端粒酶抑制劑及其使用方法

專利名稱：端粒酶抑制劑及其使用方法
技術領域：
本發明涉及用于治療癌癥及其它增生性病癥的組合物和方法。更具體地，本發明涉及端粒酶抑制劑及其用途。相關申請的交叉引用本申請依據35U. S. C. § 119 (e)，要求2008年10月7日提交的序列號為 61/103,430的美國臨時專利申請的優先權，通過引用將所述申請的內容全部并入本文。政府支持本發明是在由國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)的分子與細胞生物學部(Molecular and Cell Biology D印artment，M(B)頒發的 No. 5 T32 GM007598培訓基金的政府支持下完成的。美國政府對本發明持有一定權利。
背景技術：
在過去的幾年里，癌癥藥物開發領域取得了顯著成果，這些成果主要集中在了解尋找具有選擇性和有效性的藥物的關鍵要求和用于分子靶標選擇的基本原理 (S. L. Mooberry, Drug Discovery Handbook. Wiley-Interscience 1343-1368(2005))。會邑夠嵌入明確定義的蛋白質的疏水袋的、基于小分子的配體仍然被認為是經典的候選藥物， 而在被稱為“可成藥的”基因組內，蛋白是最普遍的治療靶標(A. L. Hopkins, Nat. Rev. Drug Discovery 1,727-730(2002)).然而，目前，相當多的注意力被投向了新型化合物、化學作用和方法的尋找上，所述新型化合物、化學作用和方法可以充分地靶向除蛋白以外的其它重要分子，其中一些分子在傳統意義上被認為是難于處理、難以實現或簡單地被認為是“不可成藥的”。特別地，多年來，盡管RNA在多種細胞過程中發揮了許多作用(例如核酶、核糖開關、miRNA)，它仍被低估為僅僅是遺傳信息的攜帶者。治療干預本身的可能性激發了對 RNA結構和功能越來越多的興趣，這些可能性包括但不局限于采用傳統的(反義)方法和最近的(RNA干擾)方法控制基因表達的可能性。盡管具有挑戰性，但旨在利用小分子靶向 RNA的努力具有很大的前景，RNA結構所固有的柔韌性和復雜性可以從原則上用作旨在打破RNA功能的新策略的理性設計的基礎(J. R. Thomas, Chem. Rev. 108，1171-1224 (2008))。 預期這不僅僅在靶向信使RNA中特別有意義，同時在靶向其它在細胞環境中扮演重要角色的高度結構化的非編碼RNA中也特別有意義。過去已有報道稱短的寡核苷酸在RNA靶向領域具有相關性質。例如，已證實0DMiR(寡核苷酸導向的RNA錯折疊(Oligonucleotide Directed Misfolding of RNA))，可用作抑制I類內含子和大腸桿菌的RNase P的有效方法(J. L. Childs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,11091-11096(2002) ;J. L. Childs, RNA 9， 1437-1445(2003))ο端粒酶是一種專門的核糖核蛋白，它由兩個主要組分反轉錄酶蛋白亞基(hTERT) 和 RNA 組分(hTR) (J. Feng, Science 269,1236-1241(1995) ；Τ. Μ. Nakamura, Science 277， 911-912(1997))及數種相關蛋白構成。端粒酶利用RNA組分中的一段短序列作為模板，指導染色體末端的端粒重復序列(5’ -TTAGGG-3’ )的合成。端粒酶被認為是人類癌癥的幾乎通用的標記物，它對端粒長度的影響在避免復制性衰老中發揮了重要作用。然而，事實上，大部分正常體細胞中端粒酶的活性是被抑制的，已經發現在大約90%的人類腫瘤中， 端粒酶是被活化的(J. W. Shay, Eur. J. Cancer 33,787-791 (1991) ；N. W. Kim, Science 266， 2011-2015(1994))。

發明內容
本發明的一個目的在于通過提供與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的抑制劑，來提供抑制人端粒酶的方法和組合物。因此，一方面，提供了端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。在優選的實施方式中，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為6-14個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其其類似物包含長度約為 10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為8個核苷酸的結合序列。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑選自序列編號1至序列編號10組成的組。在另一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。本發明的另一方面提供了抑制端粒酶活性的方法，所述方法包含將端粒酶與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。在一個實施方式中，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為6-14個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為8個核苷酸的結合序列。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑選自序列編號1至序列編號10組成的組。在優選的實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。另一方面，提供了抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
在一種實施方式中，細胞在體外(in vitro)發生接觸。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。在優選的實施方式中，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為6-14個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約 10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為8個核苷酸的結合序列。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑選自序列編號1至序列編號10組成的組。在優選的實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。另一方面，提供了在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含給予受試者有效量的端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。在優選的實施方式中，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其核酸類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為6-14個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為10 個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為8個核苷酸的結合序列。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑選自序列編號1至序列編號10組成的組。在優選的實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。在一種實施方式中，受試者中，被治療的所述增生性病癥是癌癥。另一方面，提供了治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑和藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。在優選的實施方式中，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為6-14個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其核酸類似物包含長度約為10個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度為10 個核苷酸的結合序列。在另一種實施方式中，所述核酸或其類似物包含長度約為8個核苷酸的結合序列。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑選自序列編號1至序列編號10組成的組。在另一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。本發明的另一個目的在于通過提供與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的抑制劑，來提供抑制人端粒酶的方法和組合物。因此，一方面提供了端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的核糖核酸分子或其類似物，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，所述結合序列選自序列編號12至序列編號45組成的組。在一種實施方式中， 所述端粒酶抑制劑選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44和序列編號 45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑結合序列包含序列編號20。在一種實施方式中，提供了抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核糖核酸分子或其類似物接觸，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其核糖核酸類似物包含結合序列，所述結合序列選自序列編號12至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑結合序列包含序列編號20。另一方面提供了在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含給予受試者有效量的端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/ 模板域結合的核糖核酸分子或其類似物，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，所述結合序列選自序列編號12至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑結合序列包含序列編號20。在一種實施方式中，所述增生性病癥是癌癥。另一方面提供了治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑和藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的核酸或其類似物，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，所述結合序列選自序列編號11 至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑結合序列包含序列編號20。無論是否必需，“包含”一項或多項列舉要素的方法或組合物可以包括其它未被具體列出的要素。例如，包含核酸或其類似物的端粒酶抑制劑即包括所述核酸序列，又包括以該核酸序列為組分的、更大的核苷酸序列(如載體或質粒)。進一步舉例，包含要素A和要素B的組合物還包括由A、B和C組成的組合物。術語“包含”指“大體上包含，但沒必要唯一”。此外,單詞“包含(comprising) ”的變體，例如包含(comprise)和包含(comprises) 具有對應的不同含義。
本文中所使用的術語“基本上由……組成”指那些指定的實施方式中所需要的要素。該術語允許其它不會從實質上影響本發明的該實施方式的基本的和新穎的特征或功
能的特征的附加要素存在，就其本身而論，該術語旨在表示“大體上包含，但沒必要至少唯 _■”
ο本文中所使用的術語“由……組成”指本文中記載的組合物、方法及其各自的組分，所述組合物、方法及其各自的組分不包括實施方式的描述中未列舉的任何要素。除非在上下文中有明確說明，本說明書及所附權利要求中所用的單數形式“a”、 “an”及“the”包括復數形式。因此，例如，提及“該方法”時，包括一種或多種方法，和/或本文中所記載的類型的步驟，和/或本領域技術人員在閱讀本申請之后顯而易見的方法。 除了在操作實施例或其他另外指出的地方，在一切情況下，本文中所使用的表示成分的量或反應條件的數字都應理解為用術語“約”修正。所述術語“約”與百分數連用時可表示士 1%。可以理解，前述詳細說明及以下實施例僅用于解釋，不應當認為是對本發明范圍的限制。對所公開的實施方式的各種變化和修改，對本領域技術人員來說都是顯而易見的，所述變化和修改不會背離本發明的精神和范圍。為了記載和公開的目的，所有注明出處的專利、專利申請和出版物(例如那些可用于與本發明相聯系的出版物中記載的方法學)都明確地通過引用并入本文。這些出版物僅是為了揭示在本申請的申請日之前的出版物而提供的。在這點上，絕不應解釋為承認本發明人等無權通過在先發明而先于這些公開，也不應被理解為任何其它理由。所有關于這些文件日期的聲明或關于這些文件內容的表述，都是基于本申請人等可得的信息，并不構成對這些文件的日期或內容更正的認可。


圖1A-1C提供了 RIPtide微陣列技術的概要。圖IA顯示了 RIPtide微陣列的示意圖。圖IB顯示了 2，-0-甲基RIPtide以及極性聚乙二醇接頭的結構。圖IC顯示了 RIPtide 陣列的格局。在該例子中，每個芯片含有總數為87，296個的RIPtide序列。標出了每個N 聚體家族的RIPtide數量(N = 4，5，6，7，8)。圖2A-2I描述了寡(2’ _0_甲基核糖核苷酸)RIPtide微陣列的制造，所述制造使用了含有光生酸劑(PAG)(參考文獻1 的光可成像的聚合物膜。圖2A顯示了如何清潔熔融硅基底及如何用合適的硅烷處理熔融硅基底，從而引入含有共價結合的羥烷基基團的表層。圖2B顯示了如何使用標準的寡核苷酸合成方案，用PEG分子間隔物延伸表面的羥基位點，用DMT基團保護所述PEG分子間隔物的遠端。圖2C顯示了 PAG膜如何施用于基底上以及如何暴露于光刻掩膜中，從而在膜內產生光生酸的圖案，所述圖案的特征間距為17. 5微米(圖2D)。圖2E顯示了光生酸如何在顯像區內從羥基位點移除DMT保護基團。圖2F顯示了 PAG膜如何被移除，以及圖2G顯示了基底如何暴露于活化的5’-0-DMT-2’-0-Me-核糖核苷亞磷酰胺溶液中，并隨后暴露于標準的加帽試劑(capping reagents)和氧化試劑中。 這使在步驟d中暴露的基底區域中偶聯第一核苷酸(如2’ -OMe-A)。圖2H-圖21顯示了如何重復圖2C至圖2G中所示步驟以完成陣列中的剩余序列(顯示了用于C、G和U的三個附加循環)。所有序列完成后，通過最后的脫保護、切片和單個陣列的包裝來加工基底。圖3A-3B顯示了所使用的hTR構建體的序列及二級結構的示意圖。圖3A顯示了工程化的hTR假結構建體(頂部PKWT和PKWT-I ；分別為序列編號67和序列編號68 ；按出現順序排列)及hTR的模板/假結結構域的序列(底部，序列編號69)。大寫字母表示脊椎動物中保守性> 80%的殘基。圖;3B顯示了由31改編的hTR的二級結構模型，所述模型包括用RIPtide平臺篩選的不同RNA構建體的示意圖。圖4A顯示了相當于IOOnM的PKWT禾Π PKffT-I孵育Ih的聚類譜(cluster profile)。y軸表示匹配(hits)數(100之中)；χ軸表示所篩選的RNA構建體的核苷酸位置(相對于hTR的序列來表示)。圖4B顯示了強度在前10位的RIPtide匹配的排名及用未標記的PKWT-I測定的Kd值。圖4B按照出現順序，分別公開了序列編號觀至序列編號 30、序列編號11及序列編號31至序列編號36。圖4C顯示了采用標準(ΙΟΟηΜ，lh)孵育條件的HQ23和HQ59的聚類譜。與RIPtide比對的hTR序列的核苷酸表示在X軸上。圖 4D提供了對hTR的模板/假結域的2’ -0-甲基篩選的結果總結。在第二欄中，標示出了所鑒定出的共有RIPtide序列，其中，X代表具有不同長度的區域。在第三欄中，顯示了與 RIPtide5' -3’中部(第4位)位置比對的hTR的核苷酸位置。n. d.=未測定。數據表示三個獨立樣本的平均值士標準差。圖4D按照出現順序，分別公開了序列編號46至序列編號51。圖5顯示了 RNA孵育時間對PKWT-I聚類譜的影響。為了避免熒光飽和，在較長的孵育時間時，采用了較低的RNA靶標濃度。PKWT-I的序列編號對應于在所合成的構建體中的核苷酸位置(nt)，而不是對應于hTR序列中的核苷酸位置。隨時間延長，相比聚類I中的匹配數，聚類II中的匹配數顯示出了更高的積聚趨勢。圖6A-6C顯示了 hTR的假結域的2，_0_甲基RIPtide定位(mapping)。圖6A顯示了所選擇的RIPtide和未標記的全長hTR間的解離常數，所述解離常數以納摩爾單位表示。 根據灰度對聚類編號。圖 6A 公開了聚類 1-1、1-2、11-1、11-2、11_3、111-1、111-2、IV-U IV-21、V-2及V-3，其序列編號分別為序列編號37至序列編號38、序列編號觀、序列編號 11、序列編號12、序列編號14、序列編號15、序列編號39、序列編號19、序列編號25及序列編號26。圖6B顯示了 hTR的模板/假結域內可靶向的區域并將其標示在hTR核心的二級結構上。粗體表示的堿基代表針對熒光偏振研究的突變位點。大寫字母表示脊椎動物中保守性> 80%的殘基。數據表示三個獨立樣本的平均值士標準差，代表兩次獨立的實驗。圖 6B公開了序列編號69。圖6C顯示了 RIPtide-hTR Kd值的柱狀圖，根據RIPtide-hTR的相對的結合親和力制作。圖7A-7D顯示了表示hTR-RIPtide間相互作用的FP結合曲線的代償性突變研究。 用FAM標記RIPtide的3’末端。在突變的全長hTR、突變的RIPtide或兩者都存在的情況下，用FP測定法確認RIPtide的結合位點。圖7A顯示了 WT hTR和WT RIPtide的結合曲線；圖7B顯示了突變hTR和“野生型” RIPtide的結合曲線；圖7C顯示了 WT_hTR和“突變”RIPtide的結合曲線；圖7D顯示了突變hTR和突變RIPtide的結合曲線。對于各組經鑒定的聚類，圖6中顯示了所選擇的hTR突變位點。RIPtide在兩個中心堿基處被突變。所有突變都包括將這兩個連續的堿基替換為與它們互補的堿基。總而言之，該圖顯示了當其中一個結合伴侶中引入突變時，并未觀察到偏振加強。然而，在某些情況下，通過在hTR的假定結合位點處引入代償性突變，能夠重建若干個突變RIPtide與hTR的結合。使圖7B-7D 中顯示的偏振相對于WT-hTR進行再歸一化，RIPtide狀態如圖a。點為平均值；棒為標準差。實驗重復了三次。圖8A顯示了所選RIPtide的抗端粒酶活性。PD =磷酸二酯骨架，PS =磷硫酰 (phosphorothioate)骨架，2’ -OMe = 2’ -0-甲基。小寫字母表示磷硫酰鍵的存在。IC5tl 和Kd值以nM表示。PCR反應后，加入60 μ M RIPtide以控制PCR抑制。由序列衍生而來， 但是含有錯配的2’ -0-甲基RIPtide被用于評估序列特異性的影響。用斜體表示錯配: GGUGCAAGGC (序列編號 52)，G⑶GCCAGGC (序列編號 53)及 GCUGCAACGC (序列編號 54) (PD) 和GGUGCCAGGC (序列編號53)(完全用PS取代)。圖8Α公開了 IV_3、IV_4和IV-5，序列編號為20。圖8B顯示了 RIPtide IV-3對端粒酶的劑量-響應抑制。圖8C顯示了代表HeLa 細胞提取物中RIPtide IV-3對端粒酶活性抑制的TRAP凝膠(單次實驗)。1道60 μ M ； 2 道6μΜ ;3 道:600ηΜ ；4 道60ηΜ ；5 道6ηΜ ；7 道600ρΜ ；8 道60ρΜ ；9 道6ρΜ ;10 道 0. 6ρΜ。圖8D顯示了 DU145細胞中，所選擇的RIPtide IV-3和IV-5對端粒酶抑制的柱狀圖。用165nM RIPtide處理細胞Mh，重復三次。用Lipofectamine 2000作為轉染試劑。 處理后，裂解細胞，然后進行TRAP測定。將端粒酶活性相對于作為陰性對照的模擬轉染(不加RIPtide)進行歸一化。采用與模板區互補的2’ -0-甲基寡核苷酸(13聚體)作為陽性對照(TC)。IV-3錯配=GGUGCCAGGC(序列編號53) ；IV-5錯配=GGUGCCAGGC(序列編號 53)。n. d.=未測定。誤差棒是三次重復的標準差。至少進行2次實驗，具有類似的結果。圖9顯示了人端粒酶的多個結構組分。圖9A顯示了人端粒酶的CR4-CR5和假結/ 模板域。圖9A公開了序列編號70 ‘CAAUCCCAAUC，。圖9B顯示了包含J5/6環的CR4-CR5 域。圖9C顯示了用于結合CR4-CR5域的潛在靶位點(白色)。圖9D顯示了 CR4-CR5域的 J5/6環上的序列編號1結合靶位點的位置。圖9D公開了序列編號1 : ‘GCXUCCAG’。
具體實施例方式許多腫瘤類型都牽涉到端粒酶的不當表達。人端粒酶RNA組分(hTR)對于端粒酶全酶的活性是必需的。與人端粒酶RNA組分結合并干擾hTR在酶活性或調節中的作用的試劑可以成為端粒酶活性的抑制劑。本文所記載的是與hTR結合并抑制端粒酶活性的核酸試劑及其類似物。特別地， 本文記載了核酸，優選為核糖核酸及其類似物，這些物質與hTR兩個不同域中的一個結合， 這兩個域分別為CR4-CR5域和假結/模板域。本文提供了這些抑制劑核酸分子的具體序列，同時也提供了這些分子的多種核酸類似物，相對于天然存在的核酸分子，所述核酸類似物保留了與hTR結合及抑制端粒酶活性的能力，但它們進行了一種或多種修飾。本文還記載了在對其有需求的受試者體內抑制端粒酶活性的方法。本文還記載了通過給予本文記載的端粒酶抑制劑來治療癌癥的方法。本文還記載了核酸試劑及其核酸類似物在藥物制備中的用途，所述核酸試劑及其核酸類似物與hTR結合并抑制對其有需求的受試者體內端粒酶的活性。以下說明書為本文記載的這些方面中的方法及組合物提供了指導。端粒酶的RNA結構及其與功能的關系人端粒酶是一種專門的核糖核蛋白，它由兩個主要組分反轉錄酶蛋白亞基 (hTERT)和 RNA 組分(hTR)(序列編號 71) (J. Feng, Science 269,1236-1241(1995)； Τ. Μ. Nakamura, Science 277,911-912(1997))及數種相關蛋白構成。端粒酶利用RNA組分中的短序列作為模板，指導染色體末端的端粒重復序列(5’ -TTAGGG-3’ )的合成。端粒酶被認為是人類癌癥的幾乎通用的標記物，它對端粒長度的影響在避免復制性衰老中發揮了重要作用。本文所定義的“人端粒酶”指的是一種核糖核蛋白復合物，所述核糖核蛋白復合物在大多數真核生物中的各染色體3’端富含鳥嘌呤的DNA合成的過程中，反轉錄它的RNA 亞基的一部分，從而補償正常的DNA復制機器無法完全復制染色體末端的不足。人端粒酶全酶最少包含兩個主要組分，反轉錄酶蛋白亞基(hTERT)和“人端粒酶RNA組分”(本文中被稱為“hTR”)。不同物種的端粒酶RNA組分在大小上有很大的不同，序列同源性很小，但它們似乎擁有共同的二級結構以及重要的共同特征，所述共同特征包括模板、5’模板邊界元件、包括模板和假定的假結的大環(本文中被稱為“假結/模板區域”)以及閉環螺旋。可通過將hTR(序列編號71)的假結/模板(第33至192位核苷酸)和CR4/CR5域(第243 至3 位核苷酸)在體外加入到hTERT中來重建人端粒酶的活性，因而只有這些是催化活性需要的 hTR 結構域(V. M. Tesmer Mol Cell Biol. 19(9) :6207-16 (1999))。CR4-CR5域hTR (序列編號71)的CR4-CR5域(第243至3 位核苷酸)是真正的功能域和結構域。將CR4-CR5域提供到來自于RNA剩余部分的單獨的分子上時，能夠以反式提供并激活該酶(V. M. Tesmer Mol Cell Biol. 19(9) :6207-16(1999) ;J. R. Mitchell, Mol Cell. 6(2) :361-71 ^)00))。活化的端粒酶能夠與hTERT和hTR的兩個失活域進行功能性組裝，所述失活域包含假結/模板域和CR4-CR5域(V. M. Tesmer，Mol Cell Biol. 19(9) 6207-16(1999))。本文所定義的“CR4-CR5域”是端粒酶的體外及體內酶促活性所必需的兩個功能域之一，它由hTR(序列編號71)的對3-3沈位核苷酸組成。截短研究已經確定CR4-CR5域內的功能性必要區域包括三向接頭、L6. 1環及上行至且包含J6內部環的區域。J6內部環的移除會導致活性的消失，進一步刪除末端的莖-環對hTERT的結合或酶促活性沒有影響，從而確立了 CR4-CR5域的功能區邊界(J. R. Mitchell, Mol Cell. 6(2) 361-71(2000))οP6a/J6/P6b區的基本結構特征可以總結如下環狀區形成穩定的二級結構，兩個配對區P6a和P6b形成標準的A-型莖，但P6a被胞嘧啶凸起中斷。局部變形影響了整個區域的總體構象。兩個配對區的螺旋軸并不同軸，所述凸起帶來了很強的過度扭曲 (over-twist)，使RNA具有特殊的輪廓。J6環J6內部環在所有哺乳動物端粒酶中十分常見(J. L. Chen, Cell 100(5) 503-14(2000)) 0本文所定義的“J6”環是在鳥類中不存在但在魚類和半數爬行動物中都存在的基序。所述“J6”環是由hTR序列(序列編號71)的M6-256和300-323位核苷酸形成。發現序列編號1靶向的序列在J環(序列編號71的對8-255位核苷酸)內。在具有 J6內部環的生物中，除了南美栗鼠和豚鼠，首位的C和末位的U都是保守的，而南美栗鼠和豚鼠中首位和末位均為G的取代。這兩個核苷酸的保守性支持在結構整體中不常見的C/U 配對。環的3’鏈的首位通常是嘌呤，3’鏈的中間部位是多變的，但絕不會是G。使所述環結束并起始雙螺旋區段P6b的GC對是完全保守的。此外，完成可能的三聯體的267位可以是C或U，但絕不會是嘌呤。J6凸起的小腔顯示了它作為藥物靶標的潛能。由于J6凸起區對于CR4-CR5域的RNA與hTERT相互作用是必需的，因此，停駐在所述小腔內的小分子可以阻斷這種相互作用并消除端粒酶的活性(T. C. Leeper,RNA, 11 :394-403(2005)). J6內部環內的取代在體外對端粒酶活性具有不同卻實質性的影響(J.R. Mitchell，Mol Cell. 6(2)361-71 (2000))。該環的缺失可以徹底消除CR4-CR5域與hTERT相互作用及激活端粒酶功能的能力。在3’鏈上，從A⑶到UUA的取代僅能部分降低活性；C266和C267殘基可用AA 替換并仍保有活性。由于單個核苷酸可以在基本不破壞域的功能的情況下被替換，暗示該區域的關鍵功能特征在于由內部環帶來的結構扭曲。與該明顯的局部骨架扭曲相一致的是，該位點存在反轉錄酶的中斷(M. Antal,Nucleic Acids Res. 30(4) :912-20 (2002))。有假設提出，由內部環帶來的過度扭曲使CR4-CR5域能夠折疊到自身上或背向hTERT的活性位點表面折疊，從而形成酶促活性激活所必需的整體結構。這種方向的改變可能是J6內部環的主要作用。還有人提出，J6內部環的主要作用是結構性的，該結構性作用在于建立hTR在該區域內與hTERT蛋白間的相互作用。所述假結/模板域是hTR的體外和體內的端粒酶酶促活性必需的兩個功能域之一，另一個域為上述的CR4-CR5域。本文所定義的“假結/模板域”(序列編號71的33-192 位核苷酸)是hTR的功能域和結構域。憑借在端粒酶功能中的預測作用以及人端粒酶在該區域的突變與多種疾病相關，脊椎動物端粒酶中高度保守的假結/模板域已得到了廣泛的研究(J. L. Chen，Proc Natl Acad Sci USA. 101(41) :14683-4(2004) ； C. A. Theimer，Curr Opin Struct Biol. ,16(3) :307-18 (2006)) Feigon小組報道的人假結結構包含p2b螺旋和p3螺旋以及j2b/3環和jh/3 環，所述j2b/3環和j^i/3環包括93-121位核苷酸和166-174位核苷酸，其中U177由于穩定性原因被刪除。這些代表了形成保守的H型假結需要的所有殘基(C.A.Theimer，Mol Cell. 17(5) :671-82(2005))。所述假結形成高度有序的結構，所述結構具有位于p3螺旋大溝內的富含尿嘧啶的j2b/3環(U99-U106)以及位于p2b螺旋小溝內的富含腺嘌呤的 j2a/3環(C166-A17;3)。Bb/3環的U99-U101核苷酸與p3螺旋的前三個堿基對形成三個 U-A-U堿基三聯體(base triplets)，而j2a/3環的A171和A173位形成兩個非規范的堿基三聯體。所有這些三級相互作用都通過假結穩定性的突變和熱力學研究進行了驗證。重要的是，端粒酶活性與這些假結突變體的相對穩定性有關(C.A.Theimer，Mol Cell. 17(5) 671-82(2005)). p2b發卡結構中包含一串獨特的多聚嘧啶堿基對，所述多聚嘧啶堿基對包括三個U ·υ堿基對和由結構化的五元環加帽的、水介導的U-C堿基對(C. A. Theimer, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2) :449-54 (2003))。有趣的是，發現先天性角化不良相關的突變GC(107-8) AG穩定了 p2b發卡并使得假結構象不穩定。從結構上看，穩定性提高的基礎在于穩定化的類似YMNG的四元環結構(C. A. Theimer, RNA. 9(12) 1446-55 (2003))。對本文記載的方法和組合物有用的核酸及類似物本發明的一部分提供了用于抑制人端粒酶的核酸及其類似物，以及使用及篩選此類抑制劑的方法，所述核酸及其類似物與hTR(序列編號71)結合。本文所定義的術語“核酸”指共價連接在一起的核苷酸聚合物，例如，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個或者更多核苷酸。優選地，所述聚合物包含至少四個或至少六個核苷酸或其類似物。本領域技術人員可以理解，對單鏈的描述同時也確定了其互補鏈的序列。因此，核酸還提供了所描述單鏈的互補鏈。本領域技術人員還可以理解，對于給定的核酸，核酸的多種變體可用于相同的目的。因此，核酸還包括通過與端粒酶RNA組分(序列編號71)結合來抑制端粒酶活性的、本質上相同的核酸及其互補鏈。本領域技術人員還應當理解，單鏈提供了可在適當雜交條件下與靶序列雜交的探針，所述條件包括，例如嚴格的雜交條件。因此，核酸還包括可在適當的雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈、雙鏈或可以同時包含雙鏈部分和單鏈部分的序列。所述核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)(基因組DNA和cDNA)、核糖核酸(RNA)或同時包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的雜合體、以及堿基的組合，所述堿基包括但不限于尿嘧啶、腺嘌呤、 胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、假尿苷 (pseudorindine)、二氫尿苷、鳥嘌呤核苷(gueosine)、丫核苷、硫尿核苷、二氨基嘌呤、異鳥嘌呤核苷以及二氨基嘧啶。可通過化學合成方法或重組方法獲得核酸。核酸通常包含磷酸二酯鍵，然而，為了本發明的目的，還可以包括本文所定義的 “核酸類似物”，所述核酸類似物可以有至少一種不同的連接，例如2’ -0-甲基全磷硫酰骨架、甘油核酸(glycol nucleic acid)、LNA(鎖核酸)、2’_0_烷基取代、2’_0_甲基取代、磷酰胺、磷硫酰、二硫代磷酸酯或0-甲基亞磷酰胺鍵、磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸骨架以及肽核酸骨架和鍵。可由于多種原因對核酸進行修飾，從而產生“核酸類似物”。在某些實施方式中，核酸類似物被用于提高該類分子在生理環境中的穩定性和半衰期，或者在其它實施方式中用作生物芯片上的探針。其他核酸類似物包括具有正電骨架的核酸類似物、非離子骨架的核酸類似物和非核糖骨架的核酸類似物，包括美國專利5，235，033和5，034，506中所記載的核酸類似物，通過引用將其并入本文。本文所定義的“鎖核酸”指核苷酸或可選地，指核酸或其類似物，所述鎖核酸包含這樣的核苷酸，即用額外的、連接2’碳和4’碳的橋修飾核糖部分的核苷酸。所述橋將核糖 “鎖”在3’ -內型(endo)結構構象中，所述結構構象通常存在于A型DNA或RNA中。LNA核苷酸可在需要的情況下與本發明的核酸中的DNA或RNA堿基混合。該鎖定的核糖構象增強了堿基堆疊和骨架預組裝，于是極大的提高了熱穩定性(熔解溫度)。本文所使用的“甘油核酸(GNA) ”指骨架由重復的丙三醇單元組成的核酸，所述丙三醇單元通過磷酸二酯鍵相連。GNA中的丙三醇分子僅有三個碳原子，仍顯示出沃森-克里克堿基配對。本文所定義的 “肽核酸”(PNA)指由重復的N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元通過肽鍵連接組成骨架的核酸。不同的嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵與骨架相連。PNA的描述與肽相似，其N端為第一位 (左側)，C端在右側。本文所使用的“蘇糖核酸”(TNA)指由重復的蘇糖單元通過磷酸二酯鍵連接組成骨架的核酸。核酸類似物的定義中還包括包含一個或多個非天然存在的或經修飾的核苷酸的核酸分子。例如，經修飾的核苷酸類似物可位于所述核酸分子的5’末端和/或3’末端。 核苷酸類似物具代表性的示例可選自糖修飾或骨架修飾的核糖核苷酸。然而，應當指出， 核苷堿基得到修飾的核糖核苷酸，即，含有非天然存在的核苷堿基、而不是天然存在的核苷堿基的核糖核苷酸，同樣適用于本發明的目的，同時也包括在核酸類似物的定義中。所述核苷堿基得到修飾的核糖核苷酸包括但不限于5位修飾的尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷，例如 5-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷，5-溴尿嘧啶核苷；8位修飾的腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷，例如8-溴鳥嘌呤核苷；脫氮核苷酸，例如7-脫氮-腺嘌呤核苷；0-烷基化和N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺嘌呤核苷。還包括對2’ OH基團的修飾，例如可用選自如下組中的基團對2，OH基團進行替換的那些修飾汨、(《、1 、鹵素、5!1、31 、朋2、朋1 、殿2或0隊其中，1 是C-C6烷基、烯基或炔基，鹵素為F、Cl、Br或I。可以制備天然存在的核酸及類似物的混合物；可選地，也可制備不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸及類似物的混合物。本文所使用的術語“衍生物”指經過化學修飾的核酸，例如，完成所述化學修飾的技術包括但不限于甲基化、乙酰化或添加其它分子的技術。本文所使用的“變體”指多核苷酸，例如，與參比多核苷酸相比(例如與野生型多核苷酸相比)，核酸或核酸類似物在其一級、二級或三級結構上會有所不同。變體也可以是序列編號1的反義核酸鏈，與序列編號1 互補的反義核酸鏈相比，所述反義核酸鏈在任意八個連續的核苷酸中含有至少一處、至少兩處、至少三處、至少四處、至少五處、至少六處或至少七處差異。變體也可包括一個或多個尿嘧啶核苷(“U”)被胸腺嘧啶核苷(“T”)替換的任意核酸，或者如另一個非限制性實施例，一個或多個胸腺嘧啶核苷(“T”)被尿嘧啶核苷(“U”)替代。本文所提及的關于核酸或核酸類似物序列的術語“差異”或“不同于”指核酸取代、缺失、插入和改變，以及非核酸分子或本文所公開的合成核苷酸或相對于正義鏈的核酸類似物的插入。可通過現有技術中的多種已知方法將本發明的核酸或核酸類似物導入細胞，例如通過轉染、脂質轉染、電穿孔、基因槍、被動吸收、脂質-核酸復合物、病毒載體轉導、注射、 裸DNA等。在某些實施方式中，可通過載體或質粒導入本發明的核酸及核酸類似物。本文所使用的術語“載體”與“質粒”可互換使用，表示核酸分子，該核酸分子能夠傳遞與其連接的另外的核酸。本文將能夠指導基因和/或核酸序列表達的載體稱為“表達載體”，所述基因和/或核酸序列可操作地與載體相連。一般而言，用于重組DNA技術的表達載體通常都是“質粒”的形式，所述“質粒”是指環狀雙鏈DNA環，所述“質粒”的載體形式并未與染色體結合，典型地，所述“質粒”包括用于編碼DNA的穩定表達或瞬時表達的實體。 本文所公開的方法中，還可使用其它表達載體，舉例來說，但不限于質粒、附加體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體或病毒載體，這些載體可以整合到宿主的基因組中，或在特定細胞中自主復制。載體可以是DNA或RNA載體。還可以使用本領域技術人員知曉的其它類型的可發揮等同功能的表達載體，例如自主復制的染色體外載體或整合到宿主基因組中的載體。優選的載體是能夠自主復制和/或能夠表達與其連接的核酸的載體。本文所使用的短語“與……結合”是指核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分(序列編號71)的結合，用現有技術中已知的方法(如本文所記載的熒光偏振、或使用例如 BIAcore、表面等離子共振系統和BIAcore動力學評定軟件(例如，2. 1版本)的表面等離子共振分析)測定得到的所述結合的解離常數(Kd)為IyM以下。在某些實施方式中，特定的結合相互作用的親和力或Kd(解離常數)為900ηΜ以下、800ηΜ以下、600ηΜ以下、500ηΜ以下、400ηΜ以下、300ηΜ以下或200ηΜ以下。更優選地，所述親和力或Kd為IOOnM以下、90ηΜ 以下、80ηΜ以下、70ηΜ以下、60ηΜ以下、50ηΜ以下、45ηΜ以下、40ηΜ以下、35ηΜ以下、30ηΜ以下、25ηΜ以下、20ηΜ以下、15ηΜ以下、12. 5ηΜ以下、IOnM以下、9ηΜ以下、8ηΜ以下、7ηΜ以下、 6ηΜ以下、5ηΜ以下、4ηΜ以下、3ηΜ以下、2ηΜ以下或InM以下。本文所使用的術語“高親和力結合”是指Kd小于或等于IOOnM的結合。本文還提供了用于本發明的方法和組合物的核酸分子或其類似物的篩選方法，并進一步在實施例中以非限制性的方式進行了說明。RNA-相互作用的多核苷酸(下文中稱為 “RIPtide” )是近年來有記載的基于核酸的藥物，相比標準的未經修飾的DNA寡核苷酸，它具有改進的性質。RIPtide具有能與高度結構化的RNA靶標高結合親和力并高特異性結合的能力，從而調節RNA靶標的功能。在某種程度上，本發明用于靶向結構化RNA的方法涉及通過微陣列方法發現短的寡核苷酸序列，正如其內在折疊類型所決定的，所述寡核苷酸序列能夠停駐在預組織的RNA位點內。對于RIPtide的發現方法，使用并制造2’ _0_甲基-核糖核苷酸微陣列， 所述微陣列是通過基于光致抗蝕劑的合成(A. Pawloski，J. Vac. Sci. Technol. B 25， 2537-2546(2007))從Affymetrix公司定制的規格。如圖1所示，該2’_0_甲基RIPtide微陣列的生成是為了引入所有可能的長度為4聚體到8聚體的序列，一共有87，296個探針。 本工作中記載的微陣列構成了迄今為止報道的高密度2’ -0-甲基寡核苷酸微陣列的首個用途，所述微陣列被用于篩選人端粒酶RNA組分(hTR)(序列編號71)的不同RNA構建體。端粒酶抑制劑及使用方法通過提供與人端粒酶RNA組分結合的抑制劑，本文記載了用于抑制人端粒酶的組合物和方法，所述組合物和方法包括與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域和假結/模板域結合的抑制劑。因此，一方面，提供了端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合的抑制劑是核酸類似物。另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。本文所記載的抑制劑是端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1 至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列組成。序列編號1 :5，-GCCUCCAG-3，序列編號2 :5，-GCCTCCAG-3，序列編號3 :5，-GCCUCCAU-3，序列編號4 :5，-GCCUCCUA-3，序列編號5 :5，-GCCUCCCC-3，序列編號6 :5，-GCCUCCA-3，序列編號7 :5，-GCCUCC-3，序列編號8 :5，-GCCUCCAA-3，序列編號9 :5，-GCCCAACU-3，序列編號10 :5，-GCCCAACT-3，在另一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2。本發明的另一方面提供了抑制端粒酶活性的方法。本文所記載的抑制端粒酶活性的方法包括使用核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。在一種方法中，使端粒酶與核酸或其核酸類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。在特定實施方式中，所述核酸是核糖核酸。在其它實施方式中，所述核酸是核酸類似物。在其它特定實施方式中，所述核酸是核糖核酸類似物。 本文所記載的與端粒酶接觸的抑制劑是端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA 組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1 至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列組成。在另一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2中的序列，或可選地基本上由序列編號1 或序列編號2中的序列組成，或進一步可選地由序列編號1或序列編號2中的序列組成。與將端粒酶與核酸或其類似物接觸(所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合)相關，“抑制端粒酶活性”或“端粒酶活性的抑制”表示與可比的對照端粒酶(其中不存在與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其核酸類似物)相比，在用核酸或其核酸類似物處理過的端粒酶中，端粒酶活性至少下降5%，所述核酸或其核酸類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。可用本領域技術人員已知的任何測定法或方法測定端粒酶活性，例如，所述測定法或方法包括但不限于本文所記載的TRAP活性測定法。 與對照處理的端粒酶相比，在用與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其核酸類似物處理過的端粒酶中，優選端粒酶的活性至少下降10%、至少下降15%、至少下降20%、 至少下降25%、至少下降30%、至少下降35%、至少下降40%、至少下降45%、至少下降 50%、至少下降55%、至少下降60%、至少下降65%、至少下降70%、至少下降75%、至少下降80 %、至少下降85 %、至少下降90 %、至少下降95 %、至少下降98 %、至少下降99 %、包括下降100% (即沒有可檢測到的活性)。在另一種方法中，使細胞與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。在特定實施方式中，所述核酸是核糖核酸。在其它實施方式中，所述核酸是核酸類似物。在其它特定實施方式中，所述核酸是核糖核酸類似物。本文所記載的與細胞接觸以抑制端粒酶活性的抑制劑是端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與細胞接觸的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列。在另一種實施方式中，所述與細胞接觸并與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包括序列編號1或序列編號2的序列。與將細胞與核酸或其類似物接觸(所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合)相關，“抑制端粒酶活性”或“端粒酶活性的抑制”表示與可比的對照細胞(其中不存在與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其核酸類似物)相比，在用核酸或其類似物處理過的細胞中，端粒酶活性至少下降5%，所述核酸或其核酸類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。與對照處理的細胞相比，在用與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其核酸類似物處理過的細胞中，優選端粒酶的活性至少下降 10%、至少下降15%、至少下降20%、至少下降25%、至少下降30%、至少下降35%、至少下降40 %、至少下降45 %、至少下降50 %、至少下降55 %、至少下降60 %、至少下降65 %、 至少下降70 %、至少下降75 %、至少下降80 %、至少下降85 %、至少下降90 %、至少下降95%、至少下降98%、至少下降99%、包括下降100% (即沒有可檢測到的活性)。本文所使用的短語“對照處理的端粒酶”或“對照處理的細胞”是用于描述用相同的培養基、病毒引入、核酸序列、溫度、融匯率、燒瓶尺寸、PH等處理的端粒酶或細胞，只是在 “對照處理的端粒酶”或“對照處理的細胞”中，并不加入核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。本文還記載了通過提供與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的抑制劑，來提供抑制人端粒酶的方法和組合物。因此，一方面，提供了端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的核糖核酸分子或其類似物，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號11至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。 在另一種實施方式中，所述端粒酶抑制劑結合序列包含序列編號20的序列，或可選地基本上由序列編號20的序列組成，或進一步可選地由序列編號20的序列組成。
0096]序列編號11GUCAGCGA(II-2)0097]序列編號12:AGCGAGAA(II-3)0098]序列編號13GUCAGCGAGAAA(II-5)0099]序列編號14=GGAGCA(II1-1)0100]序列編號15:GGAGCAAA(III-2)0101]序列編號16:GGAGCAAAAGCA(III-3)0102]序列編號17:GGAGCAAAAG(III-4)0103]序列編號18:GGGAGCAAAA(III-5)0104]序列編號19:GAACG⑶G(IV-2)0105]序列編號20:GGUGGAAGGC(IV-3)0106]序列編號21:GAACGGUGGAAGGC(IV-4)0107]序列編號22:ACGGUGGAAGGC(IV-6)0108]序列編號23:GGUGGAAG(IV-7)0109]序列編號24:GGUGGAAGG(IV-8)0110]序列編號25:AGG⑶UAG(V-2)0111]序列編號26:A⑶UAGG (V-3)0112]序列編號27:GUCAGCGAGAAAA0113]序列編號28:CAGCGAGA0114]序列編號29:GACAGCGC0115]序列編號30:CAGCGAGG0116]序列編號31:ACAGCGAG0117]序列編號32:AACAGCGC0118]序列編號33CAGCGAG0119]序列編號34:UCAGCGAG
序列編號35:ACAGCGCA序列編號36:AGUCAGCG序列編號37:AACAGCGC序列編號38:ACAGCGC序列編號39GAAGGCG序列編號40:GGGAGCAAAA序列編號41:GCGGGAGCAAAA序列編號42GAAGGCG序列編號43:GGUGGAAGGC序列編號44:CGGUGGAAGG序列編號45:GAACGGUGGAA本發明的另--方面提供了抑制端粒酶活性的方法，所述方法包含使用核·瘦或其類
似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合。在一種這樣的方法中，使細胞與核糖核酸分子或其類似物接觸，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA 組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號11至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列， 或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶結合序列包含序列編號20的序列，或可選地基本上由序列編號20的序列組成，或進一步可選地由序列編號20的序列組成。本文所使用的術語“細胞”是指任何真核細胞或原核細胞，包括植物、酵母、蠕蟲、 昆蟲和哺乳動物的細胞。包括但不限于哺乳動物細胞；包括但不限于靈長類、人類及來自于任何感興趣的動物的細胞；小鼠、倉鼠、兔子、狗、貓、轉基因動物、家養動物，如馬科動物、 牛科動物、鼠科動物、羊科動物、犬科動物、貓科動物等。所述細胞可以是很寬泛的多種組織類型，例如但不限于造血組織、神經組織、間葉組織、皮膚組織、粘膜組織、基質組織、肌肉組織、脾組織、網狀內皮組織、上皮組織、內皮組織、肝組織、腎組織、胃腸組織、肺組織、T細胞等。還包括干細胞、胚胎干(EQ細胞、ES-衍生細胞及干細胞的祖細胞，包括但不限于造血干細胞、基質干細胞、肌肉干細胞、心血管干細胞、肝干細胞、肺干細胞、腎干細胞、胃腸干細胞等。本發明還可使用酵母細胞作為細胞。由于特定的改變或環境的影響(例如分化)，子代細胞事實上可能與親代細胞并不相同，但仍包括在本發明的范圍內，因此，細胞并不特指某受試細胞，而是指該細胞的子代細胞或潛在的子代細胞。本發明所使用的細胞還可以包括培養的細胞，例如體外或離體培養的細胞。例如在培養基中體外培養的細胞。可選地，對于離體培養的細胞，可從受試者處獲取細胞，其中，所述受試者是健康的和/或患病的。作為非限制性的示例，可通過本領域技術人員已知的活組織切片或其它外科方法獲取細胞。 本發明所使用的細胞可以存在于受試者內，例如體內。對于本發明對體內細胞的應用，所述細胞優選存在于受試者內，并顯示出疾病、病癥或惡性腫瘤病理學的特征。本文所使用的術語“樣本”或“生物樣本”是指任何樣本，包括但不限于細胞、有機體、裂解的細胞、細胞提取物、核提取物、或細胞或有機體的組分、細胞外液及培養細胞所用的培養基。端粒酶抑制劑的治療應用在特定的方面，本發明提供了治療多種病癥的方法和組合物。所述方法包含給予對其有需求的受試者治療上有效量的本文所記載的一種或多種端粒酶抑制劑。本文所記載的、用于在對其有需求的受試者中抑制端粒酶活性的治療方法包含使用核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。因此，一方面提供了在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含給予所述受試者有效量的端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。 在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。本文所記載的用于在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的抑制劑是端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1 至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列組成。在優選的實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2中的序列，或可選地基本上由序列編號1或序列編號2中的序列組成，或進一步可選地由序列編號1或序列編號2中的序列組成。在一種實施方式中，受試者中，被治療的所述增生性病癥是癌癥。另一方面，提供了端粒酶抑制劑的用途，所述用途包含有效量的核酸或其類似物在制造治療對其有需求的受試者中的增生性病癥的藥物中的用途，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。本文所記載的用于在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的抑制劑是端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1 至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列組成。在優選的實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2中的序列，或可選地基本上由序列編號1或序列編號2中的序列組成，或進一步可選地由序列編號1或序列編號2中的序列組成。在一種實施方式中，受試者中，被治療的所述增生性病癥是癌癥。本文還記載了用于在對其有需求的受試者中抑制端粒酶活性的治療方法，所述方法包含使用核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結
I=I ο因此，一方面提供了在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含給予受試者有效量的端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的核酸或其類似物，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號11至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述核糖核酸分子或其核糖核酸類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶結合序列包含序列編號20的序列，或可選地基本上由序列編號20的序列組成，或進一步可選地由序列編號20的序列組成。在一種實施方式中，所述增生性病癥是癌癥。本發明的另一方面提供了有效量的端粒酶抑制劑的用途，所述用途包含核糖核酸分子或其類似物在制備治療對其有需求的受試者中的增生性病癥的藥物中的用途，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合。在一種實施方式中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號11至序列編號45組成的組。在一種實施方式中，所述核糖核酸分子或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成， 或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號19至序列編號對、序列編號 39、序列編號44和序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述端粒酶結合序列包含序列編號20的序列，或可選地基本上由序列編號20的序列組成，或進一步可選地由序列編號20的序列組成。在一種實施方式中，所述增生性病癥是癌癥。關于本文所公開的通過給予受試者有效量的端粒酶抑制劑來治療對其有需求的受試者中的增生性病癥的方法，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，其中的術語“治療 (treat) ”或“治療(treatment) ”或“治療(treating) ”是指有療效的治療及預防性或保護性的措施，其中，以臨床上合適的方式進行給藥，防止或減緩了病癥的發展，例如減緩了腫瘤的發展或癌癥的擴散，或減少了病狀、疾病或病癥的至少一種影響或癥狀，所述病狀、疾病或病癥與細胞群的不當增殖相關，例如癌癥。如本文所定義的，如果減少了一種或多種癥狀或臨床標記物，治療通常是“有效的”。可選地，如果疾病進展減緩或停止，治療是“有效的”。也就是說，“治療”不僅包括癥狀或標記物的改善，還包括進展停止或至少是減緩，或不進行治療時，預期癥狀會發生惡化的情況。無論是否可以檢測到，有益的或所希望的臨床結果包括但不限于一種或多種癥狀的減輕、病癥程度的削弱、病癥狀態的穩定化(即不再惡化)、病癥進展的延遲或減緩、病癥狀態的改善或緩和、以及癥狀減退(無論是部分還是整體)。與沒有接受治療的預期存活相比，“治療”還意味著延長存活。需要治療的受試者包括已經診斷出癌癥的受試者以及那些由于轉移(metastasis)很可能會發展為繼發性腫瘤的受試者。本文所使用的術語“有效的”和“有效性”包括藥理學的有效性和生理學的安全性。 藥理學的有效性是指在受試者中所述治療產生所希望的生物學效應的能力。因此，關于給予受試者有效量的端粒酶抑制劑，“有效量”的端粒酶抑制劑表示以臨床上合適的方式進行給藥后，在至少是具有統計學顯著性的部分患者中產生有益的影響，如癥狀的改善、治愈、 疾病負荷的減輕、腫瘤塊減小或細胞數下降、壽命延長、生活質量提高或其它通常被醫生認為是陽性的影響，該醫生精通受試者所需要治療的特定類型的癌癥。生理學的安全性是指由治療給藥導致的毒性水平或其它細胞水平、器官水平和/或有機體水平的有害生理學影響(通常被稱為副作用)。“不太有效”意味著所述治療引起了治療上明顯較低水平的藥理學的有效性和/或治療上較高水平的有害生理學影響。術語“治療上有效量”還表示在患有癌癥的受試者中，足以安全地防止或延遲腫瘤發展及進一步增長或轉移擴散的量。因此，所述量能夠治愈癌癥或使癌癥減退、減緩癌癥進展過程、減緩或抑制腫瘤生長、減緩或抑制腫瘤轉移、減緩或抑制在轉移位點處繼發性腫瘤的生成、或抑制新的腫瘤轉移的形成。治療癌癥的有效量取決于待治療的腫瘤、腫瘤的嚴重性、腫瘤的藥物耐受水平、接受治療的物種、受試者的年齡和身體狀況、給藥模式等。因此， 并不可能具體指定單一的、確切的“有效量”。然而，在任何給定的情況下，只需采用常規的實驗手段，本領域的普通技術人員就可確定合適的“有效量”。用于抑制端粒酶活性的治療上有效量的試劑、因子或本文所記載的抑制劑、或其功能性衍生物可以根據以下因素而改變如疾病狀態、年齡、性別、受試者的體重以及治療化合物在個體或受試者中引發所需響應的能力。治療上有效量還是這樣的量，即所述量的治療試劑帶來的治療上的有益影響超過了其所帶來的任何毒性或有害影響。本領域技術人員根據現有技術中已經建立的方法，不需要過多的實驗手段，就可憑經驗確定每個個體案例中的有效量。例如，可在癌癥和腫瘤動物模型(即治療患有癌癥的嚙齒類動物)中測定效力，可引起癌癥的至少一種癥狀減輕(例如腫瘤尺寸的減小、或腫瘤生長速率的減緩或停止)的任何治療或組合物或制劑的給藥，都意味著有效的治療。在將端粒酶活性抑制劑被用于癌癥治療的實施方式中，可以利用癌癥實驗動物模型(例如野生型小鼠或大鼠)或腫瘤細胞移植來判斷效力。利用實驗動物模型時，癌癥癥狀的減輕(例如與未治療的動物相比，在經過治療的動物中，腫瘤尺寸的減小、或腫瘤生長速率的減緩或停止發生的較早)便可證實治療的效力。“較早”是指例如，腫瘤尺寸減小發生的時間至少早于5%，但是優選更早，例如，早1 天、早2天、早3天或更早。當涉及到癌癥的治療時，本文所使用的術語“治療”通常是指癌癥癥狀的減輕和/或癌癥生物化學標記物的減少，例如，至少一種癌癥癥狀減輕至少約 10%、或至少一種癌癥生物化學標記物減少至少約10%時，便被認為是有效的治療。在某些實施方式中，當癌癥癥狀減輕或癌癥生物化學標記物減少至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100% (即不再有任何癥狀或生物化學標記物完全消失)時，可被認為是有效的治療。所述癌癥生物化學標記物的示例包括CD44、端粒酶、TGF-α、TGF-β、erbB_2、erbB_3、MUCU MUC2、 CK20、PSA、CA125和FOBT。本文所公開的方法中，若癌細胞增殖速率下降至少約10%，也可被認為是有效的治療。本文所公開的方法中，作為可選的例子，癌癥癥狀減輕，例如，癌癥增長速率減緩至少約10%、或腫瘤尺寸的增加停止或腫瘤尺寸減少至少約10%、或腫瘤擴散 (即腫瘤轉移)下降至少約10%時，也可被認為是有效的治療。在某些實施方式中，優選但并不必須要求治療試劑實際上殺死腫瘤。“癌癥”是指存在具有癌癥誘發細胞的典型特征的細胞，這些特征例如失控增殖、 永生、轉移潛能、快速的生長和增殖速率以及特定的特征性的形態學特征。通常，癌細胞是以腫瘤的形式存在，但這類細胞也可在患者內單獨存在，或可以是非腫瘤發生的癌細胞，如白血病細胞。在某些情況下，癌細胞會以腫瘤的形式存在；這類細胞可以局部存在，或作為獨立的細胞在血流中循環，例如白血病細胞。癌癥的示例包括但不限于乳腺癌、黑素瘤、腎上腺癌、膽道癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌癥、支氣管癌、胚細胞瘤、惡性瘤、軟骨肉瘤、口腔或喉咽癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、食管癌、胃腸癌、惡性膠質瘤、肝細胞癌、 惡性肝細胞瘤、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、 外周神經系統癌、前列腺癌、肉瘤、唾液腺癌、小腸或盲腸癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、泌尿膀胱癌、子宮或子宮內膜癌及外陰癌。本文中的術語“受試者”和“個體”可互換使用，指的是動物，例如本文所記載的可獲取細胞的人類。對于針對特定動物(如受試人)的特定病狀或病態的治療，所述術語受試者指的是那個特定的動物。術語“哺乳動物”旨在包括單個“哺乳動物”及多個“哺乳動物”， 包括但不限于人類；靈長類，如類人猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科動物，如狗和狼；貓科動物，如貓、獅子和老虎；馬科動物，如馬、驢和斑馬；食用動物，如牛、豬和羊；有蹄類動物，如鹿和長頸鹿；嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；及熊。在某些優選的實施方式中，哺乳動物是人類。本文中的“非人動物”和“非人哺乳動物”可互換使用，包括如大鼠、小鼠、 兔子、羊、貓、狗、牛、豬和非人靈長類在內的哺乳動物。術語“受試者”同樣包括任何脊椎動物，包括但不限于哺乳動物、爬行動物、兩棲動物和魚類。然而，有利地，所述受試者是哺乳動物(如人類)，其它哺乳動物(如家養哺乳動物(例如狗、貓、馬等)或生產哺乳動物(例如牛、羊、豬等))也包括在所述術語受試者中。關于在對其有需求的受試者中給予有效量的端粒酶抑制劑，給藥途徑可以是靜脈 (I. V.)給藥、肌肉內(I.M.)給藥、皮下(S. C.)給藥、皮內(I.D.)給藥、腹腔內(I. P.)給藥、鞘內(I.T.)給藥、胸膜內給藥、子宮內給藥、直腸給藥、陰道給藥、外用給藥、腫瘤內給藥等。本發明的組合物和抑制劑可通過注射進行非腸道給藥；或隨時間逐漸灌注，通過蠕動的方式進行遞送。可通過經粘膜或經皮方式給藥。對于經粘膜或經皮給藥，制劑中使用了針對待滲透的屏障合適的滲透劑。所述滲透劑是現有技術中所公知的，例如對于經粘膜給藥， 包括膽汁鹽和夫西地酸衍生物。此外，可使用去污劑來促進滲透。例如，可以通過鼻腔噴霧或使用栓劑進行經粘膜給藥。對于口服給藥，本發明的化合物被制劑成常規的口服給藥形式，如膠囊劑、片劑和補品(tonics)。對于外用給藥，藥物組合物(即端粒酶活性抑制劑) 被制劑為現有技術中熟知的軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。本發明的治療組合物可以通過靜脈， 例如通過注射單位劑量的治療組合物而給藥。當涉及到本發明的治療組合物時，術語“單位劑量”是指對于受試者而言適合作為單次劑量的、物理上分離的單位，每個單位含有預先確定量的活性物料及所需要的稀釋劑(即載體或賦形劑)，經過計算，所述預先確定量的活性物料能夠產生所希望的療效。所述組合物以治療上有效的量，通過可與制劑相匹配的方式進行給藥。待給藥的量和時限取決于待治療的受試者、受試者全身利用活性成分的能力及所希望的療效程度。一般而言，對于本發明的核酸或其類似物端粒酶抑制劑的使用，可以采用遞送核酸分子的任何方法(例如，參見 Akhtar S.和 Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5) 139-144 ；W094/02595，通過引用將其全部并入本文)。將端粒酶抑制劑遞送至靶細胞(例如癌細胞或其它所希望的靶細胞)以使靶細胞吸收的方法可以包括注射含端粒酶抑制劑(例如特異性針對人端粒酶的CR4/CR5結構域或假結/模板域的核酸或核酸類似物)的組合物，或直接將細胞(例如淋巴細胞)與含端粒酶抑制劑(例如特異性針對人端粒酶的CR4/ CR5結構域或假結/模板域的核酸或核酸類似物)的組合物接觸。
為了成功地在體內遞送核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑，需要考慮的重要因素包括，例如(1)所述核酸或核酸類似物的生物學穩定性；( 防止非特異性影響；及C3)所述核酸或核酸類似物分子在靶組織中的積聚。可通過局部給藥(例如直接注射到腫瘤、細胞、 靶組織中，或者外用給藥)來使端粒酶抑制劑的非特異性影響最小化。將端粒酶抑制劑分子局部給藥至治療位點，限制了例如特異性針對人端粒酶的CR4/CR5結構域或假結/模板域的核酸或核酸類似物暴露于全身組織中，從而可以使用較低劑量的、待給藥的核酸或核酸類似物分子(例如 Tolentino，MJ.等(2004) Retina 24:132-138 ；Reich, SJ.，等(2003) Mol. Vis. 9 :210-216)。對于用于疾病治療的核酸或其類似物端粒酶抑制劑的全身給藥，可對核酸或核酸類似物進行修飾，或可選地，利用藥物遞送系統進行遞送，由此將暴露于降解因子中的情況減到最小，從而起到防止核酸或其類似物端粒酶抑制劑被例如體內的核酸內切酶和核酸外切酶快速降解的作用。對所述核酸或其類似物端粒酶抑制劑或制藥載體的修飾，也可以使其靶向到靶組織，避免不希望的脫靶效應。可以通過與親脂基團(如膽固醇)的化學綴合來修飾核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑，從而增加細胞吸收并防止降解(Soutschek, J.等(2004)Nature 432:173-178)， 核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑也可與適配體綴合，從而抑制腫瘤生長并介導腫瘤消退 (McNamara, J0.等 Q006)Nat. Biotechnol. 24 :1005-1015)。在其它實施方式中，可利用藥物遞送系統(如，例如納米顆粒、樹狀高分子、聚合物、或脂質體或陽離子遞送系統)進行核酸或其類似物端粒酶抑制劑的遞送。正電性的陽離子遞送系統促進了結合(核酸帶負電)并增強了負電性的細胞膜處的相互作用，從而使得細胞可以有效吸收。陽離子脂質、樹狀高分子或聚合物可以與核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑結合，也可以引入以形成囊泡或膠束(參見，例如Kim SH.等(2008) Journal of Controlled Release 129(2) :107-116)，所述囊泡或膠束包裹核酸或核酸類似物。囊泡或膠束的形成進一步防止全身給藥時的降解。本領域技術人員掌握陽離子核酸或核酸類似物復合物的制造及給藥方法(參見，例如Sorensen，DR.等(2003) J. Mol. Biol 327 761-766 ；Verma, UN.等(2003)Clin. Cancer Res. 9 :1291-1300 ；Arnold, AS ^ (2007) J. Hypertens. 25 :197-205)。對于核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑的全身給藥，有用的藥物遞送系統的非限制性示例包括 DOTAP (Sorensen, DR.等(2003)，同上；Verma, UN.等，(2003)，同上)、Oligofectamine、"固體核酸脂質顆粒”(Zimmermann，TS.等，Q006)Nature 441 111-114)、心磷脂(Chien, PY.等(2005)Cancer Gene Ther. 12 :321-328 ；Pal, Α.等 (2005) Int J. Oncol.洸1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.等，(2008)Pharm. Res., 8 月 16 日在印刷前的網上公布(Epub) ；Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659)、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽(Liu, S. (2006)Mol.Pharm. 3 =472-487)及聚酰胺胺(polyamidoamine)(Tomalia, DA.等(2007)Biochem. Soc. Trans. 35 :61-67 ；Yoo, H.等 (1999) Pharm. Res. 16 1799-1804)。在某些實施方式中，核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑與環糊精形成復合物以進行全身給藥(美國專利No. 7，427，605)。在其它實施方式中，核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑，例如特異性針對人端粒酶的CR4/CR5結構域或假結/模板域的核酸或類似物，可以通過例如流體注射或導管插入法直接注射到任何血管(如靜脈、動脈、小靜脈或小動脈)中。可以通過單次注射、或通過兩次或多次注射給藥。在藥學上可接受的載體中遞送所述核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑。 可以同時使用一種或多種核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑。在一種實施方式中，靶向的是特定的細胞，限制了由所述核酸或核酸類似物端粒酶抑制劑的非特異性靶向引起的潛在的副作用。例如，該方法可以采用復合物或融合分子(例如抗體-魚精蛋白融合蛋白)，所述復合物或融合分子包含細胞靶向部分和核酸或核酸類似物結合部分，所述核酸或核酸類似物結合部分用于將核酸或核酸類似物有效地遞送至細胞。也可采用質粒介導或病毒介導的遞送機制來將核酸或核酸類似物遞送至體外或體內的細胞中(Xia，H.等Q002)Nat Biotechnol 20(10) :1006) ；Rubinson, D. A.等((2003) Nat. Genet. 33 :401-406 ；Stewart, S. Α.等((2003) RNA 9:493-501)。包含端粒酶抑制劑的藥物組合物本文還記載了藥物組合物及其給藥模式，所述藥物組合物包含抑制端粒酶活性的核酸或其類似物。因此，一方面，提供了治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑和藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分CR4-CR5域結合的核酸是核糖核酸。 在另一種實施方式中，所述抑制劑是核酸類似物。在另一種實施方式中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。本文所記載的抑制劑是與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域的J5/J6環結合的抑制劑。在一種實施方式中，所述與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合的端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號 10組成的組中的序列組成。在優選的實施方式中，所述端粒酶抑制劑包含序列編號1或序列編號2中的序列，或可選地基本上由序列編號1或序列編號2中的序列組成，或進一步可選地由序列編號1或序列編號2中的序列組成。相應地，本發明另一方面提供了治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑和藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合的核酸或其類似物。在一種實施方式中，所述核酸分子(例如核糖核酸分子)或其類似物包含結合序列，或可選地基本上由結合序列組成，或進一步可選地由結合序列組成，所述結合序列選自序列編號11至序列編號45組成的組。在另一種實施方式中，所述核糖核酸分子或其類似物的結合序列包含選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號 44和序列編號45組成的組，或可選地基本上由選自序列編號19至序列編號M、序列編號 39、序列編號44和序列編號45組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號19 至序列編號對、序列編號39、序列編號44和序列編號45組成的組中的序列組成。在另一種實施方式中，所述端粒酶結合序列包含序列編號20的序列，或可選地基本上由序列編號 20的序列組成，或進一步可選地由序列編號20的序列組成。可以使用本領域技術人員所熟知的適于預期用途的任何制劑或藥物遞送系統，所述制劑或藥物遞送系統含有抑制端粒酶活性所需要的活性成分。本文所使用的術語“藥學上可接受的”、“生理學上可容忍的”及其語法上的變體，當涉及到組合物、載體、稀釋劑及試劑時，是可以互換使用的，表示的是在合理的醫療判斷范圍內的那些化合物、物料、組合物和/或劑型，所述化合物、物料、組合物和/或劑型適于與人類和動物的組織接觸的用途，不會產生過多的毒性、刺激、過敏反應或其它問題或并發癥，與合理的收益/風險比相稱。本文所使用的短語“藥學上可接受的載體”表示藥學上可接受的物料、組合物或賦形劑，如液體或固體充填劑、稀釋劑、輔料、溶劑或包封物料，所述“藥學上可接受的載體”與本文所記載的核酸或其類似物聯合，用于所述核酸或其類似物的體內遞送。各載體除了如本文所定義的術語“藥學上可接受的”以外，還必須是“可接受的”， 即能夠與制劑中的其它成分相容。藥物制劑含有與藥學上可接受的一種或多種成分聯合的本發明的化合物。所述載體可以是固體稀釋劑、半固體稀釋劑或液體稀釋劑的形式、乳劑形式或膠囊劑形式。這些藥物制品也是本發明的目的。通常，活性化合物的含量占制品重量的0. 1-95% ；非腸道給藥時，優選占制品重量的0. 2-20% ；口服給藥時，優選占制品重量的 1-50%。對于本發明的方法的臨床用途，本發明的靶向遞送組合物被制劑成用于非腸道給藥(例如靜脈給藥；粘膜給藥，例如鼻內給藥；小腸內給藥，例如口服；外用，例如經皮給藥； 眼部給藥，例如通過角膜劃痕法；或其它給藥模式)的藥物組合物或藥物制劑。所述藥物組合物含有與藥學上可接受的一種或多種成分聯合的本發明的化合物。本文中的術語“組合物”或“藥物組合物”可互換使用，表示的是通常包含賦形劑 (如現有技術中常規的藥學上可接受的載體，適于對哺乳動物給藥，優選為人類或人類細胞)的組合物或制劑。所述組合物可以特別制劑，用于通過一種或多種途徑給藥，給藥途徑包括但不限于口服給藥、眼部給藥、非腸道給藥、靜脈給藥、動脈給藥、皮下給藥、鼻內給藥、 舌下給藥、脊柱內給藥、腦室內給藥等。此外，本文記載了現有技術中已知的，外用的(例如口腔黏膜、呼吸道粘膜)和/或口服給藥的組合物可以形成溶液劑、懸浮劑、片劑、丸劑、 膠囊劑、緩釋制劑、漱口液或粉末。所述組合物還可以包含穩定劑和防腐劑。對于載體、 穩定劑和佐劑的示例，參見，例如 University of the Sciences in Philadelphia(2005) Remington :The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons,21st Ed。進一步用以下實施例詳細解釋本發明，但本發明的范圍并不應當局限于此。應當了解，本發明并不限于本文所記載的特定的方法學、方案及試劑等，這些都可以進行改變。 本文所使用的命名法僅是為了描述實施方式的目的，并未旨在限制本發明的范圍，本發明的范圍唯一地僅由權利要求限定。根據詳細的說明書、附圖和權利要求書，本發明的其它特征和優勢是明顯的。實施例在過去的幾年里，癌癥藥物開發領域取得了顯著成果，這些成果主要集中在了解尋找具有選擇性和有效性的藥物的關鍵要求和用于分子靶標選擇的基本原理 (S. L. Mooberry, Drug Discovery Handbook. 1343-1368 (2005)) 能夠嵌入明確定義的蛋白質的疏水袋的、基于小分子的配體仍然被認為是經典的候選藥物，而在被稱為“可成藥的”基因組內，蛋白是最普遍的治療靶標(A.L.Hopkins，Nat. Rev. Drug Discovery 1， 727-730(2002))ο盡管迄今為止開發的所有治療試劑靶向的幾乎都是蛋白，大家已經廣泛意識到，僅有少數的蛋白能夠被作為靶標(A.L.Hopkins，Nat. Rev. Drug Discovery 1，727-730(2002))。對大部分藥物都被認為是“不可成藥的”這種認識，促進了對其它種可替代的大分子靶標的治療潛能的開發，其中，RNA成為了研究最深入的對象(Lagoja， I. Μ.禾口 Herdewijn，P. Expert Opin. Drug Discov. 2，889—903 (2007) ；Thomas, J. R.禾口 Hergenrother，P.J.Chem. Rev. 108，1171—1224(2008))。特別地，多年來，盡管RNA在多種細胞過程中發揮了許多作用(例如核酶、核糖開關、miRNA)，它仍被低估為僅僅是遺傳信息的攜帶者。治療干預本身的可能性激發了對RNA結構和功能越來越多的興趣，這些可能性包括但不局限于采用傳統的(反義)方法和最近的(RNA干擾)方法控制基因表達的可能性。盡管極具挑戰性且難以捉摸，但旨在利用小分子靶向RNA的努力具有很大的前景，RNA結構所固有的柔韌性和復雜性可以從原則上用作旨在打破RNA功能的新策略的理性設計的基礎(J. R. Thomas, Chem. Rev. 108， 1171-1224(2008))。這不僅僅在靶向信使RNA中特別有意義，同時在靶向其它在細胞環境中扮演重要角色的高度結構化的非編碼RNA中也特別有意義。盡管已經有已知的小分子強有力地并特異性地靶向RNA的例子(Thomas，J. R.和 Hergenrother, P. J. Chem.Rev. 108，1171-1224(2008) ；Hermann Τ.，Cell. Mol. Life Sci. 64，1841-1852(2007) ；Welch, Ε. M 等 Nature 447，87-91 Q007))，這樣的情況依然是很少見的，因此，大部分靶向RNA的努力都利用了以下事實，即通過核苷堿基配對，天然存在的核酸可以非常高效地靶向彼此。通過序列互補的核苷堿基配對的相互作用，主要是沃森-克里克類型的核苷堿基配對的相互作用，反義寡核苷酸、小干擾RNA、核酶、DNA酶和靶向核酸的適配體都與靶RNA的接觸片段(contiguous stretch)嚙合(engage) (Lagoja, I. Μ.和 Herdewi jn，P. Expert Opin. Drug Discov. 2,889-903 (2007))) 憑借其特有的性質，這種嚙合模式需要靶序列在競爭堿基配對的相互作用中盡可能小地被束縛。由于大部分RNA序列都廣泛參與自我配對，這種鏈內配對的結構性質和與其競爭的能量消耗都是無法精確預測的，這種限制呈現出RNA靶向實踐中最大的挑戰之一。本文所記載的新穎的工作提供了在復雜的RNA分子中對易靶向片段的無偏見鑒定(unbiased identification)。本研究還記載了通過設計能夠發現非規范的結合物的篩選法。在折疊RNA分子的高分辨率結構的可用度中的巨大進展，揭示了 RNA自身相互作用模式的高度多樣性。Hoogsteen配對、堿基三聯體和四聯體、結構化的內部環和發卡環、 假結結構、凸起(bulges)和接頭(junctions)都增強了規范的配對(Leontis，N. B.等， Curr. Opin. Struct. Biol. 16,279-287 (2006) ；Hendrix, D. K.等，Q. Rev. Biophys. 38, 221443(2005))。本文中，意識到由于RNA能夠利用如此繁多的相互作用來穩定分子內的締合(即折疊)，理所當然地，在分子間靶向RNA的試劑也可以采用這樣的非規范相互作用。 盡管對于與RNA靶標中的接觸片段進行規范配對的結合物存在著高度可預測的配對規則， 但是，對于與RNA靶標中的接觸片段進行不太規范的識別模式的結合物并不存在這樣的規則，使得利用寡核苷酸文庫篩選來發現后者中的規則成為必要。RNA-相互作用的多核苷酸(命名為“RIPtides”)是基于核酸的候選藥物，相比標準的未經修飾的DNA寡核苷酸，它具有改進的性質，RIPtide還具有能與高度結構化的RNA 靶標具有高結合親和力并高特異性結合的能力，從而調節RNA靶標的功能。過去已有報道稱短的寡核苷酸在RNA靶向領域具有相關性質。例如，已證實0DMiR(寡核苷酸導向的RNA 錯折疊)可用作抑制I類內含子和大腸桿菌RNase P的有效方法(J. L. Childs,Proc. Natl.Acad. Sci. USA 99,11091-11096(2002) ;J. L. Childs, RNA 9,1437-1445 (2003)) 本文所記載的是一種針對發現RNA-相互作用的多核苷酸(RIPtide)的新型方法， 所述RIPtide能夠與折疊的RNA靶標結合。在配對模式方面，該方法完全沒有偏見；但對可靶向的序列具有偏見。簡單地說，N聚體的微陣列代表了長度N = 4-8的所有可能的核酸序列，該N聚體的微陣列具有核苷堿基A、C、G和U,在合理的生理學條件下，該N聚體的微陣列可以有效地同時篩選針對RNA靶標的多種RIPtide結合物。這樣的短序列要發揮作用，會受到存在于單個微陣列上的序列數的實際約束，但重要的是，相比更傳統的較長的寡核苷酸，這樣的多核苷酸序列能夠顯示出更強的細胞滲透性(Loke，S.L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,3474-3478(1989) ；Chen, Ζ.等，J. Med. Chem. 45，5423-5425 (2002))，另外，相對短的核酸序列能夠緊密地、特異地與RNA靶標結合(Childs，J.L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,11091-11096(2002) ；Childs, J. L.等,RNA 9,1437-1445 (2003)) 為了增強所述多核苷酸的結合親和力和穩定性，采用了 2’ -0-甲基化的單體構件(building blocks) (Freier, S. Μ.和 Altmann，K. H.，Nucleic Acids Res. 25，4429-4443 (1997))。利用近來開發的一種工序，使得這些類似物在微陣列制造中的應用成為了可能，所述工序采用了光化學產酸，影響5’ -羥基的脫保護，從而影響區段特異性(sector-specific)的多核苷酸鏈延伸(Pawloski, A. J. Vac. Sci. Technol. B 25，2537-2546 (2007) ；McGall，G.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93，13555-13560(1996))。本文所記載的靶向結構化RNA的方法涉及通過微陣列方法發現短的寡核苷酸序列，正如其內在折疊類型所決定的，所述寡核苷酸序列能夠停駐在預組織的RNA位點內。對于首個RIPtide的發現過程，采用了 2’ -0-甲基-核糖核苷酸微陣列，所述微陣列是通過基于光致抗蝕劑的合成從Affymetrix公司以定制的規格制造的(A. Pawloski, J. Vac. Sci. Technol. B 25，2537-2546 (2007))。如圖 IC 所示，該 2，-0-甲基 RIPtide 微陣列的生成是為了引入所有可能的長度為4聚體到8聚體的序列，一共有87，296個探針。據我們所知， 本工作中記載的微陣列構成了迄今為止報道的首例高密度2’ -0-甲基寡核苷酸微陣列。作為原理論證，利用2’ -0-甲基RIPtide微陣列篩選了人端粒酶RNA組分(hTR) 的不同RNA構建體。端粒酶是一種專門的核糖核蛋白，它由兩個主要組分反轉錄酶蛋白亞基(hTERT)和 RNA 組分(hTR)(J. Feng, Science 269,1236-1241(1995) ；Τ. Μ. Nakamura, Science 277，911-912 (1997))及數種相關蛋白構成。端粒酶利用RNA組分中的短序列作為模板，指導染色體末端的端粒重復序列(5’-TTAGGG-3’)的合成。如圖9所示，人細胞中純化得到的活性端粒酶復合物由三個組分構成端粒酶反轉錄酶(hTERT)、角化不良蛋白以及端粒酶RNA組分(hTR)，所述端粒酶RNA組分是一段451個核苷酸的RNA，它含有用于重復添加的模板序列(S. B. Cohen, Science, 315,1850-1853 (2007))。已有若干可用的抑制端粒酶的策略，包括通過核酸結合來靶向hTR的策略。某些核酸結合旨在沉默表達；其它核酸結合針對的是模板區域，發揮競爭性抑制劑的作用(C. B. Harley, Nat. Rev. Cancer, 8 167-179(2008))ο端粒酶被認為是人類癌癥的幾乎通用的標記物，它對端粒長度的影響在避免復制性衰老中發揮了重要作用。通過依賴于復制的端粒縮短來逃脫細胞周期停滯是一種適應， 這種適應對于轉化細胞的存活而言十分重要。然而，事實上，大部分正常體細胞中端粒酶的活性是被抑制的，已經發現在大約90%的人類腫瘤中，端粒酶是被活化的(J. W. Shay, Eur.J. Cancer 33,787-791 (1991) ；N. W. Kim, Science 266，2011-2015 (1994))，使得抑制或下調
端粒酶成為癌癥治療的一種策略。然而，現有策略還有很大的改進空間。SiRNA分子的尺寸對它的遞送提出了挑戰， 這可以通過選擇較短的序列來改善。競爭性抑制劑專注于反轉錄的活性位點，留下了大復合物的剩余部分未經探索一事實上，已經發現了很多其它的含有hTR的核糖核蛋白復合物，而不是活性的全酶，這些相互作用也吸引了人們對端粒酶催化之外的興趣(K. Collins, Mech. Ageing Dev.，1 ，91-98 Q008))。為了填補這個缺口，本文所記載的研究中采用的策略是用于篩選短的核酸序列，所述核酸序列能夠與hTR結合，從而對端粒酶活性產生一定影響。本文所記載的是hTR中額外的可靶向位點的鑒定，這為模板序列提供了獨特的、 有意思的并且是意想不到的替代物。有一些位點特別引人注意，RIPtide與所述位點結合后，可能會影響端粒酶RNP的組裝，這樣的試劑預計會引起凋亡的快速啟動(Li. S.等， Cancer Res. 64,4833-4840 (2004) ；.Folini, Μ.等，Cancer Res. 63, 3490-3494 (2003)), 而不是由成熟RNP的抑制所引起的衰老的緩慢啟動22'27·28(Herbert, B. -S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,14276-14281 (1999) ；Hahn, W. C.等，Nat. Med. 5，1164-1170 (1999)； Zhang, X.等，Genes Dev. 13，2388-2399 (1999))。如本文所記載的，對hTR的結構化元件的 RIPtide微陣列篩選鑒定得到了 hTR中若干新的可靶向區域，所述hTR的結構化元件包含模板和假結，這兩者對端粒酶的功能都十分重要(Mitchell, J. R.，Collins, K.，Mol. Cell 6， 361-371 (2000))。靶向這些新位點的RIPtide代表了下一代端粒酶抑制劑的具有前景的候選物。本文所記載的是利用若干hTR構建體進行RIPtide微陣列篩選的方法，所述hTR 構建體位于hTR的假結/模板域和CR4/CR5結構域內，已表明這兩個結構域對于端粒酶的體外活性及與 hTERT 結合很關鍵(J. R. Mitchell, Mol. Cell 6，361-371 (2000))。本文所報道的是篩選平臺的建立、匹配驗證方案以及所選擇的2’ -0-甲基RIPtide的抗端粒酶活性，所述抗端粒酶活性是通過基于體外和細胞內的TRAP測定法得到的，所述2’ -0-甲基 RIPtide與人端粒酶RNA結合。微陣列設計原則本文所記載的是新型微陣列平臺的開發，所述微陣列平臺為RIPtide提供了結構上無偏見的、基于微陣列的篩選法，所述RIPtide高親和力地與折疊的RNA靶標結合(圖 1)，還記載了所述RIPtide的用途，即調節細胞內端粒酶的活性。進行了新型微陣列平臺的開發，所述微陣列平臺使得可以篩選有效的、高親和力的、基于寡核苷酸的RNA結合物。相比標準的、未經修飾的DNA寡核苷酸，用于該目的的寡核苷酸或RIPtide必須顯示出在穩定性、核酸酶耐受性及結合親和力方面的改進。人們普遍認為寡核苷酸的細胞滲透性隨長度降低(Loke, S. L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,3474-3478(1989) ；Chen, Ζ.等，J.Med· Chem. 45，5423-5425 (2002))，因此，關注的是鑒定長度在8個核苷酸以下的RIPtide。首例方法采用2’ -0-甲基寡核苷酸作為RIPtide探針，所述RIPtide探針連接于微陣列表面。 相比未經修飾的RNA寡核苷酸，2’ -0-烷基取代提高了核酸酶耐受性；糖的2’位的取代有利于C3’-內型(類似于A-RNA或North)構象，這會顯著提高RNA的結合親和力。此外， 在本研究所使用的RNA靶標的背景下，已經證實靶向hTR模板區域的2’ -0-甲基寡核苷酸是有效的端粒酶抑制劑(A. E. Pitts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,11549-111554(1998))； B-S Herbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,14276-14281 (1999)) 因此，微陣列上陳列的所有RIPtide中都引入了這種有益的修飾。為了給最佳的寡核苷酸-RNA結合建立最低限度的長度要求，并確定這些短序列是否會影響許多RNA-RNA相互作用中的非規范的堿基配對特性，包括了從4聚體到8聚體的相對較短的序列。此外，短序列的使用使得可以在單個微陣列片上合成所有可能的序列組合或RIPtide的排列，提高了將該方法學延伸至RNA或任意給定序列的研究中的潛能。盡管2’ -0-甲基化預期可以提供本質上的性能改善，但由于標準的高密度微陣列技術是針對2’ -脫氧寡核苷酸建立的，它還是使微陣列的制造變復雜了。在已建立的用于光化學引導的微陣列合成的Affymetrix平臺中，需要制備具有5’ _光可移除的保護基團 (photocaged)的核苷 3，-亞磷酰胺(Chen，J.-L.等，Cell 100，503-514 Q000))，如果應用于本目的中，就需要合成具有5’-光可移除的保護基團的2’-0_甲基亞磷酰胺。Affymetrix 公司利用最近開發的光致抗蝕劑技術并基于I-線(365nm)投影蝕刻，完成了首例將高密度 2，-0-甲基RIPtide微陣列用作藥物發現工具的制造(A. Pawloski, J. Vac. Sci. Technol. B 25，2537-2546Q007))。這種近來開發的微陣列制造技術采用了光化學產酸，所述酸能夠脫去標準的5’ -二甲氧三苯甲基(DMT)基團的保護(圖2)。由于這種方法學僅需要標準的、可商購的2’-0_甲基RNA亞磷酰胺，并從原理上可與任何5’-DMT-保護的核酸類似物一起使用，這種方法學特別適于本目的。這種光致抗蝕劑技術(Pawl0Ski，A.等，J. Vac. Sci. Technol. B 25,2537-2546(2007))使得我們可以生成這樣的微陣列各芯片上都陳列著所有可能的8-、7-、6-、5_及4聚體的2，-0-甲基RIPtide，所述2，-0-甲基RIPtide具有標準的核苷堿基A、C、G和U，共有87，296個RIPtide (圖1C)。各陣列中還引入了可預染的棋 ^11- ^IiE (checkerboard alignment feature)。革巴RNA人端粒酶RNA(hTR)的模板/假結域被用作RNA靶標，但預計本文所記載的方法能夠用于針對任何RNA靶標。所述hTR的模板/假結域在脊椎動物間具有高度的結構保守性(J. L. Chen, Cell 100，503-514 ^)00))，它的核心結構對端粒酶的功能很重要 (J. R. Mitchell,Mol. Cell 6，361-371 (2001))。與此相符，該域內的突變會引起人的端粒酶缺陷疾病，包括先天性角化不良和一種再生障礙性貧血。與該結構域結合、即使是與模板區外結合的RIPtide，可以發揮功能性的影響。對形成穩定的、永久的假結的需求(L. R. Como111, Proc. Natl. Acad. Sci· USA 99,16998-17003(2002) ；C.A. Theimer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100，449-454 (2003)； J.L.Chen，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,8080-8085(2005))相對于瞬時形成的假結以及它與端粒酶活性的關聯已是經過爭辯的。已經報道了工程化的最小假結RNA的若干三維結構(Kim, N. -K.等，J. Mol. Biol. 384,1249-1261，(2008) ；Theimer, C. Α.等，Mol. Cell 17， 671-682(2005) ；Theimer, C. Α.等，Mol. Cell 27,869-881(2007) ；Theimer，C. A.，Feigon， J. Curr. Opin. Struct. Biol. 16，307-318 (2006))，但除了該模板/假結域的單個模件之外， 整體的結構依然不清楚。近來，已部分揭示了該域的結構特征(C. A. Theimer,Mol. Cell 17， 671-682(2005) ；C. A. Theimer, Mol. Cell 27,869-881 (2007) ；C. A. Theimer, Curr. Opin. Struct. Biol. 16,307-318(2006)) 0有意思地是，近來已有報道稱，假結結構中的核苷酸A176(A176)的2’ -OH基團對端粒酶的催化活性有影響，所述核苷酸A176處在遠離模板區域一級序列的位置(F. Qiao, Nat. Struct. Mol. Biol. 15,634-640 (2008)) 利用折疊的RNA構建體進行微陣列的篩選，所述RNA構建體中摻入了熒光標記， 這樣，掃描的微陣列的熒光強度讀出陽性的RIPtide “匹配”。為了研究RNA靶標的大小對它接近微陣列上陳列的RIPtide的能力的影響程度，構建了一個截短系列(某些情況下，使用含有人端粒酶RNA全長序列(l-451nt)的質粒構建體)，代表逐漸變短的模板/假結域，其中，最小的是過去由i^eigon及其同事用于結構研究的48nt的工程化的最小假結 (C. A. Theimer, Mol. Cell 17,671-682(2005) ；C. A. Theimer, Mol. Cell 27,869-881(2007)； C. A. Theimer, Curr. Opin. Struct. Biol. 16，307-318(2006)，Y. G.Yingling, J Mol Graph Model. 25,261-274(2006) ；Y. G. Yingling, J. Biomol. Struct. Dyn. 24,303-20(2007)； Y. G. Yingling, J Mol Graph Biol. 348，27-42 (2005))。其中的大部分都是在少量 5，-氨基烯丙基-UTP存在的情況下，利用PCR生成的模板，通過依賴于T7 RNA聚合酶的轉錄生成的，所述5’-氨基烯丙基-UTP用于轉錄后標記，所述轉錄后標記通過用Cy3的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯處理完成(參見方法)；最短的2個是通過固相合成生產的，并在5’標記了 Cy3。用變性PAGE純化所有RNA轉錄本，用電泳確認它們的完整性和大小，所述RNA轉錄本按照以下說明進行再折疊。在最初的篩選中，全長hTR(l_451位核苷酸)和模板/假結域(PKK，1-211位核苷酸)的經熒光標記的版本并未顯示出與微陣列可計量的結合；略短的175nt版本的模板 /假結域(HQ75J6-200位核苷酸)得到了無法重復的結果。另一方面，159nt的構建體 (PK159, 33-191位核苷酸)和所有較短的版本(圖3B)得到了可重復的微陣列陽性結果。 因此，從這些最初的結果可以推斷，在這樣的實驗條件下，對于長度小于約160nt的RNA靶標，該2’ -0-甲基微陣列提供了可靠的結果；對于長度大于160nt的RNA靶標，應當謹慎使用該2’ -0-甲基微陣列。因此，利用工程化的最小假結構建體和較大的RNA轉錄本PK123和HQ59，進行了微陣列篩選方案的優化。PKffT和PKWT-I構建體包括hTR序列的93-121及166-184位核苷酸，所述PKWT和PKWT-I構建體在121及166位核苷酸間具有工程化的聯接(圖3A)。PKffT 還含有突變，引入所述突變是為了穩定莖1 (圖3A)并提高用T7 RNA聚合酶合成時的效率。 PKffT-I是PKWT的變體，它其中一個突變的堿基對被修復為野生型的序列。近期報道的PKWT 的高分辨率的 NMR 結構(Kim, N. -K. J. Mol. Biol. 384,1249-1261, (2008))揭示了一個具有廣泛三級相互作用和大量非規范堿基配對相互作用的三維折疊。2，-0-甲基RIPtide微陣列篩選對于微陣列實驗，第一步需要對棋盤格進行染色，以提供恰當的網格校準(grid alignment)基準。通過對Affymetrix基因芯片陣列中常用的標準雜交方案進行修改，便可實現該步驟。簡單而言，利用僅含緩沖液和BSA的雜交混合劑，在45°C下，將濃度為250pM 的寡核苷酸B2雜交16h。隨后，實施采用鏈霉親和素-藻紅蛋白的染色方案并掃描芯片。 盡管在某些情況下，僅需一輪雜交-染色便已足夠，但典型地，需要進行兩輪雜交-染色以獲取最佳的熒光對比度。為了確保折疊的二級結構的存在，在含鎂(5mM)的磷酸鹽緩沖液中加熱并緩慢冷卻至室溫，使所有RNA再折疊。在不同的溫度下(25°C和37°C )，將濃度為I-IOOnM的、經標記的RNA與RIPtide微陣列孵育不同時間(lh、2h、6h、12h及18h)。利用長度大于160個核苷酸的RNA完成的實驗得到了不一致的結果，從而提供了該研究中使用的微陣列中RNA雜交上限的寶貴信息。首先在室溫下用含鎂的緩沖液清洗芯片，隨后進行嚴格清洗以提高信噪比。這對于大的RNA轉錄本(如HQ23和HQ59)而言尤其重要；對于較小的假結構建體 PKffT和PKWT-1，室溫下的溫和清洗就已足夠。利用不同大小的RNA靶標，能夠產生可重復的結果的最優條件必須是在37°C下，將IOOnM的RNA靶標與微陣列孵育Ih ；此外，在37°C 下，將較低濃度IOnM)的RNA孵育至少他，也可得到類似的結果。利用該最優的工序， 平行測定的微陣列產生了幾乎相同排名的高強度RIPtide匹配。與靶RNA構建體孵育之后，掃描所述RIPtide微陣列，根據至少兩次(通常為3 次)獨立的微陣列實驗中的平均原始熒光強度，將最強的RIPtide “匹配”排名。如果存在 RIPtide與靶RNA的優選結合位點，則預計所述RIPtide匹配落入具有相關序列和靶標結合位點(與隨機分布的結合位點相反)的聚類中。為此，設計了評估匹配聚類的若干不同的潛在模式的Perl腳本。僅僅基于它們彼此間的序列互補性對RIPtide匹配進行聚類的嘗試，無法得到明確有意義的聚類，這是由于利用如此短的序列，難以給移碼的序列及具有若干非同一性位置的序列分配相應的分數。因此，利用它們與RNA靶標的部分序列互補性作為指導對所述匹配進行聚類。以這樣的方式，發現具有與靶標部分互補的、非同一但卻重疊的位點的 RIPtide可以很容易地被聚類。特別地，將RIPtide匹配與靶序列比對后，繪制了靶標上部分互補的位點針對各位點的匹配數的圖(圖4)。只有與靶RNA序列同一性大于60%的寡核苷酸才會被聚類。該聚類提供了針對結合靶標的核酸序列之間可容忍的變化的指導。在利用工程化的假結構建體PKWT和PKWT-I (圖4)作為靶標的微陣列篩選中，大部分RIPtide匹配呈現出最高的平均熒光強度，所述匹配屬于與RNA的兩個區域互補的一對聚類，所述兩個區域是假結的5’末端(P2b莖的一部分)(命名為聚類I)或J2b/3環及 P3莖的相鄰區段(命名為聚類II)(圖4)。有趣的是，盡管PKWT與PKWT-I僅有3個核苷酸的差異(莖1的G:C堿基對相對于C:G堿基對及3’-核苷酸)，在聚類I和聚類II的匹配的相對比例上，這兩個RNA靶標卻顯示出了本質上的差異，暗示該微陣列能夠對如此微妙的序列改變特別敏感。在雙鏈DNA和RNA中，相比遠離末端的位點，已知末端的熱磨損 (thermal fraying)更加嚴重，因此，在5’末端觀察到明顯的結合物的聚類并不讓人驚訝。 然而，讓人意想不到的是，幾乎完全不存在與3’末端互補的RIPtide，而該區段內的P3莖也含有雙鏈末端。出于同樣的原因，無法預測到J2b/3環與排列的RIPtide的結合如此有成效，而相同構建體中的另一個環，J2a/3，對RIPtide的結合卻幾乎是完全抗拒的。同時， 還進行了一系列實驗來研究孵育時間對微陣列匹配分布的影響，發現使用PKWT-I時，聚類 I比聚類II更快形成，而聚類II可在更長的時間內繼續積累(圖5)。利用較大的hTR構建體進行RIPtide篩選時(圖4，利用HQ23和HQ59聚類，重疊的)，鑒定了靶標上額外的明顯能夠結合的區域。對于冊123，聚類I匹配顯著減少，而聚類 II保持了良好的表現度，但現在觀察到的最突出的匹配聚類是與內部的J2a/J2b環(82-89 位核苷酸)互補的聚類，命名為聚類III。還在J2a/3單鏈區域的5’末端(約142-170位核苷酸，包括聚類IV，142-156位核苷酸)觀察到了若干次要聚類。最后，在2’ -0-甲基 RIPtide陣列上篩選HQ59構建體(代表了 hTR完整的模板/假結域)時，產生了與HQ23類似的聚類譜，僅有一個主要的例外利用PK159觀察到的最突出的聚類代表了與模板區域互補的RIPtide (聚類V，47-57位核苷酸)，所述模板區域在其它所有的構建體中是沒有的。模板區域作為端粒延伸的引導序列的極其重要的作用要求該區域可用于配對，事實上， 大量文獻記載了寡核苷酸對模板區域的可靶向性。微陣列的結果確證了這些發現，暗示在 PK159假結/模板構建體的所有位點中，對于RIPtide的靶向而言，模板區域是最有成效的位點。RIPtide微陣列匹配的體外驗證為了評估和量化微陣列篩選中的RIPtide匹配在溶液中結合靶RNA的能力，選擇了一組RIPtide，所述RIPtide代表了各聚類中最高匹配的共有序列中的變化。合成這些 RIPtide，使3-羧基熒光素(FAM)標記連接于其3’ -末端，微陣列的表面也連接了相同的 FAM標記。隨后，利用微陣列篩選中使用的相同的折疊靶RNA及緩沖液系統，采用熒光偏振 (FP)來定量測定FAM標記的RIPtide的平衡解離常數(Kd)值。首先選擇PKWT-I篩選中的前10位的RIPtide匹配作為代表性樣本，測定了溶液中相應的相互作用的親和力。如圖4B所示，這些前10位的RIPtide中，除了 IfRIPtide 以外，所有RIPtide與溶液中PKWT-I結合的Kd都在IOOnM以下，觀察到了微陣列篩選中的排名順序和與PKWT-I的親和力間粗略的關聯，即排名較低的RIPtide通常與PKWT-I的親和力也較低(較大的Kd值)。正如初次微陣列篩選中所觀察到的，還觀察到了相比末端單個核苷酸截短所得到的7聚體，完全互補的8聚體與PKWT-I的結合通常更加緊密，而所述7 聚體與PKWT-I的結合又比截短的6聚體更加緊密；同時，還觀察到相比具有單個錯配的寡核苷酸，完全互補的寡核苷酸的結合通常更加緊密。這些趨勢與基于確定的配對熱力學的期望完全一致，并證實了 RIPtide微陣列在鑒定折疊RNA靶標的高親和力結合物中的用途。在截短形式的hTR中存在或可用的RIPtide結合位點可能在全長hTR中不存在或不可用，這是很有可能的，但并不希望將其限定于理論中。因此，選擇了 5個RIPtide，并用 FP測定了它們與全長hTR的結合親和力，所述5個RIPtide與溶液中PKWT-I的結合已得到證實。如圖6所示，所有聚類I的匹配都未顯示出針對hTR的任何可測量的親和力，而聚類 II的匹配顯示出了至少和針對PKWT-I相同的針對hTR的親和力，1個RIPtide (II-2)甚至顯示出了親和力的提高。由此假設，但并不希望將其束縛或局限于理論中，即由于PKWT-I 中聚類I的匹配結合的假結末端是高度工程化的，因此，聚類I的匹配失效，導致與hTR明顯偏離；另一方面，全長hTR中仍保有聚類II的匹配結合的J2b/3環。當所述J2b/3環牽涉到hTR中的三級相互作用時，RIPtide結合可能丟失，由此推測，當存在于裸露的hTR中時，所述J2b/3環在這樣的相互作用中保持相對地不被占用。對溶液里的PK123和HQ59的初次微陣列篩選中剩余的RIPtide匹配并未驗證， 而是分析了利用全長hTR進行的驗證。選擇了各聚類中具有代表性的示例(圖4D)，并量化了這些RIPtide對全長hTR的結合親和力(圖6A)。以這樣的方式，鑒定了與全長hTR結合的聚類III、IV、V中的RIPtide。總體而言，hTR-驗證的RIPtide集合映射出了一系列模板/假結上的位點，所述位點特別容易被2’ -0-甲基多核糖核苷酸靶定；其中，各個位點相當于一個序列互補的RIPtide聚類(圖6B，根據圖6A中的序列加陰影)。特別地，這些高度可靶向的區域是J2b/3環和P3莖(聚類II)、穿過Ph莖一部分的J2a/2b凸起(聚類III)、Jh/3環(聚類IV)及模板區域(聚類V)。注意到根據hTR折疊圖所示，所有區域中至少都含有若干單鏈區。那就是說，進一步注意到了所述折疊圖所暗示的具有單鏈區的其它重要序列，如J2a/3環的整個3’末端和J2a. l/2a鼓泡，這些序列看起來似乎無法被 RIPtide 靴向。并不希望將其局限或束縛于理論中，假定RIPtide和靶標間的沃森-克里克互補性，推斷出了 hTR上的RIPtide結合位點。為了用實驗驗證所述RIPtide確實能識別hTR上預測的區域，在RIPtide的中心部分引入串聯點突變，并在hTR中引入代償性的序列改變。 用FP分析了 “野生型” RIPtide和“突變” RIPtide與野生型hTR靶標和代償性突變hTR靶標間的結合情況(圖7)。生成了 4個不同的hTR轉錄本，其中，各聚類中心位置2個連續的核苷酸，即期望中的靶位點(圖6A，粗體表示的堿基)被突變成它們的沃森-克里克互補的堿基(G — C、C — G及U — A)。各種情況中，突變的hTR與“野生型” RIPtide的結合都被消除或嚴重下降了(將圖7A與圖7B相比)。類似地，當突變的RIPtide與野生型hTR孵育時，結合也被消除或下降了(圖7C)。將代償性突變引入RIPtide和hTR時(將圖7A與圖 7D相比)，大部分情況下，結合部分或完全恢復，證實了 RIPtide靶向的這些位點。盡管在與重疊的靶位點結合的RIPtide中(V-3和11- 觀察到了恢復，但在7種情況里的2種情況中(V-1和II-1)并未觀察到恢復。特定情況下沒有恢復也許反映了單鏈元件的可利用度或折疊能的局部變化，所述局部變化是由突變引起的。綜上所述，并不希望將其束縛于理論中，該突變特異性支持了這個概念，即RIPtide確實是在相應的序列互補位點靶向端粒酶。在體外及培養的細胞中利用RIPtide對端粒酶抑制的評估發現了一組與裸露的端粒酶RNA組分上4個不同的區域結合的RIPtide后，下一步就確定了這些分子是否能夠在體外環境中抑制端粒酶核糖核蛋白復合物的活性。因此， 采用了端粒重復擴增方案(TRAP)測定法(Kim, N. W.等，Science 266，2011-2015 (1994)。 所述TRAP測定法是一種基于PCR的方案，在確定人細胞提取物中端粒酶的活性及評估端粒酶抑制劑的體外效力中具有廣泛用途。通過采用熒光檢測的TRAP測定法(Cy5-TRAP) (Herbert, B. -S.等，Nat. Protocols 1，1583-159(^2006))，利用來自兩種人腫瘤細胞系 (HeLa和DU145)及一種永生化胚胎細胞系(HEK293)的細胞提取物，確定了若干RIPtide的 IC50值。起初，通過hTR上的FP實驗，利用HeLa細胞提取物中的端粒酶活性，篩選并驗證了一個RIPtide的小文庫，所述小文庫代表了微陣列篩選中鑒定的若干聚類。其中的大部分是8聚體，但也檢測到了某些7聚體和6聚體；所有這些RIPtide都是與靶hTR序列完全互補的，對hTR的Kd值都在300nM以下。額外還測試了原始文庫的若干磷硫酰變體，即在 RIPtide的兩個末端位置或所有位置引入磷硫酰鍵。在第一輪篩選實驗中，對于磷酸二酯的化合物，在兩個與模板(聚類V，序列編號 26)互補的8聚體的RIPtide示例中發現了抑制活性。未觀察屬于聚類II、III、IV的化合物的明顯抑制。對于磷硫酰衍生物，在l-ΙΟμΜ的濃度范圍內，來自II、III、IV中的若干RIPtide顯示出了端粒酶抑制；該系列中，靶向模板的RIPtide具有最低的IC5tl值(約 1-2 μ Μ)。在TRAP測定法中，某些RIPtide顯示出了少許抑制活性，在提高這些RIPtide效力的嘗試中，通過在任一末端添加2-3個核苷酸增加了它們的長度，同時維持與hTR的沃森-克里克配對。該策略并未改善聚類II或聚類III RIPtide的活性，并不希望將其束縛或局限于理論中，這表明在組裝的核糖核蛋白復合物中，這些RIPtide識別的hTR上的區域可以是動力學上難以接近的，或可選地，端粒酶的蛋白組分在熱力學上與RIPtide競爭hTR上的那個位點。然而，靶向模板區域中的校準序列的不同長度的RIPtide (聚類V) 是有效的端粒酶抑制劑。此外，在TRAP測定法中，利用細胞裂解物，還發現若干聚類IV的序列延伸版本的RIPtide顯示出了納摩爾級別的IC5tl值，所述RIPtide靶向Jh/3環的 5’-末端。過去已有報道并證實了靶向相同區域的寡脫氧核苷酸在體外具有針對端粒酶的抑制活性；然而，并未記載選擇該特定位點的標準(Pruzan, R.等，Nucleic Acids Res. 30, 559-568(2002))。本文報道的RIPtide定位實驗確定了在裸露的hTR中，該特定位點對于靶向而言尤其有成效，但與依此法鑒定的若干其它位點不同，該特定位點在端粒酶完全組裝的形式中也保持了可靶向性。更重要的是，靶向可接近的聚類IV位點，在體外產生了對端粒酶酶活性有效的抑制。對靶向該位點的RIPtide的優化，是從覆蓋了 hTR序列143-156位核苷酸的14聚體開始的，隨后便是在任一末端的一連串截短，直至鑒定得到包含10個核苷酸的最小序列 (與hTR的143-152位核苷酸互補，條目32)，繼續移除所述最小序列中的堿基消除了體外的端粒酶抑制。包括該最小序列在內的所有RIPtide序列(長度為10個核苷酸以上)都抑制了端粒酶的活性，IC5tl值在IOnM以下。因此，通過新型RIPtide微陣列篩選及TRAP測定法引導的系統延伸的組合，鑒定出了一個新穎而獨特的最小序列，所述最小序列能夠在很低的納摩爾濃度下，在體外產生端粒酶抑制。該序列(序列編號20) 5，-GGUGGAAGGC-3，(IV-3) 抑制了存在于所有經測試的細胞系中的端粒酶活性，IC50值在很低的納摩爾范圍(圖8)。此外，在同時進行的旨在獲取針對基于細胞的活性測定法具有更好的藥理學特性 (如改善的針對核酸酶的穩定性和/或提高的RNA結合親和力)的RIPtide的嘗試中，改進了最有希望的抑制性序列的化學性質，并探究了骨架上含有不同修飾的RIPtide的端粒酶抑制潛能。由于上述的10聚體RIPtide可能沒有足夠的穩定性或細胞滲透性來抑制培養細胞中的端粒酶活性，在利用TRAP測定法監測體外的活性保持力時，在篩選中并入了化學修飾，所述化學修飾已知能提高穩定性、細胞滲透性和結合效力。特別地，測定了磷硫酰取代和用鎖核酸(LNA)替換2’ -0-甲基-核糖骨架對TRAP測定法中端粒酶抑制的影響。在最 5’端和最3’端的磷酸二酯基團、或在各個磷酸鍵處均進行磷硫酰取代。兩種情況下，磷硫酰取代的RIPtide維持了它們抑制端粒酶活性的能力，顯示出很低的納摩爾范圍內的IC5tl 值(圖8A，RIPtide IV-3(序列編號20)、IV-4和IV-5)。此外，發現所述IC5tl值與通過熒光偏振實驗測定的Kd值高度一致(圖8A-8C)。對于磷酸二酯和磷硫酰2’-0_甲基RIPtide， 都使用了含有錯配的RIPtide作為陰性對照，以排除非序列特異性的影響(圖8D)。在為基于核酸的藥物建立序列特異性而言，這一點是十分關鍵的，但磷硫酰的情況尤其必要，這是由于過去已有報道稱磷酸二酯以非特異性的方式與hTERT結合(Matthes，E. ,Lehmann,C.， Nucleic Acids Res. 27，1152-1558 (1999))。發現含有錯配的RIPtide對端粒酶的抑制被完全消除了，確立了所觀察到的結果的序列特異性。此外，還測試了一個10聚體的RIPtide， 所述RIPtide序列具有完全的LNA骨架，它的抑制效力為約InM。確定了修飾后的RIPtide也能保持在體外的活性后，在基于細胞的測定法中，對其中一些RIPtide進行了測試。用165nM RIPtide處理DU145前列腺癌細胞Mh。隨后裂解所述細胞，并通過TRAP測定法評估端粒酶活性(圖8D)。作為陽性對照，使用了在先報道的靶向hTR模板區域的13聚體的2’ -0-甲基寡核苷酸(Pitts，Α. Ε.，Corey, D. R.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95,11549-111554 (1998)) 使用脂質體(Lipofectamine )來確保最佳遞送，對于10聚體而言，是否需要陽離子脂質來進行遞送仍需要確定。特別地，含有磷硫酰鍵且靶向端粒酶的相對較短的寡核苷酸顯示出了最佳的細胞吸收特性(Chen，Ζ.等， J. Med. Chem. 45,5423-5425(2002)).用含有磷酸二酯骨架及2，-0-甲基糖的序列編號20 的RIPtide處理細胞時，并未顯示出明顯的端粒酶抑制；而用含有磷硫酰骨架及2’ -0-甲基糖的序列編號20的RIPtide處理細胞時，卻產生了對端粒酶的顯著抑制，這可能反映出后者較高的細胞滲透性和穩定性。重要的是，在含有磷酸二酯骨架及2’ -0-甲基糖的序列編號20的RIPtide中引入2個點突變(已知所述點突變能夠消除基于提取物的實驗中的端粒酶抑制)后，這2個點突變同樣消除了這些基于細胞的實驗中的抑制，支持了 RIPtide 的序列特異性的抑制機制。由于這是靶向該區域的寡核苷酸能夠在培養的細胞中抑制端粒酶活性的首個示例，而所述抑制已得到證實，這一點特別重要。體外抑制性序列的發現另一方面關注于針對hTR的CR4-CR5域的核苷酸序列，如圖9所示，該域是體外活性所必需的兩個域之一 (F. Bachand, Mol. Cell Biol.，21，1888-1897 (2001))。在尋找端粒酶的體外抑制劑中，該過程遵循了典型的藥物發現進程無偏見的先導分子篩選、Kd測定及體外活性測定法中的IC5tl測定。在這種情況下，利用2’ -0-甲基寡核苷酸微陣列來篩選先導寡核苷酸序列；通過熒光偏振(FP)來測定Kd;利用端粒重復擴增方案(TRAP)來評估對端粒酶活性的影響。Affymetrix將從4聚體到8聚體的2’ ~0~甲基核苷酸序列的所有排列印記于微陣列芯片上。通過體外轉錄合成了具有84個核苷酸的構建體，所述構建體含有hTR的CR4-CR5 域，并用Cy3標記。隨后，該經過熒光標記的構建體便可在微陣列上雜交，掃描所述芯片以獲取熒光匹配。根據序列共有性將這些匹配分類，并根據序列互補性預測結合位點。如圖 9C所示，發現微陣列上最亮的100個斑點能夠被聚類為CR4-CR5域上的4個可能的結合位點。這些聚類代表了預計會含有環的區域(J. L. Chen, Cell, 100, 503-514 (2000)) 0為了確定溶液中的結合親和力，通過體外轉錄合成了相同的具有84個核苷酸的構建體的未標記版本。同時還合成了熒光素標記的2’ -0-甲基寡核苷酸序列，所述序列對應于微陣列篩選中強熒光的斑點。通過熒光偏振測量法確定Kd。篩選了各聚類中的代表， 發現在微陣列分析中確定的4個可用的位點中，僅有2個也得到了 FP的確認(表3)。利用TRAP確定了體外的端粒酶活性抑制，所述TRAP是一種基于PCR的、針對細胞提取物中端粒酶活性的測定法(B. -S. Herbert, Nat. Protocols, 1，1583-159(^2006))。將通過FP發現發生結合的未標記的寡核苷酸序列與細胞提取物預孵育(HeLa，DU 145和四3)， 用TRAP測定活性。在測試的序列中，僅發現了 1條(序列編號1)抑制了端粒酶活性，IC50 值在微摩爾范圍內(表2)。如圖9D所示，預測序列編號1與J5/6環結合，這是一個對于端粒酶抑制而言相對未經考察的其它區域，它也許屬于一類新型的端粒酶抑制劑。確定體外作用機制這個工作假設是這樣的，序列編號1與CR4-CR5上的J5/6環結合，如TRAP所觀察到的，該結合事件抑制了端粒酶活性。如果這是真的，序列編號1的發現提出了有關J5/6 環的重要性的疑問，所述J5/6環是hTR上的一個區域，該區域之前并未與端粒酶活性的必需性相關CJ. R. Mitchell，Mol. Cell, 6, 361-371 (2000)) 因此，如圖9D所示，通過進行代償性突變實驗為這些設想收集支持性的證據十分重要。在先的FP實驗是在野生型hTR的體外轉錄產物上完成的。如果hTR中預測的結合位點內部的2個核苷酸被交換，預期與序列編號1的結合會喪失。相反，如果加入代償性突變的寡核苷酸，將會恢復具有類似Kd的結合。制備了 hTR的突變質粒構建體，并通過體外轉錄制備了突變的hTR。接下來，便能合成帶有代償性突變的熒光素-標記的寡核苷酸，并用FP進行測試，用以證實記載了序列編號1和J5/6間特異性結合事件的最初的FP數據。為了證實與J5/6環的結合事件是否與體外端粒酶活性的損失有關聯，可以使用 VA13細胞(既不表達hTR，也不表達hTERT)，該細胞過去也曾用于進行hTR上的一些突變研究。與FP實驗類似，可以通過TRAP測試具有代償性突變的寡核苷酸抑制突變的端粒酶全酶活性的能力。為此，制備了 hTR的質粒構建體，在預測的序列編號1中的結合位點上進行了定點突變。還可以嘗試多種不同突變的組合，以防止僅由突變造成的端粒酶活性損失。細胞中的測試由這些分析的推論產生的主要疑問在于用所發現的寡核苷酸處理過的細胞是否顯示出下降的端粒酶活性；延長處理是否導致端粒縮短及細胞周期停滯。這些疑問中所蘊含的問題是寡核苷酸治療中共有的核酸酶穩定性及跨細胞膜的遞送(I.Lebedeva，Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，4，403-419 (2001))。若干不同的骨架修飾已顯示出可以提高對核酸外切酶的穩定性，用于核酸合成的經修飾的單體是可商購的。微陣列分析中發現的序列傾向于在特定共有序列周圍聚集的6聚體到8聚體的序列，認為所述共有序列對應于結合位點。對各聚類中若干序列進行了結合測定，總結了所得Kd值的范圍，較低的Kd值通常對應于具有最高互補性的最長序列。一開始，用僅代表 CR4-CR5域的構建體測定了結合親和力，在全長構建體上確認了序列編號1的結合親和力。 通過TRAP測定了來自聚類1和聚類4的序列，其中僅有1個序列(GCCUCCAG，或序列編號 1)顯示出了活性的抑制。聚類2和聚類3在FP實驗中并未顯示出結合，因此未用TRAP進行測定。合成了若干個寡核苷酸的樣本，以提高序列編號1的核酸酶耐受性。星號表示骨架上存在相應的修飾。利用全長hTR構建體來確定Kd值。已知磷硫酰骨架可提高核酸酶耐受性(I. Lebedeva, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.，4,403-419 (2001))，還可使寡核苷酸的細胞滲透性更強(G.D.Gray，Biochem. Pharmacol.，53，1465-1476 (1997))。磷硫酰修飾還可以降低螺旋的穩定性，如表2所示， 制備了帶有磷硫酰修飾的序列編號1的若干版本，而僅在任一末端具有單個突變的版本中保留了 TRAP測定的抑制，IC5tl值大約為10 μ M。合成了一個具有鎖核酸骨架的序列編號 1的變體(命名為序列編號1L)，該修飾能夠提高核酸酶穩定性及雙鏈熔解溫度(H.KaUr， Chem. Rev.，107，4672-4697 (2007))。通過TRAP，序列編號IL同樣顯示了端粒酶抑制，IC50 與2’ -0-甲基的、全部為磷酸二酯的序列編號1類似(表2)。跨細胞膜遞送的問題可通過使用寡核苷酸進行培養細胞的脂質轉染來暫時規避。 一旦確定了序列編號1變體能夠在轉染進培養細胞后抑制端粒酶，就可以開發盡可能保持效力的遞送方法。為了確定任何序列編號1變體是否在培養細胞中顯示出抑制作用，可以進行短期處理實驗，其中，用寡核苷酸轉染培養的腫瘤細胞，然后在較短的時間段后測定端粒酶活性(B. -S. Herbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,14276-15291 (1999))。在轉染后不久能夠抑制端粒酶活性的寡核苷酸變體，可用于長期處理研究中，其中，連續處理數周，中間伴隨細胞增殖的周期檢查并測定隨時間的平均端粒長度(M. R. Alam, Nucleic Acids Res.，36，2764-2776 (2008))。同時還可以優化遞送。確定了單獨的寡核苷酸的滲透能力后，可以在有希望的寡核苷酸變體中加入脂質 (C. B. Harley, Nat. Rev. Cancer,8,167-179(2008))、肽(Μ. R. Alam, Nucleic Acids Res.， 36,2764-2776(2008))或小分子 / 藥物成分(W. Μ. Flanagan, Nat. Biotechnol.，17， 48-52(1999))。靶RNA樣本的制備從Dharmacon購買5’末端帶有染料標記(Cy3或DY-547)的人端粒酶假結構建體 PKffT和PKWT-I。在氨基烯丙基-UTP存在的情況下，利用合適的引物，利用從含有hTR48的 pRc/CMV載體中通過PCR產生的dsDNA模板，通過失控體外轉錄獲取所有長于50nt的RNA 片段。利用純化的帶有His6標簽的(序列編號55)T7-RNA聚合酶，在4mM NIPs、lU/mL酵母無機焦磷酸酶、RNase抑制劑及IOX轉錄緩沖液QOOmM Tris, pH 8、100mM MgCl2、50mM DTTUOmM亞精胺及0. "Triton X-100)存在的情況下，在37°C下過夜進行體外轉錄。在 DNase I處理(15-30min，37°C )、乙醇沉淀及變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化后，用 Cy3-NHS 酯(Amersham, 0. IM Na2CO3, pH 8. 5,50% DMS0/H20, lh)標記靴 RNA。用乙醇沉淀去除多余的染料，通過IX TBE (90mM Tris-硼酸鹽，2mM EDTA)緩沖液中的變性PAGE及接下來的脫鹽純化標記的RNA。通過波長為260、280及550nm處的光密度(OD)測定及溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的純度、產率及每RNA分子摻入的染料比。微陣列雜交及數據分析為了便于分析，用特異的探針(寡核苷酸B2(oligo B2), Affymetrix)染色時， RIPtide芯片會呈現出可見的“棋盤格”作為網格校準指導，所述RIPtide芯片包括劃分了 2’ -0-甲基陣列的4個區域。通過對Affymetrix基因芯片陣列中常用的標準雜交方案進行修改，便可實現該步驟。簡單而言，利用緩沖液和BSA的雜交混合劑，在45°C下，將濃度為 250pM的寡核苷酸B2與所述棋盤格雜交16h。隨后，用鏈霉親和素-藻紅蛋白給探針染色并掃描芯片。盡管在某些情況下，僅需一輪雜交-染色便已足夠，但典型地，需要進行兩輪雜交-染色以獲取最佳的熒光對比度。在含鎂的1 X陣列緩沖液(終濃度50mM磷酸鉀，150mM KCl及5mM Mg(OAc)2, pH 7. 4)中，將折疊的Cy3-標記的RNA的溶液加熱至95°C 3min,再緩慢冷卻至37°C。加入RNA 之前，在37°C下將棋盤格染色的微陣列與IX陣列緩沖液預孵育30分鐘。這些實驗中使用的折疊的RNA的濃度在I-IOOnM之間變化，在37°C下孵育l_16h。對照在雜交條件下進行 IMi的實驗。隨后用IX陣列緩沖液清洗該陣列，并用Affymetrix Genechip 3000 7G掃描儀掃描。為了提高信噪比，使用了額外的、更嚴格的清洗。用GCOS (Genechip操作軟件，Affymetrix公司)分析了微陣列圖像。在與靶 RNA孵育之前，通過掃描陣列定性地評估了背景熒光。利用Spotfire(TIBCO)或Rosetta Resolver (Rosetta)軟件觀察結果。利用Microsoft Access進行了最初的基于熒光的 RIPtide排名。比較了重復實驗中的最大熒光值，該步驟中并不需要歸一化。將原始熒光值進行平均后，利用內部開發的Perl腳本提取了前100位匹配的列表。將RIPtide序列與靶RNA序列進行比對，以鑒定可能的結合位點。熒光偏振
利用MerMade 12 (BioAutomation)DNA 合成儀，在 3，-(6-熒光素)CPG 支持物 (Glen Research)上合成FAM(6_羧基熒光素)-標記的寡核苷酸，用Poly Pak-II (Glen Research)柱純化，并通過MALDI-TOF MS核實其組分。在前述用于RIPtide篩選的條件下，在T7 RNA聚合酶存在的情況下，通過體外轉錄制備未標記的全長hTR，但不加入氨基烯丙基-UTP。DNase I處理和乙醇沉淀后，用RNeasy Midi試劑盒^liagen)純化hTR。從 Dharmacon購買未標記的PKWT和PKWT-I，所述PKWT和PKWT-I都是PAGE-純化的，并已脫鹽。用濃度增加的折疊的RNA (具代表性地，300ρΜ-3 μ Μ)滴定FAM-標記的RIPtides (5ηΜ)。 在37 °C下孵育含有RIPtide和RNA的溶液2h，隨后，利用SpectraMax M5 (Molecular Devices)讀板儀在室溫下記錄熒光偏振。在485nm處監測偏振(以millipolarization單位表示)，在525nm處激發(截止波長(cutoff)為515nm)。該測定法中使用的陰性對照包括所有2’ -O-甲基的8聚體A、C、G和U同聚物、未連接核酸的FAM接頭及文中所述的含錯配的RIPtide。利用Kaleidagraph 3. 5 (Synergy Software)測定解離常數。將三次重復實驗的結果擬合進以下方程(ml+(m2-ml)/(l+l(T (log(m3)-x)) ；ml = 100 ；m2 = 0. 1 ；m3 = 0.0000003。對于hTR-RIPtide結合位點的定位，利用QuickChange-XL突變試劑盒 (Stratagene)在pRc/CMV質粒上(Collins實驗室，UC Berkeley)進行了定點突變，并通過測序確認。生成引入2個連續堿基突變(突變為它們的沃森-克里克互補的堿基)的全長 hTR轉錄本，用于熒光偏振研究。TRAP活性測定法合成RIPtide，利用Polyl^ak-II C18反相柱純化并用MALDI-TOF MS核實其組分。從ATCC (DU145和HEK293)購買或由Chemicon TRAP試劑盒(HeLa)提供端粒酶-陽性的細胞。使用1XCHAPS裂解緩沖液(Chemicon)，通過去污劑裂解，從細胞顆粒中制備細胞提取物。TRAP測定法前，在37°C下，將RIPtide與細胞提取物孵育lh。依照如過去 Herbert等人所記載的方案進行測定，所述方案利用熒光作為定量系統(Nat. ft^tocols 1，1583-1590 (2006))。簡單而言，在30°C下，通過端粒酶延伸熒光人造基質30分鐘，接著進行30個循環的PCR擴增(340C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin)。在10%非變性PAGE凝膠上分離端粒酶延伸產物，用熒光成像觀察條帶并用ImageQuantTM(GE Healthcare)定量。RIPtide 的濃度在0. 6nM到60 μ M之間，對于最初的篩選，利用HeLa細胞提取物進行兩次重復實驗。 對于活性RIPtide，用DU145 (前列腺癌)和HEK293細胞提取物重復實驗。實驗設計中包括若干對照陽性對照(未經處理的細胞裂解物)、陰性對照(僅用緩沖液、熱失活及RNase處理的細胞裂解物)及PCR擴增對照(端粒酶延伸后，PCR步驟前加入60 μ M RIPtide)。對于基于細胞的 TRAP 測定法，用 0. 2% Lipofectamine 2000 (Invitrogen)及 165nM RIPtide 轉染DU145細胞Mh。收集細胞、計數、用IX CHAPS裂解緩沖液裂解，并將由Bradford測定法確定的總蛋白濃度歸一化。如上文所述，測定都重復三次。微陣列制造對于基于2’-0_甲基寡核苷酸的高密度微陣列的制造，使用了基于I-線(365nm) 投影蝕刻的光致抗蝕劑技術13。該方法與Affymetrix基因芯片微陣列生產中所使用的有所不同，所述Affymetrix基因芯片微陣列生產中所使用的是具有光可脫保護的5’-保護基團的2’ -脫氧核苷酸亞磷酰胺。將5’ -DMT-2’ -0-甲基亞磷酰胺用作單體，用于RIPtide微陣列的芯片上合成，在鏈延伸過程中，以光生酸移除5’ -DMT基團。在初始的核酸偶聯步驟之前，首先將用于陣列的硅基底硅烷化，然后與六甘醇衍生物(用作寡核苷酸與陣列表面的間隔物)反應。隨后，將含有光產酸劑的膜涂覆在基底上、校準并在分檔器(stepper) 里暴露于第一層掩膜，產生光生酸，實現首次脫三苯甲基作用。隨后將該膜移除，在細胞流中加工所述基底，所述細胞流中加入了首個DMT-保護的亞磷酰胺單體。接下來進行加帽、 氧化及清洗步驟，用第二層掩膜及序列中的寡核苷酸重復該工序(圖幻。合成完成后，用有機堿溶液處理基底，去除來自RIPtide的保護基團。沖洗晶片并在氮氣下旋轉干燥，再切為單獨的芯片。這些微陣列上全長RIPtide的終密度約為30-50pmol/Cm2，特征尺寸為 17. 5 μ m。所述芯片還包括用于網格校準的棋盤格，該棋盤格由13聚體的2’ -0-甲基序列 5’ -ACGGTAGCATCTT-3，(序列編號56)構成，使得能夠與商業化的Affymetrix寡核苷酸 B2(5，-生物素-GTCAAGATGATGCTACCGTTCAG-3，；(序列編號 57))雜交。RNA 生產RNA結構域轉錄的正向引物和反向引物全長hTR，l_451nt(5’ -GCCAAGCTTTAATAC GACTCACTATAGGG-3，(序列編號 58)，5，-GCATGTGTGAGCCGAGTCCTGGGTGCACGT-3，(序列編號 59))；假結/模板，l_211nt (假結/模板的正向引物與全長hTR的正向引物相同，5’-GTCCC CGGGAGGGGCGAACGGGCCAGCAGC-3，(序列編號 60)) ；PK123，63_185nt (5，-TAATACGACTCACTATA GGGCGTAGGCGCCGTGCTT-TTGCTCCCCGCGCGC-3，(序列編號 61)，5，-CAGCTGACATTTTTTGTTTGCTC TAGAATGA-ACGGT-3，(序列編號 62)) ；PK159，33_191nt (5，-TAATACGACTCACTATAGGCCATTTTTT -GTCTAACCCTAACTGAGAAGGGC-3，(序列編號 63)，5，-GGCCAGCAGCTGACATTTTTTGT-TTGCTCTAGA ATG-3，(序列編號64)) ；PK175, 26-100nt (5，-TAATACGACTCACTATAGG-GTGGTGGCCATTTTTTGTC TAACCCTAACTGA-3，(序列編號 65)，5，-GGGCGAACGGGCCAG-CAGCTGACATTTTTTGTTTGC-3，(序列編號66))。體外轉錄試劑Cy3_標記的RNA 對于200 μ L的反應體積而言，轉錄反應包括 20 μ L IOX 轉錄緩沖液、40μ L NTPs (20mM, Invitrogen)、10 μ L 氨基烯丙基-UTP (50mM， Fermentas) ,60 μ L PCR 產物、20 μ L IPPase (Aldrich,溶為 0· OlU/μ L) -RNase 抑制劑 (Roche)、5yL T7-RNA聚合酶及45 μ L無RNase的水。典型地，轉錄產率在0. 1-0. 25mg RNA 每1 μ gDNA模板的范圍內。未標記的RNA 對于FP實驗，針對全長hTR通常使用的條件對于 200 μ L 的反應而言，20 μ L IOX 轉錄緩沖液、40 μ L NTPs (20mM, Invitrogen) ,60 μ L PCR產物、20 μ L IPPase (Aldrich，溶為 0. OlU/μ L)-RNase 抑制劑(Roche) ,5 μ L T7-RNA 聚合酶及55 μ L無RNase的水，典型的產率為0. 1-0. 25mg RNA每1 μ g DNA。轉錄緩沖液(IOX) 400mM Tris, pH 8、IOOmM MgCl2、50mM DTT、IOmM 亞精胺及 0· 1% Triton X-100。附加的微陣列方案緩沖液和試劑2X雜交緩沖液(IOOmM MESUM[Na+]、20mM EDTA、0. 01%吐溫20)； 2X 染色緩沖液(IOOmM MES、1M[Na+]、0. 05% 吐溫 20)；洗液 A(6XSSPE、0. 01 % 吐溫 20、 0.005%止泡劑)；洗液 B(100mM MES,0. IM[Na+]、0· 01 %吐溫 20) ；20XSSPE(3M NaCl.O. 2M NaH2P04、0. 02M EDTA) ；SSPE,生理鹽水-磷酸鈉鹽-EDTA ；MES, 2- (N-瑪琳代)乙磺酸；BSA, 牛血清白蛋白；SAPE，鏈霉親和素-藻紅蛋白。以下工序是基因芯片雜交方案的改良，特別適用于使用折疊的RNA進行RIPtide 結合物的篩選。棋盤格染色(1)寡核苷酸B2 (Affymetrix公司)的雜交。雜交混合劑寡核苷酸B2(3nM，終濃度250pM)、BSA、2X雜交緩沖液及無RNase的水。條件16h、45°C、60rpm、 使用 GeneChip 雜交爐 640 (Affymetrix)。(2)用 Affymetrix 方案 FlexGEwsh4v_450 及以下染色混合劑染色2X染色緩沖液、BSA、SAPE及無RNase的水。陣列條件標準條件。將RNA靶標溶于方法部分中所記載的緩沖液里，并再折疊。 在37°C下，以60rpm的轉速，在GeneChip 雜交爐內，讓IOOnM RNA與陣列孵育lh。隨后用折疊緩沖液簡單清洗(5min)所述陣列(應要求可得完整的清洗方案)。對于大于SOnt的 RNA，采用Affymetrix的“EukGEwsl ”方案(參見下文)。其它通常使用的條件將孵育限定在37°C下，將IOnM靶RNA與陣列孵育乩。此外，對于大RNA轉錄本PK123和HQ59，還測試了在37°C下，以IOnM的濃度孵育18h。這些條件通常引起較高程度的沃森-克里克識別。 微陣列清洗(1)初次清洗(溫和的)50mM磷酸鉀緩沖液、5mM Mg(OAc)2U50mM KCl，pH = 7.4。用IX陣列緩沖液，在25°C下，3次混合/循環，進行5個循環(約5min)。該清洗方案應用于所有RNA構建體。(2) 二次清洗(由Affymetrix基因芯片方案修改，更加嚴格) 適于大于SOnt的構建體的額外清洗。在25°C下，用清洗緩沖液A，2次混合/循環，進行10 個循環；在50°C下，用清洗緩沖液B，15次混合/循環，進行4個循環，30min洗液A ；以及在 25°C下，用清洗緩沖液A，4次混合/循環，進行10個循環。RIPtide 合成利用MerMade 12 (BioAutomation) DNA 合成儀制備 2，_0_ 甲基 RIPtide，所述制備的規模為0. 2 μ mol或1 μ mol，偶聯時間為6min，氧化步驟為50秒。以DMT-開啟(DMT-on) 的形式進行合成，以便于隨后的Poly Pak-II(Glen Research)純化。為了活性測定法中的使用，進一步對所選的RIPtide進行C18-反相HPLC純化。對于磷硫酰及LNA合成，使用相同的參數，采用硫化劑II (DDTT)及LNA亞磷酰胺單體(同樣來自于Glen Research)。TRAP 測定法一開始，在HeLa細胞提取物中，用兩次重復實驗，在600ρΜ_60 μ M的濃度范圍內測定RIPtide的抑制效力。在0.6ρΜ-60 μ M的濃度范圍內重復所選RIPtide的實驗。除序列IV-3以外，本文報道的所有RIPtide都是2’ -0-甲基衍生物(帶有磷酸二酯或磷硫酰骨架)，所述序列IV-3是作為全LNA序列合成及測定的。RIPtide長度在6-8個核苷酸之間(RIPtide微陣列篩選中的匹配)，此外，為各感興趣的聚類研究了一系列12聚體和14聚體，以確定RIPtide長度對其端粒酶抑制劑效力的影響。細胞培養條件在37°C下，5% CO2中，在補充了 10%胎牛血清的DMEM中培養轉化的胚胎腎細胞系HEK293及前列腺癌細胞系DU145。根據廠商說明中的記載，通過用200 μ 1 1XCHAPS裂解緩沖液(Chemicon)對IO6個細胞進行去污劑裂解，制備用于TRAP測定法的可溶性細胞提取物。總結本文記載的是一種新型的、結構上無偏見的、基于微陣列的方法，所述方法用于鑒定靶向折疊的RNA分子的短多核苷酸，本文將其稱為RIPtide，即RNA-相互作用的多核苷酸。該平臺的關鍵組件是N聚體的微陣列，所述微陣列中包含長度為4-8個核苷酸(N = 4、5、6、7和8)的所有可能的2’ -0-甲基化的RNA序列，含有4個規范RNA堿基(A、C、G和 U)。該報道是使用任何核酸類似物的大型高密度微陣列的首例代表。
典型地，發現相比相應的2’ -脫氧寡核苷酸，2’ -0-甲基RIPtide與靶標的結合要強50倍以上。還發現包含所有N = 4-8的2’ -寡脫氧核苷酸的N聚體RIPtide微陣列需要微摩爾濃度的RNA靶標并過夜孵育，以觀察到匹配，這些實際上都是8聚體(W. L. S.， A. R. P.，R. K.，G. M.，和G. L. V.，未發表的結果)。相比之下，利用2，_0_甲基化的RIPtide微陣列，用納摩爾濃度的RNA孵育lh，就產生了大量的匹配，其中包括8聚體、7聚體甚至6聚體的匹配，隨后在溶液中證實了它們作為結合物的作用。本文使用的基于光致抗蝕劑的合成工序，與可商購的5’ - 二甲氧三苯甲基-保護的3’ -亞磷酰胺完全可比，例如，應當能立即應用于RIPtide微陣列的制造中，所述RIPtide微陣列包括許多其它潛在有意思的或有用的核酸類似物變種。核酸類似物的可能性包括但不限于鎖核酸(LNA) (Kaur,H.等，Chem. Rev. 107,4672-4697(2007)) ,2'-甲氧乙基-(MOE)取代的 RNA(Bennett，C. F.，Antisense Drug Technology (2nd Ed.), 273-303 (2008))及縮水甘油核酸(GNA) (Schlegel, M. K.等， ChemBioChem 8,927-932(2007)) 盡管設計該微陣列篩選是為了無偏見地針對規范的沃森-克里克結合及非規范的相互作用模式，在本篩選中，并未觀察到非規范結合物的明顯示例。如果用更大的匹配數進行更詳盡的分析，完全有可能產生非規范結合物，但至少對于端粒酶的假結，前20-30位總是顯示出與靶RNA上的序列近乎完全的沃森-克里克互補性，這些匹配與其它就靶標而言具有輕微移碼或其它在序列上或長度上具有微小差別的匹配形成了一個聚類。分子內 RNA/RNA相互作用(即RNA折疊)的一個重要特性在于2’ -羥基，該2’ -羥基被頻繁應用于廣泛且多樣的氫鍵相互作用陣列中(Leontis,N. B,ffesthof,E.，RNA 7,499-512 (2001)) 并不希望將其束縛于理論中，這些涉及了 2’ -OH的相互作用提供了一種穩定力，所述穩定力對于非規范結合結構的形成而言是必不可少的。例如，可通過制造具有2’ -羥基或功能等價物的微陣列對此進行測試。在另一種實施方式中，RIPtide陣列中表示的核苷堿基種類(alphabet)可擴展到那些具有以Hoogsteen或其它模式配對的實質傾向的核苷堿基；這樣的核苷堿基的示例包括但不限于鳥嘌呤及腺嘌呤的8-氧代衍生物和8-氨基衍生物。本文報道的RIPtide篩選實驗鑒定了端粒酶假結/模板區域上的4個區域，所述區域可與2’-0-甲基化的短多核苷酸結合。在這些區域中，與最多RIPtide (聚類V)結合的區域是模板區域。所述模板區域嚙合微陣列結合RIPtide，為該方法提供了驗證，所述方法用于在折疊的RNA靶標中篩選特別有成效的結合位點。以下的發現，即RNA上只有極少的位點能被RIPtide靶向、已知本篩選中鑒定的所有位點都來自于結構性探測及序列相關變異、所述序列相關變異具有至少部分單鏈的特性，為所述RNA靶標采取了與折疊圖中所描述的結構相關的折疊結構提供了進一步的證據。也就是說，僅根據二級結構預測的、假結/ 模板中特定的能夠接近的區域，事實上對于RIPtide結合而言卻是無效的。例如，在HQ59 中，Jh. l/2a鼓泡、模板的5’ -末端和3’ -末端及J2a/3環的整個3’ -末端幾乎都是無法靶向的(圖4C)，正如二維折疊圖所表明的，暗示這些區域可能無法進行配對相互作用。折疊RNA分子的高分辨率結構揭示了這些區域事實上通常是以非規范相互作用配對的，而折疊圖中表明這些區域是單鏈形式。注意到盡管聚類II、III、IV靶向的區域經預測是部分單鏈的，在各種情況中，靶向的區域延伸到相鄰區段中，認為其形成了沃森-克里克雙鏈，在某些情況下，在利用相同環的相鄰區段的偏好下，所述聚類優選遷移至相鄰的雙鏈中。牽涉到鏈置換的RIPtide結合事件的特征在于它們的成功率(on-rate)小于那些可自由接近的位點。可以想象，成功率的確定能夠產生有價值的領悟。并不希望將其束縛或局限于理論中，在溶液Kd值和微陣列匹配排名順序間觀察到的關聯可能是由排列的RIPtide文庫中成員間結合動力學的不均一性導致的。本文遵循的方法，即對從大核糖核蛋白顆粒中分離的RNA元件的RIPtide微陣列篩選，與現有技術中已有的方法相比具有明顯的優勢。最明顯的優勢在于RIPtide微陣列篩選中最佳范圍的RNA(即小于約160nt的RNA)很容易獲取，且經常折疊為穩定的結構。對于端粒酶，一個可能性在于單獨靶向RNA，會通過阻止RNP組裝而抑制端粒酶活性，例如，這可以通過靶向hTR WkaRNA域來阻斷輔助亞基角化不良蛋白的結合進行測試。如本文所記載的，采用這種策略及隨后的效率優化，鑒定了在體外和體內抑制人端粒酶活性的新序列， 所述新序列包括但不限于序列編號1和序列編號2。這種新方法并不需要對RNA靶標進行事先的結構鑒定，使得可以對高度結構化的 RNA中短寡核苷酸優選結合位點的鑒定進行定位。相比更長的寡核苷酸，短寡核苷酸很可能顯示出更好的類似藥物的特性，如提高的細胞吸收、以降低的成本容易地進行制備和修飾等，同時還保持了對RNA的高親和力。對于這些基于寡核苷酸的藥物，假設凈負電荷是寡核苷酸的細胞吸收而言的障礙，由此設想，相比其它RNA-相關的靶向方法中使用的傳統的20 聚體寡核苷酸而言，由于磷酸基團較少，相對較短的RIPtide所帶負電荷減少，從而能顯示出更好的細胞滲透特性。同時，短序列的需求顯著簡化了微陣列的制造過程，使得在定制的陣列中引入不同尺寸及化學修飾成為可能，更不必說合成時間和成本的全面降低了。最初的嘗試中，使用了由2’ -0-甲基RIPtide組成的微陣列，但是，相同的方法學也可應用于其它基于核苷酸的分子(如甘油核酸；同型DNA;堿基、糖、骨架經過修飾的 RIPtide等)。此外，該方法并不限于單個微陣列平臺。盡管該RIPtide方法最初是以類似于高密度基因芯片陣列的形式應用于Affymetrix制造的微陣列，但只要合成的RIPtide能夠固定到固體表面上，這種觀念還可以延伸到不同類型的陣列中，例如自制的微陣列。與RIPtide微陣列方法中所不同的，另一個感興趣的方面在于以下事實，即原則上，考慮到在RNA折疊及RNA-蛋白識別事件過程中非規范相互作用的有關作用，在RIPtide 存在的情況下進行折疊RNA的篩選，可以為RNA結合物的鑒定提供一種途徑，所述途徑并不惟一地局限于沃森-克里克識別事件。因此，設計了無偏見的或無規則的篩選，從而能夠檢測寡核苷酸-RNA相互作用中的所有方面，既包括規范(沃森-克里克堿基配對)相互作用，也包括可能的非規范(搖擺(Wobble)配對、Hoogsteen配對、剪式配對(sheared pair) 等)相互作用。本研究中，該RIPtide方法學被用于高度結構化的RNA域的研究中，所述高度結構化的RNA域屬于一個非常復雜的生物學系統(人核糖核蛋白端粒酶)，但是，也可以使用其它RNA作為靶標。在人端粒酶假結/模板域的情況下，尤其是在2’ -0-甲基RIPtide的特定情況下，發現寡核苷酸更傾向于與假結/模板域的模板區域(已知該區域在細胞環境下很容易接近)>J2a/J2b環、J2b/3環(還暗示了在我們的體外實驗條件下，所述假結可能無法永久形成)及J2a/3環的5’ -末端。在沒有其它蛋白組分存在的情況下，其中大部分區域包含環以及預測在RNA結構中相對比較開放的序列片段。在生物學環境下，由于預期hTR是作為全酶RNP復合物，與細胞中的轉錄酶及不同蛋白全面相關，可以想象得到，該RNA的一部分會處在與不同蛋白組分的緊密相互作用中，而這些蛋白并不包括在我們的篩選研究中，這會降低RIPtide與hTR最佳相互作用的可接近度。然而，所述RIPtide篩選已經促進了若干具有明顯的抗端粒酶活性的序列的鑒定。通過對hTR內的其它功能域和結構域進行篩選，預計該技術可用作加快發現許多其它新型核酸序列的工具，所述新型核酸序列可通過干擾催化和/或組裝而作為端粒酶功能的調節因子。本發明可被限定在以下任何被編號的段落中1.端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。2.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸是核糖核酸。3.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸是核酸類似物。4.第3段的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。5.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環
纟口口。6.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。7.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成。8.第1段的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成。9.抑制端粒酶活性的方法，所述方法包含將端粒酶與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。10.第9段的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。11.第9段的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。12.第11段的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。13.第9段的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結合。14.第9段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。15.第9段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成。16.第9段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1和序列編號2 組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成。17.抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核酸或其類似物接觸， 所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。18.第17段的方法，其中，所述細胞是在體外進行接觸。19.第17段的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。
20.第17段的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。21.第20段的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。22.第17段的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結合。23.第17段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4_20個核苷酸的結合序列。24.第17段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1至序列編號 10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成。25.第17段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1和序列編號2 組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成。26.在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含對受試者給予有效量的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。27.第沈段的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。28.第沈段的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。29.第觀段的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。30.第沈段的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結合。31.第沈段的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。32.第沈段的方法，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10 組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成。33.第沈段的方法，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成， 或進一步可選地由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成。34.第沈段的方法，其中，所述增生性病癥是癌癥。35.治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑及藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的 CR4-CR5域結合。36.第35段的治療組合物，其中，所述核酸是核糖核酸。37.第35段的治療組合物，其中，所述核酸是核酸類似物。38.第37段的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。39.第35段的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環
纟口口。40.第35段的治療組合物，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。41.第35段的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列組成。42.第35段的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列組成。43.端粒酶抑制劑，所述抑制劑包含核酸分子或其類似物，所述核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列，或可選地基本上由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成，或進一步可選地由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成。44.第43段的端粒酶抑制劑，其中，所述結合序列包含選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列組成。45.第43段的端粒酶抑制劑，其中，所述結合序列包含序列編號20，或可選地基本上由序列編號20組成，或進一步可選地由序列編號20組成。46.抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核糖核酸分子或其類似物接觸，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中， 所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列，或可選地基本上由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成，或進一步可選地由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成。47.第46段的方法，其中，所述結合序列包含選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45 組成的組中的序列組成。48.第46段的方法，其中，所述結合序列包含序列編號20，或可選地基本上由序列編號20組成，或進一步可選地由序列編號20組成。49.在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含對受試者給予有效量的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含核糖核酸分子或其類似物，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列，或可選地基本上由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成，或進一步可選地由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成。50.第49段的方法，其中，所述結合序列包含選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列組成，或進一步可選地由選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45 組成的組中的序列組成。
51.第49段的方法，其中，所述結合序列包含序列編號20，或可選地基本上由序列編號20組成，或進一步可選地由序列編號20組成。52.第49段的方法，其中，所述增生性病癥是癌癥。53.治療組合物，所述治療組合物包含端粒酶抑制劑及藥學上可接受的載體，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號 45組成的組中的結合序列，或可選地基本上由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成，或進一步可選地由選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列組成。54.第49段的治療組合物，其中，所述結合序列包含選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列，或可選地基本上由選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組中的序列組成， 或進一步可選地由選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號 45組成的組中的序列組成。55.第49段的治療組合物，其中，所述結合序列包含序列編號20，或可選地基本上由序列編號20組成，或進一步可選地由序列編號20組成。表表 1
聚類共有序列序列編號IlXAGCGAX序列編號46IIIXGGAGCAX序列編號47IVGAAGGCG序列編號48IVGAACGGUG序列編號49VXGGUUAAGX序列編號50VAGUUAGG序列編號51表 2
序列編號1變體由FP所得Kd由TRAP所得IC50
G*CCUCCAG GCCUCCA*G G*CCUCCA*G G*C*C*U*C*C*A*G
8.8±2.5 nM
8.9士 5.6 nM 37.3 ± 15.2 nM
ND
μΜ 16 μΜ
磷硫酰
G*C*C*U*C*C*A*G
ND
6 μΜ
LNA
4權利要求
1.端粒酶抑制劑，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
2.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸是核糖核酸。
3.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸是核酸類似物。
4.權利要求3所述的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。
5.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/ J6環結合。
6.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。
7.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列。
8.權利要求1所述的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列。
9.抑制端粒酶活性的方法，所述方法包含將端粒酶與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
10.權利要求9所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。
11.權利要求9所述的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。
12.權利要求11所述的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。
13.權利要求9所述的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結合 O
14.權利要求9所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。
15.權利要求9所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列。
16.權利要求9所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列。
17.抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核酸或其類似物接觸，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
18.權利要求17所述的方法，其中，所述細胞是在體外進行接觸。
19.權利要求17所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。
20.權利要求17所述的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。
21.權利要求20所述的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。
22.權利要求17所述的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結合O
23.權利要求17所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。
24.權利要求17所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列。
25.權利要求17所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列。
26.在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含對所述受試者給予有效量的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
27.權利要求沈所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸。
28.權利要求沈所述的方法，其中，所述核酸是核酸類似物。
29.權利要求觀所述的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。
30.權利要求沈所述的方法，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/J6環結I=I ο
31.權利要求沈所述的方法，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。
32.權利要求沈所述的方法，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號 10組成的組中的序列。
33.權利要求沈所述的方法，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號 2組成的組中的序列。
34.權利要求沈所述的方法，其中，所述增生性病癥是癌癥。
35.包含端粒酶抑制劑及藥學上可接受的載體的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域結合。
36.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述核酸是核糖核酸。
37.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述核酸是核酸類似物。
38.權利要求37所述的核酸類似物，其中，所述核酸類似物是核糖核酸類似物。
39.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑與所述CR4-CR5域的J5/ J6環結合。
40.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述核酸或其類似物包含長度為4-20個核苷酸的結合序列。
41.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1至序列編號10組成的組中的序列。
42.權利要求35所述的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含選自序列編號1和序列編號2組成的組中的序列。
43.端粒酶抑制劑，所述抑制劑包含核酸分子或其類似物，所述核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核酸分子或其類似物包含選自序列編號 11至序列編號45組成的組中的結合序列。
44.權利要求43所述的端粒酶抑制劑，其中，所述結合序列選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組。
45.權利要求43所述的端粒酶抑制劑，其中，所述結合序列包含序列編號20。
46.抑制細胞內端粒酶活性的方法，所述方法包含將細胞與核糖核酸分子或其類似物接觸，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列。
47.權利要求46所述的方法，其中，所述結合序列選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組。
48.權利要求46所述的方法，其中，所述結合序列包含序列編號20。
49.在對其有需求的受試者中治療增生性病癥的方法，所述方法包含對所述受試者給予有效量的端粒酶抑制劑，其中，所述端粒酶抑制劑包含核糖核酸分子或其類似物，所述核糖核酸分子或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列。
50.權利要求49所述的方法，其中，所述結合序列選自序列編號19至序列編號M、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組。
51.權利要求49所述的方法，其中，所述結合序列包含序列編號20。
52.權利要求49所述的方法，其中，所述增生性病癥是癌癥。
53.包含端粒酶抑制劑及藥學上可接受的載體的治療組合物，其中，所述端粒酶抑制劑包含核酸或其類似物，所述核酸或其類似物與人端粒酶RNA組分的假結/模板域結合，其中，所述核糖核酸分子或其類似物包含選自序列編號11至序列編號45組成的組中的結合序列。
54.權利要求49所述的治療組合物，其中，所述結合序列選自序列編號19至序列編號對、序列編號39、序列編號44及序列編號45組成的組。
55.權利要求49所述的治療組合物，其中，所述結合序列包含序列編號20。
全文摘要
本發明的一個目的在于通過提供與人端粒酶RNA組分的CR4-CR5域或假結/模板域結合的抑制劑，來提供抑制人端粒酶的方法和組合物。
文檔編號A61P35/00GK102238967SQ200980149015
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月7日 優先權日2008年10月7日
發明者盧爾德斯·古德-羅德里格斯, 格雷戈里·L·韋爾丹尼, 肖恩娜·休列-梅伊·斯坦頓 申請人:哈佛大學校長及研究員協會