可注射的肉毒桿菌毒素制劑的制作方法

專利名稱：可注射的肉毒桿菌毒素制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的包含肉毒桿菌毒素的可注射的組合物，其可以施用于受試者以用于多種治療、美容和/或化妝目的。
背景技術：
皮膚保護身體器官免受外部環境的威脅，并起保持體溫的恒溫器作用。其由幾個不同的層組成，每層都具有特定的功能。主要的層包括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆蓋真皮的上皮細胞的分化層，真皮由結締組織組成。表皮和真皮都受皮下組織的進一步支持， 皮下組織是脂肪組織的內層。表皮，皮膚的最上層，僅僅為0. 1至1. 5毫米厚(Inlander, Skin, New York, N. Y. People' s Medical Society，1-7 (1998))。其由角質形成細胞組成，根據它們的分化狀態，其被分成幾層。可以進一步將表皮分成角質層和有活力的表皮，該有活力的表皮由 granular melphigian和基細胞組成。角質層是吸濕性的，需要至少10%重量的水分以保持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸于角蛋白的持水能力。當角質層喪失其柔軟性和彈性時， 其變得粗糙且脆，產生干燥皮膚。真皮，其緊位于表皮之下，為1. 5至4毫米厚。其是皮膚的三個層中最厚的。大部分皮膚結構，包括汗腺和脂腺(其通過皮膚中稱為毛孔或痤瘡的孔分泌物質)、毛囊、神經末梢和血管及淋巴管，在真皮中被發現(Inlander，Skin，New York,N. Y. =People' s Medical Society, 1-7 (1998))。然而，真皮的主要組分是膠原和彈性蛋白。皮下組織是皮膚的最深層。其起用于身體熱量保存的絕緣體和用于器官保護的減震器作用(Inlander, Skin,New York,N. Y. =People' s Medical Society，1-7 (1998))。另外，皮下組織也貯藏用于能量儲備的脂肪。皮膚的PH通常為5至6之間。該酸性是由于存在來自于皮脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸。術語“酸外膜(acid mantle)”指在皮膚的大多數區域存在水溶性物質。皮膚的緩沖能力部分由于儲存在皮膚角質層中的這些分泌物。皺紋，年齡的指示特征之一，可能是由皮膚受環境損害而蓄積的生物化學、組織學和生理學變化引起(Benedetto，“International Journal of Dermatology", 38 641-655(1999))。另外，存在可引起面部皺紋的皺褶、皺紋和皺痕(creases)的其他第二因子(Stegman 等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 第2版，St. Louis編著，Mo. =Mosby Year Book :5-15 (1990))。這些第二因子包括重力的持續牽拉、皮膚上經常和持續的位置壓力(例如，在睡眠期間)和由于面部肌肉收縮引起的反復面部運動(Stegman 等人· , The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery，第 2 版，St. Louis 編著，Mo. =Mosby Year Book :5-15 (1990))。
為了可能緩和某些老化體征，已經使用了不同的技術。這些技術從包含α羥酸和視黃醇的面部增濕劑到外科手術方法和注射神經毒素。例如，在1986年，Jean和 Alastair Carruthers，一對由眼整形外科醫生和皮膚科醫生組成的夫妻團隊，研究了一種使用A型肉毒桿菌毒素治療眉間區域與運動相關的皺紋的方法(Schantz和kott， In Lewis G. Ε. (Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York :Academic Press, 143-150(1981))。在1992年，Carruthers使用A型肉毒桿菌毒素來治療皺紋引起該方法最初公布(Schantz 禾口 Scott, In Lewis G. Ε. (Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York =Academic Press, 143-150 (1981))。直到1994年，同一團隊報道了對于面部的其它運動相關的皺紋的經驗(Scott, Ophthalmol, 87 1044-1049 (1980))。這依次引起使用A型肉毒桿菌毒素進行化妝處理的時代的誕生。據報道A型肉毒桿菌毒素是人類所知最致命的天然生物劑。肉毒桿菌 (C. botulinum)的孢子可在土壤中找到，并可在不正確地殺菌和密封的食物容器中生長。肉毒中毒(其可能是致命的)，可通過攝入該細菌引起。肉毒桿菌毒素通過阻止突觸傳遞(通過抑制乙酰膽堿釋放穿過神經肌肉接點)而導致產生肌肉麻痹，并且其被認為也以其它方式起作用。其作用主要是阻斷通常引起肌肉痙攣或收縮的信號，導致麻痹。在最近十年間， 已經將肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹活性用于獲得多種治療功效。已經使用肉毒桿菌毒素的受控施用來提供肌肉麻痹，以治療多種醫學病癥，例如以骨骼肌活動過度為特征的神經肌肉失調。已經用肉毒桿菌毒素治療的病癥包括偏側面肌痙攣、成年人發病的痙攣性斜頸、肛裂、眼瞼痙攣、大腦性癱瘓、頸張力障礙、偏頭痛、斜視、顳下頌關節障礙和各種類型的肌痛性痙攣和肌痙攣。近來，在治療和化妝性面部應用中已經利用肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應，所述應用例如治療皺紋、皺眉線(frown lines)及其它面部肌肉痙攣或收縮的后果。除了 A型肉毒桿菌毒素之外，存在七種其它的血清學不同形式的肉毒桿菌毒素， 其也由革蘭氏陽性菌肉毒桿菌產生。在這八種血清學不同類型的肉毒桿菌毒素中，可引起麻痹的七種被稱為肉毒桿菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。這些毒素中的每種以用特定類型的抗體中和為特征。各肉毒桿菌毒素蛋白的分子量為約150 kD。由于肉毒桿菌毒素的分子尺寸和分子結構，其不能穿過角質層和多層皮下結構。不同血清型的肉毒桿菌毒素在不同動物物種中在它們引起的麻痹的嚴重性和持續時間方面以及效果方面不同。例如，已經確定，在大鼠中A型肉毒桿菌毒素的功效為B型肉毒桿菌毒素的500倍以上，如通過麻痹速率所測定的。另外，已經確定B型肉毒桿菌毒素在靈長類動物中在480 U/kg的劑量下是無毒的，該劑量為A型肉毒桿菌毒素的靈長類動物LD5tl的約12倍。當由肉毒桿菌細菌釋放時，肉毒桿菌毒素為毒素復合物的組分，所述毒素復合物包含約150 kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子和締合的非毒素蛋白。這些內源性非毒素蛋白被認為包括血凝素蛋白家族和非血凝素蛋白。據報道，非毒素蛋白穩定毒素復合物中的肉毒桿菌毒素分子并且保護它防止被消化酸變性(當毒素復合物被攝取時)。因此，毒素復合物中的非毒素蛋白保護肉毒桿菌毒素的活性，并因此當經由胃腸道施用所述毒素復合物時， 增加全身性滲透。此外，據認為，某些非毒素蛋白特異性穩定血液中的肉毒桿菌毒素分子。非毒素蛋白在毒素復合物中的存在通常導致毒素復合物具有比單純的肉毒桿菌毒素分子更大的分子量，所述單純的肉毒桿菌毒素分子的分子量為約150 kD，如之前陳述的。例如，肉毒桿菌細菌可以產生A型肉毒桿菌毒素復合物，其具有約900 kD、500 kD或300 kD的分子量。B型和C型肉毒桿菌毒素作為具有約700 kD或約500 kD分子量的復合物產生。D型肉毒桿菌毒素作為具有約300 kD或約500 kD分子量的復合物產生。E型和 F型肉毒桿菌毒素僅作為具有約300 kD分子量的復合物產生。為了給肉毒桿菌毒素提供額外的穩定性，在制備過程中，通常通過將復合物與白蛋白組合來穩定毒素復合物。例如，BOTOX (Allergan，Inc. ,Irvine，CA)是包含肉毒桿菌毒素的制劑，其包含100 UA型肉毒桿菌毒素，和輔助蛋白，0.5毫克人白蛋白，以及0.9 毫克氯化鈉。白蛋白用于在不同的環境中結合和穩定毒素復合物，所述環境包括與制備、運輸、存儲和施用相關的環境。一般地，通過組合物的小心受控的注射將肉毒桿菌毒素施用給患者，所述組合物包含肉毒桿菌毒素復合物和白蛋白。然而，存在與該方法相關的幾個問題。不僅是注射的痛苦，而且為了實現想要的治療或化妝效果，一般地在注射部位周圍局部地產生毒素的大的皮下孔。肉毒桿菌毒素可能從這些皮下孔轉移，引起身體的鄰近區域的不想要的麻痹。當要治療的區域較大并且需要多次注射毒素以治療該區域時，該問題更加嚴重。此外，因為注射的毒素復合物包含非毒素蛋白和白蛋白(其穩定肉毒桿菌毒素并且增加毒素復合物的分子量)，毒素復合物在體內具有長半衰期并且可能在患者中引起不希望的抗原應答。例如， 一些患者將隨時間產生對在目前的商品化制劑中用作穩定劑的白蛋白的變態反應。并且， 毒素復合物可能誘導患者的免疫系統形成中和抗體，以致在隨后的施用中需要更大量的毒素來實現相同的效果。當其發生時，隨后的注射必須小心地定位，以使它們不釋放大量毒素進入患者血流，其可以導致致命的全身中毒，特別地因為非毒素蛋白和白蛋白穩定血液中的肉毒桿菌毒素。鑒于與目前的肉毒桿菌毒素制劑相關的不利因素，非常期望具有這樣的可注射的肉毒桿菌毒素制劑，其是有效的和穩定的，但表現出減少的抗原性和較低的注射后局部擴散的傾向。還希望將這樣的肉毒桿菌毒素制劑用于各種治療、美容和/或化妝目的。發明概述本發明提供可注射的組合物，其包含與帶正電荷的載體分子非共價結合的肉毒桿菌毒素。在優選實施方案中，本發明的組合物與常規的市售可得的肉毒桿菌毒素制劑(例如BOTOX 或MY0BL0C )相比具有一種或多種優點。例如，在某些實施方案中，與常規的可注射的肉毒桿菌制劑相比，該組合物可以表現出一種或多種優點，包括減少的抗原性，減少的注射后擴散進入周圍組織的傾向，臨床功效的增加的持續時間或增強的效力(相對于常規的肉毒桿菌毒素制劑)，臨床功效的更快開始，和/或改善的穩定性。本發明的一個方面是認識到，某些非天然分子(即，未在獲自肉毒桿菌細菌的肉毒桿菌毒素復合物中發現的分子)可以添加到肉毒桿菌毒素、肉毒桿菌毒素復合物，特別是縮減的(reduced)肉毒桿菌毒素復合物(如本文所定義的)中，以提高毒素通過組織的擴散作用。非天然分子與毒素非共價結合并且用作滲透增強劑，其提高毒素注射后到達目標結構的能力。此外，非天然分子可以在注射前和注射后增加毒素的穩定性。例如，滲透增強劑可以是帶正電荷的載體，例如陽離子肽，其沒有固有的肉毒桿菌毒素樣活性并且其還包含一個或多個蛋白轉導結構域，如本文描述的。本發明的另一個實施方案是提供包含肉毒桿菌毒素、肉毒桿菌毒素復合物(或縮減的蛋白肉毒桿菌毒素復合物，其僅包括150 kD神經毒素本身或神經毒素與一些但不是全部的天然復合物蛋白)以及帶正電荷的載體的組合物。本發明進一步涉及通過給需要此類治療的受試者或患者注射有效量的本發明的組合物來產生生物學效果的方法。生物學效果可以包括例如，肌肉麻痹、減少分泌過多或出汗、治療神經性疼痛或偏頭痛、控制鼻炎或鼻竇炎、治療膀胱過度活動癥、減少肌肉痙攣、預防或減少痤瘡、減少或增強免疫應答、減少皺紋或預防或治療多種其他病癥。本發明還提供用于制備制劑或預混合物的試劑盒，所述制劑包含肉毒桿菌毒素、 肉毒桿菌毒素復合物或縮減的蛋白肉毒桿菌毒素復合物以及帶正電荷的載體，所述預混合物可以用于產生所述制劑。還提供試劑盒，其包含用于連續地施用肉毒桿菌毒素復合物 (或縮減的肉毒桿菌毒素復合物，其僅包括150 KD的神經毒素本身或所述神經毒素與一些天然復合物蛋白)和帶正電荷的載體的工具。附圖概述

圖1 柱狀圖，其表示重復施用RT003或BOTOX 后恢復至基線DAS值(0. 4)所需要的時間。圖2 圖2A表示注射了用于指示小鼠的腓腸肌肌肉部分的深色染料的小鼠的后肢，所述腓腸肌肌肉接受中線旁側注射。圖2B表示注射了用于指示小鼠的腓腸肌肌肉部分的深色染料的小鼠的后肢，所述腓腸肌肌肉接受中線注射。圖3 趾外展評分(Digital abduction scores)，其測量為 RT003、RTT150 或 BOTOX 注射入小鼠的腓腸肌肌肉的中線旁側或中線部分后的時間的函數。發明詳述本發明涉及新的包含肉毒桿菌毒素、肉毒桿菌毒素復合物或縮減的肉毒桿菌毒素復合物的可注射的組合物。在優選實施方案中，該組合物穩定毒素或使得能夠在注射后運送或遞送毒素通過組織，以便與常規的市售可得的與外源白蛋白結合的肉毒桿菌毒素復合物(例如BOTOX 或MY0BL0C )相比，毒素具有減少的抗原性，更好的安全特征，增強的效力，臨床功效的更快開始和/或更長的臨床功效持續時間。如本文所述，本發明的組合物可以用作向受試者提供肉毒桿菌毒素的可注射施用劑，用于各種治療、美容和/或化妝目的。與遞送肉毒桿菌毒素的其它組合物和方法相比，本發明的組合物還具有改善的安全特征。此外，該組合物可以有利地減少對內毒桿菌毒素的免疫應答。本文使用的術語“肉毒桿菌毒素”可以指任一種已知類型的肉毒桿菌毒素(例如， 與不同血清型的肉毒桿菌相關的150 kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子)，無論其是由細菌生成的還是通過重組技術生成的，和隨后可能發現的任何這樣的類型，包括新發現的血清型和工程改造的變體或融合蛋白。如上所述，目前已經表征了七種免疫學上不同的肉毒桿菌神經毒素，即肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，其各自以用特定類型的抗體中和為特征。所述肉毒桿菌毒素血清型為市售可得的，例如，得自Sigma-Aldrichd Louis,Mo.) 和Metabiologics，Inc. (Madison, Wis)和其它來源。不同血清型的肉毒桿菌毒素隨動物種類不同，影響它們引起的麻痹的嚴重性和持續時間。至少兩種肉毒桿菌毒素，A型和B型，是以用于治療某些病癥的制劑市售可得的。例如，A型包含在具有商標B0T0X M&Allergan 制劑中和具有商標DYSP0RT 的Ipsen制劑中，B型包含在具有商標MY0BL0C 的Elan 制劑中。在本發明的組合物中使用的術語“肉毒桿菌毒素”可以可選地指肉毒桿菌毒素衍生物，即，具有肉毒桿菌毒素活性但相對于天然存在的或重組的天然肉毒桿菌毒素在任何部分或任何氨基酸鏈上包含有一個或多個化學或功能改變的化合物。例如，所述肉毒桿菌毒素可以是修飾的神經毒素，即與天然形式相比具有至少一個氨基酸被刪除、修飾或替換的神經毒素，或者所述修飾的神經毒素可以是重組生成的神經毒素或其衍生物或片段。例如，肉毒桿菌毒素可以是已經以一種方式進行修飾的毒素，所述方式例如增強其性質或減少不想要的副作用，但仍然保持希望的肉毒桿菌毒素活性。可選地，本發明所用的肉毒桿菌毒素可以是使用重組或合成化學技術制備的毒素，例如重組肽、融合蛋白、或雜種神經毒素，例如從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或結構域制備(例如，參見美國專利 6，444，209)。所述肉毒桿菌毒素也可以是整個分子的一部分，其已經顯示具有必需的肉毒桿菌毒素活性，并且在這種情況下，可以單獨使用或作為組合或綴合分子例如融合蛋白的一部分使用。或者，所述肉毒桿菌毒素可以是肉毒桿菌毒素前體的形式，其本身可以是無毒的，例如無毒的鋅蛋白酶，其在蛋白酶切割后變成有毒的。本文使用的術語“肉毒桿菌毒素復合物”或“毒素復合物”是指約150 kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子(屬于肉毒桿菌毒素血清型A-G的任一種)連同結合的內源性非毒素蛋白 (即，由肉毒桿菌細菌生成的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，應當注意，所述肉毒桿菌毒素復合物不必作為一種單一毒素復合物來源于肉毒桿菌細菌。例如，可以首先重組制備肉毒桿菌毒素或修飾的肉毒桿菌毒素，然后將其與非毒素蛋白組合。重組的肉毒桿菌毒素還可以是購買的(例如，購自List Biological Laboratories,Campbell,Ca), 然后將其與非毒素蛋白組合。本發明還涉及通過添加一種或多種外源穩定劑，除去內源穩定劑或其組合，調節肉毒桿菌毒素分子的穩定性。例如，本發明涉及使用"縮減的肉毒桿菌毒素復合物"，其中所述肉毒桿菌毒素復合物具有減少量的非毒素蛋白，與在由肉毒桿菌細菌生成的肉毒桿菌毒素復合物中天然發現的數量相比。在一個實施方案中，使用任何常規蛋白分離方法，從來源于肉毒桿菌細菌的肉毒桿菌毒素復合物中提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，從而制備縮減的肉毒桿菌毒素復合物。例如，縮減的肉毒桿菌毒素復合物可以通過將肉毒桿菌毒素復合物暴露在PH 7. 3的紅細胞下以分離肉毒桿菌毒素復合物來產生(例如參見EP 1514556 Al，其通過引用并入本文)。可以使用HPLC、透析、柱、離心及其它方法來從蛋白中提取蛋白。或者，當通過組合合成產生的肉毒桿菌毒素與非毒素蛋白來產生縮減的肉毒桿菌毒素復合物時，人們可僅僅向該混合物中加入比天然存在的肉毒桿菌毒素復合物中所含的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。根據本發明，可以獨立地以任何量減少在縮減的肉毒桿菌毒素復合物中的任何非毒素蛋白(例如血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或兩者)。在某些示例性的實施方案中，一種或多種非毒素蛋白相對于在肉毒桿菌毒素復合物中通常發現的量減少了至少約0. 5%U %>3%,5%,10%,20%,30%,40%, 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %。如上所述，肉毒桿菌細菌產生七種不同血清型的毒素并且用不同相對量的非毒素蛋白制備市售可得的制劑(即，不同量的毒素復合物)。例如， MY0BL0C 含有5000 U的B型肉毒桿菌毒素/ml和0. 05%的人血清白蛋白、0. 01 M 丁二酸鈉和0. 1 M氯化鈉。DYSP0RT 含有500 U的A型肉毒桿菌毒素-血凝素復合物與125 meg 的白蛋白和2. 4 mg的乳糖。在某些實施方案中，從所述肉毒桿菌毒素復合物中除去了基本上所有的通常在來源于肉毒桿菌細菌的肉毒桿菌毒素復合物中發現的非毒素蛋白(例如大于95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，盡管在某些情況下可以以相同的數量減少內源性非毒素蛋白的量，本發明還涉及以不同的量減少每種內源性非毒素蛋白，和減少至少一種內源性非毒素蛋白，但不減少其它的。如上所述，一般添加外源穩定劑(例如白蛋白)以穩定肉毒桿菌毒素制劑。例如， 就BOTOX 來說，0.5 mg人白蛋白/IOOU A型肉毒桿菌毒素復合物用于穩定復合物。通常，可以添加以穩定根據本發明的組合物的外源穩定劑的量不受特別限定。在一些實施方案中，由于本發明的帶正電荷的載體單獨用作穩定劑的能力，添加的穩定劑的量可以小于常規添加的量。例如，添加的外源白蛋白的量可以是小于常規的千倍過量的外源白蛋白的任何量，并且在本發明的某些示例性的實施方案中，僅為約0. 25,0. 20,0. 15,0. 10,0. 01、 0. 005,0. 001,0. 0005,0. 00001,0. 000005,0. 000001、或0. 0000001 mg/100U 肉毒桿菌毒素。 在一個實施方案中，沒有向本發明的組合物中添加外源白蛋白作為穩定劑。根據本發明，如本文所述的，已經發現具有蛋白轉導結構域或效能基團 (efficiency group)的帶正電荷的載體分子適合作為用于肉毒桿菌毒素的運輸系統，其使得毒素能夠以改善的滲透性被注射至目標結構，例如肌肉和/或其他皮膚相關結構。在沒有共價修飾肉毒桿菌毒素的情況下進行運輸。除增強肉毒桿菌毒素的滲透性之外，在某些優選實施方案中，本發明的帶正電荷的載體還可以穩定肉毒桿菌毒素，防止降解。在此類實施方案中，可以減少或全部省略通常存在以穩定肉毒桿菌毒素的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。類似地，通常在制備過程中添加的外源白蛋白也可以省略。所使用的與術語“載體”相關的術語“帶正電荷的，，或“陽離子的”，指所述載體在至少一些溶液相條件下，更優選地在至少一些生理學相容性條件下具有正電荷。更具體地， 本文使用的"帶正電荷的"和“陽離子的”是指，所關注的基團包含在所有PH條件下帶電荷的官能團(functionality)，例如季胺，或包含在某些溶液相條件下可以獲得正電荷的官能團，例如在伯胺的情況下，PH變化。更優選地，如本文使用的，“帶正電荷的"或“陽離子的”指在生理學相容性條件下，具有與陰離子結合的行為的基團。具有多個帶正電荷的部分的聚合物不必是均聚物，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。帶正電荷的部分的其他實例是現有技術中公知的并且可以容易地被使用，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。通常，帶正電荷的載體(也稱為"帶正電荷的主鏈")一般是原子鏈，并且鏈中的基團在生理學PH下攜帶正電荷，或攜帶正電荷的基團連接至從所述主鏈延伸的側鏈。在某些優選實施方案中，所述帶正電荷的主鏈是陽離子肽。如本文使用的，術語"肽"指氨基酸序列，但不具有關于氨基酸序列內的氨基酸殘基的數目的含義。因此，術語"肽"還可以包括多肽和蛋白。在某些優選實施方案中，帶正電荷的主鏈本身不具有確定的酶促或治療性生物學活性。在一些實施方案中，主鏈是直鏈烴主鏈，其在一些實施方案中被選自氮、氧、 硫、硅和磷的雜原子中斷。大部分主鏈原子通常是碳。另外，主鏈通常是重復單位的聚合物 (例如氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯胺)、聚烯化亞胺(polyalkyleneimine)等)，但也可以是雜聚物。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是聚丙烯胺(polypropyleneamine)，其中大量胺氮原子以攜帶正電荷的銨基基團(四取代的)存在。在另一個實施方案中，帶正電荷的主鏈是非肽聚合物，其可以是雜聚物或均聚物，例如聚烯化亞胺，例如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，具有約10，000至約2，500，000，優選約100，000至約1，800，000，和最優選約500, 000至約1，400，000的分子量。在另一組實施方案中，所述主鏈連接有多個側鏈部分， 所述側鏈部分包括帶正電荷的基團(例如銨基、吡啶基、磷鐺基、锍基、胍基或脒基)。在該組實施方案中，側鏈部分可以沿主鏈間隔分布，其間隔是一致的或可變的。另外，側鏈的長度可以是相同的或不同的。例如，在一組實施方案中，所述側鏈可以是直鏈或支化烴鏈，其具有一個至二十個碳原子并且在遠端(遠離主鏈)以上述帶正電荷的基團之一終止。帶正電荷的載體和肉毒桿菌毒素、縮減的肉毒桿菌毒素復合物之間通過非共價相互作用結合， 其非限定性實例包括離子相互作用、氫鍵結合、范德華力或其組合。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是具有多個帶正電荷的側鏈基團(例如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優選地，所述多肽具有約100至約1，500，000，更優選約500至約1，200，000，最優選約1000至約1，000，000的分子量。本領域技術人員能夠理解，當氨基酸用于本發明的這部分時，所述側鏈可以在連接中心具有D-型或L-型(R 或S構型)。在某些優選實施方案中，所述多肽具有約500至約5000，更優選約1000至約 4000，更優選2000至約3000的分子量。可選地，主鏈可以包含氨基酸類似物和/或合成的氨基酸。主鏈還可以是多肽類似物，例如類肽。參見，例如，Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32 =543(1993)； Zuckermann 等人，Chemtracts-Macromol. Chem. 4 :80(1992)；禾口 Simon 等人，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 89:9367(1992)。簡言之，類肽是其中側鏈連接至主鏈氮原子而非α -碳原子的聚甘氨酸。如上所述，一部分側鏈一般以帶正電荷的基團終止，以提供帶正電荷的主鏈成分。在例如美國專利5，877，278中描述了類肽的合成，其通過引用完整并入本文。如該術語在本文中使用的，具有類肽主鏈結構的帶正電荷的主鏈被認為是"非肽"，因為它們不由具有天然存在于α-碳位置的側鏈的氨基酸組成。可以使用多種其他主鏈，例如，多肽的空間或電子模擬物，其中肽的酰胺鍵被替代物所取代，例如酯鍵、硫代酰胺(一CSNH-)，反向硫代酰胺(一NHCS-)、氨基亞甲基 (-NHCH2-)或反向的亞甲基氨基(一CH2NH--)基團、酮-亞甲基(--COCH2--)基團、亞膦酸酯(--PO2RCH2--)、烷基磷酰胺和烷基磷酰胺酯(--PO2RNH-)、反向肽(一NHC0-)、反式烯烴(一CR = CH-)、氟代烯烴(一CF = CH-)、二亞甲基(一CH2CH2--)、硫醚(一CH2S-)、羥基亞乙基(--CH(OH)CH2-)、亞甲基氧(一CH2O--)、四唑(CN4)、亞磺酰氨基(--SO2NH-)、亞甲基亞磺酰氨基(--CHRSO2NH--)、反向亞磺酰氨基(--NHSO2--),和具有丙二酸酯和/或偕二氨基烷基亞單位的主鏈，例如，如Fletcher等人((1998)Chem. Rev. 98 763)所論述的和其中引用的文獻所描述的。許多在先的取代導致相對于由α氨基酸形成的主鏈大致等電子排列的(isosteric)聚合物主鏈。在上文提供的各個主鏈中，可以連接側鏈基團，所述側鏈基團攜帶帶正電荷的基團。例如亞磺酰氨基連接的主鏈(--SO2NH-和--NHSO2--)可以具有連接至氮原子的側鏈基團。類似地，羥基亞乙基(--CH(OH)CH2--)連接可以具有連接至羥基取代基的側鏈基團。 本領域技術人員可以容易地使用標準合成法，采用其他化學連接以提供帶正電荷的側鏈基團。在一個實施方案中，帶正電荷的主鏈是具有蛋白轉導結構域(也稱為效能基團) 的多肽。如本文使用的，“效能基團(efficiency group)“是具有促進帶正電荷的主鏈轉移通過組織或細胞膜的效果的任何試劑。蛋白轉導結構域或效能基團的非限制性實例包括-(gly)ni" (arg)n2,HIV-TAT或其片段、或觸角足蛋白(Antermapedia)的蛋白轉導結構域、 或其片段，其中下標nl是0至20，更優選0至8，更優選2至5的整數，并且下標n2單獨地為約5至約25，更優選約7至約17，最優選約7至約13的奇整數。在一些實施方案中，HIV-TAT 片段不包含HIV-TAT分子的富含半胱氨酸的區域，以最小化與二硫化物聚集相關的問題。 進一步優選的是這樣的實施方案，其中HIV-TAT片段具有下式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly) q>(gly^-RKKRRQRRR-fely),，其中下標 ρ 和 q各自獨立地為
0至20的整數并且所述片段經由片段的C末端或N末端連接至主鏈。在某些優選的實施方案中，P為1且q為0或ρ為0且(1為1。優選的HIV-TAT片段是這樣的片段，其中下標 P和q各自獨立地為0至8，更優選0至5的整數。在另一個優選實施方案中，帶正電荷的側鏈或分支基團是觸角足蛋白(Antp)蛋白轉導結構域(PTD)，或其保留活性的片段。這些在本領域是已知的，例如參見Console等人，J. Biol. Chem. 278 =35109(2003)，且本發明涉及的Arrtp PTD的非限制性實例為SGRQIKIWFQNRRMKWKKC。優選，帶正電荷的載體包括至少約0. 01% (總載體重量的百分比)，優選約0. 01 至約50重量％，更優選約0. 05至約45重量％，和最優選約0. 1至約30重量％的量的側鏈帶正電荷的蛋白轉導結構域。對于具有式_(gly)nl_(arg)n2的帶正電荷的蛋白轉導結構域， 優選的范圍為約0. 1至約25%。在另一個實施方案中，主鏈部分是聚賴氨酸并且帶正電荷的蛋白轉導結構域連接至賴氨酸側鏈氨基或連接至C-或N-末端。在一些優選實施方案中，聚賴氨酸可以具有至少 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000,5500 或 6000D，且小于約 2，000，000、1，000，000,500, 000,250, 000、100，000,75, 000、 50，000和25，000D的分子量。在100至2，000，000D的范圍內，預期較低和/或較高的范圍可以分別地以100增加或減少，各個所得的子范圍是本發明明確涉及的實施方案。在一些示例性的實施方案中，聚賴氨酸具有約1，000至約1，500，000D，約2，000至約800，000D, 或約3，000至約200，000D的分子量。在其他示例性的實施方案中，聚賴氨酸具有約100至約 10，000D,約 500 至約 5，000D,約 1，000 至約 4，000D,約 1，500 至約 3，500D 或約 2，000 至約3，000D的分子量。在一些實施方案中，本發明涉及的聚賴氨酸可以是任何市售可得的(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.，USA)聚賴氨酸，諸如例如 MW > 70, 000 的聚賴氨酸，具有70，000至150，000MW的聚賴氨酸，具有150，000至300，000MW的聚賴氨酸和 MW > 300，000的聚賴氨酸。合適的聚賴氨酸的選擇取決于組合物的其他組分，并且將足以提供總的凈正電荷給所述組合物，并提供優選一至四倍于帶負電荷的組分的組合長度的長度。優選的帶正電荷的蛋白轉導結構域或效能基團包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg -arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7)或 HIV-TAT。在另一個優選實施方案中，帶正電荷的主鏈是聚烯化亞胺，其非限制性實例包括聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺和聚丁烯亞胺。在某些優選實施方案中，聚烯化亞胺具有至少 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、 5000,5500 或 6000D，且小于約 2，000，000、1，000，000,500, 000,250, 000、100，000,75, 000、 50，000和25，000D的分子量。在100至2，000，000D的范圍內，預期較低和/或較高的范圍可以分別地以100增加或減少，各個所得的子范圍是本發明明確涉及的實施方案。在本發明的其他實施方案中，載體是相對短的聚賴氨酸或聚乙烯亞胺(PEI)主鏈(其可以是線性的或分支的)并且其具有帶正電荷的分支基團。不希望被理論約束，據信， 此類載體可用于最小化主鏈和治療組合物中的肉毒桿菌毒素的不受控制的聚集，所述聚集導致運輸效率顯著降低。當載體是相對短的線性聚賴氨酸或PEI主鏈時，所述主鏈具有小于75，000 D，更優選小于30，000 D，和最優選小于25，000 D的分子量。然而當載體是相對短的分支的聚賴氨酸或PEI主鏈時，所述主鏈具有小于60，000 D，更優選小于55，000 D，和最優選小于50，000 D的分子量。在一個特別有趣的實施方案中，非天然分子是陽離子肽，其沒有固有的肉毒桿菌毒素樣活性，并且還包含一個或多個蛋白轉導結構域，如本文描述的。不希望被任何特定科學理論束縛，據信所述肽在注射后增強復合物中結合的分子的組織滲透性，同時增強皮膚中和體外的肉毒桿菌毒素的穩定性。據信，由這些肽賦予的增強的組織滲透性特別地提供了減少的抗原性，更好的安全特征，增強的效力，臨床功效的更快開始或更長的臨床功效持續時間，與常規的市售可得的與外源白蛋白結合的肉毒桿菌毒素復合物(例如BOTOX 或 MY0BL0C )相比。在優選實施方案中，本發明的組合物中帶正電荷的載體的濃度足以增強肉毒桿菌毒素至分子靶，諸如例如運動神經板的遞送。此外，不希望被理論束縛，據信滲透速率遵循受體介導的動力學，從而組織滲透性隨著滲透增強分子的量的增加而增加，直至飽和點，之后運輸速率變成常數。因此，在優選實施方案中，添加的滲透增強分子的量等于正好飽和前最大化滲透速率的量。如本文所述的，本發明的可注射的組合物中帶正電荷的載體的有用的濃度范圍為約0. Ipg至約1. Omg/單位肉毒桿菌毒素組合物。更優選，本發明的局部組合物中帶正電荷的載體以約1. Opg至0. 5mg/單位肉毒桿菌毒素存在。本發明的組合物優選為允許注射入受試者或患者(即，需要具體治療的人或其他哺乳動物)的皮膚或上皮的形式。術語"需要"意欲包括藥學或健康相關需要(例如治療病狀，包括不希望的面部肌肉痙攣)，及美容和主觀需要(例如改變或改進面部組織的外觀)。在優選實施方案中，通過將肉毒桿菌毒素(包含相關非毒素蛋白或減少的相關非毒素蛋白)和帶正電荷的載體混合來制備組合物，并且通常混合一種或多種另外的藥學上可接受的載體或者賦形劑。在它們的最簡單的形式中，它們可以包含水性的藥學上可接受的稀釋劑，諸如緩沖鹽水(例如磷酸鹽緩沖的鹽水)。然而，組合物可以包含通常在可注射的藥物或藥妝組合物中發現的其他成分，包括皮膚病學或藥學上可接受的載體、媒介物或介質， 其與將要施用的組織相容。如本文使用的，術語"皮膚病學或藥學上可接受的"指，所述的組合物或其組分適合用于與這些組織接觸或適合用于患者，而通常不具有不適當的毒性、 不相容性、不穩定性、變應性應答等等。需要時，本發明的組合物可以包含通常用于所涉及的領域，特別地用于化妝品和皮膚病學中的任何成分。根據它們的形式，本發明的組合物可以包括溶液、乳劑(包括微乳劑)、懸浮液、凝膠、粉末或其他的一般的固體或液體組合物，其用于注射至所述組合物可以使用的肌肉及其他組織。在優選實施方案中，本發明的組合物存在于適用于注射器注射的低粘度、無菌的制劑中。本發明的組合物可以是凍干粉末形式，其在注射前用藥學上可接受的液體稀釋劑重構。在某些實施方案中，用液體稀釋劑重構凍干粉末以形成可注射的制劑，該制劑具有約0. 1至約2000cP，更優選約0. 2至約500cP，更優選約0. 3至約50cP，更優選約0. 4至約 2. OcP的粘度。本發明的組合物除肉毒桿菌毒素和帶正電荷的載體之外，還可以包含通常用于此類產品的其他成分，諸如抗微生物劑、水化劑、組織膨脹劑(tissue bulking agent)或組織填充劑、防腐劑、乳化劑、天然或合成的油、溶劑、表面活性劑、清潔劑、膠凝劑、抗氧化劑、填充劑、增稠劑、粉末、粘度控制劑和水，并且任選地包括麻醉劑、抗癢活性劑、植物提取物、調理劑、礦物質、多酚、硅酮或其衍生物、維生素和植物藥(phytomedicinals)。本發明的可注射的組合物可以為控釋或緩釋組合物的形式，其包含被封裝或否則包含在材料內的肉毒桿菌毒素和帶正電荷的載體，以便它們以受控的方式隨時間在組織內釋放。包含肉毒桿菌毒素和帶正電荷的載體的組合物可以包含在基質、脂質體、囊、微膠囊、 微球體等內，或在固體顆粒材料內，其都被選擇和/或構建以使肉毒桿菌毒素隨時間釋放。 肉毒桿菌毒素和帶正電荷的載體可以一起被封裝(即在相同的膠囊中)或分別封裝(即在分開的膠囊中)。本發明的肉毒桿菌毒素制劑可以以產生麻痹、產生松弛、減輕收縮、防止或減輕痙攣、減少腺的排出量(glandular output)、或產生其他期望效果的有效量，通過注射(一般使用注射器)遞送至皮膚下的肌肉，或遞送至皮膚內的腺結構。用這樣的方式局部遞送肉毒桿菌毒素可以減少劑量、減少毒性并且允許針對期望的效果進行更精確的劑量優化(與可注射的或可植入的材料相比)。施用本發明的組合物以遞送有效量的肉毒桿菌毒素。如本文使用的，術語"有效量"指上文定義的肉毒桿菌毒素的量，其足以產生期望的肌肉麻痹或其他生物學或美容效果，并且明確地是安全量，即低至足以避免嚴重的副作用的量。期望的效果包括某些肌肉的松弛，其目的例如在于減少細紋和/或皺紋的出現(特別是在面部)，或以其他方式調整面部外觀，例如擴大眼睛、提升嘴角、或使從上唇散開的細紋變平滑，或肌肉緊張的一般緩解。上述的最后一種效果，肌肉緊張的一般緩解可以在面部或其他部位實現。本發明的組合物可以包含合適的有效量的肉毒桿菌毒素，用于以單劑量治療形式施用，或可以是更濃縮的，用于在施用時稀釋或用于多次施用。通過使用本發明的帶正電荷的載體，可以通過注射至受試者來施用肉毒桿菌毒素，從而治療病狀，例如皺紋、不希望的面部肌肉或其他肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或其中期望緩解肌肉酸痛或痙攣的體內其他部位的病狀。通過注射至肌肉或注射至其他皮膚相關結構或其他靶組織結構，施用肉毒桿菌毒素。可以施用至例如，腿部、肩部、背部(包括腰部)、腋窩、手掌、足部、頸部、面部、腹股溝、手或足的背部、肘部、上臂、膝蓋、大腿、臀部、軀干、骨盆或期望對其施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其他部位。還可施用本發明的包含肉毒桿菌毒素的可注射的組合物以治療其他病狀，包括對于其而言阻止乙酰膽堿的突觸傳遞或釋放可以帶來治療益處的任何病狀。例如，可以通過本發明的組合物治療的病狀包括但不限于，神經性疼痛、偏頭痛或其他頭痛、膀胱過度活動癥、鼻炎、鼻竇炎、痤瘡、張力障礙、張力障礙收縮(不論主觀的或臨床的)、多汗癥(不論主觀的或臨床的)、和通過膽堿能神經系統控制的一種或多種腺分泌過多。本發明的組合物還可用于減少或增強免疫應答，或治療對于其而言已經提出或進行注射施用肉毒桿菌毒素的其他病狀。最優選，由醫師或其他保健專業人員或在其指導下施用所述組合物。可以在單次治療中施用或在一段時間內在系列治療中施用它們。在優選實施方案中，在期望獲得與肉毒桿菌毒素相關的效果的部位注射本發明的組合物。因為它的性質，優選以產生期望的結果而不產生任何不利的或不希望的結果的量、施用速率和頻率施用肉毒桿菌毒素。例如，在某些實施方案中，以約IU至約20，000U，優選約IU至約10，000U肉毒桿菌毒素/平方厘米皮膚表面的比率施用本發明的組合物。可以使用這些范圍內的較高劑量，例如在將肉毒桿菌毒素和控釋材料一起施用的情況下，如本文描述的。在某些實施方案中，施用本發明的肉毒桿菌毒素制劑以提供1至400U，更優選10至350U，更優選30至250U和最優選50至 200U的肉毒桿菌毒素/注射。本發明還涉及各種遞送裝置用于注射本文所述的包含肉毒桿菌毒素的組合物通過皮膚的用途。所述裝置可以包括但不限于，針和注射器，或可以包括能夠分配所述組合物和監控所述組合物的分配，和任選地在一個或多個方面監控受試者的狀況(例如監控受試者對分配的物質的反應)的更先進的裝置。在一些實施方案中，可以預配制和/或在此類遞送裝置中預裝配組合物。本發明還涉及這樣的實施方案，其中在試劑盒中提供組合物，所述試劑盒儲存一種或多種與其他組分分開的組分。例如，在某些實施方案中，本發明提供試劑盒，所述試劑盒分開儲存肉毒桿菌毒素和帶正電荷的載體，它們在施用時或施用前組合。帶正電荷的載體的量或這些分子對肉毒桿菌毒素的濃度比取決于選擇用于所討論的組合物的載體。在給定的情況下，可以容易地確定載體分子的合適的量或比率，例如通過進行一種或多種如下所述的實驗。通常，本發明還涉及用于將肉毒桿菌毒素(可選地，肉毒桿菌毒素復合物或縮減的肉毒桿菌毒素復合物)施用至有此需要的受試者或患者的方法，其中有效量的肉毒桿菌
毒素與帶正電荷的載體一起施用，如本文所述的。"與......一起"指，兩個組分(肉毒桿
菌毒素和帶正電荷的載體)在組合過程中施用，其可以包括在施用至受試者前組合它們， 或分開地施用它們，但以使得它們共同起作用以提供有效量的治療蛋白的必要遞送的方式進行施用。例如，可以首先施用包含帶正電荷的載體的組合物至受試者的皮膚，然后應用包含肉毒桿菌毒素的皮膚貼劑、注射器或其他裝置。肉毒桿菌毒素可以以干燥形式儲存于注射器或其他分配裝置中，并且可以在施用毒素前，注射帶正電荷的載體，以便兩者共同起作用，產生期望的組織滲透增強。因此，在該情況下，兩種物質(帶正電荷的載體和肉毒桿菌毒素)組合地起作用或可能地相互作用，形成原位的組合物或組合。因此，本發明還包括試劑盒，其具有用于分配肉毒桿菌毒素的裝置和包含帶正電荷的載體的液體、凝膠等，而且其適于注射至受試者的皮膚或靶組織。用于在衛生保健專業人員指導下或由患者或受試者施用本發明的組合物的試劑盒，還可以包括適用于該目的的常規的施用器。本發明的組合物適于在具有約4. 5至約6. 3的pH的生理環境中使用，并且因此可以具有所述PH。本發明的組合物可以在室溫下或在制冷條件下儲存。應理解，本文描述的下列實施例和實施方案僅用于舉例目的，并且其各種修飾或改變對本領域技術人員來說是顯然的，并且包括在本申請的精神和范圍內和在附加的權利要求的范圍內。本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用完整并入本文，用于所有目的。實施例1小鼠模型中局部肌肉麻痹的持續時間本實施例比較用RT003或BOTOX 注射的小鼠中局部肌肉麻痹的持續時間。 RT003是本發明的示例性的可注射的制劑，其包含A型肉毒桿菌毒素(經純化以除去所有內源性非毒素蛋白)和具有序列RKKRRQRRRG-⑷15_GRKKRRQRRR的帶正電荷的載體。BOTOX
14也包含A型肉毒桿菌毒素，但是添加外源白蛋白以穩定A型肉毒桿菌毒素分子。使用趾外展評分(DAS)分析測量肌肉麻痹，如Aoki，K. R.在〃 A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A,B禾口F in mice" ,Toxicon 2001 ；39 (12) :1815-1820中報道的。在DAS分析中，通過其尾部簡單地懸吊小鼠，以引起特征性震驚反應，其中小鼠伸展其后肢并且外展它的后趾。以五分制(從0-4)對小鼠能夠表現震驚反應的程度進行評分，O表示正常震驚反應而4表示趾外展和腿伸長的最大減少。由觀察者進行評分，所述觀察者不知道受試小鼠用神經毒素處理的程度。使用DAS分析的基線評分針對未經處理的動物群體確定為0. 4。該實施例中報告的研究包括10只動物(RT003組的5只小鼠和BOTOX 組的5只小鼠)。用分別的肉毒桿菌毒素制劑(即RT003或BOTOX )注射每只動物三次，每次給藥之間間隔40天。注射后，計數每個實驗組中的所有動物都在DAS分析的0. 4基線以上的天數。圖1中所示的結果表明，在第一、第二和第三次處理后，RT003處理組的DAS分析評分保持在0. 4基線值以上的天數分別為25、22和21天。相反，在第一、第二和第三次處理后，BOTOX 處理組的DAS分析評分保持在0. 4基線值以上的天數分別為11、8和11天。DAS分析的數據表明，由RT003制劑引起的局部肌肉麻痹持續大約由BOTOX 引起的局部肌肉麻痹的兩倍長。該結果對于RT003及本發明的其他可注射的包含肉毒桿菌毒素的化合物的治療用途具有重要的意義。特別地，通過使用本發明的可注射的組合物，可以顯著地減少保持由肉毒桿菌毒素引起的具體美容或治療效果所需要的隨后注射的頻率。進一步，減少的施用頻率可以導致更好的長期功效，因為受試者較不易于產生抗肉毒桿菌毒素的抗體。實施例2具有改善的安全特征的可注射的肉毒桿菌毒素制劑在近幾十年來，肉毒桿菌毒素已經用作治療多種病狀(包括皺紋、多汗癥和肌肉痙攣)的治療劑。然而，因為肉毒桿菌毒素是人類已知的最有效的天然存在的毒素，因此不適當的施用該毒素可能非常危險。例如，意外地全身遞送肉毒桿菌毒素可以導致麻痹、呼吸困難、甚至死亡。此外，即使作為治療的一部分，將肉毒桿菌毒素適當地遞送至身體的局部區域，該毒素具有天然的隨時間擴散的趨勢，從而增加身體其他部位中不想要的麻痹的風險。例如，當將肉毒桿菌毒素注射至眼睛周圍以治療皺紋時，它可能擴散至控制眼瞼運動的肌肉。如果發生該情況，那么眼瞼肌肉可能變得部分麻痹，導致公知的被稱為"眼瞼下垂" 的病狀，其中眼瞼部分地閉合并且干擾正常視覺。本發明的一方面是提供可注射的肉毒桿菌毒素制劑，其與目前市售可得的肉毒桿菌毒素制劑相比具有改善的安全特征。在優選實施方案中，可注射的肉毒桿菌毒素制劑具有減少的注射后擴散傾向。因此，本發明的某些優選的制劑允許更精確地遞送肉毒桿菌毒素，顯著地減少不想要的與肉毒桿菌毒素的不受控制的局部擴散相關的副作用。本實施例報道了注射后各種制劑中的肉毒桿菌毒素的擴散傾向的對比研究。該研究包括三種肉毒桿菌毒素制劑(1) BOTOX ; (2)RT003，包含與具有式 RKKRRQRRRG-⑷15_GRKKRRQRRR的帶正電荷的載體非共價結合的150kD A型肉毒桿菌毒素分子的經緩沖和穩定的溶液；和C3)RTT150，除了不包含存在于RT003中的帶正電荷的載體外，其與RT003制劑相同。
在肌肉的中線旁側部分(圖2A)或在肌肉的中線部分(圖2B)，用上述的肉毒桿菌毒素制劑之一注射該研究中使用的每只小鼠的腓腸肌肌肉。注射肉毒桿菌毒素后，對每只小鼠進行4天的DAS分析，以確定各個制劑的肉毒桿菌毒素是否表現出從腓腸肌肌肉向小鼠的后爪擴散的任何傾向。根據DAS分析，將測試動物外展其后趾的能力的任何降低解釋為表示肉毒桿菌毒素擴散。圖3顯示了用如上所述的不同的肉毒桿菌毒素制劑注射測試動物后進行的DAS分析的結果。注意，將趾外展評分分為兩組，對應于注射是在腓腸肌肌肉的中線部分還是在中線旁側部分。與中線旁側注射的DAS評分相比，中線注射的通常較低的DAS評分表明，中線注射后測試動物的后爪的麻痹程度通常較輕。不希望被理論束縛，據信，該結果是由于與中線旁側注射相比，中線注射后肉毒桿菌毒素必須經過較長的距離才能到達測試動物的后趾。據認為，運送肉毒桿菌毒素所需要的更長的距離降低了后趾麻痹的可能性。圖3表示，在RT003制劑的中線注射后4天，趾外展評分全部都為零。該結果表明，RT003制劑中的肉毒桿菌毒素在注射后保持停留在腓腸肌肌肉的中線部分中，并且在實驗的時間段中沒有發生引起麻痹的擴散。相反，在注射RTT150和BOTOX 制劑后，觀察到0. 4DAS基線以上的趾外展評分，并且BOTOX 制劑的平均DAS評分更高。RTT150和 BOTOX 制劑的DAS結果表明，在中線注射這些制劑后，觀察到了測試動物的后趾麻痹，并且在注射BOTOX 制劑后觀察到的麻痹程度更高。這些數據表明，RTT150和BOTOX 制劑中的肉毒桿菌毒素分子在注射后能夠局部擴散，并且BOTOX 制劑中的肉毒桿菌毒素分子的局部擴散程度更高。圖3還表明，在中線旁側注射后在所有測試動物中都觀察到了后趾麻痹，與具體的肉毒桿菌毒素制劑無關。如上所述，與中線注射相比，中線旁側注射后更高的麻痹程度被認為與肉毒桿菌毒素至測試動物后爪的較短的運輸距離有關。然而，雖然中線旁側注射后， 所有三種肉毒桿菌毒素制劑都表現出引起麻痹的擴散，但平均來看，在實驗的時間段內與對于RTT150和BOTOX 制劑所觀察到的麻痹程度相比，注射了 RT003的測試動物中的麻痹程度較輕。因此，對應于中線旁側注射的DAS分析數據定性地與中線注射的數據類似，其顯示與RTT150和BOTOX 相比，RT003制劑的肉毒桿菌毒素的局部擴散傾向降低。可以通過考慮稱為"擴散指數"的參數來進行中線注射和中線旁側注射后的局部擴散速率的比較，所述擴散指數由下式(1)定義
,散指數=二=(1) 中線旁側恥外展評分因為趾外展評分可以為0至4，并且預期中線旁側的趾外展評分比中線的趾外展評分高(如上文所述的)，擴散指數值一般為0至100。接近100的擴散指數值表明，中線和中線旁側的趾外展評分的比接近一致。如果注射后擴散速率足夠高，使得中線和中線旁側注射后，肉毒桿菌毒素到達測試動物的后趾并且使其麻痹的擴散時間相當或者幾乎相同， 則可發生上述情況。在另一個極端的情況中，接近零的擴散指數值表明，中線和中線旁側的趾外展評分的比接近零。如果中線注射后肉毒桿菌毒素的擴散太低以致不足以引起測試動物的后趾麻痹(即使中線旁側注射后觀察到了麻痹)，則可發生上述情況。表1顯示了使用中線或中線旁側注射BOTOX 、RT003和RTT150后的趾外展評分
16計算的擴散指數值，如對應于圖3的實驗所報道的。在實驗的時間段內，對應于BOTOX 制劑注射的擴散指數值比對于RTT150和RT003制劑所觀察到的值更高。這表明，與對于 RTT150和RT003制劑所觀察到的比率相比，對于注射BOTOX 制劑，中線和中線旁側的趾外展評分的比率更接近一致。因為中線注射后肉毒桿菌毒素必須擴散更遠以引起測試動物的后趾麻痹，BOTOX 注射后中線和中線旁側的趾外展評分的比值更接近一致的觀察結果表明，相對于中線旁側注射后的速率，中線注射BOTOX 后的肉毒桿菌毒素擴散速率相當顯著。換言之，與中線注射相關的增加的擴散途徑長度對引起后趾麻痹阻礙較少。
相反，在4天的實驗時間段內，RT003的擴散指數值全部為零。該結果表明，在中線注射RT003后，沒有觀察到引起麻痹的擴散。換言之，包含與帶正電荷的載體非共價結合的A型肉毒桿菌毒素分子的RT003制劑允許增強注射的A型肉毒桿菌毒素的局部定位。由此可見，RT003制劑賦予與BOTOX 制劑相比改善的安全特征并且最小化不想要的麻痹。
觀察到的RTT150的擴散指數值，雖然不像RT003那樣為零，但仍然比對于 BOTOX 制劑所觀察到的值小[參見表1]。該結果表明，在4天的實驗時間段內，發生了足以產生可觀察的后趾麻痹的肉毒桿菌毒素擴散，但是在中線注射后肉毒桿菌毒素的引起麻痹的擴散所需的時間相對更長。 表1 RTT150、BOTOX 和RT003的肉毒桿菌毒素擴散指數的測量。
權利要求
1.給有此需要的個體施用肉毒桿菌毒素以實現治療或美容效果的方法，所述方法包括給個體注射有效量的組合物以實現治療或美容效果，其中所述組合物包含帶正電荷的載體，其包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與其連接的多個效能基團， 肉毒桿菌毒素復合物，縮減的肉毒桿菌毒素復合物，或肉毒桿菌毒素，并且其中所述帶正電荷的載體與所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素非共價結合。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素獲自肉毒桿菌血清型A、B、C、D、E、F或G。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的主鏈包含聚氨基酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述聚氨基酸選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸和聚鳥氨酸。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述效能基團包含選自下列的氨基酸序列 (gly) nl" (arg) n2，HIV-TAT或其片段，觸角足蛋白的蛋白轉導結構域或其片段，(gly) p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q,或(gly) p-RKKRRQRRR-(gly),和 SGRQIKIffFQNRRMKffKKC ；其中下標nl是0至20的整數，下標n2獨立地是約5至約25，更優選約7至約17，最優選約7至約13的奇整數；和其中下標P和q各自獨立地是0至8的整數。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體穩定肉毒桿菌毒素，防止降解。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體減少注射后肉毒桿菌毒素的局部擴散。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG- (K) 15_GRKKRRQRRR。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述組合物在注射入受試者的身體后，與 BOTOX 相比，具有減少的誘導抗體產生的傾向。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述美容效果是治療皺紋。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述治療效果是減少與選自下列的病癥相關的癥狀偏側面肌痙攣、成年人發病的痙攣性斜頸、肛裂、眼瞼痙攣、大腦性癱瘓、頭痛、斜視、 顳下頌關節障礙、神經性疼痛、膀胱過度活動癥、鼻炎、鼻竇炎、痤瘡、張力障礙、張力障礙收縮、多汗癥和通過膽堿能神經系統控制的腺分泌過多。
12.制備可注射的肉毒桿菌毒素制劑的方法，所述方法包括提供有效量的肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素； 提供帶正電荷的載體，其包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與其連接的多個效能基團；將所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的載體和藥學上可接受的稀釋劑組合。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素獲自肉毒桿菌血清型A、B、C、D、E、F或G。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述帶正電荷的主鏈包含聚氨基酸。
15.根據權利要求11所述的方法，其中所述聚氨基酸選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸和聚鳥氨酸。
16.根據權利要求9所述的方法，其中所述效能基團是選自下列的氨基酸序列 (gly) nl" (arg) n2，HIV-TAT或其片段，觸角足蛋白的蛋白轉導結構域或其片段，(gly) p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q,或(gly) p-RKKRRQRRR-(gly),和 SGRQIKIffFQNRRMKffKKC ；其中下標nl是0至20的整數，下標n2獨立地是約5至約25，更優選約7至約17，最優選約7至約13的奇整數；和其中下標P和q各自獨立地是0至8的整數。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體穩定肉毒桿菌毒素，防止降解。
18.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體減少注射后肉毒桿菌毒素的局部擴散。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所述帶正電荷的載體具有氨基酸序列 RKKRRQRRRG- (K) 15_GRKKRRQRRR。
20.根據權利要求1所述的方法，其中所述制劑在注射入受試者的身體后，與BOTOX 相比，具有減少的誘導抗體產生的傾向。
21.無菌的可注射的組合物，其包含有效量的肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素；和帶正電荷的載體，其包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與其連接的多個效能基團； 其中所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的載體非共價結合。
22.注射器，其包含有效量的肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素；和帶正電荷的載體，其包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與其連接的多個效能基團； 其中所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的載體非共價結合。
23.重構的肉毒桿菌毒素組合物，其包含有效量的肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素；和帶正電荷的載體，其包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與其連接的多個效能基團；和藥學上可接受的水性液體稀釋劑，其中所述肉毒桿菌毒素復合物、縮減的肉毒桿菌毒素復合物或肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的載體非共價結合，并且其中所述重構的肉毒桿菌毒素組合物具有約0. 4至約2. OcP的粘度。
全文摘要
本發明提供新的包含肉毒桿菌毒素的可注射的組合物，其可以施用于受試者以用于多種治療、美容和/或化妝目的。本發明涉及的可注射的組合物與常規的肉毒桿菌毒素制劑相比，表現出一種或多種優點，包括減少的抗原性，注射后減少的不想要的局部擴散的傾向，增加的臨床功效持續時間或相對增強的效力，臨床功效的更快開始，和/或改善的穩定性。
文檔編號A61K39/08GK102300584SQ200980155549
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月28日 優先權日2008年12月31日
發明者C·L·魯格, H·F·斯通, J·M·沃 申請人:雷文斯治療公司