專利名稱：用于組織修復的使用細胞外基質的組合物和方法
用于組織修復的使用細胞外基質的組合物和方法相關申請的交叉引用本申請要求2008年9月30日提交的美國臨時申請第61/101332的優先權，其全部內容通過引用并入本文中。政府權益聲明本發明是在美國國立衛生研究院(NIH)授予的批準號為0D004309的美國政府支持下完成的。政府對本發明有一定權利。
背景技術：
本說明書通篇引用了多種出版物，包括專利、公開的申請、技術文章和學術文章。 各引用的出版物通過引用的方式整體并入本文中。心血管疾病是美國死亡的主要原因。心血管疾病最普遍的起因是發生于冠狀動脈堵塞時的心肌梗塞(MI)。MI導致心肌細胞死亡和細胞外基質(ECM)降解，繼而引發瘢痕組織沉積。最終心臟衰竭發作，接著心臟擴張，導致泵血效率降低。由于心臟中只有極少量的心臟祖細胞，且這些祖細胞不易分裂，因此心臟組織的再生不會自然發生。目前對心臟衰竭的治療嚴重依賴于創傷性的外科手術，對受損心臟組織的修復幾乎無益。最近研究的方法利用將健康細胞注射到左心室(LV)梗塞壁，試圖使心肌再生，然而研究顯示，僅有少量的注射細胞存活。通常在涂覆有一種或幾種細胞外基質蛋白的表面或支架上培養細胞，包括成體和胚胎干細胞、誘導多潛能干細胞和如心肌細胞的分化細胞。 但是，在體內，這些細胞處在高度復雜的胞外環境中。目前正對一些天然來源的材料進行研究，以用于心肌注射，包括纖維蛋白、膠原、藻酸鹽、基質膠和明膠。這些均不提供顯著量的心肌細胞外基質的天然組分。對于心率不齊，非侵入性(non-ablative)治療類型包括注射纖維蛋白和細胞。現有的用于心肌細胞、干細胞和其它心臟相關細胞的體外細胞培養基質包括膠原、層粘連蛋白、 SURECOAT(CELUTR0N,膠原和層粘連蛋白的混合物)以及明膠。目前防止心肌梗塞繼發心力衰竭的工作集中于細胞移植以取代壞死的心肌細胞， 防止負性左心室重構，以及使心臟組織再生。然而由于沒有合適的基質，心肌細胞的體外生長率和體內存活率低。存在改進的用于心臟修復、心率失調治療和心肌細胞培養的組合物的需求。同樣地，也存在改進的用于骨骼肌修復、再生和細胞培養的組合物的需求。
發明內容
一方面，本發明提供一種組合物，其含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質。在一些實例中該心臟組織為心肌組織，而在另一些實例中該心臟組織為心包組織。該組合物可以是可注射的。該組合物可在室溫中、典型地在20°c至25°C中形成液體形式，并可在高于室溫或高于35 °C的溫度中形成凝膠形式。一些實例中，上述心臟組織選自人類心臟、靈長類心臟、豬心臟、牛心臟、或任意其它哺乳動物或動物心臟，包括但不限于山羊心臟、小鼠心臟、大鼠心臟、兔心臟和雞心臟。
一些實例中，該組合物設置為在心肌梗塞后注射進梗塞壁。一些實施例中，該組合物設置為通過小規格針(small gauge needle)(例如27規格(gauge)或更小)輸送到組織。一些實例中，上述組合物適合植入到患者中。一些實例中，該組合物含有天然發生的將細胞募集到組合物中的趨化因子、生長因子和刺激因子。一些實例中，該組合物含有天然葡胺聚糖。一些實例中，該組合物還含有非天然發生將細胞募集到組合物中的因子。一些實例中，該組合物還含有外源的治療性細胞。這些細胞可以是干細胞或其它心肌細胞的前體或其它心臟相關的細胞。一些實施例中，該組合物還含有治療制劑，而其本身設置為給藥載體。一些實施例中，該組合物被設置成無損的傳導阻滯來治療例如心律不齊。一些實施例中，該組合物設置成涂覆例如組織培養板或支架的表面，以培養心肌細胞或其它心臟修復相關的細胞類型。一方面，本發明提供一種制備含有脫細胞化心臟細胞外基質的組合物的方法，其包括獲取具有細胞外基質組分和非細胞外基質組分的心臟組織樣品；處理該心臟組織樣品以去除非細胞外基質組分，從而得到脫細胞化心臟細胞外基質，包括細胞外蛋白和多糖； 并對脫細胞化心臟外基質進行滅菌。一些實例中，上述方法還包括凍干和碾碎脫細胞化心臟細胞外基質的步驟。一些實例中，上述方法還包括對脫細胞化心臟細胞外基質進行酶處理、溶解或懸浮的步驟。一些實例中，上述脫細胞化心臟外基質在低PH中以胃蛋白酶進行消化。一些實例中，上述方法還包括在溶液中懸浮和中和上述脫細胞化心臟細胞外基質的步驟。一些實例中，上述溶液為可通過高規格針注射到心肌層中的磷酸緩沖溶液(PBS) 或鹽溶液。一些實例中，上述組合物在體溫形成凝膠。一些實例中，上述組合物還含有可在凝膠之前、之中或之后輸送到組合物中或附著其上的細胞、藥物、蛋白或其它治療制劑。一些實例中，上述溶液被置于組織培養板或孔內，在35°C以上或約37°C孵育，從而形成用于細胞培養的凝膠。一方面，本發明提供一種在吸收基質上培養細胞的方法，其步驟包括在組織培養裝置內提供含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質的溶液；孵育上述組織培養板裝置；去除上述溶液；并在吸收基質上培養細胞。一些實例中，上述細胞為心肌細胞或其它心臟修復相關的細胞。一方面，本發明提供用于受治療者內心臟修復的治療方法，其包括將治療有效量的心臟組織來源的含有脫細胞化細胞外基質的組合物注射或植入到有需要的受治療者中。另一方面，文中的組合物含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質。該組合物可以是可注射的。該組合物在室溫中為液態，在高于室溫的溫度中為凝膠形式。一些實例中，該組合物被設置為在心肌梗塞后注射到梗塞壁中。一些實例中，該組合物被設置為通過 27規格或更小的針輸送到組織。一些實施方式中，文中含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質的組合物，其保留天然葡胺聚糖。一些實例中，該組合物含有天然發生的將細胞募集到該組合物中的因子。一些實例中，該組合物含有非天然發生的將細胞募集到該組合物中的因子。一些實例中，該組合物被設置為涂覆組織培養表面或支架以培養骨骼肌修復相關的細胞。一方面，文中公開了一種制備含有脫細胞化骨骼肌細胞外基質的組合物的方法， 其包括從受治療者獲取具有細胞外基質和非細胞外基質組分的骨骼肌組織樣品；處理骨骼肌組織樣品以去除非細胞外基質組分，從而得到脫細胞化骨骼肌細胞外基質、細胞外蛋白和多糖；對脫細胞化骨骼肌細胞外基質進行滅菌。一些實例中，上述方法還包括將骨骼肌細胞外基質凍干和碾碎的步驟。一些實例中，上述方法還包括對脫細胞化骨骼肌細胞外基質進行酶處理、溶解或懸浮。一些實例中，該脫細胞化骨骼肌細胞外基質在低PH中以胃蛋白酶進行消化。一些實例中，上述方法還包括在溶液中懸浮和中和或改變上述脫細胞化心臟細胞外基質的PH的步驟。一些實例中，上述溶液為PBS、鹽水或其它緩沖溶液，設置為通過小直徑針注射到心肌層。該溶液可在體溫中形成凝膠。該溶液可以還含有可輸送到內部并在凝膠作用之前、之中或之后輸送附著于上述材料的細胞、藥物、蛋白質或多糖。一些實例中，溶液被置于組織培養板或孔內，在37°C或高于室溫的溫度中孵育，以形成用于細胞培養的凝膠。一方面，本發明提供一種在吸收基質上培養細胞的方法，其包括下述步驟在組織培養裝置內含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質的溶液；孵育上述組織培養板裝置；去除上述溶液；并在吸收基質上培養細胞。一些實例中，上述細胞為骨骼肌成肌細胞、 干細胞或其它與骨骼肌修復相關的細胞類型。一方面，本發明提供一種用于受治療者的骨骼肌修復的治療方法，其包括植入含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質的組合物。
圖1圖示由輸送本發明組合物的方法(上)得到的示例性心臟或由標準治療方法 (下)得到的示例性心臟。圖2圖示生長在心臟ECM上的人類胚胎干細胞來源的心肌細胞的平均肌纖維區域。圖3圖示生長在心肌ECM上的每肌纖維區域的人類胚胎干細胞來源的心肌細胞核的平均數量。圖4圖示心肌ECM上的平均橋粒斑(desmosome plaque)尺寸。圖5圖示培養于骨骼肌基質上的骨骼肌成肌細胞。圖6圖示骨骼肌成肌細胞特異性地向骨骼肌基質遷移。
具體實施例方式在某些優選實施方式中，本發明提供一種脫細胞化心臟細胞外基質(ECM)組合物，其可用于例如，在心肌梗塞后輸送治療制劑，包括細胞，到心壁中。本發明的ECM可以來源于哺乳動物心臟組織原生或天然的基質。本文所述的組合物包括可用于注射到需要治療處理的心臟組織的心臟細胞外基質。ECM還可用于將細胞募集進受損組織或用作給藥載體。 組合物還可用于支持受損細胞或改變機械性能。本發明的另一個用處是作為無損的傳導阻斷來治療例如心律不齊。一些實例中，文中所述的心臟或心臟細胞外基質來源于心肌組織。 另一些實例中，文中所述的心臟或心臟細胞外基質來源于心包組織。文中所述的含有脫細胞化心臟ECM的組合物可以幫助缺陷或缺失的心肌再生并恢復心臟功能。該ECM組合物可以從動物或合成來源獲得。文中的細胞外基質組合物可以還含有一種或多種添加組分，例如但不限于外源細胞、肽、多肽或蛋白質、表達生物活性分子的DNA的載體和其它治療制劑如藥物、細胞生長因子、養分、抗生素或其它生物活性分子。因此，在某些優選的實施方式中，該ECM可以還含有外源的細胞群例如下文所述的心肌細胞前體。一些實例中描述了輸送方法，使組合物接觸缺陷的、病態的或缺失的心肌，使心肌組織再生并使心肌恢復收縮性、傳導性或健康功能。一些實例中，該組合物可以在受體內募集內源細胞，并可協調新募集或添加的細胞的功能，允許細胞在組合物內增殖或遷移。目前，阻止心肌梗塞(MI)后心力衰竭的研究集中于細胞移植，以取代受體內壞死的心肌，阻止負性左心室重構，和再生心臟組織。已探究多種細胞類型作為細胞移植治療， 包括心肌細胞、成肌細胞、間葉細胞和胚胎干細胞。不幸的是，由于沒有合適的基質，體內細胞存活量低。本領域中已用于嘗試在注射時幫助細胞停留和存活的一些天然來源的基質包括纖維素、膠原、基質膠、藻酸鹽和明膠。但是，這些材料均不能適當地模擬特別是發現于心臟細胞外基質中的天然組分。現有的治療心臟后MI (heart post-MI)的可注射支架不能提供細胞生長所需的細胞外基質所有的需求組分。因此，在這些支架中細胞存活受到限制。在某些實施方式中，本發明提供一種天然心臟ECM脫細胞化和凝膠化方法以制造用于細胞移植的原位支架。文中提供了可以產生納米纖維凝膠的恰當的消化和制備方法。該凝膠溶液能夠注射到心肌或梗塞中，從而顯示了其作為原位凝膠支架的可能性。由于脫細胞化心臟ECM最佳地模擬自然的心臟環境，它使注射時心肌梗塞部位的細胞存活量和停留量提高，從而促進心肌組織再生。圖1圖示了文中的組合物的示例性輸送方法。左邊表示健康心臟。在圖中部表示心肌梗塞后的心臟，如右側底部示意圖所示，沒有現有的標準治療，例如僅使用現成可用的藥物和醫用裝置，能夠有效避免心肌細胞死亡、負性LV重構、LV肥大和心力衰竭。本發明通過輸送文中所述的可注射的組合物改善了這個問題。在右側上部示意圖表示向LV輸送文中的組合物而使重建增強、梗塞尺寸減小、LV重構減弱和心臟功能改善的心臟。本發明特征在于脫細胞化心臟外基質以及生產和使用該基質的方法。特別地，本發明設計一種生物相容性的組合物，其含有從心臟組織直接獲得的脫細胞化心臟細胞外基質，用于通過注射或植入生物相容性的含有脫細胞化心臟細胞外基質的組合物到受治療者中而治療受治療者的缺陷、病態、受損或缺血的組織或器官，優選人類心臟。本發明的其它實施方式涉及脫細胞化骨骼肌、細胞外基質組合物、使用方法和生產方法。一些實例中，脫細胞化心臟細胞外基質來源于選自人類、豬、牛、羊、小鼠、大鼠、雞或任意其它的哺乳或動物心臟的天然心臟組織。一些實施方式中，含有脫細胞化心臟細胞外基質的生物相容性組合物為可注射的凝膠或溶液形式，并可通過在心肌梗塞后移植或輸送其含有的細胞到梗塞壁中或將患者自體的細胞募集進受損心臟組織而用于心臟修復。在其它實例中，含有脫細胞化心臟ECM的生物相容性材料為，例如碎片(patch)、乳狀液、粘性液體、片段(fragment)、顆粒、微珠或納米珠。一些實例中，本發明提供生物相容性的材料用于在研究實驗室中或在臨床環境中移植之前培養心肌細胞或其它心臟相關細胞，以及用于心臟修復。還提供了制造和以脫細胞化心臟細胞外基質涂覆例如組織培養板或孔的表面的方法。本發明的生物相容性材料還適用于植入患者，無論是人類還是動物。
本發明還提供高生產含有本發明的脫細胞化心臟細胞外基質的生物相容性材料。 這樣的方法包括下列步驟(a)獲取具有細胞外基質組分和非細胞外基質組分的心臟組織樣品；(b)處理心臟組織細胞以去除至少一部分或大致所有的非細胞外基質組分，從而得到脫細胞化心臟細胞外基質；并(c)對脫細胞化心臟細胞外基質進行滅菌。某些實施方式中，心臟組織樣品從哺乳動物如非靈長類(如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等等)或靈長類(如猴和人類)，或鳥類來源(如雞、鴨等等)分離得到。心臟組織樣品的脫細胞過程使用本領域和文中所述的一種或多種物理、化學和/或生物技術進行。對于人類治療，已有許多用于心臟細胞外基質材料的潛在來源人類心臟(包括自體同源的、同種異體的或尸體的)、豬心臟、牛心臟、羊心臟、大鼠心臟、小鼠心臟、兔心臟、 雞心臟和其它動物來源。與全心臟移植不同，一個供體心臟可用于治療許多人。非人類動物是一類不要求人類供體的心臟細胞外基質的來源。非人類動物來源可以用作研究試劑。一些實施方式中，處理心臟細胞外基質的方法如下所述。首先對心臟組織脫細胞化，只保留細胞外基質。例如，脫細胞化可通過十二烷酸硫酸鈉和磷酸緩沖溶液灌注法進行。然后凍干心臟細胞外基質，碾碎，并在低pH、約在pHl 6或pHl 4之間以胃蛋白酶、 或以其它基質降解酶如基質金屬蛋白酶進行消化。為了生產凝膠狀的心臟細胞外基質用于體內治療，接著以PBS/鹽中和含有心臟細胞外基質的溶液，并調至所需溫度、濃度和粘度。某些實施方式中，ECM的濃度可為1 20mg/ml，或2 8mg/ml。然后含有心臟細胞外基質的溶液可通過高規格針，如27規格或更高規格，注射進心肌。在體溫中，如36.8°C 士0.7°C，該溶液形成凝膠。細胞、藥物、蛋白或其它治療制劑也可被輸送到心臟ECM凝膠中。為了生產凝膠狀的心臟細胞外基質用于體外用途，以PBS/鹽中和含有心臟細胞外基質的溶液并調至所需濃度。一些實施方式中，ECM濃度可為1 20mg/ml，或2 8mg/ ml。接著，該溶液可被放置于任何固體表面上從而進入組織培養板/孔。一旦置于37°C或室溫以上的培養箱，該溶液形成可用于細胞培養的凝膠。本發明還提供一種用于受治療者的心臟修復的治療方法，其包括注射或植入部分或整體本發明的生物相容性心臟細胞外基質到患者中。本發明還提供一種用于治療受治療者的心律不齊或其它缺陷、病態、受損或缺血的組織或器官的治療方法，包括原位注射或植入本發明的生物相容性材料。文中的組合物可含有心臟組織來源的脫細胞化ECM和另一種或多種組分。一些實例中，全部組合物中ECM的量以重量計高于組合物的90 %或95 %或99 %。一些實施方式中， 全部組合物中的ECM以重量計高于組合物的1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%或 80%。這樣制備脫細胞化細胞外基質以保持大部分用于心肌組織再生的生物活性。文中組合物示例性的生物活性包括但不限于控制或啟動細胞粘附、細胞遷移、細胞分化、細胞成熟、細胞組織化(cell organization)、細胞增殖、細胞死亡(凋亡)、血管生成刺激、蛋白水解活性、酶活性、細胞運動、蛋白和細胞調節、轉錄激活、供應轉錄、一些生物活性的抑制例如抑制凝結、干細胞誘導(attraction)、趨化性以及MMP或其它酶活性。該組合物含有實質上脫細胞化細胞外基質。一些實例中，脫細胞化基質不含有可使ECM自然形成的非活天然細胞。一些實例中，實質上脫細胞化基質含有以重量計少于1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或 10% 的天然細胞。如文中所述，組合物可含有脫細胞化心臟ECM和不同組織脫細胞化ECM或合成或天然形成的聚合物。文中示例性聚合物包括但不限于聚對苯二甲酸二乙醇酯纖維 (DACRON)、聚四氟乙烯(PTFE)、戊二醛交聯的心包膜、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、透明質酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯、鎳鈦諾(nitinol)和來自動物和非動物來源的膠原(如植物或合成膠原)。一些實例中，組合物的聚合物為生物相容性的和生物可降解的和/或生物可吸收的。示例性的生物降解或生物可吸收的聚合物包括但不限于聚丙交酯 (polylactide)、聚乙交酯、聚己內酯、聚二噁烷和它們的無規和嵌段共聚物。生物可降解和 /或生物可吸收的聚合物可包括選自乙交酯、丙交酯(Iactide)、二噁烷、己內酯、三亞甲基碳酸酯、乙二醇和賴氨酸的單體。聚合物材料可以是無規共聚物、嵌段共聚物或單體混合物、含有這些單體的均聚物、共聚物和/或雜聚物。生物可降解和/或生物可吸收的聚合物可包含生物可吸收和生物可降解的線性脂肪族聚酯如聚乙交酯(PGA)和其無規共聚物聚(乙交酯-丙交酯) (PGA-co-PLA)。其它適合的生物相容性聚合物的實例為包括甲基丙烯酸乙酯的聚羥基烷基甲基丙烯酸酯和如聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺的水凝膠。其它合適的生物可吸收性材料為生物聚合物，其包括膠原、明膠、海藻酸、殼多糖、殼聚糖、纖維蛋白、透明質酸、葡聚糖、聚氨基酸、聚賴氨酸和這些材料的共聚物。根據本發明考慮了以上實例的任意組合、共聚物、 聚合物或其混合物以供使用。這些生物可吸收材料可根據已知方法制備。因此，文中描述了制備含有心肌組織來源的脫細胞化ECM的組合物的方法。本發明還提供了以相似的工序得到的骨骼肌組織來源的ECM組合物和方法。還提供了相關組合物、生產裝置和方法。一些實施方式中，當在室溫以上包括生理溫度接近37°C受熱時，組合物的粘性增加。根據一個非限制性的實施方式，ECM來源的組合物在室溫和35°C以下的其它溫度下為可注射溶液。在另一個非限制性的實施方式中，該凝膠可在體溫以上約37°C或接近體溫時注射，但在升高的溫度中凝膠化更迅速。凝膠在37°C生理溫度中約15 20分鐘后形成。提供了制備ECM來源的凝膠的原理的總體設定以及以下實例中的制備凝膠的優選特定方案， 實施例可應用于且適用于多種組織包括但不限于心臟和骨骼肌。可含有細胞或其它治療制劑的組合物可通過許多方法植入到患者、人類或動物中。一些實例中，該組合物以液體注射到患者需要的部位。市售的ECM制劑也可結合到文中所述的方法、裝置和組合物中。其中一個實施方式中，ECM從小腸粘膜下層(SIS)獲得。市售制劑包括但不限于SURGISIS 、SURGISIS-ES 、 STRATASIS 禾口 STRATASIS-ES (Cook Urological Inc. ；Indianapolis, Ind.)及 GRAFTPATCH (Organogenesis Inc. ；Canton，Mass.)。另一個實例中，ECM 從真皮獲得。市售制劑包括但不限于PELVIC0L (為在歐洲以PERMAC0L 銷售；Bard，Covington, GA.)、 REPLIF0RM (Microvasive ；Boston, Mass.)和 ALL0DERM (LifeCell ；Branchburg, N.J.)。一些實例中，本發明的心臟細胞外基質的溶液、凝膠形式和吸收形式提供與體內發現的呈相近比例的所有組分。對于心律不齊治療，可輸送本發明的細胞外基質，其允許解決心律不齊后的心臟組織再生。對于體外心肌細胞和其它心臟相關細胞的細胞培養，與通常使用的膠原、層粘連蛋白、SUREC0AT(CELLUTR0N，膠原和層粘連蛋白的混合物)和明膠，本發明的心臟細胞外基質的凝膠和吸收形式含有所有或許多細胞體內識別的相同的細胞
外基質信號。文中的組合物提供心臟細胞外基質的凝膠或溶液形式，以及心臟細胞外基質的這些形式用于例如如心臟修復、心律不齊治療和細胞培養的使用。一個實施方式中，首先將心臟組織脫細胞化，只保留細胞外基質。然后將基質凍干、碾碎或研磨成細粉，并以胃蛋白酶或其它酶、例如但不限于基質金屬蛋白酶、膠原酶和胰蛋白酶使之溶解。對于凝膠治療，接著使用PBS/鹽將溶液中和并調至適合的濃度。一個實施方式中，該溶液可通過針注射到心肌層(或通過導管經由肋骨，或在開胸過程中)。針的規格可以是但不限于228、238、對8、258、沈8、278、觀8、四8、3(^或更小。一個實施方式中，注射溶液所用的針的規格為27g。也可通過氣囊導管或其它無針導管進行輸送。可基于傷損組織和患者個人的不同情況而常規地決定劑量和頻率。體溫中，該溶液可接著形成凝膠。在又一實施方式中，凝膠可與戊二醛、甲醛、雙-NHS分子或其它交聯劑交聯。在又一實施方式中，ECM可與其它治療制劑，如細胞、肽、蛋白質、藥物、養分、抗生素、促存活添加劑、蛋白多糖和/或糖胺聚糖結合。在又一個實施方式中，ECM可與合成的聚合物結合和/或交聯。合成聚合物的實例包括但不限于聚對苯二甲酸乙二醇酯纖維 (DACR0N )、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(P' EGDA)、聚乙烯、聚苯乙烯和鎳鈦諾(nitinol)。在又一實施方式中，可將ECM溶液或凝膠單獨或與上述組分組合而注射到梗塞部位、邊緣區或心肌層，以使內源細胞向內生長、血管生成和再生。在又一實施方式中，組合物可單獨或與上述組分組合而使用，作為基質，以改變心臟的機械性能和/或阻止負性左心室重構。在又一實施方式中，該組合物可單獨或與上述組分組合，與細胞輸送，用于再生心肌層。在又一實施方式中，該組合物可單獨或與上述組分組合而使用，以產生傳導阻斷從而治療心律不齊。在一制造可溶試劑的實施方式中，在包括但不限于0.5M、0. IM或0. OlM的乙酸或 0. IM HCl的低pH溶液中將溶液調至所需濃度，然后置于組織培養板/孔、蓋玻片、支架或其它用于組織培養的表面。在培養箱中37°C放置1小時后，或在室溫中過夜后，去除過量溶液。以PBS漂洗表面后，可在吸收基質上培養細胞。該溶液可在注射/植入之前、之中或之后，預先與肽、蛋白質、DNA、藥物、養分、促存活添加劑、蛋白多糖和/或糖胺聚糖結合。本發明基于治療組合物和吸收細胞培養組合物形式的體外心臟細胞外基質，提供增強的細胞粘附和存活。與標準平板涂層相比，可溶的細胞培養試劑形式的心臟細胞外基質誘導心肌細胞更迅速地擴散、更快成熟和/或存活改進。之前的研究顯示，難以將從心肌細胞獲得的人類胚胎干細胞(hESC)用于心肌梗塞的治療。一些實例中，有效分化和體內成熟心室心肌細胞的產率阻礙了治療的有效性。以前，分化調控主要在體外實行，例如在細胞培養基中添加可溶性因子。該處理過程受胎兒表型以外的分化難度所限。除了可溶性因子，細胞外基質也可在細胞分化中起重要作用。對于成體細胞，包括成體祖細胞，已研究了一些含有化學信號的基質，但僅進行了少量關于ECM對ESCs的效果、 特別是對hESCs的效果的研究。許多實例中，由hESC得到的心肌細胞是在含有可溶性因子和明膠的促存活培養基中輸送的。
在文中的一個實施方式中，公開了從天然心臟中獲得的仿生基質。一些實例中，基質與體內心臟環境相似，其含有許多或所有在自然心臟ECM中發現的天然化學信號。一些實例中，通過交聯或添加或其它材料，也可模仿健康成體或胚胎的心肌層的機械性能。如文中所述，可用簡單經濟的方法將心臟ECM分離并加工到凝膠中，其適合按比例擴大用于臨床轉化。一些實例中，文中提供的組合物可含有基質和外源添加的或募集的細胞。該細胞可以是任意各種細胞。一些實例中，該細胞為各種心臟或心臟血管細胞，包括但不限于干細胞、祖細胞、心肌細胞、血管細胞和自體或同種異體來源的成纖維細胞。本發明由此提供由天然脫細胞化心臟細胞外基質制得的凝膠的使用，以支持分離的新生心肌細胞或體內的心肌細胞來源的干細胞祖細胞并起作原位凝膠支架的作用，提供了基質以改進細胞在左心室壁的停留和存活。由于從心臟ECM產生的支架比目前可用的材料更準確接近于體內環境，其適于在心肌層中用于細胞移植。文中含有心臟ECM和外源添加的細胞的組合物可通過在ECM中培養而制得。此外，可在細胞外基中添加如生長因子的蛋白質，也可在組合物中添加蛋白質，或蛋白質分子可與基質中的分子共價或非共價地連接。蛋白質與基質分子的共價連接可通過本領域已知的標準共價蛋白質連接方法完成。蛋白質可與一種或多種基質分子共價連接。在一個實施方式中，當輸送含有脫細胞化心臟ECM和外源細胞的組合物時，這些細胞可以是用于治療心肌層的細胞來源，包括同種來源、異種來源、自體來源。因此，可通過文中的組合物輸送胚胎干細胞、胎兒或成體來源的干細胞、誘導多潛能干細胞、心肌細胞祖細胞、胎兒和新生心肌細胞、成肌纖維細胞、成肌細胞、間葉細胞、實質細胞、上皮細胞、內皮細胞、間皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、骨髓來源祖細胞、骨骼細胞、巨噬細胞、脂肪細胞和自移植的擴張的心肌細胞。一些實例中，文中的細胞可在體外培養且可在培養皿環境中直接向心肌細胞或可成為心肌細胞的骨髓細胞分化。然后將培養的細胞與組合物或接觸支架和其它組分而移植到哺乳動物中。成體干細胞也是另一種可成為文中組合物一部分的細胞。據認為成體干細胞通過在新部位產生其它干細胞(如適于心肌層的細胞)而起作用，或在體內直接分化為心肌細胞。引導至器官如心臟后它們還可分化成其它類型細胞。成體哺乳動物由循環內皮前體細胞、骨髓來源細胞、脂肪組織、或特殊器官的細胞為成體干細胞提供來源。已知從骨髓抽取液分離的單核細胞在體外分化成內皮細胞，并可在肌肉注射后在新形成的血管中檢測到。 因此，采用來自骨髓抽取液的細胞可在體內產生內皮細胞作為組合物的組分。其它可用于本發明的細胞為受激活的細胞因子調控的間葉干細胞。已知間葉細胞的亞群當在體外暴露于細胞因子時分化為生肌細胞系。人類胚胎干細胞來源的心肌細胞可在文中含有心臟基質的組合物上生長。一些實例中，存在文中的組合物時生長的hESC來源的心肌細胞表現出與體內更相似的形態學。一些實例中，存在文中組合物時生長的hESC來源的心肌細胞表現出增加的成熟標記物。本發明還著目于藥物輸送系統，其包括用于輸送細胞、藥物、分子或蛋白質到受治療者中以治療缺陷、病態、受損或缺血組織或器官的脫細胞化心臟細胞外基質。一個實施方式中，單獨或與其它組分結合的本發明的含有脫細胞化心臟細胞外基質的生物相容性材料用作無損的傳導阻斷以治療心律不齊。因此，本發明的生物相容性材料可用來移植細胞、或單獨注射以募集天然細胞或其它細胞因子內源治療制劑、或充當外源治療制劑輸送載體。本發明的組合物可還含有細胞、藥物、蛋白質或其它生物材料，例如但不限于促紅細胞生成素(EPO)、干細胞因子(SCF)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)、 成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、軟骨生長因子(CGF)、神經生長因子 (NGF)、角質細胞生長因子(KGF)、骨骼生長因子(SGF)、造血細胞生長因子(BDGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、細胞因子生長因子(cytokine growth factor, CGF)、干細胞因子(SCG)、血小板源生長因子(PDGF)、內皮細胞生長添加劑(EGGS)、集落刺激因子(CSF)、生長分化因子(GDF)、整合素調節因子(IMF)、鈣調蛋白(CaM)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、腫瘤壞死因子(TNF)、生長激素(GH)、骨形態發生蛋白(BMP)、基質金屬蛋白酶 (MMP)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)、干擾素、白介素、細胞因子、整合素、膠原、彈性蛋白、微纖維蛋白、纖粘蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖、血結素、血小板反應蛋白、硫酸乙酰肝素、皮膚素(dermantan)、硫酸軟骨素(CS)、透明質酸(HA)、玻連蛋白、蛋白多糖、轉鐵蛋白、腱生蛋白(cytotactin)、生腱蛋白(tenascin)和淋巴因子。組織培養板可以用本發明細胞外基質的可溶性配體或凝膠形式、或本發明的細胞外基質的吸收形式涂覆，以培養心肌細胞或其它與心臟修復相關的細胞。其可用作培養這些細胞的研究試劑或移植之前用于培養細胞的臨床試劑。細胞外基質試劑可與其它組織基質和細胞組合。對于凝膠試劑組合物，接著使用PBS/鹽或其它緩沖液將溶液中和并調至合適的濃度，然后置于組織培養板和/或孔中。當置于37°C培養箱時，溶液形成可用于細胞培養用的任何2D或3D培養基材的凝膠。在一個實施方式中，凝膠組合物可與戊二醛、甲醛、雙-NHS 分子或其它交聯物交聯，或與細胞、肽、蛋白質、DNA、藥物、養分、促存活添加劑、蛋白多糖和 /或糖胺聚糖結合，或與合成的聚合物結合和/或交聯以備將來使用。本發明還提供一種在吸收脫細胞化心臟細胞外基質上培養細胞的示例性方法，其包括以下步驟(a)在包括但不限于0. 5M或0. OlM的乙酸或0. IM HCl的低pH溶液中提供含有脫細胞化ECM的生物相容性材料的溶液，達到所需濃度，(b)將上述溶液置于組織培養板或孔中，(c)在室溫以上溫度如37°C中孵育上述培養板或孔1小時并過夜(或在室溫到 40°C中)，(d)除去過量溶液，(e)以PBS漂洗組織培養板或孔，并(f)在吸收基質上培養細胞。可在含有本發明的心臟細胞外基質的吸收基質上培養的細胞包括心肌細胞或與心臟修復相關的其它細胞類型，包括干細胞和心臟祖細胞。一些實例中，組合物包括交聯劑，包括但不限于普通的膠原交聯劑、透明質酸交聯劑或其它具有改變的降解與機械性能的蛋白交聯劑。一個實例中，制造文中的組合物的方法包括靜電紡絲法。一些實例中，設置本文的方法以控制納米纖維的尺寸、形狀或厚度。一些實例中，可使用例如細胞或體外起搏術向組合物引入收縮性。收縮性可產生周期應力從而促進更天然的心肌層。一些實例中，當組合物含有交聯基團或嵌入因子，如血管生成因子時，可向組合物引入細胞浸潤和血管生成。一些實例中，本文的組合物可含有微珠。微珠可以是組合物的一部分或輸送到組合物中。示例性微珠可以是任意種類的材料，例如天然的或合成的。一些實例中，微珠可具有不同降解性能或含有例如MMP抑制劑、生長因子或小分子。一些實例中，本文的組合物可包括可在輸送組合物中作為粘合劑或錨定物的生物基團(biological group)。一個實例中，組合物可以是生物粘合劑，例如用于創傷修復。一些實例中，本文的組合物可設置為細胞粘附劑。例如，本文組合物可在醫用裝置上涂覆或與含有或不含有細胞的生物混合。例如，本文組合物可以是合成聚合物血管移植用的涂層。一些實例中，該組合物含有抗菌劑或抗菌劑包含于其中。文中的方法包括輸送組合物作為創傷修復裝置。例如心臟損傷(cardiac ablation)后可輸送組合物以促進愈合。一個實例中，組合物含有以本文所述的ECM組合物涂覆的藻酸鹽珠。一些實例中，該組合物是可注射的。可注射的組合物可以是但不限于粉末、液體、 顆粒、碎片、凝膠或乳液。該可注射的組合物可注射到心臟中，或許多實例中，注射到左心室、右心室、左心房、右心房或心臟瓣膜。本文的組合物可募集例如但不限于內皮、平滑肌、 心臟祖細胞、成肌纖維細胞、干細胞和心肌細胞。制造本文組合物的方法可包括根據領域內我們已知的方法對任意年齡的動物或人類組織進行脫細胞化。一些實例中，本文的組合物含有ECM和天然或合成的聚合物。例如，本文的組合物含有天然聚合物如膠原、殼聚糖、藻酸鹽、纖維蛋白或透明質酸。另一個實例中，本文的組合物含有合成的聚合物、例如但不限于聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚羥基酸、聚二噁烷酮、 聚己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚氨基酸、擬聚氨基酸、導電聚合物(如聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺)或聚氨基甲酸酯或它們可能的共聚物。一些實例中，這里的組合物含有ECM和天然的以及合成的兩類聚合物。文中的組合物可以是通過ECM和另一種聚合物材料連接的多物料，例如通過與胺類、游離硫醇或短肽反應，與ECM自組裝。文中的方法包括含有ECM的組合物的輸送。示例性方法包括但不限于外科手術中直接注射；通過胸壁直接注射；通過導管穿過心內膜輸送到心肌層；通過冠狀血管輸送； 以及通過灌注氣囊導管輸送。組合物還可以固態輸送，如移植物(graft)、碎片(patch)或與細胞支架聯結。劑量和頻率將根據患者需求和內科醫生的判斷而不同。一些實例中，本文的組合物為涂層。該涂層可含有來自任意組織如心肌、骨骼肌、 心包膜、肝、脂肪組織和腦的ECM。涂層可用于組織培養用途，研究和臨床。涂層可用來涂覆例如但不限于合成或其它生物學的支架/材料或植入物。一些實例中，使涂層具有某種紋理或圖案。一些實例中，制造涂層的方法包括吸收或化學交聯。薄凝膠或吸收涂層可使用組合物的ECM溶液形式形成。一些實例中，設置文中的組合物以封閉心臟如隔膜缺損中的洞。本文的組合物還可從其它組織如骨骼肌、心包膜、肝、脂肪組織和腦形成。該組合物可用作生物制劑、醫用裝置或給藥裝置的涂層。缺少功能性替代物限制了經傷損、腫瘤切除、各種肌病而失去的骨骼肌的重建。外科手術治療如肌肉移植和移位技術已有一些成功；然而，依然存在替代療法的需求。組織工程方法提供了潛在的新解決方案；然而，當前可選方案提供不完全再生。已經研究了許多天然來源的和合成的材料作骨骼組織工程的支架，但均不能綜合模擬具有用于細胞生存、分化和遷移的重要信號的天然骨細胞細胞外基質。細胞外基質由復雜的組織特異性的蛋白質和多糖網絡組成，其幫助調節細胞生長、生存和分化。盡管天然ECM特性復雜，體外細胞研究傳統上評價單個ECM組分涂層上的細胞行為，因此對從體外細胞研究到體內環境的轉化研究結果產生限制。通常，來自各種動物來源的純化的基質蛋白被細胞培養基材吸收，為細胞粘附提供蛋白底物并修飾細胞行為。但是，這些方法不能提供準確的復雜微環境表征。曾用過更復雜的涂層，如單蛋白結合，顯示這些結合的信號影響細胞行為，但是不像體內那樣完整。對于更天然的基質，使用了細胞來源的基質。基質膠是一個復雜的系統；但它來源于小鼠肉瘤，不能模擬任何天然組織。許多ECM組分是相似的，但是各組織或器官具有獨特的組合物，天然獲得的組織特異性來源可能是更好的細胞微環境模仿者。骨骼肌包括高度取向的致密肌纖維束，各復核細胞由成肌細胞得到。天然骨骼肌中的肌纖維在細胞外三維基質中密集在一起，形成具有高細胞密度和細胞取向的有序組織，產生縱向收縮。骨骼肌受損后可產生瘢痕組織而導致功能喪失。體外肌肉組織工程作為備選方案對受體進行肌肉移植，為治療骨骼肌缺損帶來希望。組織工程組合物必須是生物相容性的，并可被血管化和神經支配。細胞外基質由復雜的組織特異性的蛋白質和多糖網絡組成，其幫助調節細胞生長、生存和分化。盡管天然ECM特性復雜，體外細胞研究傳統上評價單個ECM組分涂層上的肌肉細胞行為，因此對從體外細胞研究到體內環境的轉化研究結果產生限制。克服此限制對細胞介導的治療很重要，其依賴于隨著時間推移培養和擴增的細胞保持天然細胞行為。一方面，文中的組合物包括從豬的骨骼肌和心肌獲得的ECM。可發展該組合物形成基材涂層用于不同用途。一些實例中，組合物的ECM可溶化后保留肌肉特異性的ECM組分的復雜混合物。一些實例中，文中的涂層可在體外更恰當地效仿天然肌肉ECM。與接種于涂覆傳統的I型膠原的基材上的細胞相比時，接種于骨骼肌基質上的成肌細胞在i)肌球蛋白重鏈正極肌管的數量、 )每肌管的核數和iii)肌管寬度呈現明顯的增長。當接種于涂覆傳統明膠的基材上的細胞相比，接種于心肌基質上的人類胚胎干細胞(HES》來源的心肌細胞在以下方面呈現明顯的增長i)肌原纖維區域、ii)每肌原纖維區域的心肌細胞核數量和iii)橋粒斑尺寸，其凸顯出橋粒細胞一細胞連接蛋白、橋粒斑蛋白更大更成熟的閏盤定位。一些實例中，設置組合物以提供體內重建肌肉ECM的能力。該組合物可提供評價和保持體內肌肉和干細胞的行為與自然狀態相似的工具，并可提供用于體內細胞介導的治療的工具。圖2顯示與標準明膠涂層相比，生長在心臟ECM的心肌細胞的平均肌原纖維區域顯著增大。圖3顯示與標準明膠涂層相比，心肌細胞的平均數量明顯高于心臟ECM。如圖4 所示，在心臟ECM上培養時，橋粒斑蛋白、一細胞內的連接蛋白，在112天時特異地定位于心肌細胞之間和形成有序的橋粒，而在明膠上培養時不出現上述現象。文中所述的骨骼肌基質可以采用與心臟ECM同樣或相似的方式制備。可將該骨骼肌基質注射到骨骼肌中而用于骨骼肌組織工程。圖5顯示培養于骨骼肌基質上的骨骼肌成肌細胞，如文中所述，其顯示增加的肌管大小、增強的分化，且每肌管具有比膠原上培養的成肌細胞更高的平均核仁數。采用體外Transwell遷移檢測，如圖6所示，骨骼肌成肌細胞特異向骨骼肌基質遷移。
通過以下實施例進一步說明本發明，其不應以任意方式理解為對本發明的領域產生限制。顯而易見，對于技術人員而言，能夠并且考慮在本發明的領域內進行各種修改和變動。實施例1對直接注射細胞到梗塞壁以治療MI已經進行了各種研究，盡管許多研究顯示較低的存活率。本研究的目的在于測試采用凝膠作生長平臺，用于細胞粘附、生長、成熟和體內運輸。提供了由天然心臟細胞外基質組織構成的凝膠，可通過促進細胞存活而幫助心臟組織再生。使Sprague Dawley 雌鼠安樂死，采用由 Ott 等(Nature Medicine, 14(2) ,213, 2008)改進的方案對它們的心臟進行脫細胞化。接著將脫細胞化的心臟凍干、再水化、研磨成粉并再次凍干，以形成干粉。根據Freytes等(Biomaterials 29 1630，2008)所改進的方案，接著以胃蛋白酶最低限度消化該ECM并中和。更特別地，對成年Sprague Dawley雌鼠進行肝素化并用戊巴比妥腹腔內麻醉。橫切主動脈和肺動脈并去除心臟。將導管插入主動脈并系到改裝的LangendorfT裝置上。用改良的、之前已公開的技術對心臟進行脫細胞化。簡而言之，以十二烷基硫酸鈉(SDQ和PBS溶液對心臟的冠狀血管逆向灌流M小時，然后以l^Wtriton PBS溶液逆向灌流30分鐘。一旦脫細胞化完成，則用去洗離子水清洗心臟并在凍干機中凍干。用水將冰凍的心臟再水化，然后將其浸沒到液氮中。一旦凍結，則將心臟在杯球裝置中以70psi系統碾壓10秒。然后將研磨的心臟顆粒凍干。一旦干燥，則將凍干的心臟組織與的胃蛋白酶結合，并與0. OlM的HCl混合至濃度為10mg/ml。室溫下攪拌溶液48 小時，以使細胞外基質增溶溶解。48小時后，在冰上將該HCl溶液等分到Eppendorf管中， 并以0. IN的NaOH中和至ρΗ7· 4。通過上述方法，形成天然大鼠心臟ECM凝膠。如增強的材料粘性所證實地，2. 5 8mg/mL凝膠的成功凝膠化在15分鐘內發生。隨著更高密度的凝膠可觀察到增加的剛度。以1 XPBS稀釋中和的溶液，以每孔50 μ L接種于96孔板，然后轉移到37°C和5% CO2的培養箱中。凝膠形成后，使用移液器將100 μ L分離的2d新生心肌細胞移到凝膠上部， 每孔60000細胞。幾天后，檢測細胞對凝膠的粘附性。細胞外基質組織脫細胞化、磨碎和消化后，一旦溶液處于生理條件(pH = 7.4， 37°C)時，凝膠形成。溶液中的ECM組織以較高濃度形成的凝膠與以較低濃度ECM形成的凝膠相比，更硬更不透明。接種于凝膠上的細胞能夠粘附到凝膠上并且在其上存活。在心臟ECM凝膠上以1 X IO4接種的心肌細胞表現出對ECM的成功的粘附和細胞存活。在ECM上培養這些細胞至四天。通過30G針將IOOmL的心臟ECM溶液(7mg/mL)注射到麻醉鼠的LV游離壁中。本研究顯示，當處于生理pH和溫度時，天然心臟細胞外基質可被分離、溶解并自組裝進入凝膠。由于凝膠含有所有的天然細胞外基質組分，盡管有些雜亂，但其使該基質允許心肌細胞在體外以及一旦注入體內的成功粘附和生長。并且相信，由于由最初來源于心室的基質組成的凝膠更準確地模擬體內心臟環境，它能更成功地支持心肌細胞生長，而不是其它基質如膠原或纖維蛋白凝膠。可注射的凝膠可潛在地適應任意三維形狀并促進心臟內的細胞移植存活。注射的心肌細胞或可分化為心肌細胞的細胞可幫助心臟組織再生，促進心輸出量。該方法發展為產生不同濃度和硬度的天然心臟ECM凝膠平臺，還為細胞生長提供體外平臺，并作為原位工程支架用于再生。注射到體內時，天然ECM為心肌組織工程提供合適的復雜環境以增加細胞停留并促進組織再生。實施例2心肌細胞通常培養于涂覆有一個或可能多種細胞外基質(ECM)蛋白質的表面上。 但是，在體內，心肌細胞處于高度復雜的胞外環境；更準確模擬該天然環境的ECM可利于培養的心肌細胞的存活。這里，報導了已增溶溶解而形成涂層、用于新生心肌細胞的細胞培養的天然心臟ECM。將心臟從Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改進，2008)對心臟進行脫細胞化。將脫細胞化的心臟凍干、再水化，并在液態隊中冷凍后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0. OlM HCl最低限度消化ECM。48小時后，加入0. OlM的乙酸使終濃度為lmg/ml。使用分離試劑盒(Cellutron，Highland Park, NJ)從新解剖的1至2天大的 Sprague-Dawley大鼠的心室獲取心臟心肌細胞。棄掉最初的上清液，但隨后20分鐘的消化物用含17% M199、10%馬血清、5%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM終止并懸浮。 分離后，將上清預接種于苯乙烯組織培養皿上，通過成纖維細胞的選擇性粘附提高心肌細胞的純度。在37°C中以1小時使lmg/ml天然心臟ECM或膠原I (Sigma，St. Louis, MO)吸收至蓋玻片上。以200000/cm3的密度接種分離后的新生心肌細胞，且在M小時后將培養基更換成低血清培養液(DMEM，18. 5% M199,5% HS, 1% FBS及抗生素)。細胞培養維持在37°C 和5% CO2，每日監測，并每2 3天更換新鮮的培養液。心肌細胞粘附到吸收的天然ECM上，并形成局部融合層。起初，心肌細胞以相似的密度粘附到膠原涂層上。細胞培養物均在接種后第3天開始自發搏動。培養于膠原上的心肌細胞在第12 天開始分離，并在第14天停止搏動。但培養于天然心臟ECM的心肌細胞形成了清晰界定的纖維，其以同樣的頻率搏動直至第28天。本研究證明，由于天然心臟ECM更準確的模擬體內條件，其用于心肌細胞培養是有益的。本研究還證明，新生心肌細胞粘附到天然心臟ECM上并且比在典型的膠原涂層上作用更持久。該新的涂層對培養干細胞來源的心肌細胞以及心臟祖細胞是有用的。實施例3這里，研究了已脫細胞化和增溶溶解的成年心室的天然心臟細胞外基質的細胞涂覆用途。該優勢在于，天然心臟ECM比傳統的細胞表層具有更多組分，并且比預處理其它細胞型更易于使用。將心臟從Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改進，2008)對心臟進行脫細胞化。將脫細胞化的心臟凍干、再水化，并在液態隊中冷凍后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0. OlM HCl最低限度消化ECM。48小時后，加入0. OlM的乙酸使終濃度為lmg/ml。對天然心臟ECM的胃蛋白消化物在使用DTT的還原性條件進行心室凝膠電泳，并與層粘連蛋白(BD biosciences)和牛皮膠原(calf skin collagen) (Sigma)比較。使用 Imperial Protein Stain (Pierce)對凝膠染色。與膠原和層粘連蛋白相比，天然心臟ECM 可顯示更復雜的ECM組分的混合物。使用分離試劑盒(Cellutron，Highland Park, NJ)從1至2天大的 Sprague-Dawley大鼠的心室獲取心臟心肌細胞。棄掉最初的上清液，但隨后20分鐘的消化物用含17% M199、10%馬血清、5%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM終止并懸浮。 分離后，將上清預接種于苯乙烯組織培養皿上，通過成纖維細胞的選擇性粘附提高心肌細胞的純度。在37°C中以1小時使lmg/ml天然心臟ECM或膠原I (Sigma，St. Louis,MO)吸收至 48孔板上。以200000/cm2的密度接種分離后的新生心肌細胞，且在M小時后將培養基更換成低血清培養液(DMEM，18. 5% M199,5% HS, 1% FBS及抗生素)。細胞培養維持在37°C 和5% CO2，每日監測，并每2 3天更換新鮮的培養液。在第2天、第4天和第7天對細胞進行固定，并對α輔肌動蛋白、連接蛋白43(connexin 43)、pan_cadherin、肌動蛋白和細胞核染色。第2天心肌細胞在培養基中開始自發搏動。培養于膠原上的細胞在第8天開始從平板分離。培養于天然心臟ECM的一組細胞持續搏動直至第45天。培養于膠原上的所有細胞均在第14天停止搏動。現有的細胞培養涂層通常是吸收到組織培養板或支架上的簡單蛋白。采用更復雜的環境有利于細胞存活和成熟。本研究顯示，天然心臟ECM比其它標準細胞培養涂層含有更多的復雜組分。新生鼠心肌細胞粘附到作為細胞培養用的涂層的天然心臟ECM上，并自發地開始搏動。隨時間推移，培養于天然心臟ECM上的心肌細胞顯示增強的輔肌動蛋白、連接蛋白43(C0nnexin 43)、pan-cadherin染色。并且，與膠原相比，新生的心肌細胞在天然心臟ECM上具有提高的存活能力和粘附能力。實施例4這里，研究了文中所述的凝膠的使用，其中凝膠由天然脫細胞心臟ECM制得。該凝膠可作為原位凝膠支架，提供天然心臟基質，促進細胞LV壁中細胞停留和存活。對Sprague Dawley雌鼠心臟和豬心臟進行脫細胞化。將心臟組織切至 2mm厚并以去離子水漂洗，然后在十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌4 5天直至脫細胞化。在 1 % Triton X-100中30分鐘的附加的攪拌步驟確保完全脫細胞化，隨后在去離子水中過夜攪拌并在去離子水中最后漂洗。然后將脫細胞化的心臟凍干、碾碎成粉或研磨，并再次凍干以形成干粉。然后在胃蛋白酶中消化該ECM并中和。然后通過添加氫氧化鈉和10X PBS將溶解的心臟ECM調至生理pH或pH 8。然后以PBS稀釋中和后的心臟細胞外基質溶液至所需濃度并使其在37°C中在96孔板中凝膠化。 目測該材料證實了 2. 5 8mg/ml凝膠的成功凝膠化。隨著更高密度的凝膠可觀察到增加的剛度。測試了不同實驗條件從而為心臟ECM支架凝膠化確定不同的消化。進行心室凝膠電泳以比較消化條件的內容物，并比較ECM內容物與鼠尾膠原。確定初始pH在心臟ECM的消化和凝膠化中起重要作用。消化進行48 72小時。凝膠電泳顯示0. OlM HCl對天然心臟ECM的不完全消化。在0. IM HCl中消化心臟ECM顯示增強的降解。由此顯示更強的酸性條件促進心臟ECM溶液的消化和凝膠化。對比心臟ECM和鼠尾膠原說明心臟ECM中存在各種額外的胃蛋白酶。采用掃描電鏡觀察心臟細胞外基質凝膠形式的結構。以2. 5%戊二醛固定凝膠2 小時，接著進行一系列乙醇漂洗(30 100% )，并在臨界點干燥。樣品在成像前用鉻進行溉射鍍膜(sputter coated)。通過30G針將濃度為6mg/ml心臟ECM的溶解的天然ECM成功注射到鼠LV游離壁這，產生原位凝膠支架，心肌細胞粘附并在其上增殖。實施例5使用市售的遷移測定試劑盒進行測定心臟脫細胞化ECM溶液的體外化學趨化特性(chemoattractive properties)。簡單地說，將人類冠狀動脈內皮細胞(HCAECs)和鼠主動脈平滑肌細胞(RASMCs)血清饑餓，并評價向基質、膠原、胃蛋白酶和胎牛血清的遷移。 RASMCs顯示向基質顯著的遷移，而HCAECs顯示趨勢。因此，基質的生化信號具有能夠在體內促進細胞浸潤的化學趨化特性。在體內，在注射區域內定量微動脈的形成以評價新生血管的形成。與注射后4h相比，微動脈的密度在注射后11天顯著更大。實施例6當在MI后注射到心肌壁中時，數個細胞類型已經顯示保護心臟功能。然而，無細胞處理能夠消除用細胞療法時普遍的低細胞存活率和免疫反應的并發癥。心肌梗塞是在大鼠中使用25min缺血一再罐注模型通過閉合左前降動脈誘導的。 在MI后一周，從MRI圖計算基線函數。將豬心肌ECM以小塊在SDS中脫細胞數天，隨后通過DI漂洗過夜、凍干并研磨以產生粉末。消化在0. IM HCl中以胃蛋白酶進行，從而生成可溶形式的材料。注射前，使用IM NaOH將溶解性的ECM調至PH 7. 4并以PBS稀釋至為6mg/ml。MI 手術后，將動物隨機分為2組，梗塞手術后兩周，將ECM或鹽水通過30G針注射到Sprague Dawley雌鼠的LV游離壁中。注射手術后4周(MI后6周)，使用MRI再次評價心臟功能。以ECM注射的動物在6周顯示保持的功能(基于注射部分進行的評價)，而鹽水注射的動物沒有維持心臟功能。心臟舒張末期和心臟收縮末期體積在ECM注射的動物中也得到了保持。實施例7當前，干細胞和其它細胞類型正在用于治療心力衰竭的臨床試驗，其通過穿過27G 的導管輸送到心肌壁中。將豬心室組織使用SDS洗滌劑進行脫細胞化，并加工以形成可溶形式的基質，中和至生理PH并稀釋至6mg/ml用于注射。2只Yorkshire豬接受線圈誘導的心肌梗塞(coil-induced myocardial infarction)，并在梗塞后2個月用單獨的心肌基質或與細胞一起進行注射。將胎牛心臟外植物來源的物質用Dil、一種cyotoplasmic染料進行預先標記用于組織學鑒定。使用顯示在嚙齒動物模型中增強hESC存活的促存活的雞尾酒(cocktail)。通過NOGA定位引導，將單獨的基質或與細胞一起以臨床相關速率0. 2mL每30s通過導管進行注射。5次每次0. ImL的注射由單獨的基質或與細胞一起進行，注射到梗塞的緣帶區域。單獨的基質或與細胞一起的基質能夠成功地注射到豬的心臟內，最低限度侵襲地且不阻塞細導管。實施例8這里，將脫細胞化的心包組織來源的凝膠的研究和使用描述為具有通過促進體內新生血管形成以改進在LV壁的細胞保留和存活的自體療法的潛能。豬和人的心包均進行過脫細胞。使Juvenile農場雄豬安樂死，通過由Ott等 (Nature Medicine, 14(2), 213, 2008)改良的步驟將它們的心包脫細胞。具體而言，將心包簡單地在DI水中漂洗，在十二烷基硫酸鈉(SDQ中攪拌Mh，然后在DI中攪拌近證。 人心包組織樣品從接受心胸手術的患者中收集。這些樣品以相似的方式進行脫細胞簡短的DI漂洗，隨后在1 % SDS中3天，隨后DI漂洗過夜。在這兩種情況下，完整的脫細胞化均用組織學染色進行驗證。下述的步驟對于人和豬的心包ECM樣品均是有效的。接著將脫細胞心包或心包ECM冷凍、凍干，并研磨以形成精細干燥粉末。然后通過由Freytes等(Biomaterials 29 =1630,2008)改良的方法，將ECM粉末以溶解于HCl的胃蛋白酶消化并中和。凝膠電泳(SDS-PAGE)表明與胃蛋白酶消化的膠原相比的更大的復雜性，其顯示心包樣品中較小的帶的寬度范圍。復雜性通過用質譜法分析樣品進行確認以確定蛋白質碎片。確定的ECM蛋白質的碎片包括膠原、彈性蛋白、纖維蛋白和各種蛋白聚糖。當將150 μ 1的中和溶液加載到96孔板內并使其位于培養箱中，在2 池后觀察凝膠作用。體內凝膠作用通過注射60 μ 1的中和ECM溶液到Sprague Dawley雄鼠的左心室 (LV)壁進行觀察。來自注射后45min處死的動物的切片心臟的組織學染色顯示在LV壁可見的凝膠的ECM區域。在相同的實驗中，將動物培養2周，之后將它們處死，收集它們的心臟用于切片。 在這個時間點，ECM注射劑仍然可見，但已經被細胞浸潤。免疫組化在組織切片上進行，以確定平滑肌細胞和內皮細胞，指示血管。在ECM注射劑區域內大量血管的存在顯示該材料促進新生血管形成。實施例9用于體外細胞培養的表面涂層通常由一種或幾種細胞外基質蛋白質形成。其提供細胞粘著表面，但它并不能模仿體內細胞外微環境。文中提出了制備各種組織來源的細胞外基質的吸收涂層的方法，這些組織包括心臟、骨骼肌、肝臟、心包、脂肪組織和大腦。取出來自豬和鼠源的組織并進行脫細胞化。使用各種洗滌劑對豬和鼠源的心臟組織、骨骼肌和肝臟以及豬源的大腦、脂肪和心包進行脫細胞化。將心臟、骨骼肌和肝臟組織切片至為 2mm厚，以去離子水漂洗，然后在PBS的十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌直至脫細胞化。用于脫細胞化的時間取決于組織類型。將大腦切成兩半，并在PBS的0.001% SDS中緩慢攪拌。將心包組織在PBS的1 % SDS中進行脫細胞化，將脂肪組織在2. 5mM脫氧膽酸鈉中進行脫細胞化，然后以脂肪酶進一步處理。液測試了其它脫細胞劑。然后將脫細胞化組織在去離子水中漂洗以保證洗滌劑的去除，然后凍干。除了脫細胞化的大腦和脂肪ECM，對脫細胞化ECM進行研磨以形成干燥粉末。然后將ECM使用胃蛋白酶在低酸性條件下進行消化以形成用作涂層的可溶形式，然后使用0. IM 乙酸稀釋至希望的濃度lmg/ml。使用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳證實在各個組織類型里肽碎片的復雜的混合物，其在不同組織各不相同。這證實了在脫細胞化ECM中存在組織特異性組分。這些涂層可以以如通常的單蛋白質涂層相同的方式應用于表面。通過在模擬體內細胞外基質微環境的組織特異性涂層上培養細胞，具有對存活和細胞形態更好的控制，且能增強分化。將鼠皮質神經元在大腦基質上培養并與聚-1-賴氨酸的標準涂層比較。鼠皮質神經元在大腦基質涂層上存活，且與標準涂層相比，保持它們的分枝狀形態更為持久。當骨骼成肌細胞在骨骼肌基質涂層上培養時，與標準的膠原涂層相比，還觀察到增加的分化百分率和增加的肌管寬度。最后，當接種于心臟基質涂層時，與通常的凝膠涂層相比，心肌來源的人胚胎干細胞顯示增加的組織形成和成熟，包括細胞間連接的形成。實施例10這里，研究文中所述的凝膠的使用，其中，所述凝膠是由天然脫細胞的骨骼肌ECM 形成。凝膠可以作為原位凝膠支架起作用，提供天然骨骼肌基質以提高在腿部損傷模型中的組織再生。其優勢在于，骨骼肌ECM具有與體內發現的基質相似的組分，且可以提供合適的用于組織工程和再生、細胞募集和細胞輸送的平臺。對豬骨骼肌進行脫細胞化。將組織切片為 2mm厚并以去離子水漂洗，然后在PBS 的十二烷基硫酸鈉(SDQ中攪拌直至脫細胞化。然后將脫細胞組織在去離子水中漂洗以保證洗滌劑的去除。將多塊脫細胞化組織切片并使用蘇木精和伊紅染色以保證細胞的去除。然后將脫細胞組織凍干并研磨形成精細粉末。然后將骨骼肌ECM在蛋白酶在低酸性條件下消化，然后通過加入氫氧化鈉和IOX PBS中和至生理或近生理PH。然后將中和的骨骼肌ECM溶液以PBS稀釋至希望的濃度6mg/ ml，并使其在37°C在96孔板內凝膠化。目視檢查材料確定了成功的凝膠化。將濃度6mg/ml溶解的天然骨骼肌ECM通過25G針成功注射到大鼠大腿股肌中，形成凝膠支架。凝膠作用在10 15min內發生。將肌肉和ECM切除，切片并使用蘇木精和伊紅染色以確認骨骼肌ECM在骨肌肉中成功的凝膠作用。骨骼肌ECM也可以用于輸送細胞，比如在ECM中的骨骼成肌細胞或其它肌肉相關細胞類型。文中展示和描述了本發明的優選實施方式，但這些實施方式只是以例子的方式提供，這對本領域的技術人員來說是顯而易見的。本領域的技術人員能夠在不脫離本發明的范圍內進行多種的變動、改變和替換。應當理解的是可以在實踐中采用文中描述的本發明的實施方式的各種替代對象。因此其包括所述權利要求所限定本發明的范圍，以及這些權利要求范圍內的方法和結構及它們的等價形式。
權利要求
1.一種組合物，其含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是可注射的。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物在溫度20°C 25°C時為形式，在溫度高于25°C時為凝膠形式。
4.如權利要求2所述的組合物，其中所述組合物配制成在心肌梗塞后注射到梗塞壁中。
5.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物保留天然的葡胺聚糖。
6.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物含有天然發生的將細胞募集到組合物中的因子。
7.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物還含有非天然發生的將細胞募集到組合物中的因子。
8.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物被設定為通過27G或更小的針輸送到組織中。
9.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物還含有細胞。
10.如權利要求9所述的組合物，其中所述細胞是多潛能或多能干細胞或心肌祖細胞。
11.如權利要求2所述的組合物，其中所述可注射的組合物還含有外源的治療制劑。
12.如權利要求2所述的組合物，其中所述可注射的組合物被設定為無損的傳導阻滯。
13.如權利要求2所述的組合物，其中所述可注射的組合物被配制為涂覆組織培養板以培養心肌細胞或其它心臟細胞祖細胞。
14.如權利要求1所述的組合物，其中所述組合物含有治療上可接受的成分。
15.一種制備含有脫細胞化心臟細胞外基質的組合物的方法，其包括(a)獲取具有細胞外基質組分和非細胞外基質組分的心臟組織樣品；(b)處理心臟組織樣品以去除非細胞外基質組分，從而得到脫細胞化的心臟細胞外基質；并(c)對脫細胞化心臟細胞外基質進行滅菌。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述方法還包括將脫細胞化心臟細胞外基質凍干和碾碎的步驟。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述方法還包括對脫細胞化心臟細胞外基質進行酶處理的步驟。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述脫細胞化心臟細胞外基質在低于7的PH中以胃蛋白酶進行消化。
19.如權利要求15所述的方法，其中所述方法還包括在鹽緩沖溶液中懸浮和中和所述脫細胞化心臟細胞外基質的步驟。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述溶液通過高規格針注射到心肌內。
21.如權利要求19所述的方法，其中所述溶液在體溫自發形成凝膠。
22.如權利要求19所述的方法，其中所述溶液還含有細胞或其它治療制劑。
23.如權利要求19所述的方法，其中所述溶液被置于組織培養板或孔內，在37°C孵育以形成凝膠。
24.一種在吸收基質上培養細胞的方法，其包括下列步驟(a)在組織培養裝置內提供含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質的溶液；(b)孵育所述組織培養裝置以吸收至少一部分所述脫細胞化細胞外基質到裝置上；(c)去除所述溶液；并(d)在吸收基質上培養細胞。
25.如權利要求M所述的方法，其中所述細胞是心肌細胞或心臟細胞祖細胞。
26.一種用于受治療者的心臟修復的治療方法，其包括注射或植入治療量的含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質的組合物。
27.一種用于受治療者的心臟修復的治療方法，其包括注射或植入含有心臟組織來源的脫細胞化細胞外基質的組合物。
28.一種組合物，其含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質。
29.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物是可注射的。
30.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物在室溫中為液體，在高于室溫的溫度中為凝膠形式。
31.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物保留天然的葡胺聚糖。
32.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物含有天然發生的將細胞募集到組合物中的因子。
33.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物含有非天然發生的將細胞募集到組合物中的因子。
34.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物還含有細胞。
35.如權利要求觀所述的組合物，其中所述細胞是干細胞。
36.如權利要求觀所述的組合物，其中所述組合物被配制為涂覆組織培養表面或支架以培養與骨骼肌修復相關的細胞。
37.一種制備含有脫細胞化骨骼肌細胞外基質的組合物的方法，其包括 從受治療者獲取具有細胞外基質組分和非細胞外基質組分的骨骼肌組織樣品； 處理骨骼肌組織樣品以去除非細胞外基質組分，從而得到脫細胞化骨骼肌細胞外基質、細胞外蛋白質和多糖；并對脫細胞化骨骼肌細胞外基質進行滅菌。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述方法還包括將脫細胞化骨骼肌細胞外基質凍干和碾碎的步驟。
39.如權利要求37所述的方法，其中所述方法還包括對脫細胞化骨骼肌細胞外基質進行酶處理、溶解或懸浮的步驟。
40.如權利要求37所述的方法，其中所述脫細胞化骨骼肌細胞外基質在低PH中以胃蛋白酶進行消化。
41.如權利要求37所述的方法，其中所述方法還包括將所述脫細胞化骨骼肌細胞外基質在溶液中懸浮并中和或改變PH的步驟。
42.如權利要求39所述的方法，其中所述溶液是PBS、鹽水或其它緩沖溶液，其設定為通過小直徑針注射到心肌中。
43.如權利要求39所述的方法，其中所述溶液在體溫形成凝膠。
44.如權利要求39所述的方法，其中所述溶液還含有可輸送到內部并在凝膠作用之前、之中或之后附著于以上材料的細胞、藥物、蛋白質或多糖。
45.如權利要求39所述的方法，其中所述溶液被置于組織培養板或孔內，在37°C或高于室溫的溫度中孵育，以形成用于細胞培養的凝膠。
46.一種在吸收基質上培養細胞的方法，其包括下述步驟(a)在組織培養裝置內提供含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質的溶液；(b)孵育所述組織培養板裝置；(c)去除所述溶液；并(d)在吸收基質上培養細胞。
47.如權利要求48所述的方法，其中所述細胞是骨骼肌成肌細胞、干細胞或其它與骨骼肌修復相關的細胞類型。
48.一種用于受治療者的骨骼肌修復的治療方法，其包括植入含有骨骼肌組織來源的脫細胞化細胞外基質的組合物。
全文摘要
文中描述的是含有脫細胞化心臟細胞外基質的組合物及其治療用途。本發明提供使用本發明的脫細胞化心臟細胞外基質用于治療、修復或再生受治療者中、優選人體中缺陷的、病態的、受損的或缺血的細胞、組織或器官的方法。本發明提供制備心肌細胞培養表面以及用吸收的脫細胞化心臟細胞外基質培養細胞的方法。
文檔編號A61P21/00GK102227225SQ200980147800
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年9月30日
發明者J·德夸奇, J·辛格林, K·克里斯特曼 申請人:加利福尼亞大學董事會