專利名稱：用于提高植物和農作物產量的通過植物根系輸運活性成分的作為土壤添加劑的合成共生系統的制作方法
技術領域：
本發明描述了一種制備用作土壤添加劑的有/無生物活性的納米結構大孔親水交聯離子聚合物顆粒系統的方法，所述系統允許植物根穿入和穿透該顆粒，由此提高了生物質和農作物的生長速度和產量，特別是在水分和肥料脅迫的條件下。當將所述方法應用于種子或植株的生長時，該方法還通過向生長中的植物提供使其長成的養分來提供適宜的生長條件。當移栽這些植物時，仍然保持了所述適宜的生長條件，因此使得植物在更不利的新環境中也能夠長成。植物生長的促進作用和農作物增產作用被稱為農業集約化進程 (A-PI)，而為了 A-PI的用于促進植物根、水、養分和在可適用的情況下，微生物(如細菌和 /或真菌)之間的相互作用的合成培養基被稱為合成共生系統(SSS)。所述SSS材料(聚合物)實質上為一種納米結構大孔(NSMP)彈性/海綿狀離子交聯親水性聚合物，其帶有或不帶有如細菌和真菌的生物活性物種并在微觀上使植物根、水、養分和細菌之間發生相互作用。SSS的有益效果概述如下1、在土壤中分散高度吸水的(親水性的)且溶脹的納米結構大孔交聯離子聚合物顆粒能夠更有效地調配水，從而使生物質和農作物增產。與其他吸水性土壤改良劑不同， SSS聚合物停留在土壤里而不容易被沖走或被化學/生物降解掉。2、在顆粒狀SSS聚合物的孔內儲存肥料能使養分直接、定向、緩慢地向植物根釋放。3、如果植物根穿入SSS聚合物中，植物受益于已經被所述聚合物(該聚合物由于存在離子部分因此可同時起到離子交換介質的作用)吸附的養分和水的存在。4、用固氮細菌對所述顆粒狀SSS聚合物進行接種和定殖能使根被細菌感染并發生從空氣中到豆科植物的共生氮轉移，導致農作物的氮、磷以及金屬濃度的提高。5、接種混合微生物(例如，根瘤菌(rhizobium)和有益的土壤真菌，菌根真菌 (mycorrhizal))能使氮轉移到非豆科植物并使如磷的養分有效轉移至植物。6、在經接種的SSS-聚合物的存在下間作豆科植物和非豆科植物也使得與SSS-聚合物結合的共同根系并在植物間共享氮。7、通過在罐內在SSS-聚合物上使植物的種子生長然后移栽，存活幾率及在新環境中長成植物的幾率提高。基于對模型植物(草和麻風樹(其不能固氮)以及豌豆和大豆(其能夠固氮)) 的溫室實驗，SSS的益處概述如下1、彈性/海綿狀SSS聚合物允許土壤微生物(細菌或真菌)在其中生長。2、提高農作物內的金屬濃度。3、在干旱條件下的大幅度增產作用。4、當肥料被沖走時提高收成的數量。
5、當根系穿過所述生物活性SSS-聚合物培養基時，增加了豆科植物的感染。6、當根穿過SSS-聚合物培養基生長時，其形態得到改善。7、由于細菌和根在數十微米內彼此共存，因此對SSS-聚合物接種混合細菌可促進共生。
背景技術：
在脅迫條件下農業集約化進程(A-PI)是很重要的，而如果發生全球變暖該脅迫條件將會更加嚴重。在這種情況下，將會加重農業中水和氮的脅迫狀況，而對生物質、食物和肥料的需求增加將會使任何基于生物質的能量/化學制品供給技術不堪重負。本發明公開了如何通過靶向水調配、肥料釋放和生物固氮而同時實現植物生長。在本發明中，通過使植物根與SSS-聚合物的締合來實現水、生物固氮和肥料(包括氮)傳輸的靶向。本發明與采用土壤改良劑或緩釋肥料或間作的其他生物質/農作物增產技術有著本質的區別，這是因為，在本發明中，SSS-聚合物與植物根締合，因此養分和水的傳輸以及根感染(導致用于生物固氮的根瘤形成)是直接的并且集中在根毛處。下面的總結概述了可用于植物和農作物增產的技術。超吸收劑聚合物(Super-absorbentpolymer) (SAP)在土壤保水能力低的農業和園藝應用中或在半干旱地區，聚合物的使用具有很大的潛力。在許多半干旱國家，使用低質量的水來灌溉農作物，因此加重了土壤鹽漬度。已經有報道稱超吸收劑聚合物和水凝膠即使在壓力下也能吸收最高達其重量MOO倍的去離子水。已經顯示應用水凝膠向生長中的農作物供應水減輕了缺水脅迫的影響并且減少了灌溉需求，降低了植物的死亡率，改善了土壤中肥料的保持力并促進植物的生長(Mohana Raju, K.，Padmanabha Raju, M. and Murali Mohan，Y. (2003). Synthesis of Superabsorbent Copolymers as Water Manageable Materials. Polymer Int. 52 :768-772)。已經從植物重量、葉片寬度、總干重和在植物開始枯萎前的增加長度幾個方面研究了對植物生長的益處。這是通過聚合物或水凝膠對一系列特性(例如，土壤滲透性、密度、結構、質地、壓實、透氣、侵蝕和微生物活性)的影響并通過影響水的流失、蒸發和滲透率來實現(Abd El-Rehim, H. A.，H.，E. -S. A. and Abd El-Mohdy, H. L. (2004). Radiation Synthesis of Hydrogels to Enhance Sandy Soils Water Retention and Increase Plant Performance. J Appl Polymer Sci Vol. 93 :1360-1371)。但是，由于低交聯，水凝膠傾向于被容易地降解掉和沖走。緩釋肥料施用肥料用于出產高產量和高質量的農作物。過量施肥和低的使用效率常常導致發生肥料淋洗作用和流失，這將導致由于湖中的‘藻華’和河口中的‘赤潮’引起的水系的過營養化。據估計約50-70%施用的肥料會流失到環境中。為了幫助提高肥料的使用效率， 已經開發了緩釋和控制釋放系統來以能使肥料被利用的速度向植物釋放肥料，從而將通過淋洗作用和流失而損失到環境中的肥料減到最少。微生物接種簡單地說，接種是將活的對植物有益的微生物(細菌和真菌)施加到載體材料上的方法，所述載體材料可以是有機的、無機的、天然的或合成的。接種物對植物生長的理想效果包括在豆科植物中的固氮、土壤傳播疾病的生物防除、增加礦物質的攝取、土壤礦物質的風化和營養性或激素性作用。用根瘤菌(rhizobacteria)接種土壤導致感染適合的植物根以形成有效的根瘤。此外，有益的真菌，例如根真菌，通過根也與植物形成共生關系并促進攝取磷酸鹽。可使用多種方法來接種農作物，其中最普遍的方法是用粉末狀的接種物將種子包衣，隨后，當種子開始發芽時，該接種物可以感染種子。根據土壤類型、宿主植物和細菌，根瘤菌從接種點向根的傳播或者取決于細菌的主動活動性或者取決于細菌在水中或在載體上的被動運動。但是，通過觀察熒光假單胞菌O^seudomonas fluorescens)對豌豆根的定殖以及假單胞菌O^eudomonas)種菌株對馬鈴薯根的定殖的研究表明灌溉和水流是將細菌運送到根的最有效的方法。當缺水時，細菌的運送將受限。許多根瘤菌菌株能夠通過促進營養作用、加速礦物化過程或者通過保護植物免受有害土壤微生物的損害來刺激植物的生長而不形成根瘤。但是，在這種情況下，產量反應明顯小于固氮的情況。豌豆(Pisum sativum)作物是人類飲食中重要的蛋白質來源并為動物飼料提供草料。豌豆通過通常在歐洲可耕種土壤里發現的豌豆根瘤菌野豌豆變種 (Rhizobium leguminosarum biovar viciae) (Rlv)來形成根瘤。所有的根瘤菌均顯示出某種程度的宿主特異性，并且IUv能夠使蠶豆(Vicieae)族(包括野豌豆(Vicia)屬、山黧豆(Lathyrus)屬、豌豆(Pisum)屬和兵豆(Lens)屬)中的所有品種生成根瘤。通常，在豆科植物-根瘤菌共生現象中，宿主特異性決定了根瘤菌種和短根瘤菌屬(Bradyrhizobium) 種對豆科植物根的附著，但研究顯示，對于根瘤菌-豌豆系統，根瘤菌的生長條件強烈地影響了其對根的附著(Abd El-Rehim, H. A.，H.，E. -S. A. and Abd El-Mohdy, H. L. (2004). Radiation Synthesis of Hydrogels to Enhance Sandy Soils Water Retention and Increase Plant Performance. J Appl Polymer Sci Vol. 93 :1360—1371)。這被認為是由于Rlv菌株的低接種效率以及對菌株-栽培品種特異性(strain-cultivar specificity) 的研究較少所導致的。已知豌豆根瘤菌(lihizobium leguminosarum)附著到豌豆根毛是取決于培育的 PH值和生長階段，其中，在pH值為7. 5且用處于生長早期靜止期的細菌時產生最佳的附著。通過根瘤菌和豌豆(Pisum sativum L.)共生固定的氮的量為52_77kg N ha"1 (Elkan, G. H. (1992). Biological nitrogen fixation. In :Encyclopedia of Microbiology. Ed New York, Academic Press Inc. 1 :285-295)。混合細菌接種物協同相互作用的混合接種物(微生物的組合)能夠通過可促進其生理的某些有益方面(如固氮)的生理或生化活性來提供養分、除去抑制性產物并相互刺激。混合細菌接種物的一個實例為固氮嗜根菌(Azosipirillum)，其能夠與糖-或多糖-降解細菌(PDB)締合，建立新陳代謝的共生體，其中，糖-降解細菌產生降解和發酵產物，這些產物被固氮嗜根菌作為碳源利用，而固氮嗜根菌反過來又為PDB提供氮。其他的實例為固氮嗜根菌與降解果膠的桿菌(Bacillus)、固氮嗜根菌和降解纖維素的纖維單胞菌(Cellulomonas)以及固氮嗜根菌與發酵葡萄糖的陰溝腸桿菌(Enterohacter coacae)之間的共生體(Y· Bashan，(1998). Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture， Biotechnology Advances,16 729-770)。此外，固氮嗜根菌被看作是根瘤菌輔助菌，其刺激根瘤形成、根瘤活性和植物新陳代謝，所有這些都刺激植物生長的變量和植物對不利條件的抵抗力。固氮嗜根菌或固氮菌(AzotcAacter)與鏈霉菌(Str印tomyces)以及固氮嗜根菌與生防益菌計有瓶霉菌 (Phialophora radicola)(防真菌劑)的有益組合均有文獻記載。用固氮細菌和灌木-菌根真菌混合接種產生了協同相互作用，這種協同相互作用可使植物生長明顯加速、植物中的磷含量明顯提高、增加菌根真菌的感染并增加對如磷、 氮、鋅、銅和鐵的礦物質養分的攝取。間作間作利用混養中的天然的一體化技術，其中，一種植物的產出被其他植物利用。在間作中，主要農作物的生產力通過附加農作物的存在而提高。通過間作提高主要農作物生產力的機理是多方面的。間作已經在非機械化農業中被成功地利用。但是，間作在現代機械化農業中并不總是經濟的。然而，如果間作的唯一目的是增加生物質產出并減少施肥，那么間作和機械化農業就可以是可持續的。由于我們的目的是促進從空氣中固定氮，因此在SSS的存在的情況下間作豆科植物與非豆科植物是非常成功的。在目前的間作技術中，氮的轉移是跨越宏觀水平的(在目前的實踐中以數米到數厘米為參照)，而SSS技術能夠跨越微觀水平實現養分的轉移，因此增強了間作的效果。植物根/水/養分/微生物的相互作用通過灌溉和/或擴散向植物根運送細菌和肥料導致細菌分布在整個土壤中，因此降低了土壤/根界面的局部細菌濃度。最終，細菌和土壤均被沖走而不能到達根系。此外， 作為不利土壤環境的結果，細菌的連續分布可導致土壤中菌落的破壞、生物群體信號傳導和整體活性的減弱以及最終的細菌耗盡。這些后果導致細菌對根感染的概率降低并造成肥料和水的浪費。因此，與水和養分/肥料類似，也使用不同的策略來代替土壤細菌，包括用細菌肉湯來包衣種子。由于每單位體積的植物根部區域中的根-細菌相互作用面積小，因此即使是在高細菌濃度下，根和細菌之間的相互作用也是隨機的。可將每單位體積土壤中的根表面積看作是運送區域密度CTransport Area Density) (TAD)，TAD在可通過提高TAD 而增強的生化和化學過程中的許多熱和質量轉移步驟中都是重要的。此處描述的當前技術使水、肥料以及在可應用的情況下的細菌和植物根集合在SSS-聚合物的孔中，從而縮短了有效擴散路徑并提高了 TAD。此外，SSS-聚合物的孔起到了微生物的保護性微環境的作用， 同時，對于通過其孔生長的植物根，起到了水源和營養源的作用。細菌濃度的提高加強了生物群體信號傳導并促進了植物-細菌的共生。進一步增強在生物或催化化學反應中的質量轉移可以通過確保所有催化位點都被利用來實現，這是一個要求在整體式生物-或化學-反應器(monolithic bio-or chemical reactor)中運行的策略，在該生物-或化學-反應器中，通過如在自然界中見到的多級孔(hieratchic pores)的網絡(肺、肝臟、腎臟、循環系統等)能夠接觸到催化/活性位點。在生物(包括組織工程)和化學系統中實現的所謂“基于現象的過程強化”表示在10-1000倍的區域內的強化水平。在生物系統中，當物質或微生物的行為取決于限制它們的環境的尺寸時，強化通過所謂的“局限現象(confinement phenomena) ”來實現。因此， 對于給定的微生物，通過使用具有特定微結構(孔徑、互連尺寸)的支持系統就能夠控制生長速度、選擇性、生產率。該支持系統的化學/生物特性也影響微生物的行為。因此，基于“局限現象”，就可以強化生物過程。生物過程強化的一個重要要素為使用具有生物活性壁結構的納米結構微孔材料。使用納米結構微孔聚合物和細菌構建物作為土壤添加劑使根穿入聚合物的孔中， 細菌得以生長并且通過聚合物快速吸收/緩慢解吸水。植物生長(草、麻風樹、大豆和豌豆)和農作物產量(豌豆)數據(均為鮮重和干重產量)清楚地表明該共生系統作為生物反應器運作良好。此外，每次收割后的植物生長強化同樣證明當養分因消耗和被水沖洗而從土壤中除去時在土壤內的這些微_(生物)反應器對植物生長的生長貢獻。這種增強是由于SSS-聚合物一細菌構建物的下列屬性導致的。由于SSS-聚合物在有水時能夠容易地吸收水并在植物需要時能緩慢地釋放，因此提高了水和養分(在水里或由通過聚合物吸收的肥料提供)的可用性。由于根在水源的數微米范圍內，因此水的轉移不再受到擴散作用的限制。在與細菌締合的情況下，根同樣非常靠近細菌源并且在聚合物的孔內保持了高的細菌濃度。長到聚合物外的根已經被感染并長回到土壤中，在這里其能夠利用水和養分而無需形成其他的根瘤。如下文所述，根據SSS-聚合物的化學/物理結構，可以防止或加強細菌從土壤的滲透。防止不合需要的細菌滲透進入SSS-聚合物細菌構建物部分是因為聚合物構建物外的細菌濃度小并且在土壤中也不存在促進細菌滲透的活性機制(如強制對流)。僅有的機制是通過細菌的活動力和分裂。此外，SSS-聚合物阻止了大的或活力差的細菌進入聚合物構建物中，因此，在孔內存在的細菌得到保護而防止了其他細菌的滲透以及隨后的定殖。SSS-聚合物構建物還起到了突然增加的毒素的儲庫的作用，所述毒素例如為重金屬離子(當被磺化時SSS-聚合物實質上為離子交換樹脂)或有機毒素。在此使用的基于交聯聚苯乙烯-乙烯基吡啶的SSS-聚合物或磺化交聯聚苯乙烯SSS-聚合物為雙親性，即， 它們既吸收水也吸收其他溶劑。因此，SSS-聚合物既能吸收金屬離子也能吸收有機毒素， 隨后隨著環境中毒素水平的下降或者金屬離子或有機毒素通過植物修復或細菌降解而被代謝掉，它們被逐漸釋放。下面詳述的新近結果表明即使SSS-聚合物中不包含細菌，對于所有受試植物，總生物質產量均提高。盡管如此，就豆科農作物(例如豌豆和大豆)而言，在SSS-聚合物中存在固氮細菌(根瘤菌)且不存在水和養分脅迫的情況下，總生物質和農作物的增產明顯。 當存在水和養分脅迫的情況時，與對照相比，非-生物和生物SSS-技術均具有生物質增產的作用。這清楚地表明，與土壤細菌相比，豌豆植物通過SSS-聚合物接受了更多的氮。通過提供植物/細菌交流的顯現為植物分泌物的物質的廣泛存在，進一步證實了上述研究結果。在僅用土培生長的正常條件下，這些分泌物將會以低濃度存在并會被從根-細菌界面處沖走。有可能是這些信使化學物質增加了植物的氮攝取。已經發現合成共生系統具有許多提高生物質/農作物生長速度和產量的特性。根據本發明，其提供了一種植物生長支持培養基，該培養基包含具有孔徑在30微米以上的初級孔的磺化的聚合物材料，該聚合物材料是彈性的以使所述孔的孔徑能夠增大，例如所述孔因為水含量或因植物根穿過而增大。所述聚合物材料的最初孔徑優選為30-300微米以使該材料在空隙空間和結構完整性之間獲得平衡，并且特別優選50-150微米。
有利的是，磺化度為40-75%，并且特別有利的是，磺化度為60-70%。磺化度太高 會使孔壁的強度降低過多，而磺化度太低則不能使孔壁具有足夠的彈性和親水性。方便的是，通過熔接尺寸范圍為10-20納米的聚合物顆粒，孔壁也為多孔的。該納 米結構導致形成了允許轉運水、養分和代謝物的納米-孔(1-5納米)。有利的是，所述聚合物材料選自聚苯乙烯、苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物或苯 乙烯/乙烯基吡啶共聚物中。特別有利的是，所述苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物的組分 的重量比為75 20。進ー步特別有利的是，所述苯乙烯/乙烯基吡啶共聚物的組分的重量 比為75 8。優選地，所述聚合物材料包含毫米尺寸的毛細管以促進植物根生長。所述初級孔方便地相互連接以使水、養分、細菌和根毛從ー個孔生長到另ー個孔。優選地，為了吸收水并運送水、空氣、養分和代謝物，所述孔的壁為納米結構。方便的是，所述SSS-聚合物中包含的聚合物材料為彈性的以使根穿過其生長。優選地，所述聚合物材料為高度親水性的以使水快速吸收但緩慢釋放。有利的是，所述材料為生物相客性的，或者進ー步有利的是，所述材料為生物活性 的，以幫助促進細菌生長。在本申請中優先使用的SSS-聚合物為納米結構微孔交聯的離子性和親水性聚合 物，其也被稱為PolyHIPE聚合物(PHP)，該聚合物具有70-95%空隙容積。它們或者在被賦 予親水性之前就具有弾性或者一旦吸收水就變成彈性的。盡管這些聚合物可被制成具有 0. 5-300微米的初級孔徑，但是僅有大孔級別是優選的。如果在聚合過程中允許形成聚結孔 (其尺寸可為數百微米)，由于聚結孔分散在初級孔內，因此會降低初級孔徑。需要注意的 是，當磺化的PHP接觸水膨脹吋，孔徑増大。
現參照附圖描述本發明。在附圖中圖l(a、b)顯示了經微波照射而無需沖洗步驟的多種磺化PHP的紅外光譜，該光譜 示出了磺化作用和碳的形成。圖2 (a-f)圖示了磺化PHP的微/納米結構。圖3顯示了當將0. 5% w/w大約125mm3的海綿狀中和PolyHIPE聚合物(SNS-PHP) 用在土壌中作為土壤改良劑并每天澆水吋，草根的締合體。圖4(a)為SNS-PHP表面的SEM，其顯示了穿過海綿狀中和PolyHIPE聚合物結構生 長的最初的草根的存在。圖4(b)為SNS-PHP (海綿狀聚合物)表面的SEM，其顯示了從SSS-聚合物中存在 的毛細管中長出的纖細根毛的存在。圖4(c)與圖4(b)相同，在更高的放大倍數下。圖4(d)穿過SSS-聚合物結構生長的草根。圖4 (e)在海綿狀PHP (SNS-PHP)內的草根結構的細節。圖5 (a)彈性的磺化PHP (未中和)在用于土壤中之前的低放大倍數SEM。圖5(b)彈性的磺化PHP (未中和)的在更高放大倍數下的SEM，其顯示了孔和相 互連接的結構。
圖5(c):與Fig. 5(a)中相同，在更高的放大倍數下顯示了壁的結構。圖6 (a)帶有草根締合體的中和彈性PHP (SNS/EHA-PHP)的SEM(橫截面)。圖6 (b)帶有草根締合體的磺化-中和弾性PHP (SNS/EHA-PHP)的SEM (橫截面)。圖7(a)施肥對生長21天后的草的鮮重產量的影響(每天澆水；第一次收割)。圖7(b)施肥對生長21天后的草的干重產量的影響(每天澆水；第一次收割)。圖8 (a)施肥對生長42天后的草的鮮重產量的影響(每天澆水；第二次收割)。圖8(b)施肥對生長42天后的草的干重產量的影響(第二次收割；每天澆水)。圖9 (a)施肥對生長63天后的草的鮮重產量的影響(第三次收割；每天澆水)。圖9(b)施肥對生長63天后的草的鮮重產量的影響(第三次收割；每天澆水)。圖10(a、b)在每天澆水的條件下，海綿狀PHP (SNS/EHA-PHP)對生長21天后的草 的產量的影響(第一次收割)，(a)鮮重；(b)干重。圖11 (a、b)在每周澆水GOml)的條件下，海綿狀PHP (SNS/EHA-PHP)對生長21 天后的草的產量的影響(第一次收割)，(a)鮮重；(b)干重。圖12 (a、b)在每周澆水QOml)的條件下，海綿狀PHP (SNS/EHA-PHP)對生長21 天后的草的產量的影響(第一次收割)，(a)鮮重；(b)干重。圖13 (a、b)在使用或不使用海綿狀SNS-PHP的情況下，接種處理對41天后豌豆 莢產量的影響，(a)鮮重，(b)干重。圖14 (a、b)在使用或不使用海綿狀SNS-PHP的情況下，接種處理對41天后豌豆 植物的植株生物質產量的影響。圖15(a、b、c)在用于豌豆栽培前，在不同放大倍數下的接種了豌豆根瘤菌的海 綿狀 PHP (SNS-PHP)。圖16 (a、b、c、d、e)豌豆根與磺化-中和海綿狀PHP (SNS-PHP)的締合體。圖17(a)與海綿狀PHP(以圓片形式緊鄰種子的下面使用)締合的豌豆植物根的 照片，其顯示了根在穿過SSS-聚合物(SNS-PHP)后形成了根瘤，而未與SSS-聚合物接觸的 根沒有形成根瘤。圖17 (b)在被海綿狀PHP (SNS-PHP)內的細菌感染后形成的豌豆根的根瘤的SEM。圖17 (c)在海綿狀聚合物(SNS-PHP)內的豌豆根的SEM，其顯示了腐質和PHP結 構的存在。圖17(d)豌豆根通過海綿狀PHP (SNS-PHP)生長并產生腐質。圖17(e)因根生長和絲狀結構的存在而造成的PHP結構的變形和相互連接。圖17(f)包含根、細菌和海綿狀PHP(SNS-PHP)的微環境的產生。圖17(g)在豌豆生長過程中在海綿狀PHP(SNS-PHP)內的細菌菌落。圖17(h)在從海綿狀PHP (SNS-PHP)被感染后，在根表面生長的細菌。圖17 (i)在豌豆栽培過程中在使用海綿狀PHP (SNS-PHP)接種的根瘤菌表面形成 的纖維狀結構的細節(放大倍數X 5000)。圖18 (a)穿過海綿狀PHP (SNS-PHP)的纖維狀根結構。圖18(b)當根単獨在土壌中生長時，纖維狀的根結構。圖19(a、b、c、d)草和豌豆的根與海綿狀PHP (未接種)的締合體，其顯示了在不 同的部位以不同的放大倍數下穿過SSS-聚合物(SNS-PHP)的兩種不同類型的根的存在。
圖20(a、b、c)草和豌豆的根與用根瘤菌接種的海綿狀PHP的締合體，其顯示了細菌和纖維狀結構的存在。圖21 (a、b、c)以不同的放大倍數顯示了在海綿狀PHP(SNS_PHP)孔壁上生長的真菌。圖22 當植物由種子開始生長隨后被移栽時根生長和根瘤形成的圖示。設計這項技術是為了提高植物在不利環境中的成活率。為了實現上述特性，制備基體SSS-材料并功能化以使其具有親水性、彈性和肥料存儲能力，接著用細菌接種，用于生物固氮和植物生長。這些步驟總結在下文中。帶有相互連接的孔的納米結構大孔聚合物的通用名為PolyHIPE聚合物(PHP)，該聚合物通過在WO 2004/005355(2004)中披露的高內相乳液(HIPE)聚合路徑來制備。在這些實驗中使用的PolyHIPE聚合物由90VOl%的水相和IOvol%的油相構成。水相由去離子水、聚合反應引發劑(過硫酸鉀)和作為納米構造劑的5%的硫酸構成。水相的體積分數(相體積)為90%。制備三種類型的聚合物，其中，油相組成為單體相苯乙烯=76-X-Y-Z%，其中X、Y、Z具有下面的含義2-乙烯基吡啶 Q-VP) = Χ%丙烯酸2-乙基己酯Q-EHA) = Υ%油相可溶性引發劑(月桂基過氧化物)=Ζ%交聯劑(二乙烯基苯，DVB) = 10%非離子表面活性劑(失水山梨糖醇單月桂酸酯，司盤80) = 14%由于我們可以不使用油相可溶性引發劑(Ζ = 0)就能獲得合意的聚合物。因此， X和Y的變化導致形成3種類型的聚合物。這些聚合物為1)交聯聚苯乙烯(PS) =X = Y = Z = 02)交聯苯乙烯-丙烯酸乙基己酯共聚物(S-EHA CP) =Y = 20% X = Z = 03)交聯苯乙烯-乙烯基吡啶共聚物(S-VP CP) =X = 8% Y = Z = 0%將油相在室溫下混合在一起。在開始乳化前才將油相放入混合容器(內徑12cm) 中，然后通過振動泵將水相加入到油相中，同時發生混合。通過交疊成直角的3個扁平的攪拌槳(直徑9cm)進行混合。底部的葉輪在使用時盡可能的接近容器的底部而其他葉輪被放置成間隔3cm，這樣當加入所有的水相時，頂部的葉輪浸入混合容器中的乳液表面下1cm。加樣時間為tD并且加樣過程中的葉輪速度為Ωβ。加樣完成后，通過在ΩηΓΡπι的轉動葉輪速度下混合、的一段時間來均化乳液。這些值根據油相組成和所需的孔徑(D)而變化。互連孔徑(interconnect hole size) (d)主要由水相體積(Φ)以及油相組成和所用的表面活性劑的類型來決定。油相的體積為25ml并且水相的體積為225ml。對于給定的油相-水相組分，只要乳液在聚合過程中是穩定的，那么在微孔聚合物中的孔徑和互連孔徑主要是在乳化階段實現(即，PHP孔徑=HIPE中分散相液滴的尺寸)。HIPE中液滴的尺寸通過控制乳化溫度(TE)、混合速度(Q1^P Ωη)、加樣和混合時間 (、和、)以及葉輪的尺寸和類型來確定。如果乳液穩定，那么PHP的孔就被稱為初級孔 (參見G. Alcay，S. Dawnes，V. J. Price-Byron，Microcellular polymers as cell growth media and novel polymers, EP 1183328 A2(2002) ；US 09，856，182 (2002) ；G.Akay, MA Bokhari, VJ Byron and M. Dogru, Development of nano—structured materials andtheir application in bioprocess-chemical process intensification and tissue engineering。同樣參見 Chemical Engineering Trends and Developments, Ed :MA Galan and E. M. Del Valle, Wiley, London, 2005. Ch. pp. 171-196. (2005)) 如果乳液在聚合過程中變得不穩定，那么初級孔就開始聚結，這會使孔增大。這些擴大的聚結孔分散在初級孔內并且其體積分數和尺寸隨著不穩定性程度和初級孔尺寸的增加而增大。盡管，對于具有初級孔的PHP，d/D的比值是相對恒定的，但對于聚結孔，d/D的分布卻非常寬。根據本發明的目的，已經發現具有> 40微米的初級孔徑的聚合物是有效的，具有30-200微米的初級孔徑的聚合物是特別有效的，具有50-10微米的初級孔徑的聚合物尤其有效。所述高內相乳液(HIPE)在帶封閉蓋的聚丙烯圓柱形管(直徑2. 3cm)中于60°C下聚合8小時。在聚合反應并形成固體聚合物后，可以進行任何所需的官能化。在本申請的聚合物材料中，需要高吸水量和彈性。彈性既可以通過在共聚物鏈中存在丙烯酸乙基己酯來實現(即，PS-EHA共聚物)也可以通過當交聯苯乙烯通過磺化變成高親水性聚合物時一旦吸水而發生膨脹來獲得。當從磺化的PHP中除去水時，聚合物恢復其原來的體積。盡管 PS-EHA PHP是彈性的，但其卻是疏水的。這樣的聚合物可以通過磺化作用而具有親水性。在聚合反應后，將PHP樣品切成大約4mm的圓片，然后在過量的水中用蒸餾水沖洗 2小時，同時每隔30分鐘換水。將PHP圓片在磺化前于通風櫥內干燥M小時。所述聚合物的磺化和中和通過下述方法中的一種來進行。方法1:聚合后，如上所述進行沖洗和風干，將聚合物圓片浸入97% w/w的硫酸中2小時。 為了獲得能膨脹并吸收大量水的彈性磺化PHP(當使用90%空隙的PHP時，該聚合物通常能吸收其自身重量18倍的水)，優選在吸收濃硫酸和后續的微波照射前沖洗該聚合物。接著， 使用松下 廚房微波爐(1000W)用微波照射這些含有97%的酸的聚合物樣品。可以使用較低濃度的酸但在這種情況下需要延長照射時間。但是，眾所周知，微波爐的照射分布并不規律，這通常導致樣品中熱點的形成。熱點會導致聚合物焦化，因此需要質量控制測量，樣品以30秒的間隔進行照射，之后讓圓片冷卻60秒，接著將其倒置并隨機分布在微波盤的新位置。每隔30秒停止照射，在微波爐上翻轉樣品，繼續照射直到總照射時間對于14個聚合物圓片通常為150秒。在這些條件下，磺化度為70%。延長暴露于磺化條件下不會提高磺化度但增加了碳元素的形成。因此，發現在上述額定功率下的上述照射時間是最合適的。在微波照射過程中，隨著磺化反應的進行，PHP聚合物圓片明顯膨脹并且它們開始具有彈性。已經發現40-75%的磺化度適合本發明。低于40%的值導致壁的彈性和吸水量不足，而高于70%的值不能使壁具有足夠的完整性。已經發現60-70%的磺化度是特別優選的。例如，當根穿過時，壁的彈性能使孔的尺寸膨脹。而且，在孔壁上的磺酸基是親水性的從而吸引或保持水。此外，彈性能使更多的水保持在孔內，因此更多的水被保持在植物生長培養基的聚合物材料中。值得注意的是，初級孔的壁通常具有0. 1-1.0納米的厚度。而且， 壁可以具有熔接的顆粒狀的性質，確保了水能通過相鄰顆粒間的間隙。通過掃描電子顯微鏡已經發現顆粒的尺寸為10-20納米。當以工業化規模進行微波照射時，使用移動的托盤進行照射-無照射的循環，同時進行空氣循環。磺化后，用水徹底清洗聚合物樣品以除去過量的酸，接著用5. ON的氫氧化銨溶液中和，隨后進行進一步的水洗清潔直到溶液的PH值為5. 5。干燥并存儲這些聚合物備用。 即使在干燥后磺化的PHP圓片的厚度也稍有增加(即，厚度由4mm增加至約5mm)。一些圓片被切成測量為約5X5X5mm的立方體。方法2:將濃(97% )硫酸和硝酸的混合物用于磺化。在硝酸中硫酸的體積濃度為 90% -10%。這樣做的優點是用氫氧化銨中和磺化的PHP以在親水性聚合物的孔內獲得富氮的肥料。控制磺化的水平以使聚合物具有所需的特性。由于硫酸或磺酸根的存在，聚合物的表面變得更具親水性，這使水積聚在表面上。當在其中一個孔內出現水的積聚時，孔就被水充滿。此外，磺化使壁具有彈性，能使含水孔膨脹至其原始尺寸的7倍。因此，聚合物有效地起到了保持水和水內所含鹽的作用。這種固定使聚合物能夠保持水并緩慢地釋放水， 該特性能使聚合物在干旱條件下向植物釋放水的過程中具有重大的用處。通常的磺化水平為40-75%，優選的范圍為60-70%。值得注意的是，對于具有較大孔徑的孔，其孔壁的厚度也趨向更大。此外，在一些實施方式中，壁具有顆粒狀的性質，其中顆粒的尺寸為10-20nm。所述顆粒并沒有堆積在一起形成完全密封的壁，而是在顆粒間留有間隙以使水和溶解的鹽從中通過。為了制備含有細菌分布的生物活性合成共生系統用于磺化PHP的接種，使用了下列方法。以真空干燥的形式提供豌豆根瘤菌。為防止樣品的污染，制備豌豆根瘤菌的所有步驟，從最初開啟細菌容器到平板接種均在滅菌的通風櫥內進行。為了分散干燥的根瘤菌團粒，向團粒加入5ml的肉湯培養基并靜置30分鐘使其達到平衡。然后，將無菌環放入細菌分散物中并用其在準備好的瓊脂平板上交叉劃線以在培養過程中制備孤立的菌落。每個瓊脂平板使用一根新的無菌環，瓊脂平板在馬上開始接種前是密封的并在接種后立即被密封。接著摞起平皿、貼標簽并用兩條膠帶交叉越過這摞平皿的頂部和底部將其密封。將器皿倒置(以防止冷凝液滴落在平板上)在設定為^TC的培養箱內，并使豌豆根瘤菌生長7 天直到已經形成了清晰的單個菌落。將選出的單個菌落隨后被接種在新鮮的平板上并再次培養以確保任何平皿均未被污染。從第二套培養平板開始，在無菌環上收集單菌落一并放進5個含IOOml經高壓滅菌處理的肉湯培養基的不同容器中的一個。這些容器隨后被放入振蕩器并在^rc的溫度下以160rpm旋轉72小時。振動后，將肉湯在_18°C下儲存于無菌的50ml試管中直至使用，當使用時將它們在室溫下解凍5小時。如上所述干燥并儲存磺化的聚合物圓片備用。一些圓片被切成測量為約5X5X5mm的立方體。這些材料被用在土壤中，它們可以是經細菌接種的或未經細菌接種的。一些聚合物圓片具有穿過其中的毛細管。利用在(Alcay等人，WO 00/34454)中描述的技術，可將這些毛細管制成一維、二維或三維的網絡。在其他情況下，交聯的聚苯乙烯被切割成小顆粒(粒徑范圍為100-2000微米)，沖洗除去殘留的單體和表面活性劑，接著進行磺化、中和和干燥。這些材料被用于測試作為土壤改良劑的NSMP聚合物的外形的效果。顆粒形式的磺化PHP的使用增強了聚合物-植物根的相互作用。當制備含有細菌的磺化SSS-聚合物時，使用下列方法。在本申請中描述的是采用細菌供應商推薦的方法和成分來制備根瘤菌生長肉湯培養基。首先，通過用2mm的篩網收集并過篩80g風干的土壤并將其與0. 2g的碳酸鈉和 200ml的去離子水混合來制備200ml的土壤浸出物。該浸出物隨后在121°C下高壓滅菌1小時以確保無菌，然后在室溫下儲存。將生長培養基制備成液體肉湯，并且還加入瓊脂制成固體培養基。對于500ml的肉湯培養基，將400ml的去離子水與IOOml的土壤浸出物、5g的甘露醇和0. 5g的酵母混合。得到的溶液隨后被等分入5個不同的IOOml容器中并被高壓滅菌。為了制備固體瓊脂培養基，進行上述步驟，但在高壓滅菌前另外加入7. 5g的瓊脂。在高壓滅菌后，在無菌通風櫥內將瓊脂培養基倒入無菌的皮氏培養皿中，并使其冷卻并靜置 30分鐘，然后摞起并儲存培養皿同時制備細菌。在裝土罐內的土壤總重量為900g。在這些實驗中僅使用5X5X5mm3形式的海綿狀PolyHIPE聚合物，并且僅在土壤底部的25mm(即，在種子下面)使用該聚合物，用量為 0. 5% w/w，等于200g 土壤內有Ig聚合物。將聚合物浸入25ml的肉湯中直至達到吸收平衡，然后將其充分混合在種子下面的土壤中。將基于John Innes肥土的混合肥料No. 3用作土壤。園藝沙由紐卡斯爾的 Moorbank花園提供。使用Superstar品種的多年生黑麥草并從英國的農業、環境和漁業部 (Agriculture, Environment and Fisheries Department, UK.)購買禾中子。月巴料石肖酸按肥料粒(Nitram)由英國Teeside的Terra Nitrogen提供。Nitram含有34. 5 %的氮，并且將一次使用的量溶解在25ml的水中并在種植階段加到每個罐中。還使用市售的液體肥料 Miracle-Gro Pour & Feed，由 Scotts (英國)有限公司(高達明(Godalming)，薩里 (Surrey)，英國)生產。按照制造商的指導使用Miracle-Gro (MG)肥料，在種植階段每個罐使用25ml未稀釋的肥料。在最開始的種植后，硝酸銨肥料粒或Miracle-Gro逾均不再重復使用。在這些實驗中只使用磺化海綿狀PHP(SNS-PHP)的5mm尺寸的立方體，并以0. 5% w/w的用量將其施加在土壤中。使用上文所述的方法對聚合物進行微波磺化并將其PH值調節至5. 5以與土壤的pH值匹配。將干燥的聚合物混入土壤中，這樣當將它們傾倒在土壤上時，這些聚合物可以吸收水和/或肥料。瓊脂、甘露醇、酵母和碳酸鈉均從Sigma Aldrich (吉林厄姆(Gillingham)，多西特(Dorset))購得。從 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)(不倫瑞克(Braunsctiweig)，德國)獲得真空干燥形式的細菌(豌豆根瘤菌)。所用的多年生黑麥草為Superstar品種并從英國農業、環境和漁業部購得種子。豌豆(Pisum sativum L.)為Kelvedon Wonder的矮小多用途品種，由Johnsons (紐馬克特 (Newmarket)，薩克福(Suffolk)，英國)提供。草和豌豆被用作兩種測試植物以檢測在此項工作中開發的合成共生系統的效果。為了種植草，將園藝土壤與25%的園藝沙混合，并將得到的200g 土壤混合物放入直徑為8cm的罐中。罐中土壤有6cm深并到達罐的下緣，下緣處的直徑為7cm，表面積為 38. 5cm2,并且土壤在罐的上蓋下1. 5cm。在加入5g的常年生黑麥草種子(其被均勻地播撒在土壤表面)前，將0.5% w/w的聚合物充分混入土壤中。也使用沒有聚合物的對照處理。 用薄層的土壤覆蓋種子直到與罐的下緣平齊，然后給予40ml自來水。罐被隨機分布在面積為2X2m2的溫室內。其上放置罐的氈墊整天保持潮濕。21天后，在罐的上緣水平處，土壤表面以上1.5cm處割草。隨后，立即稱重草以確定鮮重，接著將其放入60°C烘箱內72小時并再次稱重以確定干重。生長實驗要繼續進行另外的21天，與第一次收割一樣，通過割草并處理產品獲得第二次的草收成。第三次(最后一次)的收成在另外的21天后獲得，在這 21天末，從罐中取出剩余的草和根并在水中仔細地清洗以顯示SNS-PHP和根的相互作用。在溫室草生長實驗中使用下列類型的PHP和澆水方案。磺化-中和-海綿狀PS-PHP (被稱為海綿狀PHP并由SNS-PHP表示)外形a)測量為5X5X5mm的立方體b)粉末(粉末尺寸100-2000微米)c)具有至少一條連續的毛細管(毛細管尺寸2mm)的測量為5 X 5 X 5mm的立方體磺化-中和-彈性PS-EHA-PHP (被稱為彈性PHP并由SNS/EHA-PHP表示)測量為5X5X5mm的立方體磺化-中和-海綿狀PS-VP-PHP由聚苯乙烯-乙烯基吡啶PHP制備接著用氫氧化銨中和并隨后沖洗以使pH值為 5. 5的測量為5X5X5mm的立方體。為豌豆種植所做的準備為了準備種植豌豆，形成距罐的下緣7. 5cm在罐的上蓋下2cm的7. 5cm深的土壤混合物。在裝土罐內的土壤總重量為900g。在這些實驗中使用海綿狀PolyHIPE聚合物的 5 X 5 X 5mm3小塊，并且僅用在底部的1英寸的土壤中(即，在種子下面)，其用量為0. 5% w/ w，等于200g 土壤中有Ig的聚合物。所述聚合物已經采用如上所述的方法被微波磺化并將 PH值調節到5. 5以與土壤的pH值匹配。也使用沒有聚合物的對照處理。當使用未接種的豌豆時，向土壤施加干燥的聚合物。對于接種罐，直接向土壤施加 25ml的細菌肉湯作為對照，或者對于聚合物處理，將聚合物浸入25ml肉湯中直到達到吸收平衡然后將其充分混入種子下的土壤中。剩余的、未被吸收的肉湯隨后被傾倒在要種植種子部位周圍的土壤上。將一粒豌豆種子放在每個罐中央1英寸深的土壤中，然后用另外2 英寸的土壤覆蓋。所有的罐隨后澆水50ml并隨機分布在溫室的2X2m2的區域內。在實驗過程中，通過每日澆水使所有的罐都保持潮濕。42天后，從底部切下植株， 接著除去豌豆莢并使其與其余的莖和葉分離。豌豆莢的產量與其余植株生物質(莖和葉) 分開測量從而能夠在農作物產量和總(即，莖和豆莢)_生物質產量之間進行比較。將來自各罐的豌豆莢和莖貯存在帖有標簽、可密封的塑料袋里，然后立即稱重以確定鮮重。一旦記錄下各樣品的鮮重，就將樣品放入60°C烘箱內72小時，然后分別再次稱重并記錄以確定干重。每種處理重復四次實驗。澆水方案對于草的生長，使用三種不同的澆水方案1)每日澆水；2)每周澆水(半干旱條件，每周每罐澆水40ml) ；3)減少的每周澆水(干旱條件每周每罐澆水20ml)。對于豌豆、 苜蓿和麻風樹，僅使用一種澆水方案。植物產量數據的統計學分析將各次收獲的平均鮮重和干重繪制成直方圖。以95%的可信度采用獨立假設等方差雙樣本t_檢驗比較平均產量，并采用Tukey' s兩兩比較的單向方差分析確定。所有溫室實驗重復4次進行。材料表征首先通過FT-紅外光譜表征SSS-聚合物以測定制備的不同類型聚合物之間的化學差異。在所有的情況下，在進行FTHR測量前沖洗PHP。在圖l(a、b)中顯示了聚合和磺化后幾個PHP樣品的FTHR光譜。該數據表明在經微波照射的樣品中存在元素碳(圖1(b))。使用Beckman Coulter (Palo Alto, CA) SA3100 BET 氣體吸附表面積分析儀(Gas Adsorption Surface Area Analyser)進行比表面積的測量，從而幫助測定吸水量。在制備的各個階段采用經沖洗的樣品(即，在聚合、磺化和中和后)進行表面積測量。與海綿狀 PHP相同，彈性PHP在水相中含5 %的酸且相體積為90 %。使用多種磺化技術制備彈性PHP。表1 多種磺化-中和PolyHIPE聚合物作為加工條件的函數的吸水特性。*在溫室實驗中使用的PHP
權利要求
1.一種植物生長支持培養基，所述培養基包含具有孔徑在30微米以上的初級孔的磺化聚合物材料，該聚合物材料是彈性的，使所述孔的尺寸能夠增大。
2.根據權利要求1所述的培養基，其中，所述聚合物材料的初級孔徑為30-300微米。
3.根據權利要求1所述的培養基，其中，所述聚合物材料的初級孔徑為50-150微米。
4.根據權利要求1或權利要求2所述的培養基，其中，磺化度為40-75%。
5.根據權利要求3所述的培養基，其中，磺化度為60-70%。
6.根據前述權利要求中任一項所述的培養基，其中，所述孔的壁由熔接的顆粒狀聚合物構成。
7.根據權利要求6所述的培養基，其中，所述顆粒的粒徑為10-20納米。
8.根據權利要求7所述的培養基，其中，所述孔的壁包含孔徑為l-5nm的孔。
9.根據前述權利要求中任一項所述的培養基，其中，所述聚合物材料選自聚苯乙烯、苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物或苯乙烯/乙烯基吡啶共聚物中。
10.根據權利要求9所述的培養基，其中，所述苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物的組分的重量比為75 20。
11.根據權利要求9所述的培養基，其中，所述共聚物的組分的重量比為75 8。
12.根據前述權利要求中任一項所述的培養基，其中，所述聚合物材料包含毫米尺寸的毛細管。
13.根據前述權利要求中任一項所述的培養基，其中，所述初級孔是相互連接的。
14.一種培養基，其大體上為如本申請參照附圖所描述的并且為如附圖所示的培養基。
15.如權利要求1-14所述的植物支持培養基用于通過保持水、養分、生物活性系統來幫助植物生長的用途。
16.如權利要求1-14所述的植物培養基用于通過與植物根的締合，通過根向植物輸運如水、養分、細菌、或農用化學品的活性成分來幫助植物生長的用途。
17.如權利要求1-14所述的植物培養基用于通過與植物根的締合，提供適合的環境以促進根、水、養分、細菌、真菌和根分泌物的相互作用和交流從而幫助植物生長的用途。
全文摘要
本申請描述了一種植物生長支持培養基，其改善了土壤特性，并在需要時提高了水或養分的含量。此外，可用微生物接種該培養基以改善土壤特性并提供在植物根、水、養分以及在可適用的情況下，細菌和根分泌物之間的微觀環境內的相互作用。這種微環境將活性成分直接輸運到植物根。所述培養基包含初級孔徑在30微米以上的聚合物材料。所述孔的壁為彈性的，使得孔的尺寸能夠膨脹以保持水、溶質或其他生物性可用成分并允許根穿透它們。對壁進行磺化使壁更具親水性從而將水吸引至孔內并且還增加了壁的彈性。可以提供毛細管以使孔相互連接并允許根穿入培養基。所述孔壁可為顆粒狀的，以使水、養分以及在可適用的情況下，細菌代謝物和信使分子在相鄰的孔和植物根之間通過。
文檔編號A61L27/20GK102316912SQ200980148840
公開日2012年1月11日 申請日期2009年10月6日 優先權日2008年10月7日
發明者加利普·奧考伊, 戴維·羅伯特·布爾克 申請人:紐卡斯爾大學