專利名稱：含促卵泡激素的水性組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含促卵泡激素的穩定的水性組合物。
背景技術：
促卵泡激素(Follicle stimulating hormone，下文有時將其簡稱為“FSH”)是垂體前葉的促性腺激素產生細胞中合成、分泌的激素。FSH具有刺激卵巢內未成熟卵泡的生長和使其成熟的作用，其作為醫藥用作生殖輔助醫療(Assisted Reproductive Technology ； ART)中的誘排卵劑。以前，使用從絕經后女性的尿提取的人類絕經期促性腺激素(Human Menopausal Gonadotropin ；hMG)制劑作為含FSH的組合物。該hMG制劑含有FSH和促黃體生成激素 (Luteinizing Hormone ;LH)，FSH與LH的活性比是大致1 1。最近，在國外各國，不以人尿為原料而通過基因重組制造的「重組FSH制劑」成為主流，日本國也在2005年承認了 ” ^ 'J M么O7Ollistim，注冊商標)。重組制劑的特征是，由于不以尿為原料而不含不純物， 品質恒定。另一方面，生理活性蛋白質在水溶液狀態下一般不穩定，蛋白質純度越高則該傾向越大。蛋白質在水溶液中與低分子化合物同樣發生水解，產生外消旋化等化學變化，并且由于是高分子化合物因此有可能引起高級結構的變化(物理變化)。物理變化可以列舉變性、凝集、吸附、沉淀等，但認為在物理變化時首先發生變性，隨后產生凝集、吸附、沉淀等現象。變性意味著折疊部位解開(unfolding，解折疊)等立體結構(三級和四級結構)變化，在大多數情況中，變性與生理活性喪失相關，因此，為了提高蛋白質制劑或肽制劑的穩定性，防止變性是重要的。為了抑制蛋白質制劑中的化學變化以及物理變化，通常將人血清白蛋白等夾雜蛋白質作為穩定劑加入，為了避免病毒混入等危險，最近，重組制劑逐漸成為主流，對替代在重組制劑中加入夾雜蛋白質的其它穩定化方法進行了各種研究。研究了加入具有與蛋白質分子形成氫鍵并且提高蛋白質分子的水合的作用的化合物而提高蛋白質制劑的穩定性，所述化合物例如有糖類或表面活性劑、氨基酸等(例如，參考 Bull. Chem. Soc. Jpn. , 53，pp2451_2455, 1980 ;J. Biol. Chem., 256，pp7193-7201, 1981 ；Pharm. Res. , 10，pp954_962, 1993 ；Int. J. Pharm. , 96， pp41-49, 1993 ；Pharm. Res.，8，ppl258_1263, 1991 ；Pharm. Res.，10，pp649_659, 1993等)。其中，關于氨基酸，例如，DE-A-2916711號公報中公開了甘氨酸、α或β-丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺等對凝血因子具有穩定化效果，美國專利第4440679號說明書中記載了精氨酸、賴氨酸和/或甘氨酸對第VIII因子、纖連蛋白等具有穩定化作用。另外， DE-A-1985644號公報中公開了精氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸對抗凝血酶III具有穩定化效果。但是，這些氨基酸穩定化效果對于作為對象的蛋白質或肽具有特異性，并不能從這些發現預測對任意蛋白質或肽發揮最穩定化效果的氨基酸或多數氨基酸的組合。
對于FSH，例如，專利文獻1中記載了蛋氨酸使水性組合物中的促性腺激素穩定化。另外，關于組氨酸對蛋白質的穩定化效果，例如，已知組氨酸在凝血因子關聯蛋白質 (專利文獻2、、免疫球蛋白(專利文獻幻、促紅細胞生成素(專利文獻4)等液體制劑中發揮穩定化效果。進一步地，在專利文獻5中公開了含有作為穩定劑的甘氨酸、蛋氨酸、非離子表面活性劑和磷酸緩沖劑的FSH制劑。但是，以前，組氨酸對水性組合物中的FSH是否具有穩定化效果是未知的。另外，組氨酸與其它氨基酸的組合對水性組合物中的FSH是否具有穩定化效果也是完全未知的。現有技術文獻
專利文獻專利文獻1 專利文獻2 專利文獻3 專利文獻4 專利文獻5 專利文獻6 專利文獻7
日本特開平10-203997號公報日本特開2002-275090號公報日本特表2007-511566號公報國際公開WO 02/011753小冊子日本特表2009-509953號公報 DE-A-2916711 號公報美國專利第4440679號說明書
專利文獻8 DE-A-1985644號公報非專利文獻非專利文獻1 非專利文獻2 非專利文獻3 非專利文獻4 非專利文獻5 非專利文獻6
Bull. Chem. Soc. Jpn. , 53，pp2451_2455， J. Biol. Chem.，256，pp7193_7201, 1981 Pharm. Res.，10，pp954_962，1993 Int. J. Pharm.，96，pp41_49，1993 Pharm. Res.，8，ppl258_1263，1991 Pharm. Res. , 10，pp649_659，1993。
1980
發明內容
本發明解決的課題
本發明的課題是提供含促卵泡激素的水性組合物。更具體而言，本發明的課題是提供應用氨基酸在水性組合物中使促卵泡激素穩定的手段。解決課題的手段
本發明人對使水溶液狀態的促卵泡激素穩定的物質進行了深入研究，發現組氨酸具有極優異的穩定效果，進一步地，通過適當組合其它氨基酸、糖類、緩沖劑等，能夠實現更高的穩定效果。本發明基于上述發現而完成。即，通過本發明，提供了含有促卵泡激素以及作為穩定劑的組氨酸的水性組合物。根據本發明的優選的實施方式，提供了組氨酸的濃度為0. 05 10. Omg/mL的上述水性組合物、組氨酸濃度為0. 2 5. Omg/mL的上述水性組合物、以及組氨酸濃度為0. 25 2. Omg/mL的上述水性組合物。另外，根據本發明的優選的實施方式，提供了進一步含有蛋氨酸的上述水性組合物，作為進一步優選的實施方式，提供了蛋氨酸濃度為0. 05 10. Omg/ mL的上述水性組合物、蛋氨酸濃度為0. 2 5. Omg/mL的上述水性組合物、以及蛋氨酸濃度為0. 25 2. Omg/mL的上述水性組合物。進一步地，還提供了含有作為促卵泡激素的基因重組人促卵泡激素的上述水性組合物。根據本發明的優選的實施方式，提供了進一步含有選自糖類、丙二醇和肌酸酐的1 種或2種以上物質的上述水性組合物；進一步含有選自木糖醇、肌醇、丙二醇、蔗糖、葡糖酸鈣、葡糖酸鈉、甘露醇、聚乙二醇(Macrogol) 600以及肌酸酐的1種或2種以上物質的上述水性組合物。根據更優選的實施方式，通過本發明提供了進一步包含表面活性劑的上述水性組合物。作為進一步優選的實施方式，通過本發明提供了表面活性劑為選自離子表面活性劑、 兩性表面活性劑以及非離子表面活性劑的表面活性劑的上述水性組合物；表面活性劑為非離子表面活性劑的上述水性組合物；表面活性劑為TweenSO和/或Tween20的上述水性組合物；以及表面活性劑為TweenSO的上述水性組合物。根據其它優選的實施方式，通過本發明提供了進一步包含緩沖劑的上述水性組合物。根據更優選的實施方式，提供了含有選自磷酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、酒石酸緩沖劑以及Tris緩沖劑的緩沖劑的上述水性組合物，含有磷酸緩沖劑或檸檬酸緩沖劑的上述水性組合物；以及pH為6. 5 8. 0、優選pH為7. 0 7. 8的上述水性組合物；含有等滲劑的上述水性組合物；等滲劑為氯化鈉的上述水性組合物；進一步含有選自EDTA、檸檬酸、肌醇六磷酸、蘋果酸以及葡糖酸的多元羧酸的上述水性組合物；多元羧酸為EDTA的上述水性組合物；水性溶劑為磷酸緩沖鹽水的上述水性組合物。根據另外的觀點，通過本發明提供了含有促卵泡激素作為有效成分的水溶液的穩定劑，其含有組氨酸，還提供含有組氨酸以及蛋氨酸的這種穩定劑。根據進一步另外的觀點，通過本發明提供了使含有促卵泡激素作為有效成分的水溶液穩定的方法，其包括向該水溶液中加入組氨酸以及蛋氨酸的步驟、以及加入組氨酸以及蛋氨酸的步驟。發明效果
在本發明的水性組合物中，促卵泡激素通過組氨酸得以穩定化，促卵泡激素的化學變化以及物理變化實質上減輕或排除，因此，其可用作穩定的醫藥組合物，所述醫藥組合物避免了在保存以及流通階段的活性下降。
[圖1]圖1是下列情況下的HPLC圖的α-亞基以及β -亞基附近的放大圖將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH、以50mg/mL加入蔗糖以及以0. 01%加入 TweenSO，進一步加入組氨酸而得到的含促卵泡激素的水性組合物在40°C保存8周的情況， 以及將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH以及以0. 01%加入Tween80而得到的含促卵泡激素的水性組合物在5°C或40°C保存8周的情況。[圖2]圖2是下列情況下的HPLC圖的α-亞基以及β -亞基附近的放大圖將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH、以50mg/mL加入蔗糖以及以0. 01%加入 TweenSO，進一步加入蛋氨酸而得到的含促卵泡激素的水性組合物在40°C保存8周的情況， 以及將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH以及以0. 01%加入Tween80而得到的含促卵泡激素的水性組合物在5°C或40°C保存8周的情況。
[圖3]圖3是下列情況下的HPLC圖的α-亞基以及β -亞基附近的放大圖將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH、以50mg/mL加入蔗糖以及以0. 01%加入TweenSO，進一步加入蛋氨酸和組氨酸而得到的含促卵泡激素的水性組合物在40°C保存 8周的情況，以及將在IOmM的PBS中，以150IU/mL加入基因重組FSH以及以0.01%加入 Tween80而得到的含促卵泡激素的水性組合物在5°C或40°C保存8周的情況。
具體實施例方式在本發明中，也可以使用從人尿分離的天然來源的促卵泡激素，但由于在應用純度高的促卵泡激素時顯著發揮本發明的效果，因此優選應用高度精制了的促卵泡激素、優選為高度精制了的實質上為單種物質的促卵泡激素。根據這一觀點，在本發明中，促卵泡激素優選應用通過基因重組方法制備的實質上不含夾雜蛋白質的人促卵泡激素。本發明的水性組合物中的促卵泡激素的濃度沒有特別限制，例如為50 500IU/ mL、優選100 300IU/mL左右。關于促卵泡激素的國際單位(IU)，其在有關NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)的 FSH 國際標準品的文件(http:// www. nibsc. ac. uk/documents/ifu/98-704. pdf)等中記載。本發明的水性組合物中的組氨酸濃度也沒有特別限制，例如為0. 05 10. Omg/ mL、優選0. 2 5. 0mg/mL、進一步優選0. 25 2. 0mg/mL左右。另外，本發明的水性組合物中的蛋氨酸濃度也沒有特別限制，例如為0. 05 10. 0mg/mL、優選0. 2 5. 0mg/mL、進一步優選0. 25 2. 0mg/mL左右。本發明的水性組合物也可以進一步包含選自糖類、丙二醇和肌酸酐的1種或2種以上物質。糖類可以使用單糖、二糖、糖醇、醛糖酸或其鹽、環多醇、聚乙二醇等。單糖可以列舉例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、木糖、蘇糖等；二糖可以列舉例如蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、海藻糖等；糖醇可以列舉例如甘露醇、木糖醇、山梨醇、赤蘚醇、甘油等。醛糖酸或其鹽可以列舉例如葡糖酸、半乳糖酸、甘露糖酸等或它們的鹽等；環多醇可以列舉出肌醇；聚乙二醇可以列舉出聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇1540、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000等。優選地，本發明的水性組合物可以包含選自木糖醇、肌醇、丙二醇、蔗糖、葡糖酸鈣、葡糖酸鈉、甘露醇、聚乙二醇600以及肌酸酐的1種或2種以上的物質。在本發明的水性組合物中，在包含蔗糖、甘露醇或肌醇作為糖類的情況下，例如， 可以以25 125mg/mL左右的濃度應用，優選地，可以以50 100mg/mL左右的濃度加入。 在包含木糖醇作為糖類的情況下，例如，可以以1 lOOmg/mL左右的濃度應用，優選地，可以以5 75mg/mL左右的濃度加入。在包含葡糖酸鈣或葡糖酸鈉作為糖類的情況下，例如， 可以以0. 2 75mg/mL左右的濃度應用，優選地，可以以1 50mg/mL左右的濃度加入。在包含聚乙二醇600作為糖類的情況下，例如，可以以0. 2 75mg/mL左右的濃度應用，優選地，可以以1 50mg/mL左右的濃度加入。在包含丙二醇的情況下，例如，可以以1 IOOmg/ mL左右的濃度應用，優選地，可以以5 75mg/mL左右的濃度加入。在包含肌酸酐的情況下，例如，可以以0. 1 50mg/mL左右的濃度應用，優選地，可以以0. 5 30mg/mL左右的濃度加入。
本發明的水性組合物也可以包含1種或2種以上的表面活性劑。表面活性劑的種類沒有特別限制，可以應用選自離子表面活性劑、兩性表面活性劑以及非離子表面活性劑的1種或2種以上表面活性劑。表面活性劑的濃度沒有特別限制，可以以相對于水性組合物的總容量0. 001 0. 1%左右的濃度應用，適當地，可以以0. 005 0. 05%左右的濃度加入。離子表面活性劑可列舉例如膽酸、脫氧膽酸等；兩性表面活性劑可列舉例如， CHAPS(3-[(膽酰胺丙基)二甲氨]-1-丙磺酸(3-[ (Cholamidopropyl) dimethylammoni o]-l-propanesulfonate))、CHAPS0(3_[ (3_ 膽酰胺丙基)二甲氨]_2_ 羥基-1-丙磺酸 (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-l-propanesulfonate))等； 子表面活性劑可列舉例如Tween (注冊商標)、TRIT0N(注冊商標)、PLUR0NIC (注冊商標)、 力y >7 % (注冊商標)等。非離子表面活性劑的具體實例可列舉的名稱是總稱，例如，Tween可以列舉出Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等制品名。在這些之中，本發明中優選應用非離子表面活性劑，在非離子表面活性劑中更優選Tween20以及TweenSO， Tween80尤其合適。本發明的水性組合物可以進一步包含緩沖劑，例如，可以包含選自磷酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、酒石酸緩沖劑以及Tris緩沖劑的緩沖劑，優選地， 可以包含檸檬酸緩沖劑或磷酸緩沖劑。在應用檸檬酸緩沖劑的情況下，可以以例如10 250mM左右的濃度應用，優選地， 可以以25 75mM左右的濃度加入。在應用磷酸緩沖劑或磷酸緩沖生理鹽水的情況下，可以以例如2 50mM左右的濃度應用，優選地，可以以5 15mM左右的濃度加入。本發明的水性組合物的PH值沒有特別限制，可以制備成例如pH為6. 5 8. O、優選7. O 7. 8，可以用適當的PH調節劑例如鹽酸或氫氧化鈉等調節成所需的pH值。優選將本發明的水性組合物制備成與體液等滲，出于該目的可以包含等滲劑。等滲劑可以應用例如氯化鈉、甘油等， 優選地，可以應用氯化鈉。本發明的水性組合物也可以包含選自EDTA、檸檬酸、肌醇六磷酸、蘋果酸、葡糖酸的多元羧酸，優選地，可以包含EDTA。在包含螯合劑的情況下，可以以例如0. 1 10. Omg/ mL左右的濃度應用，優選地，可以以0. 2 5. Omg/mL左右的濃度加入。另外，本發明的水性組合物中的水性介質可以應用例如水、注射用蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖劑、磷酸緩沖生理鹽水等，優選地，可以應用磷酸緩沖生理鹽水。本發明的水性組合物的制備方法沒有特別限制，例如，其可以如下制備將促卵泡激素以及組氨酸在水、注射用蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水等適當的水性介質中溶解，根據需要適當加入上文說明的氨基酸、糖類、丙二醇、肌酸酐、表面活性劑、緩沖劑、PH調節劑、等滲劑等的1種或2種以上。另外，可以根據需要進行過濾滅菌等滅菌操作，制備注射用水性組合物。本發明的水性組合物可以例如作為注射用醫藥組合物用于不孕治療等。例
下面，通過例對本發明進一步地具體說明，但本發明的范圍不限于下列例。例1 針對氨基酸的殘留率的研究
在50 mM檸檬酸緩沖劑、10 mM磷酸緩沖生理鹽水(Phosphate buffered saline ；PBS) 或IOmM磷酸緩沖劑(Phosphate buffer ；PB)中，以150IU/mL加入基因重組FSH、以50mg/mL加入蔗糖、并以0. 01%加入TweenSO，進一步如下文表1中所示地組合緩沖劑以及氨基酸 (濃度為0.5 mg/mL)，制備水性組合物。將其中的0.5 mL放入2 ml容量的容器中密閉，在 50°C保存2周。通過免疫分析測定2周后的FSH量，計算相對于實驗開始時的FSH量的比 (殘留率)。結果在下面表1中示出。
[表 1]
權利要求
1.水性組合物，其包含促卵泡激素以及作為穩定劑的組氨酸。
2.權利要求1所述的水性組合物，其中組氨酸的濃度為0.05 10. Omg/mL。
3.權利要求1或2所述的水性組合物，其包含作為促卵泡激素的基因重組人促卵泡激ο
4.權利要求1至3中任一項所述的水性組合物，其進一步包含選自糖類、丙二醇以及肌酸酐的1種或2種以上物質。
5.權利要求1至4中任一項所述的水性組合物，其進一步包含選自木糖醇、肌醇、丙二醇、蔗糖、葡糖酸鈣、葡糖酸鈉、甘露醇、聚乙二醇600以及肌酸酐的1種或2種以上物質。
6.權利要求1至5中任一項所述的水性組合物，其進一步包含作為穩定劑的蛋氨酸。
7.權利要求6所述的水性組合物，其中蛋氨酸的濃度為0.05 10mg/mL。
8.權利要求1至7中任一項所述的水性組合物，其進一步包含表面活性劑。
9.權利要求8所述的水性組合物，其中表面活性劑是非離子表面活性劑。
10.權利要求1至9中任一項所述的水性組合物，其進一步包含磷酸緩沖劑或檸檬酸緩沖劑。
11.權利要求1至10中任一項所述的水性組合物，其PH值是6.5 8. 0。
12.權利要求1至11中任一項所述的水性組合物，其進一步包含作為等滲劑的氯化鈉。
13.權利要求1至12中任一項所述的水性組合物，其進一步包含作為多元羧酸的 EDTA0
14.包含促卵泡激素作為有效成分的醫藥水性組合物的穩定劑，其包含組氨酸。
15.權利要求14所述的穩定劑，其進一步包含蛋氨酸。
全文摘要
包含促卵泡激素的穩定的水性組合物，其包含促卵泡激素以及作為穩定劑的組氨酸。
文檔編號A61P15/08GK102202682SQ20098014396
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月2日 優先權日2008年11月4日
發明者淺田一, 片岡弘臣 申請人:Aska 制藥株式會社