接而成的scFv-Fc。sc (Fv) 2是兩個VH和兩個VL通過接頭等連接形成單鏈的低分子抗體(Hudson等人，J Lmmunol. Methods 1999 ;231 177 189)。sc (Fv) 2 例如可以通過用接頭連接 scFv 來制備。優選具有以下特征的抗體，所述特征為2個VH和2個VL以單鏈多肽的N末端側為基點，按照VH、VL、VH、VL ([VH]-接頭-[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VL])的順序排列。2個VH和2個VL的順序并不特別限于上述排列，可以按照任何順序進行排列。例如包括以下排列[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL]
[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH]
[VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL]
[VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VH]
[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VH]連接抗體可變區的接頭可以使用能夠通過基因工程導入的任意肽接頭、或化學合成接頭(synthetic linker)(例如參照Protein Engineering，9 (3)，四9 305，1996)中公開的接頭等。本發明中優選肽接頭。對肽接頭的長度沒有特別限定，本領域技術人員可以根據目的適當選擇。通常，構成肽接頭的氨基酸殘基為1 100個氨基酸，優選3 50個氨基酸，進一步優選5 30個氨基酸，特別優選為12 18個氨基酸(例如15個氨基酸)。構成肽接頭的氨基酸序列，只要不阻礙scFv的結合作用即可，可以形成任意序列。例如，當為肽接頭時，可以使用下述氨基酸序列。Ser
GlySer
GlyGly ·Ser
SerGly ·Gly
GlyGly ·Gly ·Ser (SEQ ID NO :101)
SerGly ·Gly ·Gly (SEQ ID NO :102)
GlyGly ·Gly ·Gly · Ser(SEQ ID NO :103)
SerGly ·Gly ·Gly · Gly(SEQ ID NO :104)
GlyGly ·Gly ·Gly · Gly · Ser(SEQ ID NO :105)
SerGly ·Gly ·Gly · Gly · Gly(SEQ ID NO :106)
GlyGly ·Gly ·Gly · Gly · Gly · Ser(SEQ ID NO:107)
SerGly ·Gly ·Gly · Gly · Gly · Gly(SEQ ID NO:108)
(Gly Gly Gly Gly · Ser(SEQ ID NO :101))η(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :102)) η[η為1以上的整數]關于肽接頭的氨基酸序列，本領域技術人員可以根據目的適當選擇。例如，決定上述肽接頭長度的η通常為1 5，優選1 3，更優選為1或2。因此，本發明中特別優選的sc(Fv)2的方式例如有以下sc(Fv)2。[VH]-肽接頭(15個氨基酸)-[VL]-肽接頭(15個氨基酸)-[VH]-肽接頭(15個氨基酸)_[VL]或者，還可以利用化學合成接頭(化學交聯劑)來連接V區。本發明中可以使用通常用于交聯肽化合物等的交聯劑。例如下述化學交聯劑是公知的。這些交聯劑均有銷售。N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；二琥珀酰亞氨基辛二酸酯(DSS)；雙(磺基琥珀酰亞氨基)辛二酸酯(BS3)；二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)(DSP)；二硫代雙(磺基琥珀酰亞氨基丙酸酯)(DTSSP)；雙(琥珀酰亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)；雙(磺基琥珀酰亞氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)；二琥珀酰亞氨基酒石酸鹽(DST)；二磺基琥珀酰亞氨基酒石酸鹽(磺基-DST)；雙[2-(琥珀酰亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BS0C0EQ ；以及雙[2-(磺基琥珀酰亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BS0C0EQ等。連接4個抗體可變區時，通常需要3個接頭。多個接頭可以使用相同的接頭，也可以使用不同的接頭。本發明中，優選的低分子抗體為雙抗體或sc(Fv)2。為了獲得這樣的低分子抗體，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等處理抗體，生成抗體片段；或者構建編碼這些抗體片段的DNA，將其導入表達載體中，之后在適當的宿主細胞中表達即可(例如參照 Co，M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ；Better, Μ.和 Horwitz，Α. H.，Methods Enzymo1. (1989) 178,476-496 ；Pluckthun,Α.禾口 Skerra，A.，Methods Enzymo1. (1989) 178， 497-515 ；Lamoyi,E. ,Methods Enzymo 1. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J.等人，MethodsEnzymol. (1986) 121,663-669 ；Bird, R. Ε.和 Walker，B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9， 132-137)。本發明的抗體不僅包括一價抗體，還包括多價抗體。本發明的多價抗體包括具有完全相同的抗原結合位點的多價抗體、或者具有一部分或完全不同的抗原結合位點的多價抗體。作為抗體修飾物，還可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。而且， 抗體上還可以結合化療藥物、毒性肽或放射性化學物質等細胞毒性物質。上述抗體修飾物 (以下稱為抗體綴合物)可以通過對所得抗體施行化學修飾而獲得。尚需說明的是，抗體的修飾方法在該領域中已經確立。如后所述，還可以以雙特異性抗體(bispecif ic antibody) 等分子型的形式獲取，所述雙特異性抗體通過基因重組技術設計成不僅識別LGR7蛋白、還識別化療藥物、毒性肽、放射性化學物質等細胞毒性物質的形式。本發明中的“抗體”也包括這些抗體。與抗LGR7抗體結合、發揮細胞毒活性作用的化療藥物可以例示如下述化療藥物 阿扎立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、博來霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1、白消安、 喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬、伊立替康、卡鉬、克拉屈濱、 環磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、道諾霉素葡萄糖醛酸苷、柔紅霉素、 地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟達拉濱、氟他胺、氟尿嘧唆、氟甲睪酮、吉西他濱、 己酸羥孕酮、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏拉莫司汀、長春堿、長春瑞濱、長春新堿。本發明中，優選的化療藥物為低分子化療藥物。低分子化療藥物與抗體結合后，其干涉抗體功能的可能性也小。本發明中，低分子化療藥物通常具有100 2000、優選200 1000的分子量。此處例示的化療藥物均為低分子化療藥物。本發明中的這些化療藥物包括在機體內轉化成活性化療藥物的前體藥物。前體藥物的活化可以是酶轉化，也可以是非酶轉化。另外，還可以用毒性肽修飾抗體。毒性肽的例子有下述物質白喉毒素A鏈 (Langone J. J.,等人，Methods in Enzymology, 93，307—308，1983)、綠月農桿菌夕卜毒素 (Nature Medicine, 2，350-353,1996)、蓖麻毒蛋白 A 鏈(Fulton R. J.，等人，J. Biol. Chem.，261，5314-5319，1986 ；Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987 ；Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods, 135,15-24,1990 ；Wawrzynczak Ε. J.,等人，Cancer Res., 50,7519-7562,1990 ；Gheeite V.，等人，J. Immunol. Methods，142，223-230，1991)、無糖鏈蓖麻毒蛋白 A 鏈(Thorpe P. Ε.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思子毒素 A 鏈(ffawrzynczak Ε. J.，等人，Br. J. Cancer, 66, 361-366,1992 ；Wawrzynczak Ε. J.，等人， Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169—3173，1987 ； Thorpe P. Ε.，等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、多花白樹毒蛋白(Sivam G.，等人， Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods，135，15-24，1990 ；Wawrzynczak E. J.，等人，Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Bolognesi Α.，等人， Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAPs) (Bolognesi A.，等人，Clin. exp. Immunol. , 89, 341-346,1992)、Briodin (Bolognesi Α.,等 Α Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)、皂草毒蛋白(Bolognesi A·，等人，Clin. exp. Immunol. ,89, 341-346，1992)、苦瓜毒蛋白(momordin) (Cumber A. J.，等人，J. Immunol. Methods, 135, 15-24,1990 ；Wawrzynczak Ε. J.,等人，Cancer Res.，50，7519—7562，1990 ；Bolognesi Α.， 等人，Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)、木鱉毒蛋白(Bolognesi Α.，等人，Clin, exp. Immunol. , 89, 341-346,1992)、石竹素 32 (Bolognesi A.,等人，Clin. exp. Immunol., 89,341-346，1992)、石竹素 30 (Stirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195,1-8,1986)、 塑蓮根毒蛋白 IIGtirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、槲寄生毒蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8,1986)、塑蓮根毒蛋白 I (Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、商陸毒蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.， FEBS letter 195，1-8，1986)、小麥毒蛋白(Stirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195， 1-8，1986)、軟瓜蛋白(Stirpe F. , Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、栝樓素 (Casellas P.,等人，Eur. J. Biochem. 176,581-588,1988 ；Bolognesi A.,等人，Clin, exp. Immunol.，89，341-346，1992)。在本發明中，放射性化學物質是指含有放射性同位素的化學物質。對放射性同位素沒有特別限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用32P、14C、125I、3H、131I、18f5Re、-Re寸。在另一方式中，將一種或兩種以上的低分子化療藥物與毒性肽分別組合，可以用于修飾抗體。抗LGR7抗體與上述低分子化療藥物的結合可以使用共價鍵或非共價鍵。結合有這些化療藥物的抗體的制作方法是公知的。并且，蛋白性藥物或毒素可以通過基因工程方法與抗體結合。具體而言，例如使編碼上述毒性肽的DNA與編碼抗LGR7抗體的DNA進行符合讀框的融合并插入到表達載體中， 可以構建重組載體。將該載體導入適當的宿主細胞中，之后培養所得的轉化細胞，使重組的 DNA表達，可以以融合蛋白的形式得到結合有毒性肽的抗LGR7抗體。得到與抗體的融合蛋白時，通常將蛋白性藥物或毒素配置在抗體的C末端側。還可以使肽接頭介于抗體與蛋白性藥物或毒素之間。并且，本發明的抗體可以是雙特異性抗體(bispecific antibody)。雙特異性抗體是指，在同一抗體分子內具有識別不同表位的可變區的抗體。本發明中，雙特異性抗體可以具有識別LGR7分子上的不同表位的抗原結合位點。這樣的雙特異性抗體相對于1分子的 LGR7可以結合2分子的抗體分子。其結果，有望獲得更強效的細胞毒作用。或者，還可以形成其中一個抗原結合位點識別LGR7、另一個抗原結合位點識別細胞毒性物質的雙特異性抗體。細胞毒性物質具體包括化療藥物、毒性肽或放射性化學物質等。這樣的雙特異性抗體與表達LGR7的細胞結合，同時捕獲細胞毒性物質。其結果，可以使細胞毒性物質直接作用于表達LGR7的細胞。即，利用識別細胞毒性物質的雙特異性抗體， 可以特異性殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的增殖。在本發明中，還可以組合識別LGR7以外的抗原的雙特異性抗體。例如，可以組合識別非LGR7抗原的雙特異性抗體，所述非LGR7抗原與LGR7 —樣在作為靶的癌細胞的細胞
用于制備雙特異性抗體的方法是公知的。例如，使識別不同抗原的兩種抗體結合， 可以制作雙特異性抗體。進行結合的抗體可以是各自具有H鏈和L鏈的1/2分子，也可以是僅包含H鏈的1/4分子。或者，使產生不同的單克隆抗體的雜交瘤融合，也可以制備產生雙特異性抗體的融合細胞。并且，利用基因工程方法可以制備雙特異性抗體。(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)時，可以采用公知的方法。例如可以使用 ELISA (酶聯免疫吸附測定法)、EIA (酶免疫測定法)、RIA (放射免疫測定法)或熒光免疫法等。本發明的抗體可以是糖鏈被修飾的抗體。已知通過修飾抗體的糖鏈，可以增強抗體的細胞毒活性。作為糖鏈被修飾的抗體，例如以下抗體是公知的。進行糖基化修飾的抗體(W0 99/54342等)；附加在糖鏈上的巖藻糖缺失的抗體(W0 00/61739,WO 02/31140,WO 2006/067913
等)；具有帶等分GIcNAC的糖鏈的抗體(W0 02/79255等)等。為了治療目的而使用本發明的抗體時，抗體優選為具有細胞毒活性的抗體。本發明中的細胞毒活性例如有抗體依賴性細胞介導的細胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity :ADCC)活性、補體依賴性細胞毒 (complement-dependent cytotoxicity :CDC)活性等。本發明中，CDC活性是指由補體系統產生的細胞毒活性。而ADCC活性是指，特異性抗體附著于靶細胞的細胞表面抗原上時，保有Fc γ受體的細胞(免疫細胞等)經由Fc γ受體與其Fc部位結合，給靶細胞帶來傷害的活性。抗LGR7抗體是否具有ADCC活性、或者是否具有⑶C活性，這可以利用公知的方法來測定(例如 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan 等人，John Wiley & Sons, Inc. , (1993)等)。具體而言，首先，實施效應細胞、補體溶液、靶細胞的制備。(1)效應細胞的制備從CBA/N小鼠等中摘出脾臟，在RPMI1640培養基Gnvitrogen公司制備)中分離脾細胞。用含有10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制備)的相同培養基清洗，之后將細胞濃度調整至5 X IO6個細胞/mL，即可制備效應細胞。(2)補體溶液的制備將幼兔補體(BabyRabbit Complement) (CEDARLANE 公司制備)用含有 10% FBS 的培養基(Irwitrogen公司制備)稀釋10倍，可以制備補體溶液。(3)靶細胞的制備將表達LGR7 蛋白的細胞與 0. 2mCi 的 51Cr-鉻酸鈉(GE Healthcare Biosciences 公司制備)一起在含有10% FBS的DMEM培養基中、在37°C下培養1小時，從而可以放射性標記該靶細胞。表達LGR7蛋白的細胞可以使用以編碼LGR7蛋白的基因轉化的細胞、卵巢癌等。放射性標記后，將細胞用含有10% FBS的RPMI1640培養基清洗3次，將細胞濃度調整至2 X IO5個細胞/mL，從而可以制備該靶細胞。
ADCC活性或⑶C活性可以利用下述方法測定。測定ADCC活性時，在96孔U底板 (Becton Dickinson公司制造)中分別加入50 μ L靶細胞和抗LGR7抗體，在冰上反應15分鐘。之后，加入IOOyL效應細胞，在二氧化碳培養箱內培養4小時。抗體的終濃度為0或 10 μ g/mL。培養后，回收100 μ L上清，用Y射線計數儀(COBRAII AUT0-GAMMA，型號D5005， Packard Instrument Company公司制造)測定放射活性。細胞毒活性(％)可以使用所得值、根據算式(A-C)/(B-C)X100來計算。A表示各試樣的放射活性(cpm)，B表示加入了 1 % NP-40 (nacalai tesque公司制備)的試樣的放射活性(cpm)，C表示只含靶細胞的試樣的放射活性(cpm)。另一方面，測定⑶C活性時，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分別加入50 μ L靶細胞和抗LGR7抗體，在冰上反應15分鐘。之后，加入100 μ L補體溶液，在二氧化碳培養箱內培養4小時。抗體的終濃度為0或3μ g/mL。培養后，回收100 μ L上清， 用Y射線計數儀測定放射活性。細胞毒活性可以和ADCC活性的測定同樣計算。而當測定抗體綴合物的細胞毒活性時，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分別加入50 μ L靶細胞和抗LGR7抗體綴合物，在冰上反應15分鐘。在二氧化碳培養箱內培養1 4小時。使抗體的終濃度達到0或3μ g/mL。培養后，回收100 μ L上清，用 Y射線計數儀測定放射活性。細胞毒活性可以和ADCC活性的測定同樣計算。作為本發明中使用的抗體的另一方式，可以列舉具有內化活性的抗體。在本發明中，“具有內化活性的抗體”是指，與細胞表面上的LGR7結合時被輸送到細胞內(細胞質內、小泡內、其他小器官內等)的抗體。抗體是否具有內化活性，這可以利用本領域技術人員所公知的方法來確認，例如可以采用下述方法進行確認使結合有標記物質的抗LGR7抗體與表達LGR7的細胞接觸，之后確認該標記物質是否被攝入到細胞內的方法；使結合有細胞毒性物質的抗LGR7抗體與表達LGR7的細胞接觸，之后確認是否誘導了該LGR7表達細胞的細胞死亡的方法等。更具體而言，利用下述實施例記載的方法等，可以確認抗體是否具有內化活性。具有內化活性的抗體，例如可以通過結合上述細胞毒性物質，以抗癌藥等藥物組合物的形式使用。本發明的抗體可以使用識別LGR7的任意抗體。例如，優選的抗體可以例示以下 (1) 09)所述的抗體。這些抗體例如可以是全長抗體、低分子抗體、動物抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。(1)抗體(22DA6重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 5記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 6記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列；(2)抗體(22DA6輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 10記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 11記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID Ν0:12記載的氨基酸序列；(3)抗體(22DA6)，該抗體含有(1)所述的H鏈和(2)所述的L鏈； (4)抗體(22DA7重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 15記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 16記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID N0:17記載的氨基酸序列；
(5)抗體(22DA7輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 20記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :21記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 22記載的氨基酸序列；(6)抗體(22DA7)，該抗體含有⑷所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(7)抗體(22DA17重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 25記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO ,21記載的氨基酸序列；(8)抗體(22DA17輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 30記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :31記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 32記載的氨基酸序列；(9)抗體(22DA17)，該抗體含有(7)所述的H鏈和⑶所述的L鏈；(10)抗體(22DA22重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 35記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 37記載的氨基酸序列；(11)抗體(22DA22輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 40記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 41記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 42記載的氨基酸序列；(12)抗體(22DA22)，該抗體含有(10)所述的H鏈和(11)所述的L鏈；(13)抗體(22DA23重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 45記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 47記載的氨基酸序列；(14)抗體(22DA23輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 50記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 52記載的氨基酸序列；(15)抗體(22DA23)，該抗體含有(13)所述的H鏈和(14)所述的L鏈
(16)抗體(22DAM重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 55記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 56記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 57記載的氨基酸序列；(17)抗體(22DAM輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 60記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 61記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 62記載的氨基酸序列；(18)抗體(22DA24)，該抗體含有(16)所述的H鏈和(17)所述的L鏈；(19)抗體Q2SD7重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 65記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 66記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 67記載的氨基酸序列；(20)抗體Q2SD7輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 70記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :71記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 72記載的氨基酸序列；(21)抗體(22SD7)，該抗體含有(19)所述的H鏈和(20)所述的L鏈；
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(22)抗體Q2SD11重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 75記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 76記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 77記載的氨基酸序列；(23)抗體Q2SD11輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 80記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 81記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 82記載的氨基酸序列；(24)抗體(22SD11)，該抗體含有(22)所述的H鏈和(23)所述的L鏈；(25)抗體(22SD48重鏈)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 85記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 86記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 87記載的氨基酸序列；(26)抗體(22SD48輕鏈)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQ ID NO 90記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 91記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3 的SEQ ID NO 92記載的氨基酸序列；(27)抗體(22SD48)，該抗體含有(25)所述的H鏈和(26)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體與(1) (XT)中任一項所述的抗體具有同等活性；(29)抗體，該抗體識別與⑴ (XT)中任一項所述的抗體所識別的表位相同的表位。本發明中，與本發明的抗體具有同等活性是指，與LGR7的結合活性和/或對表達 LGR7的細胞的細胞毒活性同等。向多肽中導入突變的方法，是用于制備與某種多肽功能等效的多肽的、本領域技術人員所熟知的方法之一。例如，本領域技術人員可采用位點特異性誘變法 (Hashimoto-Gotoh, Τ.等人.(1995)Gene 152,271-275、Zoller, MJ,和 Smith, Μ. (1983) Methods Enzymol. 100,468-500> Kramer, W.等 K ■ (1984)Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W,和 Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154，350-367、Kunkel， TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)等，向本發明的抗體中導入適當的突變，從而可以制備與該抗體功能等效的抗體。另外，氨基酸的突變在自然界中也可發生。如上所述，在本發明抗體的氨基酸序列中， 具有1個或多個氨基酸發生突變的氨基酸序列、且與該抗體功能等效的抗體也包含在本發明的抗體中。上述突變體中，突變的氨基酸數目通常為50個氨基酸以內，優選為30個氨基酸以內，進一步優選為10個氨基酸以內(例如5個氨基酸以內)。在突變的氨基酸殘基中，優選突變成保存有氨基酸側鏈的性質的其它氨基酸。例如，根據氨基酸側鏈的性質，確立以下分類疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羥基側鏈的氨基酸(S、T、Y)；具有含硫原子側鏈的氨基酸(C、M)；具有含羧酸和酰胺側鏈的氨基酸(D、N、E、Q)；
具有含堿性基團側鏈的氨基酸(R、K、H)；具有含芳族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號內均表示氨基酸的單字母符號)。已知具有對某一氨基酸序列通過1個或多個氨基酸殘基的缺失、添加和/或用其它氨基酸的取代進行修飾的氨基酸序列的多肽維持其生物學活性(Mark，D.F.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M.J.和 Smith, Μ.，Nucleic Acids Research(1982) 10,6487-6500, Wang, A.等入，Science 224,1431-1433, Dalbadie-McFarland, G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79,6409-6413) 即，通常構成某多肽的氨基酸序列中，被分成各組的氨基酸在相互取代時，該多肽的活性得以保持的可能性高。本發明中，將上述氨基酸組的組內氨基酸間的取代稱作保守取代。本發明還提供與表位結合的抗體，所述表位與本發明所公開的抗LGR7抗體所結合的表位相同。即，本發明涉及識別與22DA6、22DA7、22DA17、22DA22、22DA23、22DA24、 22SD7、22SD11、22SD48所識別的表位相同的表位的抗體及其用途。上述抗體例如可以通過以下方法獲得。被檢抗體與某抗體共有表位，這可通過兩者對同一表位的競爭來確認。抗體間的競爭通過交叉阻斷測定(cross-blocking assay)等進行檢測。例如，競爭ELISA測定是優選的交叉阻斷測定。具體而言，在交叉阻斷測定中，在候選的競爭抗體的存在或非存在下，預培養包被在微量板的孔上的LGR7蛋白，之后添加本發明的抗LGR7抗體。與孔中的LGR7蛋白結合的本發明的抗LGR7抗體的量與對相同表位競爭性結合的候選競爭抗體(被檢抗體)的結合能力間接相關。即，被檢抗體與相同表位的親和性越大，則本發明的抗LGR7抗體與包被 LGR7蛋白的孔的結合量越降低，而被檢抗體與包被LGR7蛋白的孔的結合量越增加。關于與孔結合的抗體量，通過預先標記抗體，可以容易地測定。例如，生物素標記的抗體可通過使用抗生物素蛋白過氧化物酶綴合物和適當的底物來測定。將利用了過氧化物酶等酶標記的交叉阻斷測定特別地稱作競爭ELISA測定。抗體可以用可檢測或可測定的其它標記物標記。具體而言，放射標記或熒光標記等是公知的。或者，競爭FACS測定也是優選的交叉阻斷測定。具體而言，在競爭ELISA測定中，使用表達LGR7蛋白的細胞來代替包被在微量滴定板的孔上的LGR7蛋白。在候選的競爭抗體的存在下或非存在下預培養后，添加用生物素標記的本發明的抗LGR7抗體，再使用鏈霉親和素/熒光素綴合物，從而可以測定抗體間的競爭。將利用了流式細胞術的交叉阻斷測定特別稱作競爭FACS測定。抗體可以用可檢測或可測定的其他熒光標記物質標記。并且，當被檢抗體具有來自與本發明的抗LGR7抗體不同種的恒定區時，還可以通過識別任一恒定區的標記抗體來測定與孔結合的任一種抗體。或者，即使是來自同種的抗體，當類別(class)不同時，可以利用識別各類別的抗體測定與孔結合的抗體。與在候選競爭抗體非存在下實施的對照試驗中得到的結合活性相比，候選抗體可以阻斷至少20%、優選至少30%、進一步優選至少50%的抗LGR7抗體的結合時，該候選競爭抗體是與本發明的抗LGR7抗體實質上結合在同一表位上、或者是競爭結合在同一表位上的抗體。需要說明的是，在測定表位時，可以將本發明的抗體的恒定區置換成與被檢抗體相同的恒定區。藥物組合物從另一角度來看，本發明提供含有與LGR7蛋白結合的抗體作為有效成分的藥物組合物。此外，本發明涉及含有與LGR7蛋白結合的抗體作為有效成分的細胞增殖抑制劑、 特別是抗癌藥。優選將本發明的細胞增殖抑制劑和抗癌藥給予罹患癌癥的對象或有可能罹患癌癥的對象。由于LGR7的表達水平在腦以外的正常細胞中非常低，而在癌細胞中亢進， 由此認為通過給予抗LGR7抗體，可以得到癌細胞特異性的細胞毒作用。對本發明的藥物組合物(例如抗癌藥)中使用的抗LGR7抗體沒有特別限定，可以是任何抗LGR7抗體，例如可以使用上述抗LGR7抗體。本發明中，“含有與LGR7結合的抗體作為有效成分”是指，含有抗LGR7抗體作為主要活性成分，并不限定抗LGR7抗體的含量。當本發明的藥物組合物的治療對象疾病為癌癥時，對作為對象的癌癥沒有特別限定，但優選為卵巢癌，特別優選卵巢癌明細胞腺癌。癌癥可以是原發病灶，也可以是轉移病灶。本發明的藥物組合物可以通過口服、胃腸外給藥中的任一種途徑給予患者。優選為胃腸外給藥。所述給藥方法具體有注射給藥、經鼻給藥、經肺給藥、經皮給藥等。注射給藥的例子有例如可以通過靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部給予本發明的藥物組合物。還可以根據患者的年齡、癥狀選擇適當的給藥方法。給藥量例如可以在每次、每kg體重0. OOOlmg IOOOmg的范圍內選擇。或者，例如可以在每位患者 0. OOlmg IOOOOOmg/個體的范圍內選擇給藥量。但本發明的藥物組合物并不限于上述給藥量。本發明的藥物組合物可以按照常規方法制成制劑(例如Remington ‘ s Pharmaceutical Science, latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U. S. A),可以同時含有藥學上可接受的載體或添加劑。例如有表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、保存劑、穩定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。并不限于這些，可以進一步適當使用其它常用的載體。載體具體有輕質硅酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。本發明還提供通過使LGR7表達細胞和與LGR7蛋白結合的抗體接觸，而在LGR7 表達細胞中引發毒性的方法或抑制細胞增殖的方法。對本發明的方法中使用的抗體沒有特別限定，例如可以使用上述抗體。抗LGR7抗體所結合的細胞只要是表達LGR7的細胞即可，沒有特別限定。本發明中優選的LGR7表達細胞為癌細胞。更優選為卵巢癌細胞。本發明的方法對上述癌癥的原發病灶和轉移病灶均適用。進一步優選的癌細胞為原發性卵巢癌細胞和轉移性卵巢癌細胞。本發明中，“接觸”例如可以通過向在試管內培養的LGR7表達細胞的培養液中添加抗體來進行。在本發明中，“接觸”還可以通過對將LGR7表達細胞移植到體內的非人動物、 或具有內源性表達LGR7的癌細胞的動物進行給藥來進行。作為評價或測定通過抗LGR7抗體的接觸在LGR7表達細胞中引發的細胞毒的方法，優選采用以下方法。在試管內評價或測定該細胞毒活性的方法有上述抗體依賴性細胞介導的細胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity :ADCC)活性、補體依賴性細胞毒(complement-d印endent cytotoxicity :CDC)活性等的測定方法。抗LGR7抗體是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，這可以利用公知方法來測定(例如Current protocols in Immunology,Chapter 7. Immunologic studies in humans,Editor,John E, Coligan等人，John Wiley & Sons, Inc. , (1993)等)。測定活性時，以具有與抗LGR7抗體相同的同種型、但不具有該細胞毒活性的結合抗體作為對照抗體，與抗LGR7抗體同樣地加以使用，根據抗LGR7抗體顯示出較對照抗體強的細胞毒活性，可以判定活性。抗體的同種型由該抗體的氨基酸序列的H鏈恒定區的序列來規定。在機體內，根據產生抗體的B細胞成熟時發生的染色體上的基因重組所產生的類別轉換，最終決定抗體的同種型。同種型的不同反映在抗體的生理、病理性功能的不同。具體而言，例如已知細胞毒活性的強度和抗原的表達量同時受抗體的同種型影響。因此，測定上述細胞毒活性時，用作對照的抗體優選使用與被檢抗體相同的同種型。此外，為了在機體內評價或測定細胞毒活性，例如將表達LGR7的癌細胞移植到非人被檢動物的皮內或皮下，之后從當天或第二天起每天或間隔數天靜脈或腹腔內給予被檢抗體。通過每天測定腫瘤的大小，可以判定細胞毒活性。與試管內的評價同樣地給予具有相同同種型的對照抗體，根據抗LGR7抗體給藥組的腫瘤大小明顯小于對照抗體給藥組的腫瘤大小，可以判定具有細胞毒活性。使用小鼠作為非人被檢動物時，可適當使用遺傳性缺失胸腺從而缺失其T淋巴細胞的功能的裸小鼠(nu/nu)。通過使用該小鼠，在評價、測定給予的抗體所產生的細胞毒活性時，可以排除被檢動物中T淋巴細胞的干預。本發明還提供癌癥的診斷方法，其特征在于檢測LGR7蛋白或編碼LGR7蛋白的基因。確認LGR7在各種癌組織或癌細胞株中明顯表達亢進，相對于此，在正常細胞中LGR7的表達非常低。因此，LGR7作為用于特異性檢測癌癥的標志物是有效的。在本發明方法的一個方式中，通過檢測試樣中的LGR7蛋白來進行癌癥的診斷。優選檢測LGR7蛋白的胞外區。LGR7蛋白的檢測優選使用識別LGR7蛋白的抗體來進行。作為本發明的診斷方法的具體例之一，可以列舉包括以下步驟的癌癥的診斷方法。(a)提供從受試者采集的試樣的步驟；(b)使用與LGR7蛋白結合的抗體檢測采集的試樣中所含的LGR7蛋白的步驟。本發明中，檢測包括定量或定性的檢測。例如，定性檢測可以是下述測定僅測定是否存在LGR7蛋白；測定是否存在一定量以上的LGR7蛋白；將LGR7蛋白的量與其它試樣(例如對照試樣等)進行比較的測定等。而定量檢測可以是LGR7蛋白濃度的測定、LGR7蛋白量的測定等。本發明中的被檢試樣只要是可能含有LGR7蛋白的試樣即可，沒有特別限定。具體優選從哺乳類等生物的體內采集的試樣。進一步優選的試樣為從人體內采集的試樣。被檢試樣的具體例子可以例示如血液、間質液、血漿、血管外液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血清、 淋巴液、唾液、尿、組織、腹水、腹腔內清洗液等。優選的試樣為由下述被檢試樣得到的試樣， 所述被檢試樣為將從生物體內采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的培養液等。
對根據本發明診斷的癌癥沒有特別限定，可以是任何癌癥。具體有卵巢癌。本發明中，對上述癌癥的原發病灶和轉移病灶均可診斷。本發明中，特別優選的癌癥為原發性卵巢癌和轉移性卵巢癌。本發明中，當在被檢試樣中檢測出LGR7蛋白時，以其水平為指標來診斷癌癥。具體而言，與陰性對照或健康者相比，被檢試樣中檢測出的LGR7蛋白的量多時，顯示受試者患有癌癥、或者將來罹患癌癥的可能性高。即，本發明涉及癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟(1)檢測從受試者采集的生物樣品中LGR7的表達水平的步驟；和(2)當(1)中檢測的LGR7的表達水平與對照相比高時，顯示受試者患有癌癥的步
馬聚ο本發明中，對照是指作為比較基準的試樣，包括陰性對照和健康者的生物樣品。陰性對照可以通過采集健康者的生物樣品，并根據需要進行混合而得到。對照的LGR7表達水平可以和受試者的生物樣品中的LGR7表達水平平行檢測。或者，可以預先檢測多名健康者的生物樣品中的LGR7表達水平，再對健康者中的標準表達水平進行統計學判定。具體而言，例如還可以使用平均值士2X標準偏差(S.D.)或平均值士3X標準偏差(S.D.)作為標準值。在統計學上，平均值士 2X標準偏差(S.D.)包括80%的健康者的值，而平均值士3X標準偏差(S.D.)包括90%的健康者的值。或者，可以利用ROC曲線設定對照中的LGR7的表達水平。ROC曲線(receiver operating characteristic curve ；接收者操作特性曲線)是縱軸表示檢測靈敏度、橫軸表示假陽性率(即“1-特異度”)的曲線圖。本發明中，當連續改變用于判定生物樣品中的 LGR7表達水平的基準值時，通過將靈敏度和假陽性率的變化作圖，可以得到ROC曲線。需要說明的是，用于得到ROC曲線的“基準值”，是為了進行統計學分析而暫時使用的數值。用于得到ROC曲線的“基準值”通常在可以覆蓋可選擇的所有基準值的范圍內連續變化。例如可以使基準值在所分析的集團的LGR7測定值的最小值與最大值之間變化。根據所得的ROC曲線，可以選擇可以期待所需的檢測靈敏度以及精度的標準值。 根據ROC曲線等在統計學上設定的標準值也稱為截斷值(cut-off值)。在基于截斷值的癌癥的檢測方法中，在上述步驟⑵中將(1)中檢測的LGR7的表達水平與截斷值比較。而且，當(1)中檢測的LGR7的表達水平比截斷值高時，檢測到受試者的癌癥。本發明中，LGR7的表達水平可以通過任意方法來確定。具體而言，通過評價LGR7 的mRNA的量、LGR7蛋白的量、以及LGR7蛋白的生物學活性，可以知道LGR7的表達水平。 LGR7的mRNA或蛋白的量可以通過本說明書中所述的方法來確定。本發明中，可以以表達LGR7蛋白的任意動物種作為受試者。例如已知黑猩猩(Pan troglodytes) (ENSPTRG00000016551)、恒河猴(Macaca mulatta) (ENSMMUG00000004647)、 小鼠(Mus musculus)(ENSMUSG00000034009)、大鼠(Rattus norvegicus)(ENSRN0G 00000024120)、豚鼠(Cavia porcellus) (ENSCP0G00000015517)、狗(Canis familiar is) (ENSCAFG00000008672)、雞(Gallus gallus) (ENSGALG00000009429)等人以外的多種哺乳類表達LGR7蛋白。因此，本發明中的受試者包括這些動物。特別適合的受試者是人。需要說明的是，以人以外的動物作為受試者時，當然可以檢測該動物種的LGR7蛋白。對被檢試樣中所含的LGR7蛋白的檢測方法沒有特別限定，優選通過使用抗LGR7抗體的、以下例示的免疫學方法進行檢測放射免疫測定(RIA)；酶聯免疫測定(EIA)；熒光免疫測定(FIA)；發光免疫測定(LIA)；免疫沉淀法(IP)；免疫比濁法(TIA)；蛋白質印跡法(WB)；免疫組織化學法(IHC)；以及免疫擴散法(SRID)。上述方法中，作為癌癥的診斷方法，免疫組織化學(IHC)法是優選的免疫學測定方法之一，該方法包括以下步驟將從罹患癌癥的患者取得的組織或細胞固定在切片上，之后檢測切片上的LGR7蛋白。免疫組織化學(IHC)法等上述免疫學方法為本領域技術人員所公知。S卩，LGR7是癌細胞中特異性表達增強的膜蛋白，因此利用抗LGR7抗體可以檢測癌細胞或癌組織。通過上述免疫組織學分析，檢測從機體內采集的細胞或組織中所含的癌細胞。在另一優選方式中，還可以利用抗LGR7抗體檢測機體內的癌組織。即，本發明涉及癌癥的檢測方法，該方法包括(1)給予受試者用放射性同位素等標記物標記的與LGR7 蛋白結合的抗體的步驟；以及( 檢測該標記物的累積的步驟。為了追蹤給予到機體內的抗體，可以標記抗體以能夠進行檢測。例如，可以追蹤用熒光物質、發光物質或放射性同位素標記的抗體在機體內的行為。用熒光物質或發光物質標記的抗體，可以使用內視鏡或腹腔鏡來觀察。至于放射性同位素，通過追蹤其放射活性，可以將抗體的定位圖像化。本發明中，機體內的抗LGR7抗體的定位表示癌細胞的存在。為了檢測機體內的癌癥，標記抗體的放射性同位素可以使用正電子發射核素。例如可以用18F、55Co、64CU、66(ia、68(;a、76Br、89&和124I這樣的正電子發射核素標記抗體。利用這些正電子發射核素標記抗LGR7抗體時，可采用公知的方法(Acta Oncol. 32，825 830， 1993)。將用正電子發射核素標記的抗LGR7抗體給予人或動物后，使用PET (正電子斷層攝影裝置)從體外計測該放射性核素放射的放射線，通過計算機層析成像的方法轉換為圖像。PET是用于非侵襲性地獲得與藥物的體內行為等有關的數據的裝置。利用PET可以將放射強度以信號強度的形式定量圖像化。通過按上述方式使用PET，無需從患者體內采集試樣，即可檢測在特定癌癥中高度表達的抗原分子。抗LGR7抗體除了用上述核素標記外，還可以利用使用11C^l15CK18FJ5Ti等正電子發射核素的短壽命核素進行放射標記。使用由醫療用回旋加速器得到的上述核素的短壽命核素的生產、短壽命放射標記化合物的制備技術等相關研究開發得到推進。利用這些技術，可以用各種放射性同位素標記抗LGR7抗體。給予患者的抗LGR7抗體，根據抗LGR7抗體對各部位的病理組織的特異性而累積在原發灶和轉移灶中。抗LGR7抗體用正電子發射核素標記時，檢測其放射活性，從而根據放射活性的定位，檢測該原發灶和轉移灶的存在。用于該診斷用途時，可適當使用25 4000keV的γ粒子或正電子放射量的活性值。另外，選擇適當的核素、再大量給予時， 也有望獲得治療效果。為了得到放射線產生的抗癌作用，可以使用給予70 700keV的γ 粒子或正電子放射量值的核素。在本發明方法的另一方式中，檢測LGR7的基因的表達。本發明中，對所檢測的基因沒有特別限定，但優選mRNA。本發明中，檢測包含定量或定性檢測。例如，定性檢測的例子有下述測定操作。僅測定是否存在LGR7的mRNA ；測定是否存在一定量以上的LGR7的mRNA ；將LGR7的mRNA量與其它試樣(例如對照試樣等)進行比較的測定等。而定量檢測可以是LGR7的mRNA濃度的測定、LGR7的mRNA量的測定等。作為本發明中的被檢試樣，可以使用可能含有LGR7的mRNA的任意試樣。優選從哺乳類等生物的體內采集的試樣，進一步優選為從人體內采集的試樣。被檢試樣的具體例子可以例示如血液、間質液、血漿、血管外液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、 尿、組織、腹水、腹腔內清洗液等。本發明的被檢試樣還包括優選的試樣、即由下述被檢試樣得到的試樣，所述被檢試樣為將從生物體內采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的培養液等。使用由將從生物體內采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的培養液等的、 從被檢試樣得到的試樣時，優選采用原位雜交法。原位雜交法是作為確認細胞或組織內是否存在特定的DNA或RNA、或分布及其表達的強弱的方法而發展起來的。其原理是利用了下述性質具有與細胞內的特定核酸序列互補的核苷酸序列的探針核酸特異性地形成復合體。通過預先將放射性同位素(RI)或抗原物質(半抗原)等標記在該探針上，通過檢測該標記，即可識別雜交的部位，因此原位雜交法被用于細胞內DNA或RNA等的檢測等。作為探針的標記，優選使用利用RI進行的標記。作為進一步優選的例子，可以使用利用了非放射性物質的生物素或洋地黃毒苷等的半抗原等的熒光標記。作為特別優選的例子，采用利用被稱作FISH的熒光原位雜交(fluorescence in situ hibridization)進行的檢測法。所要診斷的癌癥可以列舉卵巢癌中的明細胞腺癌。本發明中，對上述癌癥的原發病灶和轉移病灶均可診斷。本發明中，可以以表達LGR7蛋白的任意動物種作為受試者。例如已知小鼠、大鼠、 恒河猴、黑猩猩等人以外的多種哺乳類表達LGR7。特別適合的受試者是人。需要說明的是， 當以人以外的動物種作為受試者時，檢測該動物種的LGR7的mRNA。以下記載檢測方法的具體方式。首先，由受試者制備試樣。然后，檢測該試樣中所含的LGR7的mRNA。本發明中，還可檢測由mRNA合成的cDNA。本發明中，在被檢試樣中檢測出LGR7的mRNA或編碼LGR7的cDNA時，判定可能患有癌癥。例如，與陰性對照或健康者相比，在被檢試樣中檢測出的LGR7的mRNA或編碼LGR7的cDNA的量多時，顯示受試者患有癌癥、或者將來罹患癌癥的可能性大。檢測mRNA的方法是公知的。在本發明中，具體可以利用例如RNA印跡法、RT-PCR 法、DNA陣列法等。上述本發明的檢測方法，還可以使用各種自動檢查裝置自動進行。通過自動化，可以在短時間內檢查多個試樣。
本發明還提供用于診斷癌癥的診斷試劑或試劑盒，所述診斷試劑或試劑盒含有用于檢測被檢試樣中的LGR7蛋白的試劑。本發明的診斷試劑至少含有抗LGR7抗體。通過將本發明的癌癥診斷用試劑與用于檢測LGR7的其它要素組合，可以制成用于診斷癌癥的試劑盒。即，本發明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，該試劑盒含有與LGR7結合的抗體、和檢測該抗體與LGR7結合的試劑，還可以進一步含有對照試樣，所述對照試樣包含含LGR7的生物樣品。本發明的試劑盒，還可以在試劑盒中附帶用于說明測定操作的說明書。需要說明的是，本說明書中引用的所有現有技術文獻均作為參照而納入本說明書中。實施例以下，利用實施例來進一步具體說明本發明，但本發明的技術范圍并不受這些實施例的限定。[實施例Il利用Affymetrix U133 Plus2. 0陣列講行的人LGR7 mRNA表汰分析在東京大學醫學部附屬醫院(日本)獲得書面批準后，從采集并冷凍保存的10例卵巢癌手術樣本中提取總RNA。此時，手術樣本包埋在OCT化合物(OCT compound)中，將切薄后的手術樣本溶解于TRIZOLdnvitrogen公司)中，之后按照產品附錄的方法進行總 RNA提取。同時制作HE染色標本，確認到包含癌部分。10例卵巢癌的組織型的明細為4 例明細胞腺癌、2例漿液性腺癌、3例類內膜腺癌、1例癌肉腫。使用這些檢體的總RNA，利用 Affymetrix U133 Plus2. 0陣列進行表達分析，選出在卵巢明細胞腺癌中確認到特異性地高度表達的基因。使用來自正常組織(Clontech公司)、卵巢癌細胞株(從ATCC、JCRBJS 研購入)的總RNA作為對象。作為適合治療明細胞腺癌的靶分子的選擇標準，在4例卵巢明細胞腺癌中，至少在1例中縮小范圍至表達值為200以上的11761探針組。接下來，在4例卵巢明細胞腺癌中，將第3高的表達值與正常卵巢、末梢血、骨髓、主要組織(肝臟、腎臟、肺、胃、腸、胰臟) 中顯示出最高值的表達值比較，進一步縮小范圍至其比為1. 8以上的197探針組。其中，選出LGR7作為尚未報道其與卵巢明細胞腺癌的關系、且其比顯示出最高值的分子。選擇時， 以由國際基因組聯盟(International Genomics Consortium, IGC)公開的包含3例明細胞腺癌的87例卵巢癌的表達數據作為參考。在LGR7的探針1552715_a_at的卵巢癌、卵巢癌細胞株、正常組織中將信號值作圖，結果見圖1。樣品名稱的詳細內容見表1。LGR7即使在卵巢癌中也特異性地表達在明細胞腺癌中，有望成為抗該癌種的以人 LGR7為靶的抗腫瘤藥。表 權利要求
1.抗體，該抗體與LGR7蛋白結合、且對表達LGR7蛋白的細胞具有細胞增殖抑制活性。
2.權利要求1所述的抗體，其中，細胞增殖抑制活性為細胞毒活性。
3.權利要求2所述的抗體，其中，上述細胞毒活性為抗體依賴性細胞毒活性。
4.權利要求2所述的抗體，其中，上述細胞毒活性為補體依賴性細胞毒活性。
5.權利要求1 4中任一項所述的抗體，該抗體為細胞毒性物質所結合的抗體。
6.權利要求5所述的抗體，該抗體為具有內化活性的抗體。
7.權利要求1 6中任一項所述的抗體，該抗體為抑制癌細胞增殖的抗體。
8.權利要求7所述的抗體，其中，上述癌細胞為卵巢癌明細胞。
9.以下(1) 09)中任一項所述的抗體(1)抗體即22DA6重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 5記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 6記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 7記載的氨基酸序列；(2)抗體即22DA6輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 10記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 11記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 12記載的氨基酸序列；(3)抗體即22DA6，該抗體含有⑴所述的H鏈和⑵所述的L鏈；(4)抗體即22DA7重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 15記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 16記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 17記載的氨基酸序列；(5)抗體即22DA7輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 20記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 21記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 22記載的氨基酸序列；(6)抗體即22DA7，該抗體含有⑷所述的H鏈和(5)所述的L鏈；(7)抗體即22DA17重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID N0:25記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 27記載的氨基酸序列；(8)抗體即22DA17輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 30記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 31記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 32記載的氨基酸序列；(9)抗體即22DA17，該抗體含有(7)所述的H鏈和⑶所述的L鏈；(10)抗體即22DA22重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 35 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 37記載的氨基酸序列；(11)抗體即22DA22輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 40 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 41記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 42記載的氨基酸序列；(12)抗體即22DA22，該抗體含有(10)所述的H鏈和(11)所述的L鏈；(13)抗體即22DA23重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 45 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQID NO 47記載的氨基酸序列；(14)抗體即22DA23輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 50 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 52記載的氨基酸序列；(15)抗體即22DA23，該抗體含有(13)所述的H鏈和(14)所述的L鏈；(16)抗體22DAM重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 55記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 56記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 57記載的氨基酸序列；(17)抗體即22DAM輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 60 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 61記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 62記載的氨基酸序列；(18)抗體即22DAM，該抗體含有(16)所述的H鏈和(17)所述的L鏈；(19)抗體即22SD7重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID N0:65記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 66記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 67記載的氨基酸序列；(20)抗體即22SD7輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 70記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 71記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 72記載的氨基酸序列；(21)抗體即22SD7，該抗體含有(19)所述的H鏈和Q0)所述的L鏈；(22)抗體即22SD11重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 75 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 76記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 77記載的氨基酸序列；(23)抗體即22SD11輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 80 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 81記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 82記載的氨基酸序列；(24)抗體即22SD11，該抗體含有(22)所述的H鏈和(23)所述的L鏈；(25)抗體即22SD48重鏈，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 85 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 86記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 87記載的氨基酸序列；(26)抗體即22SD48輕鏈，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為⑶Rl的SEQID NO 90 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO 91記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO 92記載的氨基酸序列；(27)抗體即22SD48，該抗體含有05)所述的H鏈和Q6)所述的L鏈；(28)抗體，該抗體與(1) (XT)中任一項所述的抗體具有同等活性；(29)抗體，該抗體識別與(1) (XT)中任一項所述的抗體所識別的表位相同的表位。
10.權利要求1 9中任一項所述的抗體，該抗體具有人恒定區。
11.權利要求10所述的抗體，該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
12.權利要求1 11中任一項所述的抗體，該抗體是巖藻糖缺失的抗體。
13.藥物組合物，其中含有權利要求1 12中任一項所述的抗體作為有效成分。
14.細胞增殖抑制劑，其中含有權利要求1 12中任一項所述的抗體作為有效成分。
15.抗癌藥，其中含有權利要求1 12中任一項所述的抗體作為有效成分。
16.權利要求15所述的抗癌藥，其中，作為治療對象的癌癥為卵巢癌。
17.權利要求16所述的抗癌藥，其中，上述卵巢癌為明細胞腺癌。
18.癌癥的診斷方法，其特征在于檢測LGR7蛋白或編碼LGR7蛋白的基因。
19.癌癥的診斷方法，其特征在于檢測LGR7蛋白。
20.權利要求19所述的診斷方法，其中，LGR7蛋白的檢測使用與LGR7蛋白結合的抗體來進行。
21.癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟(a)提供從受試者采集的試樣的步驟；(b)使用與LGR7蛋白結合的抗體檢測(a)的試樣中所含的LGR7蛋白的步驟。
22.癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟(a)給予受試者具有LGR7蛋白結合活性、且用放射性同位素標記的抗體的步驟；(b)檢測上述放射性同位素的累積的步驟。
23.權利要求18 22中任一項所述的診斷方法，其中，作為診斷對象的癌癥為卵巢癌。
24.權利要求23所述的診斷方法，其中，上述卵巢癌為明細胞腺癌。
全文摘要
本發明人等進行了深入研究，結果發現在卵巢癌中的明細胞腺癌細胞中，不僅LGR7的基因就連其蛋白也高度表達。并且，本發明人等還發現抗LGR7抗體對LGR7表達細胞具有抗體依賴性細胞毒(ADCC)活性和補體依賴性細胞毒(CDC)活性。根據以上的認識，本發明人等發現抗LGR7抗體對原發性或轉移性卵巢明細胞腺癌的診斷、預防和治療有效。
文檔編號A61P35/00GK102395603SQ20098015766
公開日2012年3月28日 申請日期2009年12月25日 優先權日2008年12月26日
發明者上原由利子, 油谷浩幸, 舟橋真一 申請人:國立大學法人東京大學, 株式會社未來創藥研究所