專利名稱：修飾的淀粉狀蛋白β肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及增強淀粉狀蛋白β (下文中稱為Αβ)肽的免疫應答誘發能力的方法。 更具體地，本發明涉及用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物，其包含來源于阿爾茨海默病的致病因子A β的肽或其部分，其中加入或插入半胱氨酸或其類似物。
背景技術：
阿爾茨海默病是癡呆的一種并與作為主要癥狀的退化的認知功能和性格改變相關。隨著老年人口的增長，阿爾茨海默病患者的數目持續增加。預計在日本、美國和歐洲的患者數目將從2004年的560萬變為2014年的730萬。因此，迫切需要用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物的早期開發。阿爾茨海默病的病理學適應癥包括3種特征神經元的萎縮和/或減少，由于A β 聚集和/或沉淀導致的老年斑的形成和由于異常tau蛋白導致的神經纖維改變。阿爾茨海默病分為2個主要種類，即家族性阿爾茨海默病和孤立性阿爾茨海默病。對前者已鑒定出致病的遺傳突變并發現其表型說明了大腦中淀粉狀蛋白β肽，尤其是由42個氨基酸殘基組成的Αβ 1-42的產生的增加是疾病的主要原因。然而，被診斷患有家族性阿爾茨海默病的患者的比例在嚴格意義上占總患者的1%或更少。希望盡快地闡明占患者的99%的孤立性阿爾茨海默病的致病原因。認為孤立性阿爾茨海默病是由未鑒定的遺傳風險因子的復制、 隱性基因的存在、環境風險因子的存在等等導致的。目前，基于在家族性阿爾茨海默病中的遺傳突變普遍具有高度聚集的A β 42的最終增加的事實，認為與家族性阿爾茨海默病經歷類似病理學發展的孤立性阿爾茨海默病的主要原因可能是Αβ 42的增加。此觀點被稱為淀粉狀蛋白假說，并且目前用于治療的研究基于此假說進行。Αβ通過膜結合的天冬氨酸蛋白酶的切割從其前體蛋白產生。β-分泌酶切割Αβ 的N-端而Y-分泌酶切割其C-端。之后，取決于突觸的活性，切割的Αβ可分泌至細胞外。Αβ迅速地自動聚集從而使單體Aβ經二聚體、三聚體和可溶性寡聚體形成前纖維結構初原纖維，其之后形成和積聚成不溶的淀粉狀蛋白纖維。這已經成為主流的觀點，即聚集的可溶性Αβ寡聚體對神經的負面作用在阿爾茨海默病的病理條件中起重要作用。已報導了可能阻礙神經傳遞的多種可溶性Αβ寡聚體形式，包括二聚體，三聚體，淀粉狀球狀體(53 kDa的聚集物)，Αβ 56 (56 kDa的聚集物)，長達40個氨基酸的聚集物等等。目前，廣泛進行了通過Αβ (其在阿爾茨海默病的發病機制中可能發揮高度重要的作用)的清除的治療方法，其中包括使用Αβ抗體的抗體治療研究。認為通過抗_Αβ抗體的Αβ清除作用機制包括經抗體Fc受體的小神經膠質細胞的吞噬作用，纖維狀Aβ的加速溶解或抑制聚集和抗體與血液中的Aβ的結合以加速可溶性Αβ從大腦中的排除。提議了 2種方法，即主動免疫，其中通過疫苗誘發抗_Αβ抗體和被動免疫，其中施用抗-Aβ抗體本身。對前一種方法，使用A β本身作為抗原的疫苗ΑΝ1792進展到II期臨床試驗，但由于6%的患者在試驗中患有腦脊髓膜炎而中斷試驗。然而，在具有增加的抗體滴度的患者和不具有增加的抗體滴度的患者之間觀察到部分高級(high-order)功能的差異(非專利參考 1)。此外，檢查了在臨床試驗中死亡的患者的大腦，發現新皮層中的老年斑消失。另外，在施用前和后的MRI顯示施用組比安慰劑組展示了較小的腦容量。由此，盡管臨床試驗由于不良副作用中斷，這仍然證明使用Αβ本身作為抗原的疫苗是有效的。未來希望開發更安全的疫苗。認為由ΑΝ1792導致的腦脊髓膜炎是由于使用了高效力佐劑QS21和由Αβ序列本身中存在的T細胞表位引起的細胞免疫。對Αβ序列本身中存在的T細胞表位進行了大量研究，發現至少在Αβ序列N-端的第1-10位殘基中存在可引起體液免疫的T細胞表位但不存在可引起細胞免疫的T細胞表位(專利參考2-4)。非專利參考1: Gilman S, Roller M, Black RS, Jenkins L 等人，NEUROLOGY, 2005; 64: pl553-1562
非專利參考 2: Michael G, Agadjanyan MG 等人，Journal of Immunology, 2005; 174: pl580-1586
非專利參考 3: Bard F, Barbour R, Cannon C, Carretto R, Fox M 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: p2023_2028
非專利參考 4: Wanga CY 等人，Vaccine, 2007; 25: p3041_3052。
發明內容
(本發明待解決的技術問題)
如上所述，擔憂的是在使用全長Αβ序列和高效力佐劑例如QS21的組合的阿爾茨海默病的疫苗治療中的不良副作用。因此，希望開發用以更安全形式的Αβ肽和更安全佐劑的組合用于預防和治療的更安全和更有效的方法。由此，本發明的一個目的是通過設計Αβ 肽的形式提供用于阿爾茨海默病的更安全的疫苗治療的肽。(解決問題的方式)
本發明者已認真研究了用于免疫和用于增強免疫的對活體安全、有效和不昂貴的方法，結果發現可通過加入或插入半胱氨酸殘基(一種組成天然存在蛋白質的氨基酸)增強目的肽誘發增強的免疫應答的能力，因此顯示可通過在Αβ肽的部分加入或插入半胱氨酸分子得到誘發增強的免疫應答的性能，而不使用全長Αβ肽(PCT/JP2008/0576U)。依照本發明，進一步的研究導致以下發現，即得到針對Αβ的增強的免疫應答的方法和預期引起減少的細胞免疫應答的加入半胱氨酸分子的新Aβ肽。本發明涉及增強免疫應答的新方法，更具體地，增強免疫應答的方法的特征在于將半胱氨酸分子加入或插入免疫原性肽，并包含如下發明
(1)肽，其特征在于在淀粉狀蛋白β肽的部分或來源于淀粉狀蛋白β肽的序列中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，所述肽選自如下(A)至(F)
(A)由下述組成的肽(a)由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基的部分組成的肽和(b)由在SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第42位氨基酸殘基內的包含SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第36 位氨基酸殘基的9個或更多個氨基酸殘基組成的肽，肽(a)和肽(b)彼此結合，其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與得到的肽(a)和肽(b)的組合的C-端結合；(B)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第沈位或第1至第27位氨基酸殘基，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物；
(C)由下述組成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與所述肽的C-端結合；
(D)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基或由SEQ ID N0:1 的N-端第1至第18位氨基酸殘基的部分，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其進一步與由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1 的N-端第觀至第42位氨基酸殘基的部分組成的肽結合，所述由SEQ ID N0:1的N-端第觀至第42位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第42位氨基酸殘基的部分組成的肽的C-端任選地與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合；
(E)由下述組成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其C-端與半胱氨酸類似物結合；
(F)由下述組成的肽2條或多條由SEQID NO: 1的氨基酸序列組成的肽或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分組成的肽，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，所述2條或多條肽通過所述半胱氨酸或所述半胱氨酸類似物之間的二硫鍵彼此結合。(2)如上第(1)項的肽，其中如上(A) (a)的肽選自由SEQ ID N0:1的N-端第1至第10，第2至第10，第3至第10，第1至第9，第2至第9，第1至第18位氨基酸殘基組成的肽，和如上㈧(b)的肽選自由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36，第28至第37， 第觀至第38，第觀至第39，第觀至第40，第觀至第41，第觀至第42位氨基酸殘基組成的肽。(3)如上第(1)項的肽，其中如上(C)的肽為由下述組成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第觀位氨基酸殘基，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與所述肽的C-端結合。(4)如上第(1)項的肽，其中如上(D)的肽為由下述組成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第18位氨基酸殘基，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其進一步與由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽結合，所述由SEQ ID NO: 1的 N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端任選地與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結
I=I ο(5)如上第(1)項的肽，其中如上(E)的肽為由下述組成的肽SEQ ID N0:1的 N-端第1至第28位氨基酸殘基，其C-端與半胱氨酸類似物結合。(6)如上第(1)項的肽，其中如上(F)的肽為由下述組成的肽由2條或多條由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第觀位氨基酸殘基組成的肽，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其中所述2條或多條肽通過所述半胱氨酸或所述半胱氨酸類似物之間的二硫鍵彼
此結合。(7)如上第(1)至(6)項中任一項的肽，其中所述半胱氨酸類似物為高半胱氨酸。(8)如上第(1)至(7)項中任一項的肽，其中所述肽為選自下述的肽 SEQ ID N0:2 至 SEQ ID N0:19 中任一種的肽；
由2條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID N0:20組成并通過二硫鍵彼此結合；肽，其由SEQ ID NO:20組成的肽和由SEQ ID NO:21組成的肽組成，每條肽通過二硫鍵彼此結合；
由2條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID NO:21組成并通過二硫鍵彼此結合； 由多條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID NO:21組成并通過二硫鍵彼此結合。(9)增強對淀粉狀蛋白β的免疫應答的方法，其特征在于使用如上第(1)至(8) 項中任一項的肽。(10)用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物，其特征在于所述藥物包含如上第(1) 至(8)項中任一項的肽作為活性成分。(11)對預防和治療阿爾茨海默病有效的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗包含編碼如上第(1)至(8)項中任一項的肽的氨基酸序列的基因片段。本發明還涉及在哺乳動物中預防和治療阿爾茨海默病的方法，其包括對所述哺乳動物施用藥學上有效量的本發明的肽，以及在哺乳動物中預防和治療阿爾茨海默病的方法，其包括對所述哺乳動物施用藥學上有效量的編碼本發明的肽的氨基酸序列的基因片段。本發明還涉及本發明的肽在制造用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物中的用途以及編碼本發明的肽的氨基酸序列的基因片段在制造用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。發明效果
本發明提供了誘發對A β肽的增強和充分的免疫應答的免疫原性肽，即使其被單獨使用而不加佐劑。根據本發明，僅僅通過在Αβ肽的部分或來源于Αβ肽的序列中加入或插入半胱氨酸分子可增強免疫原性肽的抗體產生。因此，不具有與使用佐劑相關的缺點，使藥物制劑的設計更容易。當對活體施用時，本發明的誘發對Αβ肽的增強的免疫應答的免疫原性肽可迅速和充分地在血液中誘發特異性針對所述肽的抗體。已知半胱氨酸是沒有毒性的，而已知半胱氨酸和其相關物質在活體中具有抗毒性作用，因此本發明的誘發增強的免疫應答的免疫原性肽可非常安全地在體內使用。本發明的誘發增強的免疫應答的免疫原性肽可通過無需生物合成的通過化學合成的非生物程序制備，因此比傳統成分疫苗具有更高的一致性。此外，可提供具有最低風險的毒性、感染和由于污染導致的質量下降的更安全的疫苗。不僅可通過注射例如皮下或肌肉內施用包含本發明的誘發對Αβ肽增強的免疫應答的免疫原性肽的肽制品，而且可通過口服、經鼻或經皮施用所述肽制品，這可避免由注射器針頭導致的壓力和醫療事故。
圖1顯示了加入半胱氨酸的通過二硫鍵彼此結合的觀個氨基酸殘基的Αβ肽的結構。本發明的最佳實施方式
依照本發明，可將半胱氨酸分子或其衍生物直接加入或插入肽或可選地將表達半胱氨酸的序列加入或插入DNA或RNA序列。只要可得到對A β肽的免疫應答增強作用，不具體限制加入和插入半胱氨酸的位置。待插入的半胱氨酸分子的數目可為一個或多個。當插入多個半胱氨酸分子時，可連續地或不連續地插入半胱氨酸分子。最簡單的結構可為Aβ肽的一部分，其N-端或C-端與一個半胱氨酸結合。在預防和治療阿爾茨海默病中有效的本發明的肽可包括由第1至第42位氨基酸殘基組成的Aβ 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA: SEQ ID Ν0:1)的部分或來源于其的肽，其中加入半胱氨酸(Cys)或其類似物。這些肽的實例包括在下文中所列的那些肽。如本文中使用的半胱氨酸類似物指半胱氨酸的前體和代謝物并通常包括高半胱氨酸。(A)肽,其包含(a)由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基的部分組成的肽和(b)由在SEQ ID N0:1 的N-端的Il 28至Il 42位氨某酸殘某內的句,含SEQ ID NO: 1的N-端的Il 28至Il 36
9 頓纏某麵細flt (a) ^Pflt (b)彼此齢，#Φ輔細鮮胱氡剛_輔至_仏綱太(漏船白化㈱齢
(1)由下述組成的肽SEQID Ν0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸殘基組成的肽，所述SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第42位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-42AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:2)
(2)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第41位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第41位氨基酸殘基組成的肽C-端加入半胱氨酸(1-10 28-41AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWK (SEQ ID N0:3)
(3)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第40位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第40位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-40AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGW￡ (SEQ ID NO:4)
(4)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第39位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第39位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-39AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGV￡ (SEQ ID NO:5)
(5)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第38位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第38位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-38AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGG￡ (SEQ ID N0:6)
(6)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:7)
(7)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第36位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-10 28-36AACys) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMV￡ (SEQ ID NO:8)
(8)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第9位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-9 28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:9)
(9)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第2至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸O-IO 28-37AACys)
N-端-AEFRHDSGIGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO: 10)
(10)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第3至第10位氨基酸殘基，其C-端結合由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第洲至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(3-10 28-37AACys)
N-端-EFRHDSGYKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:11)
(11)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第2至第9位氨基酸殘基，其C-端結合由 SEQ ID NO: 1的N-端第28至第37位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第 28至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸28-37AACys)
N-端-AEFRHDSGKGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:12)
(12)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基，其C-端結合由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸殘基組成的肽，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第42位氨基酸殘基組成的肽的C-端加入半胱氨酸(1-18 28-42AACys)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO: 13)。(B)由下述組成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第26位或第1至第27位氨基 11 , ^^ N-端H 18 禾nn 19 ^Mgil^g^J^ilA^EMilaK^EMil^M^
(1)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第27位氨基酸殘基(在下文中稱為“27-氨基酸Αβ肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸 (l-18Cysl9-27AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡FFAEDVGSN (SEQ ID NO:14)
(2)由下述組成的肽SEQID N0:1的N-端第1至第沈位氨基酸殘基(在下文中稱為“26-氨基酸Αβ肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸 (l-18Cysl9-26AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVQFFAEDVGS (SEQ ID NO:15)。(C)由下述組成的肽SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的肽或由SEQ ID N0:1的氨序歹！丨的部分， Φ^ΗΝ-端H 18禾nn 19位氨, !! ;^旬插入半胱氨或半胱Mil^l
^m ^ H.^^^EMii^^EMii^i^ii^^jta^ c-端結合
(1)由下述組成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第觀位氨基酸殘基(在下文中稱為 “28-氨基酸A β肽”)，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸，并且其中半胱氨酸與所述肽的C-端結合(l-18CyS19j8AACyS)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡FFAEDVGSNK￡ (SEQ ID NO:16)。
(D)由下沭組成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基或由SEQ ID NO 1的N-端H 1 ^ll 18位的部分，IC-端與半胱氡半胱氡勿結合， 其講一步與由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID N0:1 ^Ν-2842imMm^m^Am^mm^,^^SEQ ID NO:I的Ν-端h 28 42 WMMm^mW ^AtgK^ SEP ID NO: 1 ^ N- 28 42 ^M^if M· __ C-職態辟胱細鮮胱氡
(1)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基，其C-端結合半胱氨酸，其進一步結合由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第37位氨基酸殘基組成的肽 (l-18Cys28-37AA)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡KGAIIGLMVG (SEQ ID NO:17)
(2)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基，其C-端結合半胱氨酸，其進一步結合由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第37位氨基酸殘基組成的肽， 所述由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第37位氨基酸殘基組成的肽的C-端結合半胱氨酸 (l-18Cys28-37AACys)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLV￡KGAIIGLMVG￡ (SEQ ID NO:18)。(E)由下沭組成的肽SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的肽或由SEQ ID N0:1的氨歹丨丨_仉1； C-躺輔細鮮胱氡
(1)由下述組成的肽SEQ ID NO: 1的N-端第1至第觀位氨基酸殘基，其C-端結合高半胱氨酸08AA-高半胱氨酸)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX (SEQ ID N0:19) (X:高半胱氨酸)。(F)由下述組成的肽由2條或多條由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成的肽或由 SEQ ID N0:1的氨序歹I丨的部分組成的HHC-端ij半胱氨或半胱
Φ戶斤沭2 I或多Ijfeil丄寸所沭半胱氨或所沭半胱氨勿t丨旬的二硫Hlt皮此結合
(1)加入半胱氨酸的28-氨基酸Aβ肽Q8AAC)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK￡ (SEQ ID Ν0:20)
(2)加入2個半胱氨酸的28-氨基酸Aβ肽Q8AACC)
N-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK￡￡ (SEQ ID Ν0:21)。由經二硫鍵彼此結合的^AAC和^AAC組成的肽Q8AAC 二硫^AAC)，由經二硫鍵彼此結合的^AAC和^AACC組成的肽Q8AAC二硫^AACC)，由經二硫鍵彼此結合的^AACC 和^AACC組成的肽Q8AACC 二硫^AACC，包括具有在各個N-端半胱氨酸之間形成的二硫鍵的肽，具有在各個C-端半胱氨酸之間形成的二硫鍵的肽，具有在N-端半胱氨酸和C-端半胱氨酸之間形成的二硫鍵的肽，具有在各N-端半胱氨酸之間和在各C-端半胱氨酸之間形成的二硫鍵的肽，和具有各在N-端半胱氨酸和C-端半胱氨酸之間形成的二硫鍵的肽)， 和由多個經二硫鍵彼此結合W^AACC組成的肽Q8AAC(^28AAC)-結合產物)。圖1顯示了這些肽的結構。在如上所述的加入或插入半胱氨酸的A β肽中，由缺失其氨基酸序列的部分并加入半胱氨酸的Αβ 肽組成的肽，例如 1-10 28-42AACys (SEQ ID NO:2), 1-10 28-4IAACys (SEQ ID NO:3), 1-10 28-40AACys (SEQ ID NO:4), 1-10 28-39AACys (SEQ ID NO:5), 1-10 28-38AACys (SEQ ID NO:6), 1-10 28-37AACys (SEQ ID NO:7), 1-10 28-36AACys(SEQ ID NO:8)， 1-9 28-37AACys (SEQ ID NO:9)， 2-10 28-37AACys (SEQ ID NO:10) 和1-18 28-42AACys (SEQ ID NO: 13)；由28-氨基酸A β肽并加入或插入半胱氨酸組成的肽，例如 l-18Cysl948AACys (SEQ ID NO: 16)，l_18Cysl9_27AA (SEQ ID NO: 14)， l-18Cysl9-26AA (SEQ ID NO: 15), l-18Cys28-37AA (SEQ ID NO: 17)；由沘-氨基酸 Αβ 肽并加入高半胱氨酸組成的肽，例如^AA-高半胱氨酸(SEQ ID NO: 19)；以及^AAC 二硫 28AAC和^AAC 二硫^AACC可引起特別增強的免疫應答，因此可有效用于預防和治療阿爾茨海默病。根據本發明，可通過將半胱氨酸或半胱氨酸類似物加入或插入Αβ肽的部分或來源于Aβ肽的序列制備可誘發增強的免疫應答的肽。可通過使用常規技術用所述肽免疫小鼠和測定在血液中的抗-Αβ IgG抗體滴度證實加入或插入半胱氨酸后得到的肽是否發揮了免疫應答增強作用。因此，本發明也提供了增強免疫應答的方法，其特征在于使用了通過將半胱氨酸或半胱氨酸類似物加入或插入Aβ肽的部分或來源于Aβ肽的序列得到的肽。含有通過本發明得到的加入半胱氨酸的肽的肽制品可通過任意施用途徑例如皮下、經皮、肌肉內、口服或經鼻施用。最優選地，其通過皮下或肌肉內施用。盡管即使本發明的加入半胱氨酸的免疫原性肽單獨施用而不加佐劑時，其也可提供足夠的免疫，但是如果與佐劑組合其可提供更充分的免疫。在本文中可使用的佐劑包括可優先激活體液免疫而不刺激細胞免疫的佐劑，并且通常為鋁鹽。此外，可使用包含編碼誘發增強的免疫應答的肽的基因片段的載體作為DNA疫苗用于有效預防和治療阿爾茨海默病，所述肽通過將半胱氨酸或半胱氨酸類似物加入或插入 Αβ肽的部分或來源于Αβ肽得到。編碼半胱氨酸的核苷酸序列包括例如tgt，但可為任意序列，只要其編碼半胱氨酸。下面描述編碼由上述42個氨基酸殘基組成的Αβ肽的基因片段。然而，下面描述的核苷酸序列代表Αβ肽的典型基因序列，但是可應用任意基因序列， 只要其編碼相同的氨基酸序列。gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (SEQ ID N0:22)。編碼通過將半胱氨酸(Cys)加入或插入Αβ肽的部分或來源于Αβ肽的序列得到的肽的基因片段實例包括下面描述的那些。盡管下面描述的核苷酸序列代表編碼上述各個肽的典型基因序列，但是可應用任意基因序列，只要其編碼相同的氨基酸序列。編碼1-10 28-42AACys的基因片段
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc
ggtgttgtca tagcgtgt (SEQ ID N0:23)
編碼1-10 28-4IAACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat ggtgttgtca tatRt (SEQ ID N0:24)
編碼1-10 28-40AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat RRtRttRtct Rt (SEQ ID N0:25)
編碼1-10 28-39AACys的基因片段
aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc
aaaggtgcaa tcattggact catggtgggcgatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc Rgtgtttgt (SEQ ID NO:26)
編碼1-10 28-38AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc RRttRt (SEQ ID NO:27)
編碼1-10 28-37AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tRt (SEQ ID NO:28)
10 編碼1-10 28-36AACys的基因片段
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt (SEQ ID NO:29)
編碼1-9 28-37AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID NO:30)
編碼2-10 28-37AACys的基因片段 gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID N0:31)
編碼3-10 28-37AACys的基因片段 gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (SEQ ID N0:32)
編碼2-9 28-37AACys的基因片段 gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (SEQ ID NO :33)
編碼1-18 28-42AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt (SEQ ID NO:34) 編碼l-18Cysl9-27AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc(SEQ ID NO :35)
編碼l-18CyS1946AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt_g^tttc tttgcagaag atgtgggttc a (SEQ ID NO:36) 編碼l-18Cysl9j8AACys的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt_g^tttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt (SEQ ID NO:37) 編碼l-18Cys28-37AA的基因片段 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgt￡t_aaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (SEQ ID NO:38) 編碼l-18Cys28-37AACys的基因片段gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt RgtRtRtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID NO:39)0通過以下實施例更詳細的解釋本發明，但不應理解為受其限制。實施例1
日 白·本碰育P匕力·愧:Αβ1 ■ 10_某_某繼
個不同的C-端flt結合并在后者的C-端力D入半胱氡_ (1)加入半胱氨酸的A β肽的制備
加入半胱氨酸的1-10+30-42氨基酸A β肽(1-10 30-42AACys) N-端-DAEFRHDSGYAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:40)
加入半胱氨酸的1-10+29-42-氨基酸Αβ肽(1-10 29-42AACys) N-端-DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:41)
加入半胱氨酸的1-10+28-42-氨基酸Αβ肽(1-10 28-42AACys) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA￡ (SEQ ID NO:2)
1-10+28-42-氨基酸 Αβ 肽(1-10 28-42ΑΑ) N-端-DAEFRHDSGIGAIIGLMVGGWIA (SEQ ID NO:42)
合成上面的肽(Sigma Aldrich Japan)并用鹽溶液稀釋以得到5mg/mL的儲液。向 100 μ L儲液中加入900 μ L鹽溶液以得到0. 5mg/mL的濃度，將混合物分裝至1. 5mL小管 (immunogen)中并在_80°C或更低溫度下儲存直至使用。(2)免疫小鼠
雄性C57BL/6小鼠(7周大，SPF)購自日本Charles River Co.，Ltd.并在SPF環境下培養。(3)免疫組
將16只小鼠分為4組，每組包含4只小鼠對組1施用1-10 30-42AACys ；對組2施用 1-10 29-42AACys ；對組 3 施用 1-10 28-42AACys 和對組 4 施用 1-10 ^_42AA。(4)免疫和時間表
使用ImL結核菌素注射器(Terumo，SS-01T2613S)在腹部皮內或皮下對小鼠施用各 200 μ L/小鼠的免疫原(每只小鼠的劑量100μ g)。免疫小鼠3次，每次間隔2周。(5)血液取樣
在最后第三次免疫后第7天，在用戊巴比妥鈉(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl)麻醉下從所有小鼠的腹主動脈收集血液。將采集的血液轉移至Microtainer (Becton Dickinson Co.，Ltd)，在室溫下進行充分的凝血，然后在5，000 rpm離心10 min。 將各個分離的血清分裝至2個0. 5mL小管并在-80°C下儲存直至測量。(6)抗-A β IgG抗體的測量
將 A β 肽(1-40 位氨基酸序列Ν-端-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV V (SEQ ID Ν0: 43)由 Hokkaido System Science Co.，Ltd.合成)用 0. IM 碳酸緩沖液 (ρΗ9· 6)稀釋成 10μ g/mL 并以 100μ L/孔加入 8-孔帶(Nalge Nunc K. K. , Immobilizer Amino)中，置于4°C孵育過夜以固定。第二天，用300 μ L含0. 05% Tween20的PBS (PBST) 洗各孔3次，以300 μ L/孔加入IOmM乙醇胺并置于室溫孵育1小時。1小時后，將IOmM乙醇胺完全去除并將用PBST稀釋50至10000倍的樣品以100 μ L/孔加入各孔。在室溫反應1小時后，去除加入的稀釋的血清并用300 μ L/孔的PBST 洗各孔3次。洗滌后，將孔里的洗滌液完全去除，以IOOyL/孔加入用稀釋樣品的溶液稀釋 2000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG山羊抗體(American Curlex, A131PS)，之后在室溫反應 1小時。反應后，去除用于稀釋標記抗體的溶液，用300 μ L/孔的PBST洗各孔2次，用等量的蒸餾水洗2次，向各孔中加入100 μ L/孔的顯色底物溶液TMB+ (Dako Inc.)，之后在室溫避光反應30min。然后加入100 μ L/孔的IN硫酸以終止顯色并在450nm處測量光密度 (0D450 值)。使用市售的針對Aβ的單克隆抗體(CHEMI-CON Corporation,ΜΑΒ1560)作為標準血清。用PBST將標準血清稀釋至0. 156,0. 3125,0. 625,1. 25,2. 5,5,10ng/mL以制備用于抗體滴度測量的標準品。測定了各個鼠血清樣品的抗_Αβ IgG抗體并同時測量了各個稀釋的樣品的0D450值。使用得到的標準品單位和0D450值的標準曲線計算了各個鼠血清樣品的抗-A β IgG抗體滴度。表1顯示了在各個免疫組中的鼠血清的計算的抗_Αβ IgG抗體滴度。如表1所示，在施用1-10 28-42AACys的組和施用1-10 28-42AA的組中觀察到針對A β的抗體的誘發(induction)。并且，與用不加入半胱氨酸的Aβ肽片段(1_10 28-42ΑΑ)的免疫相比，用加入半胱氨酸的Αβ肽片段(1-10 28-42AACys)的免疫提供了針對Αβ的較高抗體滴度。
權利要求
1.一種肽，其特征在于在淀粉狀蛋白β肽的部分或來源于淀粉狀蛋白β肽的序列中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，所述肽選自如下(A)至(F)(A)由下述組成的肽(a)由SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基的部分組成的肽和(b)由在SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第42位氨基酸殘基內的包含SEQ ID NO: 1的N-端的第28至第36 位氨基酸殘基的9個或更多個氨基酸殘基組成的肽，肽(a)和肽(b)彼此結合，其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與得到的肽(a)和肽(b)的組合的C-端結合；(B)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第沈位或第1至第27位氨基酸殘基，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物；(C)由下述組成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與所述肽的C-端結合；(D)由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第18位氨基酸殘基或由SEQ ID N0:1 的N-端第1至第18位氨基酸殘基的部分，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其進一步與由SEQ ID NO: 1的N-端第28至第42位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1 的N-端第觀至第42位氨基酸殘基的部分組成的肽結合，所述由SEQ ID N0:1的N-端第觀至第42位氨基酸殘基組成的肽或由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第42位氨基酸殘基的部分組成的肽的C-端任選地與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合；(E)由下述組成的肽SEQID NO: 1的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分，其C-端與半胱氨酸類似物結合；(F)由下述組成的肽2條或多條由SEQID NO: 1的氨基酸序列組成的肽或由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的部分組成的肽，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，所述2條或多條肽通過所述半胱氨酸或所述半胱氨酸類似物之間的二硫鍵彼此結合。
2.權利要求1的肽，其中(A)(a)的肽選自由SEQ ID NO: 1的N-端第1至第10，第2 至第10，第3至第10，第1至第9，第2至第9，第1至第18位氨基酸殘基組成的肽，和(A) (b)的肽選自由SEQ ID N0:1的N-端第觀至第36，第觀至第37，第觀至第38，第觀至第39，第觀至第40，第觀至第41，第觀至第42位氨基酸殘基組成的肽。
3.權利要求1的肽，其中(C)的肽為由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第觀位氨基酸殘基，其中在N-端第18和第19位氨基酸殘基之間插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物，并且其中半胱氨酸或半胱氨酸類似物與所述肽的C-端結合。
4.權利要求1的肽，其中(D)的肽為由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第 18位氨基酸殘基，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其進一步與由SEQ ID N0:1 的N-端第觀至第37位氨基酸殘基組成的肽結合，所述由SEQ ID NO: 1的N-端第觀至第 37位氨基酸殘基組成的肽的C-端任選地與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合。
5.權利要求1的肽，其中(E)的肽為由下述組成的肽SEQID NO: 1的N-端第1至第觀位氨基酸殘基，其C-端與半胱氨酸類似物結合。
6.權利要求1的肽，其中(F)的肽為由下述組成的肽2條或多條由SEQID N0:1的 N-端第1至第觀位氨基酸殘基組成的肽，其C-端與半胱氨酸或半胱氨酸類似物結合，其中所述2條或多條肽通過所述半胱氨酸或所述半胱氨酸類似物之間的二硫鍵彼此結合。
7.權利要求1至6中任一項的肽，其中所述半胱氨酸類似物為高半胱氨酸。
8.權利要求1至7中任一項的肽，其中所述肽為選自下述的肽 SEQ ID NO:2 至 SEQ ID NO: 19 中任一種的肽；由2條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID NO:20組成并通過二硫鍵彼此結合； 肽，其由SEQ ID NO: 20組成的肽和由SEQ ID NO: 21組成的肽組成，其中每條肽通過二硫鍵彼此結合；由2條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID NO:21組成并通過二硫鍵彼此結合； 由多條肽組成的肽，其中每條肽由SEQ ID NO:21組成并通過二硫鍵彼此結合。
9.一種增強對淀粉狀蛋白β的免疫應答的方法，其特征在于使用如權利要求1至8中任一項所述的肽。
10.一種用于預防和治療阿爾茨海默病的藥物，其特征在于所述藥物包含如權利要求 1至8中任一項所述的肽作為活性成分。
11.一種對預防和治療阿爾茨海默病有效的DNA疫苗，其特征在于所述疫苗包含編碼如權利要求1至8中任一項所述的肽的氨基酸序列的基因片段。
全文摘要
提供了含有淀粉狀蛋白β作為基礎序列的肽，所述肽作為阿爾茨海默病的預防和治療劑是安全的并可有效增強免疫應答。其中加入或插入半胱氨酸或半胱氨酸類似物的淀粉狀蛋白β肽或其部分肽，和使用所述肽增強針對淀粉狀蛋白β的免疫應答的方法。使用增強免疫應答的淀粉狀蛋白β肽的阿爾茨海默病的預防和治療劑。預期具有同樣效果并含有編碼其中加入或插入半胱氨酸的淀粉狀蛋白β肽或來源于其的肽的基因的DNA疫苗。
文檔編號A61K39/00GK102245629SQ200980150209
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月16日 優先權日2008年10月16日
發明者上仲一義, 松田純一, 野崎周英 申請人:一般財團法人化學及血清療法研究所