糖結(jié)合分子的制作方法

專利名稱：糖結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供包含或應(yīng)用糖結(jié)合分子的化合物，組合物，藥物和方法。更具體地的， 本發(fā)明提供治療由病原體，特別是微生物病原體，引起或促成的疾病和/或病癥的手段及篩選，鑒定，檢測，給糖加標(biāo)簽和/或標(biāo)記糖的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞表面富有復(fù)合糖并且很多病原體利用這些復(fù)合糖的末端糖在發(fā)病機(jī)制初期階段進(jìn)行細(xì)胞附著。以實(shí)例說明，病毒病原體流行性感冒和副流行性感冒都與哺乳動物細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合。唾液酸的識別由凝集素或凝集素樣分子和它們相應(yīng)的受體介導(dǎo)(3)。在大多數(shù)情況下，結(jié)合唾液酸的凝集素，其也包含幾種病毒糖蛋白和細(xì)菌毒素0，4)，以及哺乳動物凝集素超家族例如涎免凝集素( 和選凝素(6)，由于這些分子的多價性質(zhì)，它們以相對高親和力與它們的受體結(jié)合，因而減少了大多數(shù)蛋白質(zhì)-糖相互作用所關(guān)聯(lián)的固有的低親和力 (7,8) 0通常，這樣的凝集素結(jié)合單價和雙價唾液酸糖苷(sialoside)的締合常數(shù)(Ka)可達(dá)到IO4MA然而，由于它們的多價性，有些唾液酸結(jié)合凝集素可以和多價的細(xì)胞表面多糖相互作用以通過親和性(avidity)作用取得達(dá)到IO9M4的親和力。這些被增加的親和力已顯示出一部分原因是由于經(jīng)配體結(jié)合促成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包裝的改善，這與有利的結(jié)合能量學(xué)相關(guān)(9-11)。其中研究最多的多價凝集素-唾液酸相互作用中的一種是流感病毒三聚血凝素，與當(dāng)一個或兩個實(shí)體不在多價狀態(tài)時大約4X102M_i的親和力相比(12)，其能獲得至 IO8M-1的親和力。唾液酸酶，或神經(jīng)氨酸酶，催化從很多種復(fù)合糖而來的唾液酸的水解作用并常常是模塊式酶，包含粘附于蛋白質(zhì)催化核心的附屬組件。這些組件中有些已經(jīng)被識別為糖結(jié)合組件(CBMs). CBMs廣泛發(fā)現(xiàn)于糖苷水解酶中且是不連續(xù)的，非催化性組件，它們的存在目的主要是使母體酶靶向它們的底物通過增加底物表面酶的濃度來進(jìn)行有效水解(13)。在糖基水解酶結(jié)構(gòu)中組件可以是單個的，串聯(lián)的或多重的。研究表明當(dāng)和母體分子分離時，它們可以和它們特異性的多糖獨(dú)立性地結(jié)合，并且當(dāng)分離成串聯(lián)式時，也可以表現(xiàn)為協(xié)同方式(14，15)?；谥饕男蛄邢嗨菩裕壳癈BMs被歸類進(jìn)52個家族(http://WWW. cazy. org/fam/acc_CBM. html)。CBMs結(jié)構(gòu)中的細(xì)微差別能導(dǎo)致多種多樣的配體特異性，這使 CBMs成為一個用來闡明蛋白質(zhì)-糖機(jī)制具有吸引力的系統(tǒng)。一個題名為"Engineering Multivalent Sialic Acid Recognition using the CBM40 module from Vibrio cholerae Sialidase (利用來自霍亂弧菌唾液酸酶的 CBM40 組件來改造多價唾液酸識別)”的海報(公開發(fā)表于2008年5月17日見http://WWW. biochem. emory. edu/conferences/glycot/Images/GlycoTProgram-Posters. pdf)描述了通過多價性來研發(fā)對唾液酸具有增加的親和力的試劑。然而，該海報沒有公開這樣的試劑在治療由病原體引起的疾病和/或病癥中有任何應(yīng)用。已經(jīng)有充分的記載，即目前具有的流感抗病毒藥(特別是，羅氏(Roche)的達(dá)菲) 有遞增的耐藥性并且已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了尋找替代性方法來抵抗流感的需要。先前的研究已經(jīng)表明
4利用無毒性的凝集素，例如來自接骨木的SNA凝集素作為一種流感病毒抑制劑，但是這顯示與唾液酸微弱的結(jié)合力并有賴于兩個或三個不同的糖結(jié)構(gòu)部分的存在以識別和有效的抑制。最近利用一種稱為DAS181(FludaSe，由NexBio Inc.研發(fā))的重組唾液酸酶-融合蛋白質(zhì)的工作當(dāng)前正在作為這些備選的另外一種進(jìn)行研究。這種蛋白質(zhì)有效地在上皮細(xì)胞的表面去除了唾液酸，使得病毒無法和受體結(jié)合。然而，利用唾液酸酶來去除唾液酸，這同時可能暴露隱藏的受體，而它們可能作為其它病原體的受體。本發(fā)明目的在于提供有利于治療由病原體引起的疾病和/或病癥的化合物，組合物，藥物和方法，并消除與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即糖結(jié)合分子(CBMs)可用于抵抗和/或預(yù)防疾病或病癥，所述疾病或病癥的發(fā)生是病毒和/或細(xì)菌病原體感染所導(dǎo)致的。已知為了結(jié)合/粘附，建群或進(jìn)入細(xì)胞，一些病原體利用細(xì)胞表面上糖類的存在。以實(shí)例說明，呼吸道病原體，如屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或副粘病毒屬 (Paramyxovirus)家族的病毒，利用細(xì)胞表面糖類來結(jié)合和進(jìn)入多種哺乳動物組織的特異性細(xì)胞類型。類似地，細(xì)菌如屬于鏈球菌(^reptococcus)屬的細(xì)菌利用細(xì)胞表面糖類作為結(jié)合/粘附細(xì)胞和/或進(jìn)入某些細(xì)胞的手段。哺乳動物細(xì)胞表面包含大量不同類型的分子。特別地，哺乳動物細(xì)胞富有復(fù)合糖， 它們的末端糖是典型的唾液酸。于是，某些病原體已經(jīng)進(jìn)化形成利用細(xì)胞表面唾液酸的存在來結(jié)合/粘附那些細(xì)胞和/或進(jìn)入那些細(xì)胞。CBM組的成員通常發(fā)揮功能以將糖基水解酶例如唾液酸酶或神經(jīng)氨酸酶靶向或?qū)蛴谒鼈兊牡孜镆缘玫接行У乃庾饔谩Ｍ瑯拥?，CBMs對細(xì)胞表面糖類如，例如，唾液酸， 半乳糖，巖藻糖，N-乙酰葡糖胺，和血型抗原有親和力。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到對細(xì)胞表面糖顯示出親和力的化合物，可以被用來阻斷病原體結(jié)合，或識別該糖的能力，因而可能預(yù)防病原體建群和/或進(jìn)入細(xì)胞。于是發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過利用CBM對糖類的親和力，很有可能提供有利于治療一系列由那些病原體引起或促成的疾病和/或病癥的化合物，組合物，藥物和/或方法，那些病原體在病理機(jī)制過程中結(jié)合/粘附細(xì)胞表面糖類或用別的方法與細(xì)胞表面糖類締合。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種糖-結(jié)合組件(CBM)用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥。在第二方面中，本發(fā)明提供了糖-結(jié)合組件(CBM)在制備用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥的藥物中的應(yīng)用。除了以上所述之外，本發(fā)明的第三個方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含CBM，其用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的藥物組合物被配制成無菌藥物組合物并且合適的賦形劑， 載體或稀釋劑可以包括，舉例來說，水，鹽水，磷酸緩沖鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)硅石，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇(polyethylene glycon)，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟類，聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂等，或其組合。所述藥物組合物可以被配制成，舉例說明，適合用于口服，腸胃外或局部施用的形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到除了使用特異性結(jié)合糖類的各個或單一 CBMs，在此提供的化合物，組合物和藥物可以進(jìn)一步包括其它的CBMs，這些CBMs與備選(alternate)的糖結(jié)合或?qū)ζ浔憩F(xiàn)親和力，或?qū)ν环N糖顯示出不同的親和力。如上所述，除了提供用于治療或預(yù)防多樣的疾病和/或病癥的化合物，組合物和/ 或藥物，本發(fā)明同時也提供了用于治療受試者，特別是人受試者的方法，所述受試者正遭受或冒有風(fēng)險染上由病原體，特別是那些有能力結(jié)合細(xì)胞表面糖類的病原體，而引起或促成的疾病和/或病癥。于是本發(fā)明的第四個方面提供了一種治療或預(yù)防由病原體引起或促成的疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的糖結(jié)合組件(CBM)的步驟。本發(fā)明與已存在的治療由病原體(例如，病毒和/或細(xì)菌性呼吸道病原體)引起或促成的疾病和/或病癥的方法相比表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，所述現(xiàn)存的治療方法包括例如， 酶促去除細(xì)胞表面糖類。這種類型的策略可能把隱藏的受體暴露于其它的病原體使細(xì)胞易受感染。通過阻斷與細(xì)胞表面糖類的接近而不是把它們從細(xì)胞表面去除，這樣的問題可以避免，此外由于本文描述的CBMs與末端糖殘基(如，以唾液酸為例)結(jié)合，CBM可能不會引發(fā)免疫反應(yīng)。本文使用的術(shù)語“病原體”，應(yīng)該被理解為包含任何有結(jié)合，識別或以其它方法締合細(xì)胞表面糖能力的病原體，特別是那些已經(jīng)進(jìn)化形成利用或使用細(xì)胞表面糖的存在作為結(jié)合/粘附細(xì)胞與和/或進(jìn)入細(xì)胞的手段的病原體。同樣地，在一個實(shí)施方案中，術(shù)語 “病原體”包括微生物病原體并包括呼吸道病原體如屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae) 或副粘病毒科(Paramyxoviridae)家族的病毒，例如流行性感冒和人類副流行性感冒病毒，和屬于鏈球菌屬的細(xì)菌如肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)和/或流感嗜血菌(Hemophilus influenzae)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)—所有這些病原體具有結(jié)合哺乳動物細(xì)胞表面上糖類的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到哺乳動物細(xì)胞最頻繁地被本文描述的病原體類型建群/傳染的是上皮細(xì)胞，尤其是那些襯在黏膜管道 (mucosal tract)(例如，呼吸道上皮細(xì)胞)的上皮細(xì)胞。鑒于以上所述，應(yīng)用本文提供的化合物，組合物，藥物或方法，可被治療的或預(yù)防的疾病和/或病癥有很多且是多樣的并且應(yīng)該認(rèn)為是那些由任何一種本文提到的病原體引起或促成的疾病和/或病癥。因此，由病毒性呼吸道病原體例如，以流感病毒和/或副流感病毒為例，和細(xì)菌性病原體例如，以肺炎鏈球菌為例，引起或促成的疾病和/或病癥，可受益于本文提供的各種的化合物，組合物，藥物和/或方法的應(yīng)用。在這方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防疾病或病癥，如流行性感冒和病毒性和/或細(xì)菌性呼吸道疾病如哮吼， 肺炎和支氣管炎中的化合物，組合物，藥物和/或方法。鑒于以上所述，本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了用于治療由選自由流感病毒，副流感病毒，和肺炎鏈球菌組成的組的一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥的化合物，組合物，藥物和/或方法。術(shù)語“糖”應(yīng)該被理解為包括任何糖，尤其是那些存在于細(xì)胞表面的那些糖和特別是存在于哺乳動物細(xì)胞表面，例如哺乳動物上皮細(xì)胞表面的那些糖。必須同樣知道術(shù)語“糖”可以包括單糖單位，它還可以包括多糖，聚糖鏈和/或復(fù)合糖的糖結(jié)構(gòu)部分。同樣地， 術(shù)語“糖”可以包括，例如唾液酸，其是這樣的糖家族，所述糖具有九個碳骨架并且位于細(xì)胞表面的聚糖鏈末端(或遠(yuǎn)端)。唾液酸家族包括很多(大約50)可能由在C4，C5，C7，C8和 C9乙酰化，糖基化(glycolylation)，內(nèi)酯化和甲基化作用產(chǎn)生的衍生物。此外，發(fā)現(xiàn)唾液酸在α (2,3)或α (2,6)連接于Gal和fellNAc或在α (2,8)或α (2,9)連接于另外的唾液酸。由此，懂得盡管術(shù)語“唾液酸”被用在整個的說明書中，在此它應(yīng)被理解為包括其所有衍生物，類似物或變體(或是天然存在的或是人工合成的)以及二聚體，三聚體，寡聚體，聚合物或包含其的多聯(lián)體是很重要的。其它細(xì)胞表面糖類可以包括N-乙酰葡糖胺，半乳糖， N-乙酰半乳糖胺，巖藻糖，甘露糖，和在血型抗原這樣的表位中發(fā)現(xiàn)的它們的復(fù)合物。CBMs在自然界中廣泛存在并對各種各樣不同的糖類顯示出廣泛程度的親和力。到目前為止，基于它們初級序列相似性，CBMs已經(jīng)被歸類進(jìn)52個家族，并必須注意本發(fā)明可涉及到任何一種CBM。當(dāng)然，為了治療已知由病原體引起的疾病或病癥，該病原體和特定的細(xì)胞表面糖結(jié)合，與該糖結(jié)合的或?qū)υ撎秋@示出親和力的CBM，在治療或預(yù)防那種疾病或病癥上將是特別有效的。本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及那些顯示對唾液酸具有親和力或與之結(jié)合的CBM分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到與唾液酸結(jié)合的或?qū)ν僖核犸@示出親和力的CBMs，作為用于治療由在病理機(jī)制過程中結(jié)合或與唾液酸締合的病原體而引起或促成的疾病或病癥的化合物，或組合物，藥物或方法將是有效的。應(yīng)當(dāng)注意很多不同的CBMs可顯示針對特定的糖的親和力并且那種親和力的大小可能呈現(xiàn)不同。盡管如此，應(yīng)當(dāng)知道，在與細(xì)胞表面糖例如唾液酸結(jié)合的CBMs的情況下，任何一種對唾液酸顯示親和力的CBM應(yīng)該被認(rèn)為具有潛在有效性。其中，潛在有效的CBMs是屬于40家族和要不然可能作為“ CBM40 ”而被知曉的CBMs。包含在CBM40家族內(nèi)的是從霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringens)而來的 CBMs0來自于霍亂弧菌的CBM40展示對唾液酸相對高的親和力(Kd 30 μ M)，而來自于產(chǎn)氣莢膜梭菌的CBM40展示對唾液酸高毫摩爾的親和力除如上所述之外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雖然單個的CBM分子可以顯示對特定糖(如例如，唾液酸)的親和力，通過連接或組合兩個或更多的CBM分子，通過親和性，可以產(chǎn)生一種針對那種糖具有更高親和力的分子。因此，本發(fā)明還涉及多價的CBM分子或多肽，其在下文中稱為“CBM聚合物”，包含一個或多個通過某些途徑被聯(lián)結(jié)，連接或綴合在一起的CBMs (或單體)。于是，本發(fā)明的第五個方面提供了包含兩個或多個CBMs (CBM單體)的CBM聚合物。術(shù)語“聚合物”將會很容易地被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解為包括包含很多個連接單元的分子。在這點(diǎn)上，術(shù)語“CBM聚合物”可以被用來描述CBM-二聚體(也就是，兩個CBM 單體)，CBM-三聚體(三個CBM單體)，CBM四聚體(四個CBM單體)和更大的，CBM-寡聚體(五個或更多個CBM單體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到雖然生產(chǎn)包含相同重復(fù)性的CBM單體(例如，重復(fù)性的霍亂弧菌衍生的CBM40單體)的CBM聚合物可能是合乎需要的，產(chǎn)生包含很多不同CBM單體的CBM聚合物也是可以的，其中每一個單體有能力和不同的糖結(jié)合和/或每一個單體針對特定的糖顯示不同的親和力。類似地，包含和不同的細(xì)胞表面糖類結(jié)合或?qū)ζ滹@示親和力的CBM單體的CBM聚合物也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。象這樣，根據(jù)本發(fā)明的CBM聚合物可以包含對唾液酸具有親和力的CBM單體和對其它一些糖，例如甘露糖，半乳糖，巖藻糖， N-乙酰葡糖胺具有親和力或與之結(jié)合的CBM單體。如上所述，通過將CBM單體聯(lián)結(jié)，連接或綴合在一起，可以產(chǎn)生出更大的聚合物分子，其通過親和性，顯示對特定的糖或很多的糖類更強(qiáng)的親和力。因此，盡管一種特定的CBM 單體，例如來自霍亂弧菌的CBM40可對唾液酸顯示親和力，當(dāng)兩個或多個所述CBM40單體連接，聯(lián)結(jié)或綴合在一起時，產(chǎn)生出的聚合物可能顯示對唾液酸增強(qiáng)的親和力。因此，本發(fā)明和特別是用在本發(fā)明的第一，第二和第三及第四個方面中的術(shù)語 “CBM”應(yīng)該被理解為包括在本文描述的CBM聚合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到包含與不同的糖類結(jié)合或顯示與其有親和力的CBM 單體的CBM聚合物它自身可能與相同的糖類結(jié)合或與其有親和力。例如，如果CBM聚合物包含與兩種不同細(xì)胞表面糖類結(jié)合或與其有親和力的CBM單體，那么產(chǎn)生的CBM聚合物也可以與相同的兩種細(xì)胞表面糖類結(jié)合或顯示與其有親和力。包含很多不同的CBM單體和繼而與很多不同的糖類分子結(jié)合或顯示與其有親和力的CBM聚合物，可能在治療或預(yù)防由一種以上病原體引起或促成的疾病和/或病癥的組合物，化合物，藥物和/或方法中特別有效。例如，如果受試者遭受或有傾向于感染由兩種不同病原體引起或促成的至少兩種疾病或病癥(其中每一種病原體能與不同細(xì)胞表面糖類結(jié)合(作為建群和/或進(jìn)入細(xì)胞的方式))，包含識別，結(jié)合或以別的方式與這些糖類締合的CBM單體的CBM聚合物在治療或預(yù)防所述疾病和/或病癥中可以是有益的。作為選擇性地，由兩種或多種病原體引起的疾病和/或病癥可以通過使用利用相關(guān)的單體CBMs的化合物或組合物，藥物或方法進(jìn)行治療。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到有很多種可以連接氨基酸，蛋白質(zhì)和/或肽的方法。 在一個實(shí)施方案中，氨基酸，肽和/或蛋白質(zhì)可以通過化學(xué)手段和/或通過克隆和/或PCR 技術(shù)被聯(lián)結(jié)、連接或綴合。以實(shí)例說明，編碼相關(guān)的CBM (s)的核苷酸序列可以通過PCR來擴(kuò)增和被修飾以致其一個或多個的拷貝可以被連接在一起或與其它CBM編碼核苷酸序列連接。另外，CBM核苷酸序列可以被進(jìn)一步修飾以在它們的3’端和/或5’端包含編碼含有一個或多個氨基酸殘基的接頭結(jié)構(gòu)部分的序列。CBM聚合物(或多價的CBMs)還可以通過應(yīng)用被修飾過以包含，例如，寡聚化結(jié)構(gòu)域的CBM單體而產(chǎn)生。具有這些結(jié)構(gòu)域的分子可能自己組裝而形成寡聚體的結(jié)構(gòu)。在一個實(shí)施方案中，寡聚化結(jié)構(gòu)域可以從例如，細(xì)菌種類比如已知編碼一種三聚化結(jié)構(gòu)域的銅綠假單胞菌而得到。基于PCR的技術(shù)可以用來以這種方法修飾CBM分子。擴(kuò)增的和任選被修飾/連接的CBM序列然后可以被克隆進(jìn)合適的載體中用以表達(dá)和純化產(chǎn)生出的CBM或CBM聚合物。重組的CBM單體(例如編碼寡聚化結(jié)構(gòu)域的那些)或 CBM聚合物可以在，例如大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)。鑒于以上所述，本發(fā)明的第六個方面可能提供了一種生產(chǎn)CBM聚合物的方法，所述方法包括以下步驟
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(a)連接編碼CBM的核苷酸序列；和(b)表達(dá)被連接的CBM核苷酸序列生產(chǎn)CBM聚合物。如上所述，本發(fā)明提供的CBM聚合物可包含通過某些形式的接頭結(jié)構(gòu)部分連接的 CBM單體，所述接頭結(jié)構(gòu)部分可以以一種或多種氨基酸的形式存在。雖然包含接頭結(jié)構(gòu)部分的氨基酸確切的數(shù)目可能會變動，典型地，接頭結(jié)構(gòu)部分將包含從1到大約30個氨基酸的任何長度。生產(chǎn)CBM聚合物的備選手段是通過分子生物技術(shù)，將寡聚化結(jié)構(gòu)域與CBM連接。 例如，發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌pseudaminidase中的三聚化結(jié)構(gòu)域(殘基335-438，Xu, G， Ryan, C. , Kiefel, Μ. J. , Wilson, J. C.和 Taylor，G. L. (2009) J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)386 (3) ,828-840)可以通過接頭肽和一個或多個CBM(s)連接。表達(dá)單一構(gòu)建體會產(chǎn)生通過親和性作用而具有增加的親和力的三聚體。類似地，來自人血管舒張劑刺激的磷蛋白的四聚化結(jié)構(gòu)域(Kuhnel K.，等PNAS 2004，101，17027-17032)，即一種形成四聚體的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的45-殘基肽，可以通過適合的接頭，與一個或多個CBM(S)連接，以形成例如通過親和性作用而具有增加的親和力的四聚體寡聚體。本發(fā)明的第七個方面提供了篩選或鑒定在治療疾病和/或病癥中潛在有效的 CBMs的方法，該方法包括以下步驟(i)使CBM或CBM聚合物與細(xì)胞在病原體存在的情況下接觸，該病原體已知會結(jié)合或感染所述細(xì)胞；(ii)鑒定病原體已經(jīng)結(jié)合或病原體已經(jīng)感染的那些細(xì)胞；和(iii)將結(jié)果與沒有加入CBM或CBM聚合物的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諟y定進(jìn)行比較；其中相對于對照測定，病原體已經(jīng)結(jié)合的細(xì)胞數(shù)目的減少或病原體已經(jīng)感染的細(xì)胞數(shù)目的減少，指示CBM或CBM聚合物在治療由該病原體引起或?qū)е碌募膊『?或病癥中是潛在有效的。與CBM/CBM聚合物接觸的細(xì)胞可以采取在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞單層，或獲自受試者的活組織檢查組織或獲自受試者的刮削物(scraping)的形式。另外，細(xì)胞可以存在于動物，如嚙齒類動物(小鼠，大鼠，豚鼠，兔子等)中。當(dāng)動物在本發(fā)明第七個方面提供的方法中被使用時，可以向所述動物施用待測試的CBM或CBM聚合物并且同時(或之前或之后)感染病原體(例如呼吸道病原體)。此外，標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諟y定可以采取這樣的動物形式，其已經(jīng)被病原體感染但還未被施用CBM或CBM聚合物。當(dāng)使用動物時，為了確定CBM或CBM聚合物在治療或預(yù)防由一種特定的病原體引起或促成的疾病中是否具有潛在有效性，完成由第七個方面提供的方法后，細(xì)胞可以從動物中取得并檢查病原體是否已經(jīng)結(jié)合所述細(xì)胞或感染所述細(xì)胞。另外的或作為選擇性的， 可以觀察動物疾病的跡象或癥狀。當(dāng)與經(jīng)歷對照或標(biāo)準(zhǔn)方案的動物作比較時，癥狀嚴(yán)重性的降低可以說明施用于該動物的CBM或CBM聚合物在治療由該病原體引起或促成的疾病和 /或病癥中可能是有效的。除了如上所述，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種各樣本文所述的CBMs和CBM聚合物的差異結(jié)合能力可以被利用來提供一些篩選，鑒定，檢測，標(biāo)記糖和/或給糖加標(biāo)簽的手段。因此，在第八方面，本發(fā)明提供了在樣品中篩選，鑒定，檢測，標(biāo)記糖和/或給糖加標(biāo)簽的方法，所述方法包含以下步驟
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(a)使樣品與本文所述的CBM或CBM聚合物在適合于允許CBM/CBM聚合物與糖結(jié)合的條件下接觸，所述CBM/CBM聚合物結(jié)合所述糖或?qū)ζ渚哂杏H和力；(b)去除未結(jié)合的CBM或CBM聚合物；和(c)檢測結(jié)合的CBM或CBM聚合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到由于CBMs顯示對某些糖類一定程度的特異性，在步驟(c)中檢測到的CBM或CBM聚合物將作為所述糖在樣品中存在的標(biāo)示。必須知道術(shù)語“樣品”包含生物學(xué)樣品例如體液(尿液，血液，血漿，血清，汗液，唾液，精液等)和其它來源(如，例如食物，飲料和水源(河流，海洋))的樣品。的確，可以使用幾乎任何被認(rèn)為含有糖類并且CBM或CBM聚合物可以加入其中的樣品。在一個實(shí)施方案中，樣品包括細(xì)胞，優(yōu)選的是哺乳動物細(xì)胞，其由組織活組織檢查，刮削或分泌而來。用這種方法，本發(fā)明的第八方面提供的方法可以用于檢測樣品中某些細(xì)胞的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地意識到因?yàn)榧?xì)胞在它們表面表達(dá)一系列的糖類，通過使樣品與對已知在某種細(xì)胞類型上表達(dá)的糖有特異性的CBM接觸并檢測CBM是否和樣品中的任何細(xì)胞已經(jīng)結(jié)合，可以在異種的細(xì)胞群中識別某些細(xì)胞的存在。根據(jù)本發(fā)明，像FACS 這樣的技術(shù)可以用于鑒定用CBMs或CBM聚合物(任選地被修飾以包括可檢測的標(biāo)簽)標(biāo)記或加標(biāo)簽的細(xì)胞。另外，這類技術(shù)可用于診斷疾病或其它病癥。例如，與已知表達(dá)在癌細(xì)胞上的糖類結(jié)合的或?qū)ζ渚哂杏H和力的CBMs或CBM聚合物可以用于鑒定或檢測樣品中癌細(xì)胞的存在。為了去除未結(jié)合的CBM或CBM聚合物，由上述步驟(a)產(chǎn)生的樣品CBM/CBM聚合物復(fù)合物可以用合適的緩沖液進(jìn)行一個或多個清洗步驟。在一個實(shí)施方案中，樣品可以被固定在一種合適的基底，如例如，塑料，玻璃，瓊脂糖，硝酸纖維素，紙等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到由本發(fā)明提供的CBMs或CBM聚合物可以再被修飾以包括一種或多種可檢測的標(biāo)簽或標(biāo)記。這樣，修飾或綴合CBM或CBM聚合物以包括能夠通過比色化學(xué)發(fā)光反應(yīng)報告一定水平的酶可以檢測出被結(jié)合的CBM或CBM聚合物。這樣的酶可以包括但不限于辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AlkP)。另外地，或替代性地，本文提供的CBM或CBM聚合物可以綴合于熒光分子，如例如GFP和熒光團(tuán)，如FITC，羅丹明或德克薩斯紅(Texas Red)。其它類型的可以綴合于本文描述的CBM或CBM聚合物的分子可以包括放射性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)部分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的CBM聚合物或CBMs可以進(jìn)一步被修飾以包括將被遞送到細(xì)胞中的例如抗體，小的有機(jī)分子，核酸，藥物或毒素這樣的結(jié)構(gòu)部分。通過識別那些在細(xì)胞表面表達(dá)的糖，結(jié)合一種或多種被識別的糖類或?qū)ζ溆杏H和力的CBM或CBM 聚合物可以用于把上面列出類型的結(jié)構(gòu)部分遞送于那種細(xì)胞。發(fā)明的詳述現(xiàn)在將用以下附圖作為參考來詳細(xì)描述本發(fā)明，附圖顯示

圖1 (A)顯示側(cè)鄰凝集素樣糖結(jié)合組件(CBMs)的中心催化結(jié)構(gòu)域的霍亂弧菌唾液酸酶示意圖。唾液酸識別CBM，CBM40位于圖右側(cè)。(B)此研究中構(gòu)建的構(gòu)建體的示意圖。圖2 在ITC研究中使用的唾液酸糖苷。(A)3’唾液乳糖，(B)6 ‘唾液乳糖，(C)雙唾液乳糖(disialylactose) (DSL)，(D)雙唾液酸-乳-N-四糖
10(disialyl-lacto-N-tetraose)(DSLNT)。圖3 霍亂弧菌CBM40和3’唾液乳糖復(fù)合的晶體結(jié)構(gòu)。(A)配體與CBM相互作用，其中氫鍵用虛線表示。σ-a加重的!7O-Fc電子密度圖譜(sigma-a weighted Fo-Fc electron density map)在3σ作圖。(B)晶體結(jié)構(gòu)中不對稱單元的三個CBM40組件之間的關(guān)系。圖4:等溫的滴定量熱等溫線顯示各種配體與分離的CBM40的結(jié)合。(A) 3 ‘ SL, (B)6' SL, (C)DSL, (D)DSLNT。圖5 等溫的滴定量熱等溫線顯示3 ‘ SL與各種CBM40構(gòu)建體的結(jié)合。 (A)2CBM(5), (B)2CBM(10), (C)2CBM(15), (D)3CBM(5), (E)3CBM(10), (F)4CBM ⑶。圖6 表面等離子共振(SPR)感應(yīng)圖顯示CBM40組件與固定的3'唾液乳糖受體的結(jié)合。(A) 1CBM, (B)2CBM(5), (C)2CBM(10), (D)2CBM(15), (E)3CBM(5), (F)3CBM(10), (G) 4CBM(5)。圖7 由在不同溫度的SPR實(shí)驗(yàn)得來的Van，t Hoff圖。圖8 噬菌斑測定顯示多價的CBM40多肽能降低流感病毒在體外的結(jié)合。圖9 雞紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集試驗(yàn)，用(a)疫苗X31，單體的和多價的CBM40，和(b) 有和沒有來自疫苗毒株X31 A流感病毒的存在。圖10 哺乳動物MDCK細(xì)胞通過3CBM(5)，4CBM(5)和CBMTD多肽保護(hù)抵抗流感病毒 A/Udorn/72(H3N2)。圖11 (A)GFP-3CBM40 (0. 5mg/ml)與 MDCK 細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合；(B)MDCK 細(xì)胞與 GFP-3CBM40溫育，用Udorn病毒感染后72小時的相差顯微圖片。組(a)只有CBM(0. 5mg/ ml), (b)-(f) 0· 5，0· 1，0· 05，0· 01 和 0. 005mg/ml CBM 與 Udorn 病毒存在時，(g)只有 Udorn 病毒，和(h)未被感染的細(xì)胞。圖12 在被A型流感病毒感染的BALB/c小鼠中3CBM40對肺病毒滴度㈧，和小鼠體重⑶的影響。被Hmi感染(IO3病毒pfu)前一天，感染當(dāng)天或感染后1或3天，小鼠被施用3CBM40(黑色條)或BSA(白色條)。在感染后6天，將數(shù)據(jù)采集于每組4只小鼠。病毒對照組(第O天)以在條形圖中的PBS顯示。材料和方法重組DNA技術(shù)將編碼40CBM家族的霍亂弧菌唾液酸酶/神經(jīng)氨酸酶(VCNA)，殘基25-216的DNA 片段使用基于表2中列出的序列的寡核苷酸引物對IF和IR從含有nanH基因(16)的構(gòu)建體pET30b+通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的57!3bp DNA片段用Nco I和Bio I進(jìn)行消化并克隆進(jìn)入pEHISTEV載體(pET30的改造變體，其具有被煙草蝕斑病毒(TEV)蛋白酶裂解的 N-末端6x His標(biāo)簽)(Dr H. Liu，未發(fā)表的研究)，用相同的酶進(jìn)行消化并用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a。將構(gòu)建體，ρICBM用 DNA 測序證實(shí)(University of Dundee Sequencing Service, UK)。將編碼霍亂弧菌CBM40的DNA片段通過使用不同的引物對在5’-和3’-末端修飾以結(jié)合不同的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。這樣操作以允許DNA片段的個體拷貝連接以產(chǎn)生串聯(lián)形式的2，3和4個拷貝(圖1B)。此外，引物對允許5，10或15個密碼子的插入以代表連接個體組件的氨基酸長度。所有這些修飾使用在表2中列出的不同的引物對以及plCBM作為模板，通過PCR擴(kuò)增而獲得。將產(chǎn)生的片段克隆進(jìn)經(jīng)過適當(dāng)消化的pEHISTEV載體直到預(yù)想的組件數(shù)量達(dá)到為止。將這些進(jìn)行標(biāo)記，即p2CBM(5)，p2CBM(10)，p2CBM(15)，p3CBM(5)， 和p3CBM(10)，代表2和3個重復(fù)的唾液酸-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其接頭具有在括弧內(nèi)所示數(shù)量的氨基酸。對于p4CBM(5)，將HindIII-EcoRI-修飾過的和EcoRI-XhoI-修飾過的DNA片段先克隆進(jìn)經(jīng)合適的酶消化過的pET17b，之后組裝成在pEHISTEV中的最終基因。所有的構(gòu)建體都在大腸桿菌Dffia中增殖。陽性克隆通過DNA測序進(jìn)行證實(shí)，之后將其轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌 BL21 (DE3) (1CBM, 2CBM (5), 3CBM (5), 3CBM (10), 4CBM (5))和大腸桿菌 BL21 (DE3) Gold(分別地2CBM(10)，和2CBM(15))進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。蛋白質(zhì)生產(chǎn)與純化所有構(gòu)建體的生長和表達(dá)如對VCNA(16)所作的描述。簡要地，將IL含有30 μ g/ ml卡那霉素的Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基等分部分用單個集落接種并在37°C生長直到培養(yǎng)物的光密度在600nm達(dá)到0. 4-0. 6。細(xì)胞在42°C水浴中接受熱休克20分鐘并用ImM IPTG 誘導(dǎo)，之后冷卻至25°C，并且在相同的溫度被擱置搖動過夜。通過離心(8000xg，4°C)收取細(xì)胞，并將沉淀物冷凍于-20°C直到需要使用。所有的多肽如前所描述(16)通過鎳親和性層析法進(jìn)行純化。將樣品用SDS PAGE 進(jìn)行分析，將部分純化的多肽透析進(jìn)TEV蛋白酶裂解緩沖液(PBS，0.3M NaCiamM DTT, 0. 5mM EDTA, 20mM咪唑)并用TEV蛋白酶過夜消化。接著，將每個多肽用PBS，0. 3M NaCl, IOmM咪唑緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步透析，之后進(jìn)行經(jīng)過鎳填充的柱子以去除未消化的加His-標(biāo)簽的多肽的第二輪純化。在應(yīng)用前，將未加標(biāo)簽的多肽樣品在IOmM HEPES緩沖液，pH 7.4， 0. 15M NaCl中大量透析和濃縮結(jié)晶化和結(jié)構(gòu)確定將單個的霍亂弧菌CBM40的晶體在作為沉淀劑的0. IM MOPS pH6. 5，1. IM硫酸鋰，0.6M硫酸銨中，用就座點(diǎn)滴法(sitting drop method)獲得。通過把晶體先轉(zhuǎn)入10% (ν/ν)甘油沉淀劑混合物中接著置于20% (ν/ν)甘油-沉淀劑中進(jìn)行晶體低溫保護(hù)。在 ESRF的光束線(beamline)BM-14上收集延伸到2.5人的衍射數(shù)據(jù)。將結(jié)構(gòu)用分子轉(zhuǎn)換程序(molecular replacement program)PHASER(18)進(jìn)行解析,在不對稱單元中發(fā)現(xiàn)有三個 CBM40單體。提純(refinement)通過使用具有用于建立模型的COOTQ0)的REFMAC(19)來進(jìn)行。數(shù)據(jù)收集和提純統(tǒng)計信息在表3中顯示。等溫的滴定量熱法(ITC)ITC 實(shí)驗(yàn)用 1. 4ml 細(xì)胞體積在Microcal Inc. (Northampton，·)的 VP-ITC微熱量計(microcalorimeter)上操作。除非另作說明，所有的ITC滴定在25°C，在含有0. 15M NaCl 的IOmM HEPES緩沖液pH7. 4中進(jìn)行。為了表征分離出的CBM40 (ICBM)，使用以下的配體從 Dextra Labs (Reading，UK)購買的3'唾液乳糖(3 ‘ SL)，6 ‘唾液乳糖，(6 ‘ SL)，和雙唾液酸-乳-N-四糖(DSLNT)，和從Sigma-Aldrich, UK購買的雙唾液乳糖(DSL)(圖2)。將凍干的唾液酸糖苷配體在脫氣的，用于肽構(gòu)建體透析的過濾的緩沖液中再次懸浮。對于其它的所有多肽構(gòu)建體，將3'唾液乳糖在全程作為配體使用。分別用對ICBM(384101^(^-1), 2CBM 構(gòu)建體(758601^0^1)，3CBM 構(gòu)建體(113790M_1cm_1)和 4CBM(5) (151720M_1cm_1)計算出的摩爾消光系數(shù)在A28tl確定蛋白質(zhì)濃度。CBM40多肽的濃度為0. 007-0. 084mM,并且唾液酸糖苷的濃度為0.45-2. 14mM。將唾液酸糖苷的等分試樣(10 μ 1，除非另作說明)滴定進(jìn)每種多肽溶液。將稀釋液的熱量從結(jié)合等溫數(shù)據(jù)減去，之后將數(shù)據(jù)使用來自MicroCal Origin軟件的單結(jié)合位點(diǎn)模型，通過非線性回歸分析進(jìn)行擬合。表面等離子共振(SPR)結(jié)合動力學(xué)由SI3R通過使用BIAC0RE 3000生物傳感儀器(GE Biosystems)進(jìn)行確定。在使用之前，使鏈霉抗生物素蛋白(SA)包被的生物傳感器芯片進(jìn)入儀器中并用3次連續(xù)1分鐘注射50mM NaOH中的IM NaCl預(yù)調(diào)節(jié)。在將生物素化的3 ‘唾液乳糖-PAA(Glycotecti)在HBS-P(IOmM HEPES pH 7. 4,0. 15M NaCl和0. 005%表面活性劑P20) 中稀釋到1 μ g/ml之后，將其注射在芯片中4個流動細(xì)胞(flow cell)的3個上。針對每種細(xì)胞的配體，典型的固定水平大約為500RU。還制備用來減少體效應(yīng)(bulk effect)和與鏈霉抗生物素蛋白的非特異性相互作用的參考表面。運(yùn)行緩沖液由IOmM HEPES pH 7. 4組成，流速為100μ 1/min。每種肽構(gòu)建體和固定的3'唾液乳糖的相互作用分析在運(yùn)行緩沖液中，在15，25 和35°C進(jìn)行。將純化的肽構(gòu)建體稀釋到HBS-P中以產(chǎn)生一系列濃度對于1CBM，0. 625 μ Μ, 1. 25 μ M 2. 5 μ Μ, 5 μ Μ, 10 μ M ；對于 2CBM 構(gòu)建體 20ηΜ，125ηΜ, 250ηΜ, 500ηΜ 和 IOOOnM ；對于 3CBM 構(gòu)建體 InM, 5ηΜ, 20ηΜ, 62. 5ηΜ 和 125ηΜ,并且對于 4CBM 0. 18ηΜ, 0. 5ηΜ, 1. 6ηΜ 5ηΜ 和 15ηΜ。將所有分析物以30 μ 1/min注射在流動細(xì)胞表面。分析物從表面的解離在3_5分鐘內(nèi)在相同流速的運(yùn)行緩沖液中實(shí)現(xiàn)。以30 μ 1/min，兩次進(jìn)行IOmM甘氨酸-HCl pH 2. 5的連續(xù)30秒注射來再生表面。將通過平衡解離常數(shù)(Kd)所述的親和力，通過用BIAevaluation 軟件(BIAcore)，設(shè)定Langmuird 1)結(jié)合，擬合于動力學(xué)同步ka/kd模型而全面進(jìn)行確定。不同的CBM多肽構(gòu)建體與生物素?；? ‘唾液乳糖-PAA相互作用的自由能變化通過使用由對于每一溫度的動力學(xué)速率常數(shù)的比率提供的平衡解離常數(shù)來確定。InK11相對于1/T的van’ t Hoff圖從斜率產(chǎn)生關(guān)于Δ H/R的值并從y截距產(chǎn)生關(guān)于-Δ S/R的值。噬菌斑測定將病毒噬菌斑測定用來證實(shí)在A型流感病毒存在時，多價的CBM40多肽結(jié)合的效果。在6-孔板內(nèi)的匯合(IO6細(xì)胞)MDCK單層用無血清的DMEM清洗兩遍，用Iml 2CBM40或 3CBM40溶液(10mg/ml, 10-倍系列稀釋于無血清的DMEM中)，在37°C (+5% CO2)溫育1小時。無血清的DMEM單獨(dú)用于平行的“模擬”溫育。CBM40試劑隨后被去除，并且單層細(xì)胞用 80PFU的A型流感病毒/Udorn/72 [H3N2]在37°C (+5% C02)接種1小時。在病毒吸附后， 去除接種物，用補(bǔ)充有2 μ g/ml胰蛋白酶和1% (w/v)瓊脂糖的DMEM中的IOmM HEPES(pH 7.4)覆蓋于細(xì)胞上。將倒置的平板在37°C (+5% C02)溫育2_3天。噬菌斑通過把單層細(xì)胞固定在5%甲醛中和用0. 結(jié)晶紫著色而被顯現(xiàn)。血細(xì)胞凝集測定將雞紅細(xì)胞在Alsever’ s溶液中離心并用PBS至少清洗4次。細(xì)胞最后在 (v/v) PBS中再次懸浮。將疫苗毒株Χ31(具有細(xì)胞表面Hong Kong/68HA和NA)用在PBS中的1 4000貯存液的2-倍系列稀釋物滴定在96-孔板內(nèi)，其中已經(jīng)添加了等體積的紅細(xì)胞。將板在室溫溫育至少30分鐘。將終點(diǎn)計算為觀察到血細(xì)胞凝集反應(yīng)的最低病毒濃度。 將CBMs適當(dāng)稀釋并滴定進(jìn)已被加入相同體積細(xì)胞的PBS中。還計算了 CBM與細(xì)胞結(jié)合的終點(diǎn)。隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定當(dāng)與雞RBCs溫育時固定濃度的ICBM與滴定病毒相對于只有病毒的效果
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用寡聚化結(jié)構(gòu)域研發(fā)CBM. TD將包含1CBM40的pEHISTEV構(gòu)建體，plCBM進(jìn)行修飾以在C-末端包含寡聚化結(jié)構(gòu)域從而當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時，允許多肽自組裝成寡聚體結(jié)構(gòu)。為此，使用來自銅綠假單胞菌pseudominidase的三聚化結(jié)構(gòu)域(Xu等，2009)。將編碼殘基333-440的DNA片段使用含有BamHI和BioI的引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并將其連接于之前被同樣的酶消化過的plCNM。 將其隨后用與所有其他CBM40構(gòu)建體生長和表達(dá)相似的條件轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3) Gold細(xì)胞中。寡聚體的純化使用鎳親和力和TEV蛋白酶水解進(jìn)行，并且在凝膠過濾后顯示大約為IOOkDa的分子量(數(shù)據(jù)未顯示)。研發(fā)GFP-3CBM40以監(jiān)測細(xì)胞表面被CBM40結(jié)合的唾液酸為構(gòu)建GFP-融合的3CBM40片段，將3CBM40片段從p3CBM(5)用NcoI-XhoI消化， 并插入類似地消化過的pEHISTEV載體，其包含這樣的基因，所述基因編碼在N-末端His 標(biāo)簽下游的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP) (Liu等2009 ；Connaris等，2009)。針對MDCK細(xì)胞測試這個構(gòu)建體以確定CBM40是否與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合。為此，將96-孔板中的 MDCK細(xì)胞的匯合單層在37°C與不同濃度的GFP-3CBM溫育1小時，之后加入流感毒株A/ Udorn/72 (H3N2)病毒(moi = 0. 002)在相同溫度進(jìn)一步溫育1小時。去除混合物并加入不含F(xiàn)CS的DMEM，將板溫育72小時。小鼠研究劑量尋找實(shí)驗(yàn)為了評估CBM多肽作為抵抗流感病毒的抗病毒劑的預(yù)防性/治療性潛力，進(jìn)行初步研究以確定CBM40在小鼠中施用所需要的劑量。這些研究在愛丁堡傳染病中心的用于流感研究的動物試驗(yàn)裝置中進(jìn)行。為此，根據(jù)最初用于體外尋找的劑量，將5-6周的BALB/c 小鼠用于劑量尋找實(shí)驗(yàn)以測試不利的反應(yīng)。將小鼠用在40 μ 1 PBS中50 μ g禾Π 40 μ 1 PBS 中500 μ g的3CBM40多肽經(jīng)鼻內(nèi)給藥。將PBS和BSA作為對照。從第2天開始，小鼠每天被監(jiān)測臨床跡象和測體重。在第5天小鼠被處死(cull)(除了兩個被施用500 μ g的小鼠， 其等到14天處死)。CBM40抗A型流感病毒的效果為了評估CBM40抵抗A型流感病毒/WSN/33(H1N1)的預(yù)防性和治療性效果，在用 3CBM40和病毒處理前，用氟烷氧混合物對BALB/c小鼠輕度麻醉。用于實(shí)驗(yàn)的CBM40劑量為在PBS(40yl)中500μ g的3CBM40，其經(jīng)鼻內(nèi)只一次遞送。BSA和PBS用來作為對照。從鼻內(nèi)感染103A/WSN/33pfu的前1天或當(dāng)天，或之后+1或+3天開始，小鼠用CBM40或安慰劑治療。每組的病毒滴度在感染后6天被確定，在此情況下，小鼠被處死，肺在PBS中進(jìn)行勻漿化以提取病毒用于噬菌斑測定。被處死的小鼠體重也進(jìn)行測量以確定體重減少。結(jié)果分離的CBM40組件的結(jié)構(gòu)將編碼從霍亂弧菌唾液酸酶而來的唾液酸結(jié)合組件CBM40的基因片段亞克隆進(jìn) pEHISTEV并在大腸桿菌中表達(dá)以產(chǎn)生繼而被純化用于結(jié)合和結(jié)構(gòu)研究的1CBM。起初，ICBM 盡管表達(dá)水平很高卻不溶解，但是在對數(shù)生長期過程中把培養(yǎng)物在42°C熱休克提高了這種 CBM的可溶性以致于持續(xù)性地生產(chǎn)達(dá)到每升50-70毫克數(shù)量?；魜y弧菌CBM40的晶體在3 ‘ 唾液乳糖的存在下生長。不對稱單元包含三個CBM40單體，每個單體對配體的所有三個糖結(jié)構(gòu)部分有明顯的電子密度(圖3A)。只有唾液酸和所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，并且這些相互作用與那些由僅與完整的霍亂弧菌唾液酸酶復(fù)合的唾液酸產(chǎn)生的相互作用是相同的。在晶體的不對稱單元中有三種CBM40組件，其中單體A和B包埋大約750人2的界面(圖3B)。唾液酸糖苷的確定和霍亂弧菌CBM40的連接特異性研究用ICBM進(jìn)行以確定它對不同的單價-和雙價-唾液酸糖苷的特異性。應(yīng)用 ITC，對每種相互作用直接測量結(jié)合常數(shù)Ka及焓(ΔΗ)和熵(AS)的變化，化學(xué)計量法(n， 結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量)用數(shù)據(jù)對以上所描述的單位點(diǎn)結(jié)合模型(one-site binding model)的非線性最小二乘方擬合來確定。從稀釋物校正的結(jié)合等溫線的熱量得到的數(shù)據(jù)證實(shí)ICBM 對于α-唾液酸的偏好(圖4)，顯示對α (2,3), α (2,6)和α 0，8)-連接的唾液酸糖苷廣度的結(jié)合特異性。所有被測試的唾液酸糖苷展示相似的親和力，其解離常數(shù)Kd范圍在 10-19 μ M之間(在25°C)(表4，圖4)。雙唾液酸糖苷，DSLNT和DSL與單價的配體相比對唾液酸顯示1. 5-2倍更高的親和力。與DSL(-12. 5kcal/mol)相比，DSLNT顯示出更大的焓變化，具有Δ H值為-24kcal/m0l。當(dāng)對于結(jié)合DSLNT和DSL比較化學(xué)計量法時，觀察到相應(yīng)的η值為0. 57和0. 92，說明對于DSLNT，需要有兩個ICBM的分子與DSLNT的一個分子結(jié)合，而對于DSL，是1 1的相互作用。這里的差別不僅是由于存在的唾液酸結(jié)構(gòu)部分的數(shù)量，還由于它們在唾液酸糖苷內(nèi)的位置所導(dǎo)致。結(jié)構(gòu)上，DSLNT是分支雙價唾液酸糖苷，不像 DSL具有兩個以線性方式連接在一起的唾液酸結(jié)構(gòu)部分，以致只有末端唾液酸結(jié)構(gòu)部分被識別(圖2)。這樣的結(jié)果說明了 DSLNT的ΔΗ值大約為3'唾液乳糖，6'唾液乳糖和DSL 各自結(jié)合焓的總和，其具有一個化學(xué)計量法。多價的唾液酸特異性CBM40多肽的改造我們想研究如果相同拷貝的ICBM連接在一起以產(chǎn)生一種多價的種類，唾液酸結(jié)合是否會發(fā)生。為此，編碼CBM40的基因拷貝用DNA接頭(顯示至多15個氨基酸)聯(lián)接在一起以產(chǎn)生2，3，和4個組件串聯(lián)的多肽，其分別被指定為2CBM (5)，2CBM (10)，2CBM (15)， 3CBM⑶，3CBM(10)和4CBM(5)(括弧內(nèi)的數(shù)字指示接頭氨基酸的數(shù)量)(圖1B)。這些基因構(gòu)建體的表達(dá)在大腸桿菌中進(jìn)行并且全都顯示不可溶性直到培養(yǎng)物像針對分離的ICBM 接受熱休克處理。用鎳親和力層析法純化后，對所有肽構(gòu)建體的SDS PAGE分析顯示單體的分子量對于1CBM, 2CBM, 3CBM和4CBM構(gòu)建體分別為 21kDa, 42kDa, 63kDa和 85kDa (數(shù)據(jù)未顯示)。具有單價3 ’唾液乳糖的各種改造的CBM40多肽的結(jié)合等溫線在圖5中顯示。使用 ITC，顯示了這種唾液酸糖苷與設(shè)計的CBM40多肽的結(jié)合是焓驅(qū)動的，具有在25°C從-12. 3 至-16. 3kCal/mol的非常相似的范圍的ΔΗ值(表5)。在對每一個多肽相互作用測得的所有其它的熱動力參數(shù)中同樣存在非常小的差異。實(shí)際上，多價CBM40對唾液酸的結(jié)合親和力顯現(xiàn)出與ICBM的非常相似。此外，從熱動力學(xué)角度講，組件間接頭的長度沒有顯示出對這種相互作用的貢獻(xiàn)是顯著的(表5)。根據(jù)單位點(diǎn)結(jié)合模型，η值顯示了每個CBM40多肽與3'唾液乳糖的相互作用的適當(dāng)數(shù)量的位點(diǎn)。當(dāng)我們增加被連接的組件數(shù)量，親和力沒有被觀察到顯著增加的事實(shí)提示了唾液酸-多價多肽的相互作用相似于單價-單體多肽的相互作用，說明了一種簡單的雙分子締合。多價CBM40多肽對多價3’唾液乳糖增強(qiáng)的結(jié)合親和力為了測試對于唾液酸的親和性作用是否可以用多價的CBM40多肽來取得，用固定在鏈霉抗生物素蛋白芯片上的生物素酰化的3'唾液乳糖來進(jìn)行表面等離子共振(SPR)。
15對所有注射在固定的3'唾液乳糖上的CBM40多肽的傳感圖在圖6中顯示。對每一種 CBM40-3' SL的相互作用的親和力，在此描述為平衡解離常數(shù)Kd，通過設(shè)定Langmuir 1 1 結(jié)合，用從締合/解離速率常數(shù)比率(ka/kd)得出的整體擬合模型來確定(表6)。當(dāng)組件數(shù)量增加時，觀察到對唾液酸親和力的增加。對1CBM-3' SL在25°C的相互作用，和與其通過ITC測量的相應(yīng)的單體的-單價相互作用(Kd 1。8 μ M)相比，結(jié)合力(Kd 18 μ Μ) 有10-倍的增加。當(dāng)組件數(shù)量增加到兩個，觀察到增加了的親和力，在該情況下，有大約 400-500-倍結(jié)合的增加，導(dǎo)致在25°C時親和力在38-45ηΜ之間(表6)。在這種情況下，接頭長度表現(xiàn)出少量影響親和性，因?yàn)楫?dāng)從5至15增加氨基酸數(shù)量時，只觀察到1. 2-倍親和力的增加。關(guān)于3和4個CBM40組件，有進(jìn)一步的10至20-倍對唾液酸親和力的增強(qiáng)， 在25°C對于5aa-，和IOaa-連接的3CBM組件，達(dá)到的親和力大約為4nM，對于4CBM組件， 親和力達(dá)到2.6nM。當(dāng)在15°C結(jié)合多價的3' SL時，最高親和力為4CBM(5)，其具有Kd 861pM。因此，看來7000-10000-倍親和力的增加可以通過從單價-單體的相互作用變?yōu)槎鄡r的相互作用而達(dá)到，這取決于相互作用的溫度。對從在15，25和35°C測得的每一種CBM40 多肽-唾液酸相互作用van’ t Hoff圖得到的數(shù)據(jù)(圖7，表7)顯示了對于1CBM，AG值為-7. 8kcal/mol，對于 2CBM，八6值大約為-101 ^1/11101，對于30811，Δ G 值為 11. 3kcal/mol 和對于4CBM，AG值為-12kcal/mol。ICBM和2CBM間AG值的巨大差別同樣體現(xiàn)在相互作用的焓和熵的變化。在所有CBM40多肽中，2CBM多肽給予AG值為大約-20kCal/mol的最大焓變化，這樣彌補(bǔ)了大量不利的熵的影響(表7)。這種在ICBM和2CBM相互作用的能量學(xué)中的巨大差別同樣顯示在與1CBM，3CBM和4CBM多肽相比，2CBM對唾液酸親和力的增加中，這提示了配體-受體相互作用的協(xié)同性。與此相對，3CBM多肽顯示微小的有利的熵增加，但是由于更大地有利的焓損失， 相互作用的自由能變化仍然呈很強(qiáng)地負(fù)性(表7)。有趣的是，與ICBM和2CBM多肽相比， 3CBM和4CBM多肽對于關(guān)于配體結(jié)合的Δ H和T Δ S都顯示更少的負(fù)性貢獻(xiàn)，盡管事實(shí)上相互作用自由能隨著組件數(shù)量的增加而增加，這可能對親和力的增加有貢獻(xiàn)。這些觀察可基于很多因素如由于組件的構(gòu)象排列，配體結(jié)合位點(diǎn)的可及性，結(jié)合方式例如分子內(nèi)和分子間的結(jié)合，及組件的內(nèi)部結(jié)構(gòu)包裝，相互作用對接頭的柔性是敏感的。接頭長度在3CBM多肽間的影響，在結(jié)合能量和親和力方面是微不足道的，這類似于不同的2CBM多肽。由于用 4CBM(5)在25°C沒有獲得相應(yīng)的親和力增加，已經(jīng)決定多肽的進(jìn)一步設(shè)計不再進(jìn)行。血細(xì)胞凝集測定為了測試單體的和多價的CBM40是否結(jié)合紅細(xì)胞和阻止流感病毒的結(jié)合，初期的實(shí)驗(yàn)用滴定的CBMs，和滴定的病毒，疫苗毒株X31針對紅細(xì)胞進(jìn)行。初步結(jié)果顯示在 1CBM40的情況下，沒有看見凝集反應(yīng)，并且當(dāng)這種CBM是單體時，預(yù)期它和細(xì)胞表面的唾液酸以單價的方式結(jié)合，即1 1締合(圖9a)。至于多價的CBM40s，2和3CBMs都和紅細(xì)胞凝集，就像疫苗X31 —樣(圖9a)。另外，多價的CBM與紅細(xì)胞凝集必需的終點(diǎn)濃度，3CBM40 和2CBM相比更低(分別為0. 122 μ M和0. 48 μ M)，提示重復(fù)的組件數(shù)量增加增加了它們與唾液酸的結(jié)合親和力。然而，由于多價的CBMs和紅細(xì)胞凝集，我們決定將滴定的疫苗和固定濃度(71. 25 μ Μ)的ICBM的混合物與僅疫苗對比測試來觀察血細(xì)胞凝集反應(yīng)。如圖9b 所見，當(dāng)和模擬細(xì)胞(只有病毒)相比時，當(dāng)用疫苗攻擊時，ICBM的存在阻止了病毒的結(jié)合。 當(dāng)板被置放于4°C 2. 5天，在ICBM和病毒的存在下，沒有觀察到血細(xì)胞凝集反應(yīng)，提示了這種CBM40阻斷競爭性分子結(jié)合的有效性。噬菌斑測定噬菌斑測定的初步結(jié)果提供強(qiáng)有力的證據(jù)啟示10mg/ml 3CBM(5)的1/100稀釋物相比于相同稀釋濃度的2CBM(10)更有效地阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞(見圖8)。特別是，在MDCK 細(xì)胞與不同的CBM重復(fù)片段溫育后，可以看見噬菌斑在數(shù)量上有不同，當(dāng)與模擬細(xì)胞相比和當(dāng)H3N2存在下應(yīng)用3CBM(5)時，出現(xiàn)非常少的噬菌斑。對于3CBM(5) (1/100稀釋物)，有80_85% H3N2病毒噬斑形成單位的減少。對于 2CBM(10)結(jié)果，雖然對于病毒阻斷有作用，相同濃度的相同稀釋物不具有與3CBM(5)相同的效果。像這樣，顯示了 CBM組件數(shù)量的增加對有效地阻斷病毒與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合是重要的。噬菌斑研究(用CBMTD)病毒感染的MDCK細(xì)胞一流感毒株A/Udorn/72 (H3N2)病毒用CBM40多肽阻斷。 圖10顯示多肽3CBM40，4CBM40和CBMTD對MDCK細(xì)胞抵抗Udorn病毒的細(xì)胞保護(hù)作用。當(dāng)連接的CBM40s數(shù)量從3增加到4CBM40時，有顯示具有增加的CBM抑制流感毒株的潛力。此外，把MDCK細(xì)胞和寡聚體CBM. TD溫育，之后加入病毒，與病毒對照相比，顯示出在0. 5mg/ mlCBM有效的抑制和在0. lmg/mlCBM顯著減少噬菌斑的數(shù)量(圖10)。這些數(shù)據(jù)表明霍亂弧菌唾液酸酶CBM40，無論是串聯(lián)式連接或作為自組裝的具有至4個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的寡聚體， 可以有效地保護(hù)MDCK細(xì)胞免受來自病毒的感染。監(jiān)測細(xì)胞表面被CBM40結(jié)合的唾液酸圖Ila顯示加入病毒后1小時GFP-3CBM40與MDCK細(xì)胞的細(xì)胞表面的結(jié)合。圖 lib顯示即使在感染后72小時后，當(dāng)與只有病毒的孔相比，GFP-3CBM40確實(shí)賦予針對病毒感染的某些保護(hù)。組(a)還表明加入MDCK細(xì)胞的CBM(0. 5mg/ml)，在沒有病毒存在下，因?yàn)橛^察到細(xì)胞存活而顯示72小時后無毒性作用，并與沒有被感染的對照[組(h)]相比具有相似的形態(tài)學(xué)。小鼠研究(劑量尋找實(shí)驗(yàn))表1顯示研究開始和結(jié)束時小鼠體重的結(jié)果。從臨床觀察，小鼠都顯示非常健康， 在指定的第5天和第14天時間期間它們都增加了體重，并且沒有對3CBM40有不利反應(yīng)。進(jìn)一步的研究，從抗體反應(yīng)和肺組織組織學(xué)方面說來，還仍然得進(jìn)行。CBM40抗A型流感病毒的效果初步結(jié)果啟示在WSN病毒攻擊前1天施用3CBM40顯示顯著降低病毒感染小鼠的效果，證明CBM40作為抗A型流感病毒的預(yù)防劑是有效的。在感染后第6天被處死的小鼠中，與BSA和PBS對照組相比，病毒滴度的降低是明顯的，在該情況下，從IO3病毒pfu的初始劑量起測得只有1. 5對數(shù)(log)滴度的增加(圖12A)。在這組中的小鼠也獲得體重增加并顯示對來自病毒的攻擊無不利作用(圖12B)。當(dāng)3CBM40與病毒同時施用(第0天)，感染后6天觀察到病毒的2. 4-對數(shù)增加并體重增加超過100 %，說明盡管病毒滴度增加，小鼠耐受病毒感染。然而，當(dāng)在病毒感染后1天和3天施用CBM40時，小鼠顯示體重降低和與初始負(fù)荷相比病毒滴度增加3至3. 25對數(shù)，啟示了 CBM40當(dāng)作為治療劑給予時，至少在所述方法描述的條件下，可能不是有效的。進(jìn)一步的研究，包含在感染過程中每日給藥，而不是一次性給藥，和優(yōu)化施用途徑可以確定CBM40是否可以考慮作為治療性抗病毒劑，特別是在流感病毒感染的早期作為治療性抗病毒劑。作為預(yù)防劑，這種蛋白質(zhì)生物可以通過鼻內(nèi)遞送以保護(hù)呼吸道上皮黏膜免受來自病毒的攻擊。討論我們已經(jīng)顯示從霍亂弧菌唾液酸酶而來的唾液酸特異性的CBM可以成功地從它們的母體酶中分離出并被利用來產(chǎn)生與唾液酸以高親和力結(jié)合的多價多肽。應(yīng)用ITC和 sra組合，我們還顯示了單價和多價形式的霍亂弧菌CBM40與唾液酸結(jié)合的熱動力學(xué)，其呈現(xiàn)出受焓驅(qū)動的單價-和雙價形式，正如目前很多的CBM-糖的相互作用(Boraston等 2004，等)，但當(dāng)被引入多價表面時，連接的組件數(shù)量大于2時受熵驅(qū)動。至于它們的配體和連接特異性，分離出的CBM40傾向于與α (2,3), α (2,6)和 α 0，8)_連接的唾液酸以微摩爾親和力結(jié)合。這種結(jié)合親和力和被報道的霍亂弧菌唾液酸酶與非一可水解性的硫代唾液酸糖苷(thiosialoside)相互作用相似(16)。在不同連接的唾液酸糖苷之間存在少許區(qū)別的事實(shí)可以在與3'唾液乳糖CBM40復(fù)合的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到。結(jié)構(gòu)顯示和唾液酸分子間相互作用的廣泛的網(wǎng)絡(luò)。半乳糖和葡萄糖結(jié)構(gòu)部分不與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用，這被反映在本文觀察到的與不同連接唾液酸糖苷有相似的Kd值和與結(jié)合自由能。通過利用霍亂弧菌CBM40對唾液酸相對高的單價親和力，我們已經(jīng)成功的改造串聯(lián)式連接的重復(fù)多肽至η = 4，當(dāng)與多價的表面相互作用時獲得次納摩爾級親和性。這可能是第一個報導(dǎo)通過使用不同長度的接頭肽融合相同拷貝可以操作CBM。之前有過報導(dǎo)應(yīng)用分離的CBMs作為分子探針用于植物細(xì)胞壁聚合物的分析和研究在多組件糖苷水解酶中自然發(fā)現(xiàn)的CBMs，其已經(jīng)被分離作為單獨(dú)的組件或作為與它們鄰近的組件組合以確定它們的功能(14，17，22)。我們想探索與它們的受體多價的相互作用的熱動力學(xué)以確定構(gòu)象的限制是否將阻止這些改造的多肽結(jié)合。眾所周知，蛋白質(zhì)亞單位間的接頭長度可能影響相互作用的熱動力學(xué)，并且在很多情況下，共價鍵連接的亞單位，通過降低用以解離的熵驅(qū)動力，可能提高相互作用中寡聚體的穩(wěn)定性。我們改造了范圍從5個氨基酸至15個氨基酸的CBM 組件間柔性肽接頭以確定接頭的長度是否將顯著提高改造的CBM多肽針對唾液酸的親和力。在2-串聯(lián)連接的CBMs情況下，盡管在不同的2CBM構(gòu)建體中觀察到1. 5-2-倍對唾液酸親和力的增加，增加肽接頭至10個氨基酸產(chǎn)生在構(gòu)象上熵的顯著的降低。這暗示了當(dāng)兩個CBMs連接在一起時，組件某種程度上的柔性已經(jīng)產(chǎn)生。當(dāng)與ICBM-多價3SL相互作用比較時，2CBMs和唾液酸結(jié)合的相互作用也顯示結(jié)合焓的增加，這彌補(bǔ)了大量不利的熵的影響，導(dǎo)致了結(jié)合的自由能增加和對唾液酸親和力的增加。這表明2CBM和唾液酸的結(jié)合是非常穩(wěn)定的，分子內(nèi)相互作用如關(guān)于1CBM，是焓驅(qū)使的。然而，對于3CBMs和固定的多價3SL 相互作用，在不同長度的肽中沒有顯著的差別。事實(shí)上，由不同的3CBM-唾液酸相互作用的 van' t Hoff圖導(dǎo)出的熵數(shù)據(jù)都顯示了熵的增加。此外，當(dāng)從2CBMs到3CBMs時，觀察到結(jié)合焓顯著降低，并且觀察到10倍親和力的提高。很有可能在3CBM和唾液酸結(jié)合的情況下， 觀察到的增加的親和力由可能形成的存在于sra芯片表面的穩(wěn)定聚集物導(dǎo)致，并且焓的較大變化可能由于結(jié)構(gòu)上有序的水分子受緊密的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)包裝的影響從水化層釋放所導(dǎo)致。這可以從1CBM-3SL復(fù)合物的結(jié)構(gòu)觀察到，其中三個ICBM單體緊密疊集在一起(圖 3B)。熵-驅(qū)動的相互作用特別是在當(dāng)分子間結(jié)合發(fā)生，導(dǎo)致聚集物形成時在其它多價的蛋
18白質(zhì)-糖系統(tǒng)中觀察到04) (25)，(沈)。有趣的是，增加連接組件至4顯示了對于3CBMs較少有利的熵供量和有利的結(jié)合焓，盡管這略微少于ICBM和固定的3’ SL相互作用中的結(jié)合焓。結(jié)合的自由能稍微高于其它所有的CBMs，這與從3至4CBM略微增加的親和力相對應(yīng)。 很可能改造的串聯(lián)式連接的多肽的價在寡聚體的穩(wěn)定化和它們的相互作用中可具有重要作用。PoonOO)描述了增加串聯(lián)式連接的單個多肽鏈的價，這可以導(dǎo)致束縛(tethered)的寡聚體的分子數(shù)(molecularity)的相應(yīng)性減少，這從熱動力學(xué)角度來講，變得更穩(wěn)定。實(shí)際上，Poon聲明高于寡聚體的分子數(shù)的價的串聯(lián)，或不能被寡聚體的分子數(shù)除盡的價的串聯(lián)將導(dǎo)致交聯(lián)的寡聚體。因此，對于四聚體的寡聚體，例如在4CBM的情況下，串聯(lián)的二聚體或四聚體是理想化的，而三聚體或五聚體的寡聚體需要相同的各個價的串聯(lián)。這些研究表明CBM40可以被分離和用融合它的相同拷貝操縱以通過親和性來提高它對唾液酸的親和力。此外，我們已經(jīng)顯示單體和由霍亂弧菌唾液酸酶改造而來的多聚體CBM40可以用來作為潛在的抗病毒劑抵抗A型流感病毒。利用這類技術(shù)，因而有可能使其它的CBMs可以被分離出來并改造成作為高親和力的工具用作多糖的篩選和概況分析。另外，確定在和它的多糖復(fù)合物中的CBM結(jié)構(gòu)能幫助用于糖組學(xué)領(lǐng)域中選擇性試劑的研發(fā)。參考文獻(xiàn)1. Angata, T.，和 Varki，A. (2002)化學(xué)藥品綜述 102 (2)，439-469 (Angata，T.，and Varki, Α. (2002)Chemical reviews 102(2)，439-469).2. Lehmann, F.，Tiralongo, Ε.，和 Tiralongo，J. (2006)細(xì)胞分子生命科學(xué) 63(12)，1331-1354(Lehmann，F(xiàn).，Tiralongo, E.，and Tiralongo, J. (2006)Cell Mol Life Sci 63(12),1331-1354).3. Lis, H.，和 Sharon，N. (1998)化學(xué)綜述 98 O)，637-674 (Lis，H.，and Sharon, N. (1998)Chem Rev 98 (2),637-674).4. Mandal，C.，和 Mandal，C. (1990)經(jīng)驗(yàn) 46 (5)，433-441 (Mandal，C.，and Mandal， C. (1990)Experientia 46(5),433-441).5. Crocker, P. R. (2002)結(jié)構(gòu)生物學(xué)當(dāng)今意見 12 (5), 609-615 (Crocker, P. R. (2002)Current Opinion in Structural Biology 12(5)，609-615).6. Ehrhardt, C.，Kneuer, C.，和 Bakowsky, U. (2004)高級藥物傳遞綜述 56(4)， 527-549(Ehrhardt, C. ， Kneuer, C. ， and Bakowsky, U. (2004)Adv Drug Deliv Rev56(4), 527-549).7. Lee, R. Τ.，和 Lee, Y. C. (2000)糖綴合物 J 17 (7-9)，543-551 (Lee, R. Τ.，and Lee, Y. C. (2000)Glycoconj J 17 (7-9)，543-551).8. Sacchettini, J. C.，Baum, L. G.，和 Brewer, C. F. (2001)生物化學(xué) 40(10)， 3009-3015(Sacchettini, J. C. ,Baum,L.G.，and Brewer,C. F. (2001)Biochemistry40(10), 3009-3015).9. Williams, D. H. ,0' Brien，D. P.，Sandercock，Α· Μ·，和 St印hens，Ε· (2004)分子生物學(xué)雜志 340 (2)，373-383 (Williams, D. H. , 0' Brien, D. P.，Sandercock, Α. M.，and Stephens, Ε. (2004) J Mol Biol 340 (2),373-383).10. Williams, D. H.，Stephens, Ε.，0' Brien, D. P.，和 Zhou，Μ. (2004)無機(jī)化學(xué)英文國際版 43 08) ,6596-6616 (Williams，D. H.，St印hens, Ε·，0' Brien, D. P.，and Zhou,M. (2004)Angew Chem Int Ed Engl 43 (48)，6596-6616).11. Williams, D. H.，Stephens, Ε.，和 Zhou，Μ. (2003)分子生物學(xué)雜志 3 (2)， 389-399(Williams，D. H.，St印hens，E.，and Zhou, Μ. (2003) J Mol Biol 329 (2), 389-399).12. Mathai Mammen, S. -K. C.，George Μ. Whitesides (1998)無機(jī)化學(xué)國際版 37 (20),2754-2794(Mathai Mammen, S.-K. C. , George Μ. Whitesides(1998)Angewandte Chemie International Edition 37 (20)，2754—2794).13. Boraston, Α. B. ，Bolam, D. N. ，Gilbert, H. J.，禾口 Davies，G. J. (2004)生物化 382 (Pt 3)，769-781 (Boraston, Α. B. ， Bolam, D. N. ， Gilbert, H. J. ， and Davies,
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小鼠數(shù)量籠/組劑量第o天體重死亡體重895dys50ug 3CBM17. 117. 5905dys50ug 3CBM15. 0515. 5915dysPBS12. 513. 1925dysPBS14. 715. 4935dys500ug 3CBM15. 4516. 709414dys500ug 3CBM14. 618. 39514dys500ug 3CBM1418. 1965dys500ug 3CBM14. 7516. 05975dys500ug BSA14. 815. 4985dys500ug BSA13. 41權(quán)利要求
1.一種糖結(jié)合分子(CBM)，其用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥。
2.糖結(jié)合分子(CBM)用于制備用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥的藥物中的應(yīng)用。
3.—種藥物組合物，其包含CBM和藥用賦形劑，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其被配制用于口服、腸胃外或局部的施用。
5.治療或預(yù)防由病原體引起或促成的疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的糖結(jié)合分子(CBM)的步驟。
6.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、應(yīng)用、組合物或方法，其中所述疾病或病癥由病毒呼吸道病原體和/或細(xì)菌病原體導(dǎo)致。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CBM、應(yīng)用、組合物或方法，其中所述病毒呼吸道病原體屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或副粘病毒科(Paramyxoviridae)家族。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CBM、應(yīng)用、組合物或方法，其中所述細(xì)菌病原體是鏈球菌屬(Sti^ptoccus)的細(xì)菌，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)或銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的CBM、組合物、應(yīng)用和/或方法，所述CBM、組合物、應(yīng)用和/ 或方法用于治療和/或預(yù)防流行性感冒、哮吼、肺炎和/或支氣管炎。
10.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、組合物、應(yīng)用或方法，其中所述CBM對唾液酸顯示親和力或與唾液酸結(jié)合。
11.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、組合物、應(yīng)用或方法，其中所述CBM屬于40CBMS 家族。
12.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、組合物、應(yīng)用或方法，其中所述CBM來源于霍亂弧菌(Vibrio cholerae)或產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。
13.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、應(yīng)用、組合物或方法，其中所述CBM是包括兩個或多個CBM單體的多價CBM。
14.一種CBM聚合物，其包含兩個或多個CBM分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的CBM聚合物，所述CBM聚合物與一種或多種細(xì)胞表面糖結(jié)合或?qū)σ环N或多種細(xì)胞表面糖具有親和力。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的CBM聚合物，所述CBM聚合物用于治療或預(yù)防由一種或多種病原體引起或促成的疾病和/或病癥。
17.生產(chǎn)CBM聚合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)連接編碼CBM的核苷酸序列；和(b)表達(dá)被連接的CBM核苷酸序列以生產(chǎn)CBM聚合物。
18.篩選或鑒定在治療疾病和/或病癥上潛在有效的CBMs的方法，所述方法包括以下步驟(i)使CBM或CBM聚合物在病原體存在下與細(xì)胞接觸，已知所述病原體結(jié)合或感染所述細(xì)胞；( )鑒定所述病原體已經(jīng)結(jié)合的或所述病原體已經(jīng)感染的那些細(xì)胞；和(iii)將結(jié)果與其中沒有添加CBM或CBM聚合物的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諟y定進(jìn)行比較； 其中相對于所述對照測定，所述病原體已經(jīng)結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量的減少或所述病原體已經(jīng)感染的細(xì)胞數(shù)量的減少，指示CBM或CBM聚合物在治療由該病原體引起或促成的疾病和/ 或病癥上潛在有效。
19.在樣品中篩選、鑒定、檢測、標(biāo)記糖和/或給糖加標(biāo)簽的方法，所述方法包括以下步驟(a)使樣品與CBM或根據(jù)權(quán)利要求14所述的CBM聚合物在適合于允許所述CBM/CBM聚合物與糖結(jié)合的條件下接觸，所述CBM/CBM聚合物結(jié)合所述糖或?qū)λ鎏蔷哂杏H和力；(b)去除未被結(jié)合的CBM或CBM聚合物；和(c)檢測被結(jié)合的CBM或CBM聚合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述樣品包括來自組織活組織檢查，刮削或分泌的細(xì)胞。
21.前述權(quán)利要求中任一項所述的CBM、應(yīng)用、組合物或方法，其中所述CBM或CBM聚合物被進(jìn)一步修飾以包括將被遞送到細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)部分。
全文摘要
本發(fā)明提供包含或使用糖結(jié)合分子的化合物，組合物，藥物和方法。更確切的，本發(fā)明提供治療由病原體，特別是微生物病原體，引起或促成的疾病和/或病癥的手段及篩選，鑒定，檢測，給糖加標(biāo)簽和/或標(biāo)記的糖的方法。
文檔編號A61K45/06GK102215871SQ200980145243
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者加里·泰勒, 海倫·康納里斯 申請人:圣安德魯斯大學(xué)董事會