含有突變型h因子結合蛋白的疫苗組合物的制作方法

專利名稱：含有突變型h因子結合蛋白的疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于引發對病原生物的免疫應答的免疫原性組合物，具體的，涉及能引發保護性免疫應答的免疫原性組合物。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌)是寄居于人鼻咽中的一種莢膜革蘭氏陰性雙球菌。普通人群中的攜帶率通常為約10%。復雜的宿主-病原體關系通常是共生性的。但是，攜帶腦膜炎球菌有時能引起侵入性疾病。這一現象通常與屬于少數的超毒力克隆譜系的菌株有關(Caugant，D. A.等(1987) J Bacteriol 169 :2781-2792)。 腦膜炎球菌(N. meningitidis)是全球化膿性腦膜炎的主要原因，并且是唯一一種能造成腦膜炎和敗血癥爆發的細菌。根據疾病在任何一個地理位置的地方性或流行性的普遍性， 發病率在每IO5人群中為1-3之間。因此，需要開發預防性和治療性方案來降低侵入性腦膜炎球菌疾病的發生率、致死率和發病率。腦膜炎奈瑟球菌對多種一線抗生素敏感，但是盡管如此，大量被診斷為腦膜炎球菌感染的患者死于重癥或承受嚴重的并發癥。致死率從沒有并發癥的腦膜炎病例中的2-3 %到發生感染性休克的病例中的50 %或更高(Cartwright，K. Α.和 D.A.Ala' Aldeen(1997)J Infect 34:15-19)。當前批準的疫苗是基于包裹住細菌外膜的多糖莢膜，因此僅提供了針對表達相應莢膜的一部分菌株的保護。此外，還沒有針對血清組B腦膜炎奈瑟球菌廣譜有效的疫苗，而這種菌株是發達國家中腦膜炎球菌疾病的最常見病因。這是因為血清組B莢膜由唾液酸的聚合物組成，該聚合物在結構上與嬰兒期和胚胎發育期表達的人神經細胞粘著分子的一種修飾相關。人們擔心用這一抗原進行免疫會造成自身免疫應答。

發明內容
本發明涉及新型的組合物，具體地，涉及新型的包含修飾的H因子結合蛋白的免疫原性組合物，以及這些組合物在引發針對腦膜炎奈瑟球菌的免疫應答中的應用。本發明的目的之一是提供一種或多種能用來引發針對腦膜炎奈瑟球菌的保護性免疫應答的組合物。本發明的第一方面提供了包含至少一種修飾的H因子結合蛋白的免疫原性組合物，其中該組合物給予人或非人動物時能引發免疫應答。優選地，本文所述H因子結合蛋白是指來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)或淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的H因子結合蛋白。腦膜炎奈瑟球菌通過模擬宿主而破壞宿主生物的免疫應答。腦膜炎奈瑟球菌使用H因子結合蛋白形式的蛋白質替代帶電碳水化合物化學特性來征集宿主的補體調節子， H因子。在健康個體中，補體的激活通過包括H因子(fH)在內的膜結合和水溶性血漿調節蛋白被精確調控。H因子是155kDa的蛋白質，由二十個域(稱為補體控制蛋白重復，或CCP) 組成。多種病原體已經適應為通過在它們的表面螯合H因子來避免補體介導的殺傷。如上所述，腦膜炎奈瑟球菌作為造成細菌性腦膜炎和感染性休克的主要原因，是一種具有全球重要性的適應人體的病原體( 印hens等(2007) Lancet 369，2196-210)。由于奈瑟球菌菌株的差異，現有的腦膜炎球菌疾病疫苗不提供廣譜基礎的保護，因此其應用很有限。一種方法是使用H因子結合蛋白(稱為fHbp、GNA 1870、或R2086)作為疫苗組合物中的抗原。H因子結合蛋白是27kDa的表面脂蛋白，普遍存在于腦膜炎奈瑟球菌的表面， 能引發保護性的殺菌抗體(Fletcher 等(2004) Infect Immun 72，2088-100 ;Masignani 等 (2003) J Exp Med 197，789-99)。H因子結合蛋白起到把補體的負調節物，H因子征集到細菌表面的作用，并通過抑制人血漿中補體介導的裂解而對腦膜炎球菌避免先天免疫應答的能力有貢獻(Madico 等 Q006) J Immunol 177，501-10 ;Schneider 等 Q006) J Immunol 176， 7566-75)。在本發明中，使用了至少一種修飾的H因子結合蛋白作為抗原。該蛋白質被修飾以避免、或減少H因子與蛋白質的結合。在疫苗制劑中的H因子結合蛋白被給予到對象后， H因子與H因子結合蛋白的結合被認為會降低疫苗的成功。首先，H因子結合蛋白上H因子的存在可能限制宿主免疫系統對H因子結合蛋白上關鍵表位的識別。所產生的針對這些表位的抗體可以是殺菌的，并且抑制H因子與細菌結合使得細菌對補體介導的裂解敏感。其次，針對H因子結合蛋白的免疫應答還能以和半抗原類似的方式引發針對已結合的H因子的應答。這可能引起潛在的不希望發生的自身免疫應答。最后，由于補體蛋白質具有佐劑活性，免疫應答中涉及補體激活。通過征集H因子來降低免疫位點的補體激活會降低疫苗接種后得到的免疫水平。優選地，本發明中使用的修飾的H因子結合蛋白在蛋白質的一個或多個位點上被改變。優選地，與野生型蛋白質的氨基酸相比，修飾的H因子結合蛋白至少有一個氨基酸被改動。優選地，所述一個或多個被改變的氨基酸殘基使H因子結合蛋白在和H因子形成復合物時與分離的H因子結合蛋白相比表面暴露減少。H因子結合蛋白中所述一個或多個被改變的氨基酸可以是圖6 (SEQ ID NO :1)所示序列中選自下列位置編號的氨基酸103、 106、107、108、109、145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、
194、195、196、199、262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、 311 和 313。在H因子結合蛋白中被改變的一個或多個氨基酸可以是在野生型蛋白質中與H因子形成氫鍵結合的一個或多個氨基酸。在H因子結合蛋白中被改變的一個或多個氨基酸可以是圖6(SEQ ID NO 1)所示序列中選自下列位置編號的氨基酸:103、106、107、108、180、181、183、184、185、191、193、
195、262、264、266、272、274、283、286、304和 306。本發明中使用的修飾的H因子結合蛋白中，上述氨基酸中的兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、或者五個或更多個可以被改變。優選通過改變H因子結合蛋白中的一個或多個氨基酸，防止或顯著降低與H因子的結合。
在一種實施方式中，氨基酸編號283和204中的至少一個被突變/改變成丙氨酸， 而不是谷氨酸。優選地，這一突變導致H因子的結合幾乎完全消除。和H因子與野生型H因子結合蛋白間的結合相比，H因子與修飾的H因子結合蛋白間的結合優選至少降低5倍，優選至少降低10倍，優選至少降低2個數量級。結合力的降低優選在分析物濃度為約50nM下測得。這樣的結合力降低幅度被認為是顯著的降低。除了對H因子結合蛋白進行修改來避免或抑制與H因子的結合之外，該蛋白質還可以包括對蛋白質作為針對腦膜炎奈瑟球菌感染的免疫原的能力沒有影響的其它突變。例如，可以對蛋白質做出其它保守性氨基酸改變。類似地，可以對蛋白質進行不改變蛋白質免疫原性的插入或缺失操作。優選地，修飾的H因子結合蛋白與圖6所示序列具有至少60 %、70 %、80 %、85 %、 90%、95%或更高的序列相同性，但是經過修飾，優選至少在一個位置上有一個不同的氨基酸，這一修飾導致H因子的結合力喪失或者顯著降低。序列相同性的百分值被定義為經過序列比對和在必要時引入缺口以最大程度提高序列相同性百分數后，序列中與所提供的氨基酸序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分數。為確定序列相同性百分數進行的比對可以通過本領域技術人員公知的多種方式實現， 例如包括利用BLAST(國家生物技術信息中心基礎本地比對搜索工具，National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)。例如，相同性百分數的變化可能是由于氨基酸的取代、插入或缺失。氨基酸取代可以是保守性的，其中所取代的氨基酸具有相似的結構和/或化學特性，例如用異亮氨酸取代亮氨酸就是保守性取代。免疫原性組合物是一種當被給予對象后能引發針對至少一種修飾的H因子結合蛋白的免疫應答的組合物。優選地，對象是人或者非人動物，更優選是人或者非人哺乳動物。優選地，本發明的組合物引發的免疫應答影響到腦膜炎奈瑟球菌感染已免疫的人的能力。優選地，腦膜炎奈瑟球菌對經本發明組合物免疫的人的感染能力被阻止或預防。 這可以通過多種方式實現。被引發的免疫應答可以識別并破壞腦膜炎奈瑟球菌。或者或此外，被引發的免疫應答可以阻止或預防腦膜炎奈瑟球菌的復制。或者或此外，被引發的免疫應答可以阻止或預防腦膜炎奈瑟球菌在人或非人動物內弓丨起疾病。修飾的H因子結合蛋白可以是重組生產的(例如從基因工程表達系統中)，或者是合成產物，例如通過體外肽合成或體外翻譯制得。除了一個或多個修飾的H因子結合蛋白以外，本發明的組合物還可以進一步的包含一個或多個抗原。進一步包含的抗原也可以來自腦膜炎奈瑟球菌，并且可能引發針對腦膜炎奈瑟球菌的免疫應答。在被給予對象時，組合物可以用來引發/引起保護性的免疫應答。保護性的免疫應答可以造成腦膜炎奈瑟球菌在感染對象時被殺傷，或者可以預防或抑制腦膜炎奈瑟球菌復制和/或引起疾病。組合物可被用作針對腦膜炎奈瑟球菌的預防性或治療性疫苗。本發明的另一方面提供了一種包含至少一種修飾的H因子結合蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
優選地，該藥物組合物包含按本發明的第一方面所述的組合物。優選地，該藥物組合物能引起針對腦膜炎奈瑟球菌的保護性免疫應答。本文所用的短語“引起保護性的免疫應答”是指，組合物能在被給予組合物的宿主生物如人或者非人哺乳動物中引起一種保護性的反應。優選地，保護性的免疫應答能保護免受腦膜炎奈瑟球菌的后續感染。保護性的免疫應答可以通過減少腦膜炎奈瑟球菌的復制或通過影響腦膜炎奈瑟球菌的作用模式來消除或降低感染程度從而減輕疾病。合適的可接受的賦形劑和載體是本領域技術人員公知的。它們可以包括固體或液體載體。合適的液體載體包括水和鹽水。組合物中的蛋白質被配制成乳液或者它們可被配制成生物可降解的微球體或者脂質體。組合物還可以包含佐劑。合適的佐劑是本領域技術人員公知的，可以包括不完全弗氏佐劑(Freund' s Incomplete Adjuvant，用于動物中的應用)、以及金屬鹽如鋁或鈣
Τττ . ο組合物還可以包含用來控制組合物稠度和/或控制抗原/分泌型蛋白質從組合物中釋放的聚合物或其它試劑。組合物還可以包含其它試劑，例如稀釋劑，可包括水、鹽水、甘油或其它合適的醇等；潤濕劑或乳化劑；緩沖劑；增稠劑例如纖維素或纖維素衍生物；防腐劑；去污劑、抗微生物劑；等等。優選地，組合物中的活性成分純度超過50 %，通常純度超過80 %，經常純度超過 90%，更優選純度超過95%、98%或99%。最經常使用的是活性成分純度接近100%，例如純度約99. 5%或99. 9%。本發明的組合物可以用作針對由腦膜炎奈瑟球菌引起的感染的疫苗。該組合物可以用作針對腦膜炎或其它侵入性腦膜炎球菌疾病包括敗血癥或感染性休克的疫苗。該疫苗可以預防性地給予具有腦膜炎奈瑟球菌接觸風險的人群和/或治療性地給予已經接觸腦膜炎奈瑟球菌的人。優選地，若組合物用作疫苗，那么組合物包含免疫有效量的抗原，其中組合物包含至少一種修飾的H因子結合蛋白。抗原的“免疫有效量”指在一次劑量或一系列劑量中給予個體時能有效治療或預防腦膜炎奈瑟球菌感染的量。這個量會因待治療個體的健康和身體狀況以及抗原而變。確定給予生物體的免疫原性或疫苗組合物的有效量是本領域技術人員能力范圍內的。本發明的組合物可以經口服、全身、胃腸外、外用、粘膜、肌肉內、靜脈內、腹膜內、 皮內、皮下、鼻內、陰道內、直腸內、透皮、舌下、吸入或氣霧劑給藥。該組合物可以被安排為作為一次劑量或者多次劑量方案中的一部分進行給藥。多次劑量可以以初次免疫之后進行一次或多次加強免疫進行給藥。初次免疫和加強免疫之間合適的時間可以常規確定。本發明的組合物可以單獨使用，或可以與一種或多種其它免疫原性或疫苗組合物，和/或一種或多種其它治療方案聯合使用。在被給予對象后，本發明的組合物可以誘發血清殺菌抗體應答并引發介導調理素調節的吞噬作用的抗體。這些應答可以在小鼠中方便的測得，并且結果是疫苗效力的標準指標。
或者替代地，本發明的組合物還可以引發免疫應答來中和細菌蛋白或其它分子， 從而預防它們具有它們的正常功能并且預防或減輕疾病進展，而無需破壞病原性生物/細菌，在本申請中為腦膜炎奈瑟球菌。本發明的另一方面提供了一種或多種修飾的H因子結合蛋白在制備用于引發免疫應答的藥物中的應用。該藥物可用于對對象進行針對腦膜炎奈瑟球菌的預防性或治療性疫苗接種。該藥物可以是預防性或治療性疫苗。該疫苗可以針對腦膜炎奈瑟球菌引起的腦膜炎、敗血癥和/或感染性休克。本發明的另一方面提供了一種包含用于產生針對腦膜炎奈瑟球菌的免疫應答的一種或多種修飾的H因子結合蛋白的組合物。該免疫應答可以是預防性或治療性的。該組合物可以用作疫苗。本發明的另一方面提供了一種保護人或非人動物免受腦膜炎奈瑟球菌感染影響的方法，包括把本發明的任一其它方面所述的組合物給予人或者非人動物。該組合物可以
是疫苗。本發明的另一方面提供了一種提高人或非人動物的免疫應答的方法，包括把本發明所述的藥物組合物給予人或非人動物。該免疫應答優選為保護性的。在已接受初免的患者中該方法可產生加強應答。所述免疫應答可以是預防性或治療性的。一種檢測包括給予本發明組合物的治療性治療的功效的方式包括在給予該組合物后監測腦膜炎奈瑟球菌感染。一種檢測包括給予本發明組合物的預防性治療的功效的方式包括在給予該組合物后監測針對腦膜炎奈瑟球菌的免疫應答。本發明的另一方面提供了一種或多種修飾的H因子結合蛋白在制備用于免疫人或非人哺乳動物使其免受腦膜炎奈瑟球菌感染的藥物中的應用。本發明的另一方面提供了用于誘導生物體中免疫應答的藥盒，包含本發明所述的免疫原性或疫苗組合物以及與給藥相關的說明書。除了它們的疫苗潛在應用外，本發明的組合物還可用作診斷試劑和對接種者免疫能力的測量方式。盡管本發明的所有內容和上面討論的優選特征都針對腦膜炎奈瑟球菌，但技術人員能夠理解它們同樣可用于淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)。技術人員能夠理解上述討論的任何優選特征可以用于本發明的任何方面。下面參照以下附圖和實施例，僅以舉例的方式描述本發明的優選實施方式。


圖Ia到If-圖Ia到If顯示H因子結合蛋白結合位點位于H因子的CCP6處并需要H因子結合蛋白的全部胞外部分。圖Ia為H因子與完整的H因子結合蛋白及其截短形式(如圖示)結合的Far Western分析。膜用純化的H因子培育并用α-fH pAb檢測。只有在完整的27kDa的H因子結合蛋白(箭頭所示)處觀察到結合。圖Ib顯示了用α -fH PAb獲得的FACS分析結果，該抗體檢測腦膜炎奈瑟球菌和H因子之間的結合。圖Ic利用 SPR結果顯示H因子結合蛋白只能與含有CCP6的H因子構建體結合。小插圖顯示了注射到H因子結合蛋白表面的不同稀釋度的fH67的1 1朗格繆爾(Langmuir)擬合曲線，以確定動力學參數。圖Id顯示了 FACS競爭研究(使用針對CCP5的α -fH mAb,因此不能識別fH67構建體)的結果，說明短的fH67構建體(在約0. 3到30 μ M之間)能夠競爭掉全長H因子的結合，證明該構建體包含了完整的H因子結合蛋白結合位點。所示數值為三次實驗熒光強度的平均值士標準差(s. d.)。圖Ie所示Sra定量證實了 CCP6的存在對于與 H因子結合蛋白的高親和力結合是必要和充分的，并且常見的H因子CCP7多態性G02His/ Tyr)不顯著改變fHbp結合的親和性。圖If列表說明了通過表面等離振子共振(Surface Plasmon Resonance)實驗用芯片表面的H因子結合蛋白和液相中的H因子構建體獲得的結合常數。使用 BiaEvaluation 2. O軟件和1 1朗格繆爾模型進行擬合。所示數值是均值士標準差，Chi2 是BiaEvaluation 2. O給出的擬合質量的指標。圖加到2c-顯示了 H因子結合蛋白及其與fH67的復合物的結構。圖加顯示了 H 因子結合蛋白(殘基80至320)的動畫圖示的兩個視圖。標明了 A、B和C區域。圖2b顯示了在H因子結合蛋白和H因子的CCP 6與7之間形成的fHbp:fH67復合物的動畫圖。兩種蛋白中參與了相互作用表面之間的鹽橋形成的側鏈以球-棍模式標示(小圖中被放大并重新定向)。圖2c顯示了 H因子結合蛋白和fh67的拓撲結構，指示出了參與蛋白質之間氫鍵或鹽橋相互作用的殘基。實心圓點表示與其伙伴形成氫鍵的殘基。實心星形表示與其伙伴形成鹽橋的殘基。星號表示該相互作用僅在一些獨立的復合物結構拷貝中被發現。圖3-涉及H因子結合蛋白與H因子之間的界面，表明在H因子和H因子結合蛋白中將帶電側鏈取代為丙氨酸的定位誘變導致它們在濃度約為野生型的KD時與各自的野生型伙伴間的結合力消滅。黑色柱表示H因子分析物注射到(SOnMJOyLmirr1)H因子結合蛋白表面上的時間段。圖4-使用了兩種晶形的七個晶體學獨立的fH67/fHbp復合物拷貝G個復合物拷貝為Pl形式，3個拷貝為C2形式)的重疊圖考慮到fH67/fHbp復合物的撓性。盡管包裝環境非常不同，晶體間的高度相似性表明復合物是生物學相關的。復合物內蛋白質的重排僅限于fH67的CCP7相對于CCP6和H因子結合蛋白的位置發生少量移動。包裝在最接近CCP7的H因子結合蛋白的環也相對可移動，這由它們較高的溫度因子所顯示(在此圖中用“更稠厚”的色調標示)。圖5-顯示H因子結合蛋白表面上的抗體表位的位置。在12，20，21處保護性表位 deCCPibed中的殘基用CPK圖示法(CPK representations)按元件著色(C為綠色，N為藍色，0 為紅色)(Glu 211、Arg 214 和 Arg 269)。阻斷H因子結合的抗體的表位用CPK圖示法，按H因子結合蛋白的著色標示(區域〃 A"為黃色，區域"B"為綠色，區域"C"為青色)。盡管這些表位中沒有一個被直接定位在H因子識別位點，但它們都離識別位點很近，使得與大抗體的結合可能阻礙H因子的識別。H因子的多態性殘基402的組氨酸側鏈也在CPK圖示中顯示。盡管這一殘基靠近H 因子結合蛋白的次要觸點(參見圖2，殘基103到108附近)，但sra得到的兩種多態性形式的證據表明，該殘基并非關鍵觸點。晶體學獨立的復合物拷貝之間(圖4)，兩個蛋白在這一點上的相互接觸方式有顯著變化，由此可見復合物的這一區域(GNA環和H因子域)是最具可移動性的區域，這個事實也支持了上文的結論。圖6-H因子結合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。該蛋白質的GenBank登錄號為 AAF42204。
圖7_fHbp:fH67復合物的結構。圖7A-動畫圖顯示的fHbp (綠色表示家族間保守的殘基，紅色為非保守的殘基)和表面模型顯示的fH67。圖7B-小鼠和人fH之間不同的殘基顯示為紅色，我們的研究顯示黃色殘基影響fH的結合。圖8-Sra確定的fHbp變體1、2和3與fH678的結合。還檢查了與淋球菌同源物 NG00033的相互作用。圖9A，等溫滴定量熱法證實fHbp/fH相互作用在溶液中表現為nM水平的KD。圖 9B，包含兩個Glu至Ala突變的fHbp結構證實只在突變的側鏈有結構改變(由α C, FO-FC 圖中紅色電子密度差異所示)。圖9C，5nM H因子的結構域5、6和7流過野生型和突變型 fHbp的響應(上方數據線為fHbp變體1，下方數據線為fHbp變體1DM)。圖9D，20nM完整的H因子流過野生型和突變型fHbp的響應(上方數據線為fHbp變體1，下方數據線為fHbp 變體1DM)。
具體實施例方式H因子結合蛋白(其序列由圖1給出)的功能以前已通過將蛋白質分割成覆蓋全部胞外區域的一系列區域，稱為“A”、“B”和“C”進行過研究(Giuliani等^)05nnfect Immun 73，1151-60)。Western印跡分析顯示，所有三個區域對于H因子和H因子結合蛋白之間高親和力的相互作用都是必需的(圖la)，表明H因子結合蛋白在其整個表面上具有較長的H因子識別位點。為了鑒定H因子20個CCP結構域中的哪一個介導與H因子結合蛋白的相互作用， 使用了以下技術far Western分析；FACS分析(圖lb)；表面等離振子共振(圖Ic)。所得結果顯示，H因子被H因子結合蛋白識別的關鍵區域是第六結構域CCP6和含有CCP6的構建體能抑制依賴H因子結合蛋白的H因子和腦膜炎奈瑟球菌間的相互作用(圖Id)。相互作用的定量分析顯示，任何含有CCP6的構建體的解離常數為約5nM(圖lc、le和If)。這一相互作用在高鹽(1M NaCl，未顯示)或pH為4到8(未顯示)的條件下不解離，這補充支持了結合事件的高親和性性質。參見圖9A-D，表面等離振子共振顯示fHbp的雙突變體以高出兩個數量級的KD結合H因子的結構域6和7。該突變體也結合更長的構建體(由結構域5、6和7組成)和全長H因子(提純自血清)，其結合力比野生型fHbp弱得多。獲得了 H因子的CCP 67(下文中稱為fH67)和包含H因子結合蛋白區域A、B和C 的胞外部分形成的復合物的晶體結構，建立了 H因子結合蛋白和fH67的模型并總共用七個獨立的復合物拷貝(圖h、b和c)把兩種晶形的模型改進到2.35 A。如圖加所示，H因子結合蛋白的胞外區域折疊形成兩個β桶(β-barrels)，N-端的桶由“Α”和一部分“B”區域組成，而C-端的桶由其余的“B”區和“C”區域組成。用N-端的桶在結構數據庫中搜索未發現接近的結構同源物，β桶的獨特拓撲結構(圖2c)表明它們不是從基因重復事件中產生的。fH67:fHBP復合物(H因子H因子結合蛋白)通過H因子結合蛋白的兩個β桶和H因子CCP6之間廣泛的相互作用而連接在一起(圖2b)，這與結合研究相一致。具體的， 插入在CCP6的第二個β鏈(該CCP域的一個不尋常的特征)內的螺旋位于復合物中心。 PISA服務器進行的分析對所有七個獨立復合物給出了 1.0的顯著性值(即，極有可能是生物學顯著的)，H因子結合蛋白埋入復合物的平均表面積(2860 ± 177A2)比多數抗體抗原復合物中的埋入面積都大。此外，基于結構所預測的復合物形成的AG(-6kCal/mol)與結合研究得出的親和性(-llkcal/mol，從圖Ie所示的KD計算得到)相一致，進一步支持了結晶復合物的生理相關性。相互作用表面顯示了良好的形狀互補性(圖2c)，具有大量靜電相互作用，包括多個氫鍵和鹽橋。與fHbp:fH相互作用研究相一致，該研究未檢測到與衰老相關黃斑變性有關的H因子402His/Tyr同種型之間結合的差異(圖le、4和5)。His402僅外圍參與了與 H因子結合蛋白相互作用，它與H因子結合蛋白N-端β桶的鏈1和2之間的撓性環接觸 (圖 4)。為進一步查明相互作用表面，形成了兩種蛋白質的雙突變/取代型，其中的帶電側鏈被取代為小的疏水殘基丙氨酸㈧。在fH67中進行了 R341A和H337A突變，而H因子結合蛋白中的突變為和E304A。利用SI3R對突變蛋白和它們的野生型伙伴之間相互作用的研究顯示，兩種突變型的親和性都降低了兩個數量級以上，以致在分析物濃度為野生型KD的10倍左右(約50nM)時幾乎觀察不到相互作用(圖3a)。在高數千倍的分析物濃度(μΜ范圍)下，兩種蛋白質的突變型與野生型伙伴發生相互作用與野生型相比， fHbpE283A, E304A保持了定性意義上相似的結合速率但解離速率有提高，而fH67R341A， H337A在解離速率上與野生型相互作用更相似但結合速率大大降低(圖le)。來自不同家族的fHbp具有相同的結合特性腦膜炎奈瑟球菌菌株表達單一的fHbp，各屬于三種變體家族中的一種變體1、變體2和變體3。我們的研究集中在變體1的fHbp，因為這是疾病分離物中最常見的家族。圖 7顯示了繪制在復合物結構上的三個家族間序列的差異，并表明，盡管序列保守度較高(> 60%相同)，但在fH結合位點周圍存在顯著的差異。因此，我們測定在不同的fHbp家族之間fH識別模式是否保守，以及相同的fHbp和fH殘基是否是結合的關鍵。這對于形成結合力減弱的fHbp變體來作為疫苗進行評價是關鍵的信息。為此，我們克隆、表達并純化了來自變體2和變體3的fHbp，并開始鑒定它們與fH 的相互作用(圖8)。迄今為止，我們的SI^R研究顯示識別模式是類似的，親和性在同一數量級，并且fH中相同殘基的突變對所有家族fHbp的結合都有顯著影響(未顯示)。值得注意的是，盡管淋病奈瑟球菌fHbp同源物(NG00033)與變體3密切相關(91 %氨基酸相同)，但沒有檢測到純化蛋白與fH發生相互作用(圖8)。fHbpE283A, E304A突變型保持了原子結構對fHbpE283A，E304A突變型(雙突變，DM)不能與fH67以納摩爾(nM)范圍的解離常數(KD)結合的一個可能解釋是，氨基酸變化破壞了蛋白質的整體結構。為解決這一問題，確定了與fH67復合的fHbpE283A，E304A突變型的晶體結構。結果證實fHbp唯一的結構變化是突變的側鏈(圖9B)。此外，我們確定了這些突變在與fH5、6、7和全長fH結合中的相關性(圖9C和D)。可以觀察到fH在濃度為IOnM范圍時與野生型蛋白質相互作用，表明全長fH的親和性與較小的片段(如fH5、6、7)在相同范圍內。然而，fHbpE^3A，E304A蛋白的結合親和性與野生型蛋白相比顯著降低。將已發表的能引發殺菌抗體的H因子結合蛋白的表位(Giuliani等O005nnfect Immun 73，1151—60 ;Cantini 等(2006) J Biol Chem 281,7220-7)繪制到結構圖上，顯示目前已鑒定的位點都不直接位于H因子識別位點內。然而，抗體識別的影響因子結合的表位位于識別位點周圍，因此可能通過位阻來抑制H因子結合(圖5)。fHbp單突變體和雙突變體保持了免疫原性為檢查氨基酸變化E283A和E304A的影響，表達并純化了具有這些取代的單個(即fHbpE283A、和fHbpE304A)或組合(fHbpE283A， E304A)的fHbp變體1。用野生型fHbp和這些蛋白質來免疫各組小鼠(每組5個)，并測定免疫血清中的殺菌抗體。結果(表1)用能造成50%或更高的野生型血清組B腦膜炎奈瑟球菌(菌株H44/76)殺傷率的血清的最高稀釋度的倒數表示。免疫前的血清沒有殺傷作用。表1用野生型或突變型fHbp免疫動物得到的血清殺菌抗體(SBA)效價
權利要求
1.一種免疫原性組合物，包含至少一種修飾的H因子結合蛋白，其中該組合物給予人或非人動物時能引發免疫應答。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述H因子結合蛋白來自腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌。
3.如權利要求1或權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述組合物引發針對腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中任一個或兩者的免疫應答。
4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于，所述免疫應答足以阻止或預防腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的感染。
5.如上述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述H因子結合蛋白經過修飾以避免或減少H因子與所述H因子結合蛋白的結合。
6.如上述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結合蛋白與野生型蛋白質相比，在蛋白質的一個或多個位置上被改變。
7.如上述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結合蛋白與野生型蛋白質相比，至少有一個氨基酸被改變。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述被改變的一個或多個氨基酸是使所述H因子結合蛋白與H因子形成復合物時，與分離的野生型H因子結合蛋白相比表面暴露減少的氨基酸殘基。
9.如權利要求7或8所述的組合物，其特征在于，所述H因子結合蛋白中被改變的一個或多個氨基酸選自圖6所示序列中下列位置編號的氨基酸殘基103、106、107、108、109、 145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、194、195、196、199、 262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、311和 313。
10.如上述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結合蛋白與圖6所示序列具有至少60%的序列相同性，并且在至少一個位置具有被改變的氨基酸， 造成H因子結合力消失或顯著降低。
11.如上述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物能引發/產生的免疫應答是保護性免疫應答。
12.用作針對腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的預防性或治療性疫苗的上述權利要求中任一項所述的組合物。
13.一種藥物組合物，其包含至少一種修飾的H因子結合蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑。
14.如權利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，包含權利要求1到12中任一項所述的組合物。
15.一種或多種修飾的H因子結合蛋白在制備引發免疫應答的藥物中的應用。
16.如權利要求15所述的應用，其特征在于，所述藥物用作針對腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的預防性或治療性疫苗接種。
17.如權利要求16所述的應用，其特征在于，所述疫苗用于預防或阻止腦膜炎奈瑟球菌引起的腦膜炎、敗血癥和/或感染性休克。
18.用于產生針對腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的免疫應答的包含一種或多種修飾的H因子結合蛋白的組合物。
19.一種保護人或非人動物免受腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌感染的影響的方法， 包括把權利要求1到12中任一項所述的組合物給予人或者非人動物。
20.一種提高人或非人動物的免疫應答的方法，包括把權利要求13或14所述的藥物組合物給予人或非人動物。
21.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述免疫應答是保護性的。
22.—種或多種修飾的H因子結合蛋白在制備用于免疫人或非人哺乳動物使其免受腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌感染的藥物中的應用。
23.一種用于在生物體中誘發免疫應答的藥盒，包含如上述任一項權利要求所述的組合物和給藥相關的說明書。
全文摘要
本發明涉及包含至少一種修飾的H因子結合蛋白的免疫原性組合物，其中該組合物給予人或非人動物時能引發免疫應答；以及相關的組合物、用途和藥盒。
文檔編號A61K39/095GK102245202SQ200980148000
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月26日 優先權日2008年10月25日
發明者C·唐, R·埃克斯利, S·M·利亞 申請人:帝國創新技術有限公司