離體被動保護菌血癥實驗的制作方法

專利名稱：離體被動保護菌血癥實驗的制作方法
技術領域：
本披露涉及針對細菌的抗體的殺菌活性的實驗。背景奈瑟氏腦膜炎菌是一種共生生物，常見于健康青少年喉部，可侵入血流，導致腦膜炎或快速致死性敗血癥，是嚴格的人類病原體。腦膜炎球菌疾病的可靠動物模型難以開發。 許多在人類中高度致病的有莢膜的奈瑟氏腦膜炎菌在如兔、小鼠和大鼠等常用實驗動物的血流中容易被清除。清除可能部分是由于細菌蛋白fH結合蛋白(fHbp)所導致，該蛋白與下調補體激活的人補體因子H(fH)相結合。人fH與細菌的結合增強了生物體對補體介導的細菌殺傷的耐受性，可能是使奈瑟氏腦膜炎菌繞過宿主天然防御的重要機制。對于奈瑟氏淋球菌，fH的結合局限于人fH，這可能部分解釋了天然淋球菌感染的種屬特異性限制 ((Ngampasutadol, J.等人(2008) J Immunol 180:3426-3435)。相當多數據表明，血清中補體介導的殺菌抗體提供了針對腦膜炎球菌病的保護 (Goldschneider,I.等人(1969) J Exp Med 129 :1307_1326 ;Goldschneider 等人(1969) J Exp Med 129 1327-1348 ；Borrow,R.等人(2005)Vaccine 23:2222-2227 ；Balmer,P.等人 (2004)Expert Rev Vaccines 3 77-87 ；Andrews, N^A (2003)Clin Diagn Lab Immunol 10 780-786 ；Borrow, R.等人(2001) Infect Immun 69:1568-1573)。例如，在一項開創性的研究中，Goldscheider等人在招募新兵中研究了血清中補體介導的殺菌性抗體對流行性 C 組腦膜炎球菌病的抵抗能力(Goldschneider 等人.1969，J Exp Med 129(6) 1307-26 ； Goldschneider 等人· 1969，J Exp Med 129(6) :1327_48)。在超過 14，000 的受試者中，82% 具有的針對流行性菌株的血清殺菌滴度> 1 4，但是隨后患上腦膜炎球菌病的53人中有 51人的血清殺菌滴度<1 4。作者認為， 4的滴度能防御該病，但也指出估算的滴度<1 4的2600位招募新兵中，許多人很可能暴露于流行性菌株中卻沒有發病。事實上， SBA滴度<1 4的一小組招募新兵中，有超過半數都被發現在喉部攜帶有C組流行菌，但是卻沒有發病。因此，盡管滴度 4能提供保護，但是滴度< 1 4也未必就是疾病易感性的指標。英國近期的一項研究報道指出，在1至10歲年齡段中，B組腦膜炎球菌病的發生率降低，但卻沒有發現B組血清殺菌滴度> 1 4的普遍性有相應的提高(Trotter等人， (2007)Clin Vaccine Immunol 14(7) :863_8)。該研究還發現在年輕人中血清抗菌活性滴度的普遍性(約50%)比Goldschneider研究報道的(約80%至90%)低。在北美或歐洲其它國家的其它最新研究也確認，成人中SBA滴度> 1 4相對并不常見(取決于菌株，成人通常是 10 至 25% ) (Mitchell 等人，1996，J Infect Dis 173(4) 1009-13 Jones 等人.2000，J Infect Dis 181(3) 1172-5 ；Welsch and Granoff, 2004, Infect Immun 72 (10) 5903-9 ；Amir 等人· 2005，Vaccine 23 (8) :977_83 ；Granoff 等人· 2005，Pediatr Infect Dis J 24(2) :132_136)。因此，盡管SBA滴度≥1 4在1960年代很普遍，但現在的普遍性低了很多，但是腦膜炎球菌病的發生率卻沒有相應上升(從2000年以來美國的發病率是過去50年中最低的)。綜上，這些血清流行病學數據與防御腦膜炎球菌病需要血清殺菌滴度 4的假說不一致。另外的假說包括，在血清稀釋度< 1 4時通過補體介導的殺菌抗體保護，和/或在缺乏SBA時通過調理素的活性提供保護。已經開發出了對A組和C組殺菌實驗的一些標準操作方法，其補體來源使用幼兔血清而不是人血清(Maslanka, S. Ε.等人.(1997)Clin Diagn Lab Immunol 4:156-167; Jodar，L.等人· (2000)Biologicals 28 :193_197)。為了標準化后更加方便，所以在這些操作方法中選擇了兔補體，但是多年以來已經公知，相比于人補體測得的滴度，兔補體會提高血清殺菌滴度(Zollinger, W. D.等人.(1983) Infect Immun 40 257-264 ；Santos,G. F.等 A · (2001)Clin Diagn Lab Immunol 8:616-623)。盡管用兔補體測得的血清殺菌滴度與在大量人群中進行的腦膜炎球菌免疫的效力相關聯(Borrow，R.等人.(2005)Vaccine 23 2222-2227 ；Balmer, P.等人 1. (2004)Expert Rev Vaccines 3 -JlSl ；Andrews and Borrow (2003) Cl in Diagn Lab Immunol 10 :780_786)，但是如果用人補體測試，許多這些血清將不具有殺菌活性。因此，用兔補體觀察到的關聯性可能不能準確或完全反映出用疫苗誘導的抗體提供保護性的真實機制。全血殺菌實驗(WBA)用來測試兒童(Isonet al. (1999)Microb Pathog 27(4) 207-14)和成人(Findlow 等人.(2006) Infect Immun 74(8) :4557_65)對腦膜炎球菌免疫的天然獲得性免疫(Ison 等人.(2003)PediatrInfect Dis J 22(10) :868_73 ;Ison 等人.(1995)Microb Pathog 18(2) 97-107)或抗體反應。該實驗使用每個免疫個體在免疫之前和之后獲得的新鮮血液樣品。正如Findlow等人(2006)指出的那樣，用WBA測試疫苗反應并不現實，因為每個實驗中都需要新鮮血液，而且不能使用保存的血液或血清樣品進行所描述的實驗。因此，使用臨床實驗的個體或病人的新鮮全血樣品來評價疫苗產生的殺菌抗體是不現實的或不可能的。例如，根本不可能在同樣的實驗條件下將個體新鮮全血中的免疫前殺菌抗體與同一個體的新鮮全血中的免疫后殺菌抗體相比較，因為在能夠獲得免疫后樣品時，免疫前血液已不再“新鮮”。而且，在單獨測試兩份樣品的滴度是否不同時，在不同天分別測定比兩者同時測定的準確性要低。調理素的活性也被用于評價用血清殺菌活性實驗不能測出的針對奈瑟氏腦膜炎菌的保護性抗體(Ross 等人.1987，J Infect Dis 155 (6) 1266-75 ;Halstensen 等人· 1991，NIPH Annl4(2) 157-65 ；討論 166-7 ；Lehmann 等人· 1991，Apmis 99(8) :769_72 ； Guttormsen 等人· 1993，J Infect Dis 167 (6) 1314—9 ;Aase 等人· 1995，Infect Immun 63(9) 3531-6 ；Aase 等人.1998，Scand J Immunol 47(4) :388_96 ；Lehmann 等人.1999， Infect Immun 67(12) :6526_32 ;Naess 等人· 1999，Vaccine 17(7-8) :754_64 ;Quakyi 等 A · 1999, J Infect Dis 180(3) :747_54 ;Rosenqvist 等人· 1999，Infect Immun 67(3) 1267-76 ；Plested 等人.2001，Infect Immun 69(5) :3203_13 ；Martinez 等人.2002，Clin Diagn Lab Im munol 9(2) 485-8 ；Borrow ^A · 2006, Vaccine 24(24) 5093-107 ； Romero-Steiner 等人· 2006，Clin Vaccine Immunol 13(2) : 165-9 ;Plested 等人· (2008) Clin Vaccine Immunol 15(5) 799-804) 0該實驗通常測試被加熱而去除內源補體活性的測試血清，其中加入外源兔或人血清作為補體來源，加入分級或未分級的外周血單核白細胞或組織培養中生長的單核細胞系作為吞噬細胞性效應細胞。可以在同一 OPA實驗中測試來自于一個個體的配對的免疫前和免疫后血清，或使用不同疫苗的多人的多組血清，因此， 用OPA要比用前面描述的WBA更能夠確定免疫后滴度的變化，或組間疫苗反應的差別。然而，OPA實驗中通常用的反應混臺物中含有作為補體來源的稀釋的非免疫血清(通常5%、 10%或20% )。因此，檢測OPA殺菌活性的結果可能沒有WBA的結果靈敏。發明概述本披露提供了測試生物樣品中的殺菌抗體的方法，通過使用未免疫人的人新鮮全血作為實驗的反應媒介。在某些實施方式中，檢測生物樣品中殺菌抗體的方法包括在反應混合物中混合疑似含有殺菌抗體的生物樣品、感興趣的革蘭氏陰性病原活菌和來源于未免疫的人供體的新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對感興趣的病原菌殺菌抗體，其中所述人生物樣品取自的人不是未免疫的人供體，其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑，以及通過評價革蘭氏陰性菌的存活，檢測樣品中是否存在或缺乏殺菌抗體，其中在生物樣品存在時，所述革蘭氏陰性菌存活降低則表明所述樣品中含有殺菌性抗菌抗體。在某些情況下，所述生物樣品是人血清。在特別的例子中，所述生物樣品是人血漿。在某些情況下，所述生物樣品是抗體分泌細胞的上清。在其它實施方式中，所述生物樣品是小鼠血清。在特別實施方式中，所述反應混合物中的所述生物樣品是免疫前的生物樣品，所述方法還包括在單獨的反應混合物中混合疑似含有殺菌抗體的免疫后生物樣品，其中所述免疫后樣品和所述免疫前樣品取自于同一個個體，且其中所述免疫后樣品在將免疫原性組合物給藥于所述個體后獲得；感興趣的革蘭氏陰性活菌；新鮮人全血， 其不含有可檢測的、能有效針對感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于未免疫的人供體，其中所述人生物樣品取自的人不是未免疫的人供體，且其中新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑；以及所述檢測包括，通過評價樣品中細菌的存活，檢測免疫前樣品和免疫后樣品中是否存在或缺乏殺菌抗體，其中與免疫前樣品相比， 在免疫后樣品中存在或缺乏殺菌抗體則表明給藥于個體的免疫原性組合物引起針對革蘭氏陰性菌的殺菌抗體的能力。在示例的實施方式中，所述革蘭氏陰性細菌是奈瑟氏細菌，所述免疫原性組合物包括旨在引起抗奈瑟氏菌抗體的抗原。在特別的例子中，所述奈瑟氏細菌是奈瑟氏腦膜炎球菌。在某些實施方式中，所述免疫前樣品和所述免疫后樣品分別是免疫前血清樣品和免疫后血清樣品。在一些情況下，所述免疫前血清和免疫后血清在混合前被熱滅活。在一些例子中，所述個體是人。或者，所述個體是小鼠。也提供了篩選候選疫苗的方法。方法包括在第一種反應混合物中混合在對個體給藥含有免疫原性組合物的候選疫苗前，從個體中獲得的免疫前生物樣品；革蘭氏陰性活細菌；以及新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對所述感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于未免疫的人供體，其中所述人免疫前樣品取自的人不是所述候選疫苗將給藥的個體，且其中新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑；在第二種反應混合物中混合在所述候選疫苗給藥后，從所述個體獲得的免疫后樣品；所述新鮮人全血；所述革蘭氏陰性活細菌；以及通過評價細菌的存活，檢測每一份所述免疫前和免疫后樣品中是否存在或缺乏殺菌性抗細菌抗體。在某些情況，所述免疫前和免疫后樣品是人血清樣品。在典型示例中，所述革蘭氏陰性細菌是奈瑟氏細菌。在同樣的實施方式中，所述奈瑟氏細菌是奈瑟氏腦膜炎球菌。還提供了反應混合物，包括疑似含有殺菌抗體的生物樣品；感興趣的革蘭氏陰性活細菌；新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于未免疫的人供體，其中所述人生物樣品取自的人不是所述未免疫的人供體，且其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑。

附圖簡要說明

圖1，A部分顯示了補體介導的血清殺菌實驗的結果，血清來自用3次劑量的吸附有氫氧化鋁的3組分(5抗原)研究性重組蛋白免疫的36位健康成人(Giuliani等人， PNAS2006)。圖1，B部分顯示了測試的兩株菌株ΝΖ98Λ54和S3032的相應OPA滴度彡1 4 的結果，這兩株菌株對免疫后的人血清的SBA相對不敏感。圖2A顯示了四株代表性的奈瑟氏腦膜炎球菌株(3株B組，1株C組)與來自健康供體的全血測試孵育時的存活與生長。數據表明供體沒有針對這些菌株的殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。因此，該供體的血液適合在離體人腦膜炎球菌血癥模型中用于測試外源測試抗體或血清的被動保護活性。圖2B顯示了離體被動保護殺菌實驗(PPA)的結果，用健康未免疫供體的全血進行實驗，在上述全血中已加入SBA滴度< 1 4的供體的熱滅活血清。測試血清的最終稀釋度是1 4。一份血清在PPA中沒有殺菌活性(陰性對照)，而另一份血清來自用奈瑟氏菌 OMV疫苗免疫的個體，盡管該血清具有陰性的SBA滴度，但是在PPA測試中卻具有殺菌作用 (陽性對照)。圖3顯示了離體被動保護殺菌實驗(PPA)的結果，實驗使用未免疫供體的全血、保存的免疫前和免疫后血清(與圖1中用的36份血清組相同)、菌株NZ98/254(A部分)和菌株S3032 (B部分)。圖4顯示了離體被動保護殺菌實驗(PPA)在14位個體的免疫前和免疫后血清上對菌株NZ98/254 (A部分)和S3032 (B部分)的重復性。標記1A、2A、3A等的血清代表免疫前血清。標記1B、2B、3B的血清分別代表免疫后的血清。每個“X”代表一份獨立實驗的結果(每份樣品進行3次實驗)。圖5A顯示了 PPA測試的結果，實驗使用菌株ΝΖ98Λ54，SBA滴度< 1 4的血清和SBA滴度彡1 4的血清。對于每份血清，3個數據點是不同天進行的3次獨立實驗的結^ ο圖5B顯示PPA測試的結果，如圖5A說明中說述，實驗使用SBA滴度< 1 4的血清和SBA滴度彡1 4的血清，和菌株S3032。圖6顯示用SBA、OPA和PPA分別測試的血清的結果的比較。在描述本發明和發明的特定示例性實施方式之前，應理解本發明不限于所描述的特定實施方式，因為這顯然可以變化。還應理解本申請中所用的術語僅旨在描述特定實施方式，而非意在限制，因為本發明的范圍將僅被后附的權利要求所限制。當提到一個數值范圍時，應理解為本發明包括了范圍的上限和下限之間的每一個中間數值以及任何其他在所描述的范圍內描述到的數值或者中間數值，所述中間數值小到下限單位的十分之一，除非上下文內容另有明示。本發明還包括這些可能被獨立包括在較小范圍之內的這些較小范圍的上限和下限，在所描述到的范圍中明確排除的端值除外。當所描述到的范圍包括一個或兩個端值時，本發明的范圍也包括排除了這些包含在內的端值后的范圍。除非另有定義，本申請所用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義相同。與本申請所述的相同或等同的方法或材料也可以用于本發明的操作或測試，但本申請在此描述的為優選的方法和材料。本申請中提及的所有出版物都在本申請中被參考并入，旨在公開和描述與被引用的出版物相關的方法和/或材料。如果這些出版物提出的對某術語的定義與本公開中明確或隱含的定義相沖突，應以本公開的定義為準。必須注意的是，在本申請中和后附的權利要求中，單數形式“一”、“一個”和“所述” 包括復數對象，除非上下文另有明確指出。因此，例如，“一份樣品”的描述包括多份樣品， “細菌”的描述包括一種或多種細菌，等等。

本申清中提供對出版物的討論僅僅是為其在本申請的申請日之前的公開內容。本申請中的任何內容不得解釋為承認本發明不能通過發明在先的方式而早于這些出版物。而且，提供的出版日可能與實際出版日不同，可能需要單獨進行確認。示例性實施方式的詳細說明本披露提供了用人新鮮全血作為實驗的反應媒介來評估人血清樣品中殺菌抗體的方法。定義本申請所用的“殺菌抗體”指的是促進補體介導的殺菌作用的抗體。術語“保護性免疫”的意思是，給藥于哺乳動物的疫苗或免疫方案引發免疫反應， 該免疫反應能預防致病菌如奈瑟氏腦膜炎球菌等引起的疾病、延緩所述疾病進程、或降低所述疾病的嚴重程度，或者減少或消除全部疾病癥狀。保護性免疫可能伴隨有殺菌抗體的產生。應該注意的是，在本領域內，針對奈瑟氏腦膜炎球菌的殺菌抗體的產生被公認為預示疫苗在人體內產生了保護性效果(Goldschneider等人，1969，J. Exp. Med. 129 1307 ； Borrow 等人.2001 Infect Immun. 69 1568)。“離體”是指在宿主體外，對自然條件改變極少的人工環境中在活組織內或活組織上進行實驗或測試。“免疫前樣品，，或“暴露前樣品，，是指在個體有意暴露于抗原(例如通過將抗原給藥于個體)之前，從個體中獲得的樣品。“免疫后樣品，，或“暴露后樣品，，是指在個體有意暴露于抗原(例如通過將抗原給藥于個體)之后，從個體中獲得的樣品。“補體”是指一類血清蛋白，其能提供功能性補體級聯反應，一種促進細菌死亡的生化級聯反應。因此，本申請所用的“補體”是指一類血清蛋白，其能介導與經典途徑、旁路途徑或兩者均相關的功能性補體級聯反應，并且可以進一步包括可以介導甘露糖結合凝集素途徑的血清蛋白。概述
本披露提供了殺菌活性的離體模型，采用未免疫人供體的新鮮全血，用于檢測樣品中的殺菌抗體。因此，本披露提供了利用人全血組分來評價樣品中抗體的殺菌活性的系統。這些實驗可以用于檢測來自任何來源的殺菌抗體，例如在熱滅活血清樣品中的殺菌抗體。特別優選應用本實驗在平行實驗中檢查免疫前血清和免疫后血清中是否存在或缺乏殺菌抗體。本實驗也允許在相同對照的背景下，同時比較用不同疫苗免疫引起的殺菌性抗菌抗體的滴度，因為所有實驗均可用單一供體的血液進行。換句話說，本披露的實驗允許在同樣的反應混合物環境中平行測試多個樣品，并提供了由人補體系統和其它人血液組分介導的殺菌活性的離體模型。因為本披露公開的實驗可以用于提供樣品從血液中清除細菌的能力的相關信息，對細菌的清除通過補體介導的殺菌活性、調理素吞噬殺菌活性或者兩種機制相結合，因此全血PPA實驗在本申請中有時也被稱為“離體被動保護實驗”。個體實驗采用未免疫的人供體的新鮮全血，其中用不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑處理血液。這種類型的抗凝劑的例子包括特異性凝血酶抑制劑，如來匹盧定。雖然本披露討論了用于檢測抗奈瑟氏菌的殺菌抗體的實驗，但本申請中提供的方法也可以用于檢測針對任何感興趣的革蘭氏陰性致病菌的殺菌抗體，這些致病菌能被抗體和補體和/或吞噬細胞殺死。所述細菌可以感染人類、牲畜(例如牛、豬、家禽或魚等等)。 示例的目標細菌包括奈瑟氏菌、假單胞菌、志賀氏菌、彎曲桿菌、沙門氏菌、嗜血桿菌、螺旋體等等。尤其感興趣的致病菌是那些一旦檢測出針對其殺菌抗體的一個臨界水平就可以表明樣品來源的個體中對該致病菌的保護性體液免疫反應情況檢測殺菌性抗奈瑟氏菌抗體的實驗方法在某些實施方式中，本披露提供了檢測樣品中殺菌性抗奈瑟氏菌抗體的方法和組合物。未免疫供體的新鮮人全血本披露的實驗采用了未免疫人供體的新鮮全血。在“新鮮人全血”中使用的“新鮮血液”是指通常保存不超過約6小時、從個體獲得后通常不超過約4小時的血液。通常新鮮血液的保存使得其具有至少90%的原始溶血補體活性。新鮮血液可以在18°C至26°C保存，直至在實驗中使用。在示例的實施方式中，新鮮血液保存在環境溫度(室溫)中。“新鮮血液”包括用與本申請中描述的實驗兼容的方式處理的血液樣品(比如，力口入抗凝劑，或除去IgG，例如通過與蛋白A或蛋白G偶聯的小珠孵育，等等)。如上所述，實驗中采用的新鮮人血取自于未免疫的人供體。“未免疫”的供體是指針對特定感興趣的細菌沒有任何可檢測到的殺菌抗體的個體，其中感興趣的細菌取決于測試樣品中待測試的殺菌抗體的靶細菌(細菌)，通過采用本申請所述的未免疫供體的全血來測定。“未免疫供體”包括“未感染供體”，其中“未感染”供體是指已知沒有被暴露于待測試的細菌的人。通常，“未免疫供體”是指這樣的供體，當其全血與靶細菌菌株在37°C孵育培養90分鐘至4小時的時間后，其血液不能顯著殺菌(CFU/ml的降低低于10% )。在某些情況，在全血實驗中，“未免疫供體”的血液在90分鐘至4小時孵育期間，CFU/ml血液增加 2個IoglO數量級、增加1個IoglO數量級或增加0. 5個IoglO數量級。未免疫供體的識別通常通過獲得供體血液樣品，并測試樣品中是否存在針對于感興趣的細菌的殺菌抗體，例如奈瑟氏菌、奈瑟氏菌屬的特定菌株(例如，疫苗的目標)等等。 例如，當被測試的疫苗是用于引發針對菌株A的殺菌抗體時，可以測試未免疫供體的血液樣品中是否存在或缺乏針對菌株A的可檢測的殺菌抗體。已知含有針對菌株A的殺菌抗體的樣品可以用作陽性對照。通常，未免疫供體的血液允許感興趣的細菌的存活或生長，因為其缺乏針對細菌的可檢測或顯著的殺菌抗體。供體樣品可以用全血實驗、血清殺菌實驗、調理素吞噬實驗或這些實驗的組合或者本領域所知的其它用于檢測殺菌抗體的實驗來測試。通常，用全血實驗檢測在候選未免疫供體的全血中是否存在或缺乏殺菌抗體。在某些實施方式中，可以找出與不同樣品能產生相似結果的未免疫供體。因此，不同未免疫個體供體的血液可以用于比較不同的測試樣品。例如，在用被動保護實驗比較個體A的免疫前后樣品與個體B的免疫前后樣品中，第一位未免疫供體的血液可以用于測試個體A的樣品，第二位未免疫供體的血液可以用于測試個體B的樣品。樣品可以測試任何疑似含有殺菌抗體(例如，殺菌性抗奈瑟氏菌抗體)的樣品，例如生物樣品，比如取自于個體的(比如，血液或血液組分(比如，血清)，粘膜分泌物等等)，取自于細胞培養物的(比如，取自于抗體分泌細胞(比如雜交瘤細胞)的上清)。尤其優選疑似含有殺菌抗體的血清樣品。在示例的實施方式中，樣品可以來自于用疫苗免疫過的動物。 例如，小鼠、兔、非人靈長動物等等。樣品可以來自于感興趣的個體，尤其優選人。通常，當樣品可能含有補體時(例如，像在血清樣品中)，可以處理樣品以滅活內源補體，例如通過加熱(例如，在56°C約30分鐘)。在反應管中將不同體積(例如100 μ 1、 25yl、10yg或5μ1)未稀釋的血清加入固定體積的全血中，以實現最終稀釋度為1 4、 1 8或1 16的測試血清。樣品(例如血清樣品)也可以用緩沖液稀釋，例如Dulbecco 緩沖液等，將固定體積的稀釋后的測試血清加至固定體積的血液中，以便樣品以系列稀釋進行測試，以幫助評估抗體滴度。用于測試殺菌抗體的存在或缺失的樣品在使用前可以是新鮮的或冷凍的。當待評價的樣品是用來確定疫苗引發殺菌抗體(例如，殺菌性抗奈瑟氏菌抗體)的效力時，樣品可以在個體免疫之前和之后獲得，稱為“免疫前”和“免疫后”樣品。 可以平行測試這樣的樣品，以便在相同條件下測試這些免疫前和免疫后樣品，例如在相同供體的相同新鮮全血中。靶細菌本披露的實驗可以用來評價針對任何感興趣的革蘭氏陰性致病菌的殺菌抗體。所述實驗特別適用于評價血清中的殺菌抗體，所述殺菌抗體在本領域中被公認為表明在血清樣品取自的人個體中有保護性免疫反應。特別優選奈瑟氏菌。例如，當靶細菌是奈瑟氏菌時，任何合適的奈瑟氏菌，特別是表達表面fHbp的奈瑟氏菌，可以在本申請描述的實驗中作為用于檢測殺菌抗體的靶細菌。這種奈瑟氏菌包括奈瑟氏腦膜炎球菌和奈瑟氏淋球菌。可以根據待測試的殺菌抗體的特異性來選擇靶細菌。 例如，當實驗是用來檢測殺菌性抗奈瑟氏腦膜炎球菌抗體時，靶細菌可以是任何合適的奈瑟氏腦膜炎球菌，例如A組、B組、C組或W-135奈瑟氏腦膜炎球菌或者任何其它感興趣的有莢膜組的奈瑟氏腦膜炎球菌、表達特定感興趣的抗原(例如v. 1、v. 2或v. 3 fHbp，包括 fHbp亞變異體；PorA類型等等)的奈瑟氏腦膜炎球菌菌株。實驗可以結合使用經遺傳修飾以表達感興趣抗原的奈瑟氏菌。例如，可以挑選靶細菌以幫助分析疫苗免疫后殺菌性抗奈瑟氏菌抗體的產生。
在用于測試前，靶細菌可能用本領域已知的方法培養，例如在液體培養基(例如， Mueller-Hinton液體培養基)中或在瓊脂平板(例如，巧克力瓊脂平板)上培養。優選在實驗中使用生長至早或中對數期的細菌。如果在瓊脂平板上培養，則將細菌移出瓊脂平板并重懸。如果在液體培養基中培養，則將細菌離心并重懸。通常，可以提供需要數量的細菌， 并可以提供不同細胞數量的樣品作為對照。例如，細菌被重懸至細菌密度約為IO5至IO8菌落形成單位(CFU)/ml，通常為約^dO7CFUAil。可以選擇重懸溶液以便與檢測實驗的使用相兼容，例如，緩沖液，通常為加入了 18(12和&(12并含有如牛血清白蛋白(BSA)等蛋白的 HBSS (Hanks基礎鹽溶液)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在用于實驗前，細菌可以洗滌一次或多次以去除培養基的組分。例如，可以用緩沖液(例如，含有BSA)和/或用熱滅活血清(例如，去除IgG，例如以便不含有可檢測的IgG) 洗滌細菌。洗滌通常包括將細菌在溶液中重懸，通過離心將細菌細胞沉淀以及將細菌重懸， 例如，用實驗中使用的反應混合物緩沖液重懸。反應混合物通過以任何合適的順序混合實驗試劑(例如，含抗凝劑的新鮮全血)、測試血清以及奈瑟氏菌，以制備實驗的反應混合物。可以通過在任何合適容器中混合這些組分來制備反應混合物，如在測試管、微孔板的孔或毛細管等。反應混合物的組分應該充分混合，這可以用任何合適的方法(例如，通過攪拌)來完成。通常，實驗中使用未稀釋的熱滅活測試血清、未稀釋的血液以及盡可能小體積的包含細菌懸浮物的生理可容性緩沖液，以達到所需的CFU/ml。目的在于使產生的條件盡可能近似地模擬血清和血細胞各自在全血中濃度。反應混合物的反應體積可以變化，通常在微升至毫升的級別(例如，50μ 1、100μ 1、500μ 1、 Iml等等)。例如，可以用供體的新鮮全血和測試樣品進行實驗，其中血液和測試樣品的總體積在微升范圍內，比如，約25μ 1、50μ 1、75μ 1、100μ 1、500μ 1或1000 μ 1等等。在某些實施方式中，可以在微孔板中進行實驗。在某些實施方式中，實驗可以部分或完全自動化。可以在反應混合物中提供不同的稀釋度的測試樣品，比如，1 2、1 4、1 5、1 6、 1 8、1 IOU 12、1 14、1 16、1 18、1 20,1 22、1 24 或更高等等，優選稀釋度1 64，以及更高。反應混合物在適合補體介導的殺菌抗體活性的條件下孵育。例如，反應混合物可以孵育足夠長的時間(例如，從約15分鐘至90分鐘，約30分鐘至90分鐘等等)，以允許產生補體介導的殺菌抗體活性，以及可以在合適的溫度孵育(例如，環境溫度或生理相關的溫度(例如，約37°C))。除了測試樣品，還可以提供對照樣品。這樣的對照樣品可以包括陰性對照樣品(例如，和測試樣品條件平行，但未加入生物樣品或加入沒有可檢測的殺菌活性的抗體的樣品，等等)和/或陽性對照(例如，和測試樣品條件平行，但加入對靶細菌具有已知殺菌活性的抗體的樣品)。反應混合物可以包含與本申請所描述的實驗相兼容的其他組分。例如，可以在來自未免疫供體的新鮮全血中加入不干抗補體功能的抗凝劑。本領域已知多種這樣的抗凝劑，比如水蛭素(例如，重組水蛭素)、來匹盧定以及本領域已知的其變異體(例如，其中天然存在的氨基酸被刪除、增加或取代的變異體)。因此，在某些實施方式中，本申請所述的被動保護實驗采用不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑，即，不顯著抑制或激活補體激活或補體活性。如肝素或乙二胺四乙酸等抗凝劑會影響補體激活或補體活性。例如，肝素與多種補體蛋白結合，并因此影響經典和旁路放大途徑。肝素能抑制細胞結合放大途徑的 C3轉換酶的產生，從而抑制一部分補體級聯反應。它也通過干擾Ob上的B的結合位點，而具有補體抑制劑的活性。而且，在Ob存在時它可以阻止D對B的消耗，再次表明其對Ob 有直接作用。因此，在優選的實施方式中，可以不采用例如肝素、EDTA等會激活或干擾補體激活或補體活性的抗凝劑。在實驗中，可以將來自未免疫供體的新鮮全血、個體的免疫前樣品以及靶細菌混合，同時平行地在單獨的樣品收集區域(例如，微孔板的單獨孔或單獨容器)中，將來自同樣未免疫供體的新鮮全血、同樣個體的免疫后樣品以及靶細菌進行混合。在這樣實驗的背景下所用的“平行”的意思包括，在同一時間，以及在未免疫供體的全血仍然新鮮的時間內制備和測試這種反應混合物，例如，第一份反應混合物的制備可以比第二份混合物的制備早1小時、2小時、4小時，直到6小時。本披露的實驗適用于測試在疫苗試驗中獲得的保存的樣品。這些樣品可以在實驗期間的不同時間點獲得，例如，在第一份劑量的疫苗給藥前，在第一份劑量給藥后1個月、2 個月或3個月，第二份劑量之前和/或之后，等等。這些樣品可以是已經被熱滅活的血清樣品，樣品中的補體被滅活。這樣的樣品可以是血液組分樣品(例如血清或血漿)，其在適當條件下保存(例如，冷凍的或凍干的)以保存可能存在的任何殺菌抗體。本申請中公開用來自未免疫供體的新鮮全血進行的實驗可以用于測試多個疫苗試驗中獲得的樣品。使用單一未免疫供體的全血可以提供恒定的背景，以比較一種疫苗和另一種疫苗的效力。檢測在與測試樣品孵育后，通過評價反應混合物中奈瑟氏菌的存活，可以檢測是否存在或缺乏殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。這步的實現可以通過例如，將反應混合物在合適培養基(例如，瓊脂平板)上鋪涂，并評估菌落形成單位，將反應混合物在液體培養基中培養并通過細菌密度、FACS (參見，例如，Mountzouros 等人，2000，J. Clin. Microbiol. 38 2878-2884)等來評價細菌生長。殺菌滴度被定義為觀察到活的奈瑟氏屬菌減少的血清稀釋度(例如，每毫升CFU的減少)，通常是導致與對照相比，存活率降低50%，或0. 5個IoglO 數量級，或1.0個IoglO數量級(90%降低)或2. O個IoglO數量級(99%的降低)的稀釋度。結果也可以表示為導致存活率與時間O點的陰性對照的存活率相比，降低50%的血清稀釋度。本領域普通技術人員能夠理解，需要將對照反應與實驗反應混合物平行進行。例如，含有高、中和低滴度的已知殺菌抗體的樣品可以作為陽性對照測試。另外，應該設置不加樣品的反應混合物，以及加入未免疫個體的血清的反應混合物。疫苗開發本申請公開的實驗也可以用來篩選能夠預防或改善細菌感染的候選疫苗。通常， “疫苗”是一種試劑，在給藥后能幫助宿主提高其針對目標病原體的免疫反應。引起的體液、 細胞或體液/細胞免疫反應可以幫助抑制由該開發疫苗針對的病原體引起的感染。特別優選的是能引起抑制奈瑟氏菌(例如奈瑟氏腦膜炎球菌、奈瑟氏淋球菌以及類似菌)的感染和/或復制的保護性免疫反應的預防性疫苗。還優選能對攻毒提供保護的治療性疫苗，例如通過產生殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。
可以通過多種方式完成候選疫苗的篩選，例如，收集個體的免疫前樣品，給藥候選疫苗以及收集個體的免疫后樣品。候選疫苗可以通過一次單劑量給藥(例如，腹腔內或肌肉內注射，口服)，隨后可任選地進行一次或多次加強免疫。可以通過檢查抗體反應來評價免疫反應的引發情況，例如，用傳統實驗和本申請所描述的實驗。本申請中所述的離體被動保護殺菌實驗可以用來同時測定多個候選疫苗免疫前樣品和免疫后樣品中殺菌性抗菌抗體的滴度。由于可以用小體積(在微升范圍)的新鮮血液進行實驗，可以使用單一供體作為整個篩選的全血來源。使用單一供體可以為本實驗提供更好的重現性以及恒定的背景。 而且，因為本實驗可以僅用小體積完成，可以僅用相對小體積的單一未免疫供體的新鮮全血(例如，0. 2ml、lml、10ml、50ml、100ml等等)來完成平行的多組實驗。
實施例下列提供的實施例是為了進一步展示本發明的優勢和特點，而非意在限制本發明的范圍。盡管它們代表了那些可以使用的方案，但也可以選擇使用本領域普通技術人員所知的其它規程、方法或技術。材料與方法血清樣品。保存的血清樣品由Novartis Vaccines提供，來自于研究性3組分(五抗原)重組疫苗(GNA 2091，fHbp 變異體 1，GNA 2132，GNA1030 和 NadA) (Chiron Vaccines, Emeryville CA(現為 Novartis Vaccines, Cambridge MA) (Giuliani, Μ. M 等人.2006， ProcNatlAcad Sci USA 103(29) :10834-9)的I期臨床實驗。這些血清來自于年齡為18至 50歲的36位個體。疫苗的劑量為每份劑量60 μ g的每種單個蛋白(總量為180yg)，用氫氧化鋁吸附(每份注射劑量的總量為1. 65mg)。個體給予3份劑量，每份間隔1個月。在免疫前(免疫前的血清)和第三份劑量后1個月(第三次免疫后的血清)獲取血清樣品。血清在56°C加熱30分鐘，以滅活內源補體。在SBA、OPA和PPA中使用的最終血清稀釋度為 1 4。奈瑟氏屬腦膜炎球菌菌株。使用3株B組菌株H44/76-SL(B. 15. Pl. 7，16，ST-32)、 NZ98/254(B :4 ；PL 7-2,4 和 ST 41/44 復合型)以及 S3032 (B 19,7 :Ρ1· 12，16，ST 型， ST-6875)。H44/76-SL 菌株來源于挪威的一次疫情(Bjune 等人· 1991，NIPH Ann 14(2) 125-30 ;Fredriksen，等人· 1991，NIPH Ann 14(2) :67-79)。該菌株 H44/76-SL (菌種號) 被稱為H44/76。NZ98/2M(B:4;P1.7-2，4*ST 41/44復合型)來自新西蘭最近的一次疫情(Dyet 和 Martin，2006，Epidemiol Infect 134(2) :377-83)。S3032 (B 19，7 :Ρ1· 12，16， ST型，ST-6875)來自于美國的一位住院病人(Frasch等人.1985，Rev Infect Dis 7(4) 504-10)。至于疫苗中的3個主要抗原，H44/76測試菌株高表達變異體1組中的fHbp，其與疫苗中fHbp具有相同的氨基酸序列，而NZ98/2M菌株相對低表達fHbp v. 1的亞變異體，其與疫苗中的相差少數幾個氨基酸(Welsch和Granoff，2004，Infect Immun 72(10) 5903-9 ;Welsch 等人.2008，JInfect Dis 197(7) :1053-61)。第三株測試菌株 S3032 表達天然存在的變異體2和3組的fHbp的嵌合體(Genbank登錄號EU921901)。所有三株菌株都具有編碼GNA2132的基因。NZ98/2M和H44/76菌株表達的GNA2132蛋白具有同源的63 個氨基酸的肽，該片段也存在于重組疫苗的抗原中，但不存在與于菌株S3032的GNA 2132 中(Welsch 和 Moe，2003，JInfect Dis 188(11) :1730-40) NZ98/254、H44/76 和 S3032 的GNA2132的Genbank登錄號分別是AY315196、AF226436和AY315192。三株菌株都沒有NadA 基因。血清殺菌實驗(SBA)。本實驗按照別處所述的方法進行，用早對數期、液體培養基生長的奈瑟氏腦膜炎球菌和人補體進行(Plested和Granoff，2008，Clin Vaccine Immunol 15(5) :799-804 ;Welsch 等人· 2008，J Infect Dis 197(7) :1053-61)。補體來源于健康成人的未免疫血清，該健康成人具有正常總溶血補體活性，并且沒有針對每株測試菌株的可檢測的血清殺菌抗體。通過插值提供50%存活率的稀釋度來確定血清滴度。注意，與陰性對照血清和補體孵育的細菌通常在60分鐘的孵育期間內表現出CFU/ml百分之150至250 的升高。調理素吞噬殺菌實驗(OPA)。用熱滅活的測試血清、對數期活細菌(和與SBA同樣的方法制備)、新鮮純化的人供體PMN(三個供體，不同的Fc y RIIA受體，根據PCR測定) 以及外源人補體進行OPA實驗。實驗過程如前人描述(Plested和Granoff，2008,如前)， 但補體來源用C6-充足的血清而不是C6-去除的血清。陽性OPA滴度定義為，在反應混合物中孵育1小時后，與陰性對照時間零點(0)相比CFU/ml減少50%。離體被動保護實驗(PPA)。用含有重組水蛭素(來匹盧定，27. 8 μ g/ml終濃度) 作為抗凝劑的注射器獲取健康成人的新鮮血液。血液供體的來源與SBA和OPA中人補體來源的血清供體相同。在微孔板的每一孔中加入65 μ 1血液、25 μ 1測試血清以及10 μ 1含有 15%已加熱補體、牛血清白蛋白(Equitech)和約4000CFU的PBS緩沖液。陽性對照是相關抗PorA單克隆抗體(NIBSC，Pl. 4或Pl. 12)和針對各個測試菌株具有高、中或低OPA和 SBA的人血清樣品。陰性對照血清是補體供體的熱滅活血清或僅緩沖液。微孔板在37°C， 5% CO2條件下孵育90分鐘，同時在MS 3數字迷你振蕩器(IK，Wilmington, NC)上以500 振幅/分鐘震蕩而完全混勻組分。將樣品從孔中移出，在巧克力瓊脂平板上在37°C，5% CO2 的條件下孵育進行定量培養。接下來的一天確定CFU/ml，結果計算為在90分鐘時的CFU/ml與陰性對照測試血清在0時間點相比的IoglO數量級變化。根據不同天進行的重復實驗的重現性(見結果)， 我們將陽性PP活性定義為相比于時間0點，CFU/ml降低了彡0. 5個IoglO數量級的血清 (即，CFU/ml降低約70% )。所有實驗都做兩個復孔，報告結果來源于至少3次進行的獨立實驗。 實施例1 :SBA和OPA測定保存血清的殺菌活性用SBA和OPA實驗測試用3份劑量的3組分疫苗(五抗原疫苗，見材料與方法)免疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血滴。OPA按照前人描述的方法進行(Plested 和 Granoff，2008，Clin Vaccine Immunol 15(5) :799-804)，但是使用 C6 充足(也就是非去除的)的補體而不是C6-去除的補體。圖1，A部分顯示用3組分(五抗原)疫苗免疫之前和之后，具有保護性SBA滴度> 1 4的個體的比例。測試了血清針對菌株H44/76、 NZ98/254和S3032的血清殺菌活性。圖1，B部分顯示用3組分(五抗原)疫苗免疫之前和之后，具有保護性OPA滴度> 1 4的個體的比例。測試了針對菌株NZ98/2M和S3032 的調理素吞噬活性。實施例2 鑒定未免疫個體測試健康供體的血液中是否存在針對5株菌株MC58、H44/76.4243, NZ98/254和S3032的殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。所用的供體就是在圖1所示的SBA和OPA結果中血清來源的供體。圖2A顯示用新鮮全血和菌株MC58、H44/76、4243和NZ98/2M進行的全血殺菌實驗(WBA)的結果。加入重組水蛭素作為抗凝劑。在接種測試菌株后，在0、1、2、3小時取樣接種血液的樣品，并確定菌落形成單位(CFU) /ml。每一株菌株在全血中的生長表明，該供體對于這些菌株是未免疫的或未感染的，因為供體缺乏針對這些菌株的殺菌抗體。取決于測試的菌株，約 13 至 60% 的供體是未免疫的(Welsch 和 Granoff，2007，Clin Vaccine Immunol 14 :1596-1602)。圖2B顯示用新鮮全血和菌株NZ98/2M和S3032進行的離體被動保護菌血癥實驗(PPA)的結果。將重組水蛭素加入血液中作為抗凝劑。一份血清在PPA中沒有殺菌活性 (陰性對照)，而另一份用奈瑟氏菌OMV疫苗免疫的個體的血清在PPA實驗中具有細菌殺傷作用(陽性對照)，雖然其SBA滴度為陰性。血清被熱滅活并以1 4的血清稀釋度加入全血中。在接種測試菌株后，在0和1. 5小時從接種血液中取樣，并確定CFU/ml。實施例3 保存血清的離體被動保護菌血癥實驗(PPA)。用本披露的示例的離體被動保護殺菌實驗(PPA)，測試用3份劑量的3組分疫苗 (五抗原疫苗，見材料與方法)免疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血清。根據材料和方法中的描述，測試這些血清針對菌株NZ98/2M和S3032的殺菌活性。這些菌株對血清殺菌活性和調理素吞噬活性相對不敏感。用來源于實施例2中鑒定的未免疫供體的全血對每一份血清進行1 4稀釋。在含有未免疫供體的全血和測試血清的反應混合物中接種測試菌株，在0和1. 5小時取樣，并確定CFU/ml。對于菌株NZ98/2M，36份免疫前血清的CFU/ml的平均IoglO數量級變化是-0. 12個IoglO數量級，免疫后獲得的對應血清則增加至-1. O個IoglO數量級(P < 0. 001)。菌株S3032的CFU/ml的相應IoglO數量級改變為，免疫前-0. 59至免疫后-1. 69 (P < 0. 001)。實施例4 離體被動保護殺菌實驗(PPA)是可重復的。36位個體中的14位的保存的免疫前和免疫后血清樣品用PPA在1至3個月內的不同時間點進行測試。全血來源于實施例2中鑒定的未免疫供體。每一份熱滅活血清用新鮮全血進行1 4稀釋。14位個體的血清從1標記到14，其中A表示免疫前血清而B表示免疫后血清。陽性PPA定義為，在細菌接種后1. 5小時，其CFU/ml與陰性對照在時間0點相比降低0. 5個IoglO數量級。圖4，A部分和B部分顯示菌株NZ98/2M和S3032各自的 PPA結果。每份血清測3次。在三次獨立條件下進行的三次獨立實驗中，除了血清IA針對菌株S3032的實驗之外，其他測試的血清的結果都是可重復的。實施例5 3組分疫苗免疫的個體的血清的離體被動保護菌血癥實驗(PPA)。用SBA和PPA對3組分疫苗免疫個體的血清在菌株NZ98/2M上進行測試。在三次獨立條件下，進行三次獨立的PPA實驗。用PPA測試SBA滴度< 1 4的個體。圖5A， A部分顯示，PPA結果表明SBA滴度< 1 4的某些個體具有針對菌株NZ98/2M的殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。B部分顯示，PPA結果表明SBA滴度< 1 4的某些個體沒有針對菌株 NZ98/254的殺菌性抗奈瑟氏菌抗體。C部分是用SBA滴度> 1 4的血清進行PPA實驗測得的殺菌活性。A部分和C部分的比較顯示，PPA能夠測試SBA滴度< 1 4的殺菌活性， 也能測試SBA滴度> 1 4的殺菌活性，因為這兩種SBA滴度的IoglO數量級改變的量級差不多。用SBA和PPA對3組分疫苗免疫個體的血清在菌株S3032上進行測試(圖5B)。 在三次獨立實驗中進行PPA實驗。對于SBA滴度<1 4且呈陽性PPA的個體，其在全血測試中CFU/ml的IoglO數量級改變與用SBA滴度> 1 4的血清觀察到的值在相同數量級(圖5B，將A部分與C部分比較)。實施例6 SBA、OPA和PPA的比較用SBA、OPA和PPA測試用3份劑量的3組分疫苗(五抗原疫苗，見材料與方法) 免疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血清。每次試驗中血清以1 4稀釋。陽性 SBA或OPA滴度定義為，在與細菌培養1小時后的CFU/ml與時間0點相比降低50%。陽性 PPA定義為，在與細菌培養1. 5小時后的CFU/ml與時間0點相比降低0. 5個IoglO數量級。 如圖6所示，PPA比SBA和OPA都更敏感。在免疫后血清中，針對兩株測試菌株NZ98/2M和 S3032的陽性PPA比SBA滴度彡1 4的頻率高2_3倍。同樣，針對測試菌株ΝΖ98ΛΜ和 S3032的陽性PPA比OPA滴度彡1 4的頻率分別高1. 5-2倍。用人補體和人PMN檢測到調理素吞噬殺菌滴度彡1 4的免疫后血清，比SBA滴度彡1 4的血清多10%到50%。 因此，對于檢測殺菌抗體，用調理素吞噬殺菌活性檢測可能比用血清殺菌活性更敏感，但是調理素吞噬實驗的增量優勢沒有預期的大。
權利要求
1.一種檢測生物樣品中殺菌抗體的方法，方法包括 在反應混合物中混臺疑似含有殺菌抗體的生物樣品； 感興趣的革蘭氏陰性病原活菌；以及來源于未免疫的人供體的新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對所述感興趣的病原菌的殺菌抗體，其中所述人生物樣品取自的人不是所述未免疫的人供體，且其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑；以及通過評價所述革蘭氏陰性菌的存活，檢測所述樣品中是否存在或缺乏殺菌抗體， 其中在所述生物樣品存在時，所述革蘭氏陰性菌存活降低則表明所述樣品含有殺菌性抗菌抗體。
2.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是人血清。
3.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是人血漿。
4.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是抗體分泌細胞的上清。
5.權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品是小鼠血清。
6.權利要求1所述的方法，其中所述反應混合物中的所述生物樣品是免疫前的生物樣品，且其中所述方法還包括在單獨的反應混合物中混合疑似含有殺菌抗體的免疫后的生物樣品，其中所述免疫后樣品和所述免疫前樣品取自于同一個個體，且其中所述免疫后樣品在將免疫原性組合物給藥于所述個體后獲得； 感興趣的革蘭氏陰性活細菌；以及新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對所述感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于從未免疫的人供體，其中所述人生物樣品取自的人不是所述未免疫的人供體，且其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑； 以及所述檢測包括，通過評價所述樣品中所述細菌的存活，檢測所述免疫前樣品和所述免疫后樣品中是否存在或缺乏殺菌抗體，其中與免疫前樣品相比，在免疫后樣品中存在或缺乏殺菌抗體則表明給藥于個體的免疫原性組合物引起對革蘭氏陰性菌有殺菌力的抗體的能力。
7.權利要求6所述的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌是奈瑟氏細菌，且所述免疫原性組合物包括旨在引起抗奈瑟氏菌抗體的抗原。
8.權利要求7所述的方法，其中所述奈瑟氏細菌是奈瑟氏腦膜炎球菌。
9.權利要求6所述的方法，其中所述免疫前樣品和所述免疫后樣品分別是免疫前血清樣品和免疫后血清樣品。
10.權利要求7所述的方法，其中所述免疫前血清樣品和免疫后血清樣品在所述混合前被熱滅活。
11.權利要求6所述的方法，其中所述個體是人。
12.權利要求6所述的方法，其中所述個體是小鼠。
13.—種篩選候選疫苗的方法，所述方法包括 在第一種反應混合物中混合在對個體給藥含有免疫原性組合物的候選疫苗前，從個體中獲得的免疫前生物樣品；革蘭氏陰性活細菌；以及新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對所述感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于未免疫的人供體，其中所述人免疫前樣品取自的人不是所述候選疫苗將給藥的個體，且其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑； 在第二種反應混合物中混合在所述候選疫苗給藥后，從所述個體獲得的免疫后樣品； 所述新鮮人全血；以及所述革蘭氏陰性活細菌；以及通過評價細菌的存活，檢測每一份所述免疫前和免疫后樣品中是否存在或缺乏殺菌性抗細菌抗體。
14.權利要求13所述的方法，其中所述免疫前和免疫后樣品是人血清樣品。
15.權利要求13所述的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌是奈瑟氏細菌。
16.權利要求15所述的方法，其中所述奈瑟氏細菌是奈瑟氏腦膜炎球菌。
17.一種反應混合物，包括疑似含有殺菌抗體的生物樣品； 感興趣的革蘭氏陰性活細菌；以及新鮮人全血，其不含有可檢測的、能有效針對感興趣的細菌的殺菌抗體，其中所述新鮮人全血取自于未免疫的人供體，其中所述人生物樣品取自的人不是所述未免疫的人供體， 且其中所述新鮮人全血含有不顯著影響補體激活或補體活性的抗凝劑。
全文摘要
本公開提供了評價生物樣品中的殺菌抗體的方法，用未免疫人的新鮮全血作為實驗的媒介。
文檔編號A61K39/095GK102256619SQ200980151918
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月10日 優先權日2008年12月22日
發明者D·M·格拉諾夫, J·A·韋爾施爾, J·普萊斯蒂德 申請人:奧克蘭兒童醫院及研究中心, 諾華疫苗和診斷公司