疫苗的制作方法

專利名稱：疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含通過中間連接物與抗原連接的顆粒抗原遞送系統的疫苗和免疫原性組合物。
背景技術：
一直需要具有改進的免疫原性的新的組合物或疫苗。作為一種策略，佐劑已經被用于嘗試改善針對任意給定抗原產生的免疫應答。W005/014110公開了組合物，其包含a)脂質體；b)至少一種A-型CpG，其中所述 A-型CpG與所述脂質體結合或由所述脂質體封裝。Shahum&Th6rin [Immunology (1988)65 315-317]公開了包含牛血清白蛋白的組合物，所述牛血清白蛋白是游離的，或封裝在脂質體中，或通過異雙官能試劑N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)與脂質體表面共價連接。通過這種經典的綴合方法，抗原在配制的早期與脂質體直接且共價地連接。 該連接不是可逆的，除非發生酶促或化學降解。另一方面，封裝方法具有發生抗原變性和/ 或降解的風險。替代性的方法包括，通過靜電相互作用使抗原與離子性帶電荷的脂質體結合。HSV 抗原gB與陽離子性脂DOTAP配合并成功用于在接種的小鼠中誘發免疫應答，尤其是CTL 應答(Walker 等人.1992_PNAS，89 :7915_7918)。組合了陽離子性脂 DOchol 的 HBsAg 產生了改進的和平衡的免疫力，其能夠克服小鼠對乙肝疫苗的無響應性(Brunei等人.1999. Vaccine 17 :2192_2203)。仍然需要提供合適的免疫應答的改進的疫苗和免疫原性組合物。

發明內容
本發明人證明，包含顆粒抗原遞送系統和抗原(其中所述抗原和顆粒通過中間連接物連接)的疫苗或免疫原性組合物誘導免疫應答，該免疫應答相對于其中顆粒和抗原不通過中間連接物連接的組合物而言是改進的免疫應答。特別地，本發明的免疫原性組合物誘導改進的CD8+T-細胞免疫應答。本發明的具體實施方式
提供了包含至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述抗原和抗原遞送顆粒通過中間連接物連接。特別地，在本發明的一個實施方式中提供了免疫原性組合物，其中連接物包含至少2個彼此互補的組件，其中連接物組件之一與抗原遞送顆粒連接，互補性連接物組件與抗原連接；抗原遞送顆粒與抗原繼而通過與它們連接的互補性組件的雜交和/或結合 (joining)而連接。在本發明的一個實施方式中，連接物由互補性單鏈寡核苷酸構成。寡核苷酸介導的連接允許以可通過改變寡核苷酸的長度和序列而調節的強度進行的可逆連接。這繼而允許抗原在被細胞攝取之后被釋放。此外，抗原通過一定長度的連接物位于抗原遞送顆粒的表面處，這使其能夠被B-細胞識別。
本發明還允許“兩瓶概念”，其中顆粒抗原遞送系統和抗原可以在包裝和運輸中保持分離，例如，其中，可以在適當的時間點(可以是在臨給藥前)將它們組合。本發明還允許可以與任何感興趣的抗原組合的一般性顆粒抗原遞送系統的概念。此外，通過使用與顆粒抗原遞送系統連接的不同寡聚體(OligO)，人們可以將不同的抗原(如果需要，按不同的比例)連接至同一顆粒。因此，在本發明的第一方面，提供了包含通過中間連接物連接的抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物。在本發明的一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與顆粒連接，另一互補性連接物組件與抗原連接。在本發明的另一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與顆粒連接，另一互補性連接物組件與抗原連接，并且其中所述2 個互補性連接物組件是雜交的。在本發明的一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。在本發明的另一個方面，提供了疫苗或免疫原性組合物在制備用于預防感染和/ 或疾病的免疫原性組合物中的用途，所述疫苗或免疫原性組合物包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。在本發明的另一個方面，提供了本文描述的疫苗或免疫原性組合物在制備用于預防和/或治療感染和/或疾病的免疫原性組合物中的用途。在另一個方面，提供了如本文定義的疫苗或免疫原性組合物的方法或用途，其用于提供保護以抵抗由病原體引起的感染或疾病，所述病原體是所述免疫原性組合物中的抗原所源自的病原體的變體。在另一個實施方式中，提供了如本文定義的疫苗或免疫原性組合物的方法或用途，其用于提供保護以抵抗由包含抗原的病原體引起的感染或疾病，所述抗原是所述免疫原性組合物中的抗原的變體。在本發明的另一個實施方式中，提供了如本文定義的免疫原性組合物的方法或用途，其用于產生抗原特異性⑶8+T-細胞免疫應答，所述方法或用途包括向患者給予本發明的免疫原性組合物。在本發明的另一個方面，提供了如本文定義的疫苗或免疫原性組合物的方法或用途，其用于治療哺乳動物中的疾病。在本發明的另一個方面，提供了試劑盒，其包含i)與寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒；和ii)與互補于i)中的寡核苷酸的寡核苷酸連接的至少一種抗原。


圖1 不同的洗脫級份的SDS-PAGE/考馬斯分析。圖2 不同的洗脫級份的SDS-PAG/BET分析。
圖3A和3B 雜交反應混合物超離心之后的沉淀和上清液的SDS-PAGE分析。圖4:研究設計。圖5 產生細胞因子的⑶8+T-細胞比例(⑶8+群體內的百分比)。圖6 產生細胞因子的⑶4+T-細胞比例(⑶4+群體內的百分比)。圖7 體內檢測的細胞介導的細胞毒性。圖8 抗-p27抗體效價(總IgG-匯集的血清)。
具體實施例方式在本文中，本發明人使用的術語“包含/包括(comprising) ”、“包含/包括(comprise) ”和“包含/包括(comprises) ”意在任選在各種情況下分別與術語
“由......組成(consisting of)”、“由......組成(consist of) ” 和“由......組成
(consists of)，，替換。本文中的涉及本發明的“疫苗組合物”的實施方式也適用于涉及本發明的“免疫原性組合物”的實施方式，反之亦然。本發明人證明，相對于其中的抗原遞送顆粒和抗原不通過中間連接物連接的組合物而言，如本文描述的本發明的疫苗或免疫原性組合物引發改進的免疫應答。“改進的免疫應答”的意思是以下列一種或多種方式改變免疫應答效應細胞(例如，CD8+和/或 CD4+T-細胞、B-細胞)的數目增加；一種或多種效應細胞類型的有效性提高；一種或多種細胞類型產生的一種或多種細胞因子增加；以及產生的一種或多種細胞因子占總細胞因子譜的比例增加。特別地，本發明的免疫原性組合物誘導改進的CD8+T-細胞免疫應答。改進的CD8+T-細胞應答對于預防和/或治療某些疾病具有重要意義，所述疾病為其中靶細胞可能被細胞內細菌或病毒例如HIV感染，或者靶細胞可能是腫瘤細胞。因此，在本發明的第一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物。使用具有互補性組件的中間連接物的進一步有益之處在于，不同大小的顆粒/抗原可以容易地分別與不同抗原/抗原遞送顆粒結合。這相對于直接共價鍵合是進一步的優勢。特別地，提供了免疫原性組合物，其中連接物包含至少2個彼此互補的組件，其中連接物組件之一與抗原遞送顆粒連接，互補性連接物組件與抗原連接；抗原遞送顆粒與抗原繼而通過與它們連接的互補性組件的雜交和/或結合而連接。因此，在本發明的一個具體方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述中間連接物包含至少一對互補性
寡核苷酸。 在本發明的一個具體方面，本發明的免疫原性組合物包含免疫原性組合物，后者包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸，其中第一寡核苷酸與所述抗原遞送顆粒連接，并且與第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸與抗原連接。在本發明的另一方面，提供了免疫原性組合物，其包含通過一對或多對互補性寡核苷酸與一種或多種抗原連接的至少一種抗原遞送顆粒。在另一個實施方式中，免疫原性組合物包含與一種或多種抗原連接的至少一種抗原遞送顆粒；所述抗原可以是全都相同的，或者一種或多種抗原可以是不同的。在本發明的另一個實施方式中，提供了包含抗原遞送顆粒成分的免疫原性組合物，其中一種或多種抗原遞送顆粒是不同的。在本發明的另一個實施方式中，提供了免疫原性組合物，其包含一種或多種不同的抗原遞送顆粒以及一種或多種不同的抗原。顆粒抗原遞送系統顆粒遞送系統是本領域熟知的(參見例如Singh和0，Hagan 2002Pharmaceutical Research 19(6) :715_727)，并且包括水包油乳液、微粒(參見 0，Hagen&Sing h 2003 Expert Rev. Vaccines 2(2) :269_283)、免疫刺激復合物(ISCOM)、蛋白酶體、油滴和脂質體。如本文使用的術語“抗原遞送顆粒”是指顆粒抗原遞送系統的單個顆粒，其包括但不限于，水包油乳液的油滴、單一的微粒或納米顆粒、單一的蛋白酶體、單一的油滴、單一的脂質體、膠束、蛋白酶體或單一的ISC0M。脂質體本發明的一個具體實施方式
涉及包含脂質體制劑的免疫原性組合物，所述脂質體制劑通過中間連接物與抗原連接。在本發明的一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種脂質體和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述脂質體連接，并且另一個互補性連接物組件與抗原連接。在本發明的另一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種脂質體和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述脂質體連接，并且另一個互補性連接物組件與抗原連接，并且其中2 個互補性連接物組件是雜交的。在本發明的具體實施方式
中，中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。術語“脂質體”一般是指單層或多層(尤其是2，3，4，5，6，7，8，9或10層，這取決于形成的脂膜的數目)的包含水性內部的脂結構。脂質體和脂質體制劑是本領域熟知的。能夠形成脂質體的脂類包括所有的具有脂或脂樣特性的物質。可以構成脂質體中的脂的脂類可以選自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油膦酰脂、硫酯、鞘脂、磷脂、isoprenolide、甾類、 硬脂、留醇、archeolipid、合成的陽離子性脂和含脂的碳水化合物。在一個實施方式中，脂質體包含磷脂。合適的磷脂包括(但不限于)磷酸膽堿 (PC)，其為合成磷脂酰膽堿的中間體；天然磷脂衍生物卵磷酸膽堿、卵磷酸膽堿、大豆磷酸膽堿、氫化的大豆磷酸膽堿、作為天然磷脂的鞘磷脂；和合成的磷脂衍生物磷酸膽堿 (二癸酰-L-α-磷脂酰膽堿[DDPC]、二月桂酰磷脂酰膽堿[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿[DMPC]、二棕櫚酰磷脂酰膽堿[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰膽堿[DSPC]、二油酰磷脂酰膽堿 [D0PC]、1-棕櫚酰，2-油酰磷脂酰膽堿[P0PC]、二反油酰磷脂酰膽堿[DEPC])、磷酸甘油 (1，2- 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG] ,1,2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸甘油 [DPPG] ,1,2- 二硬脂酰-sn-甘油_3_磷酸甘油[DSPG]、1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[P0PG])，磷脂酸(1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕櫚酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1，2_ 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1，2_ 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE 1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸絲氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端激活的磷脂)。在一個實施方式中，脂質體包含1-棕櫚酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一個實施方式中，使用高度純化的磷脂酰膽堿，其可以選自磷脂酰膽堿(卵)、氫化磷脂酰膽堿(卵)、磷脂酰膽堿 (大豆)、氫化磷脂酰膽堿(大豆)。在另一個實施方式中，脂質體包含磷脂酰乙醇胺[POPE] 或其衍生物。脂質體的尺 寸可以為30nm至數微米，這取決于磷脂組成和用于制備脂質體的方法。在本發明的具體實施方式
中，脂質體的尺寸為50nm至500nm的范圍，在進一步的實施方式中為50nm至200nm。動態激光散射是用于測定脂質體尺寸的方法，其是本領域技術人員熟知的。在本發明的進一步的實施方式中，本發明的脂質體與不止一個寡核苷酸連接，例如 1 至 10，000 個，1 至 15，000 個，1 至 25，000 個，1 至 50，000 個，1 至 90，000 個，1 至 100，000
個，或更多的寡核苷酸。與抗原連接的寡核苷酸可以是全部相同的，或者一個或多個可以是不同的。在進一步的實施方式中，本發明的脂質體還包含留醇。合適的留醇包括谷甾醇、豆留醇、麥角留醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個具體的實施方式中，脂質體包含膽固醇作為甾醇。這些甾醇是本領域熟知的，例如膽固醇公開于Merck索引，第11版，第341頁， 其是發現于動物脂肪中的天然存在的甾醇。本發明的免疫原性組合物可以包含不止一種脂質體。脂質體的組成可以是不同的，因此，在本發明的一個實施方式中，提供了包含一種或多種不同脂質體的免疫原性組合物。脂質體的不同可以在于它們包含不同的元件或由不同元件組成，包含另外的元件，缺少某些元件，或者構成脂質體的一種或多種元件的比例是不同的。脂質體的不同可以在于其組成，即在于其所源自的磷脂。在進一步的實施方式中，脂質體的不同可以在于存在于脂質體中的留醇的量，例如，在一個實施方式中，免疫原性組合物包含一定比例的含有留醇的脂質體和一定比例的不含留醇的脂質體，或者脂質體可以具有不同量的留醇。在進一步的實施方式中，免疫原性組合物可以包含含有不同免疫刺激劑的脂質體；例如，在一個實施方式中，免疫原性組合物可以包含一定比例的含有免疫刺激劑(例如皂苷和/或TLR配體) 的脂質體和不含另外的免疫刺激劑的脂質體。在進一步的實施方式中，提供了包含連接了不同寡核苷酸的脂質體的免疫原性組合物。例如，本發明的免疫原性組合物可以包含一定比例的與特定寡核苷酸或寡核苷酸組連接的脂質體，而其余的脂質體可以包含替代性寡核苷酸或寡核苷酸組。免疫原性組合物可以包含任意數目的不同類型的脂質體，例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多不同的脂質體。當然，一些脂質體可以不與一種或多種寡核苷酸連接，而其它脂質體與一個或多個不同類型的寡核苷酸連接。水包油乳液在本發明的一個實施方式中，提供了本發明的免疫原性組合物，其包含通過中間連接物連接的至少一種抗原和水包油乳液中的至少一種油滴。在本發明的一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原和水包油乳液中的至少一種油滴的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述油滴連接，另一個互補性連接物組件與抗原連接。
在本發明的另一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原和水包油乳液中的至少一種油滴的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述油滴連接，另一個互補性連接物組件與抗原連接，并且其中所述2個互補性連接物組件是雜交的。在本發明的一個具體實施方式
中，中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。 本發明的水包油乳液包含可代謝的油和乳化劑。為了使任意水包油組合物適合向人類給予，乳液系統的油相必須包含可代謝的油。術語“可代謝的油”的含義是本領域熟知的。“可代謝的”可以定義為“能夠通過代謝被轉化”(Dorland’ s Illustrated Medical Dictionary，^. B. Sanders Company，第25版(1974))。油可以是任意植物油、魚油、動物油或合成油，其對于受體是無毒的并且能夠通過代謝被轉化。堅果、種子和谷物是植物油的常見來源。合成油也是本發明的一部分，其可以包括商業上可獲得的油，例如NEOBEE 等。特別適宜的可代謝油是角鯊烯。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14， 18，22_ 二十四碳己烯)是一種非飽和油，其大量存在于鯊魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中，是用于本發明的特別優選的油。角鯊烯是膽固醇的生物合成中的中間體，從這個意義上來講，其為可代謝的油(Merck索引，第10版，條目號8619)。在本發明的進一步的實施方式中，可代謝油以組合物總體積的0.5%至10% (ν/ν)的量存在于免疫原性組合物中。水包油乳液進一步包含乳化劑。適宜地，所述乳化劑可以是聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯。另外，所述乳化劑適宜地以組合物總體積的0.125%至4% (ν/ν)的量存在于疫苗或免疫原性組合物中。本發明的水包油乳液任選包含母育酚。母育酚是本領域熟知的，描述于 ΕΡ0382271。適宜的母育酚可以是α -生育酚或其衍生物，例如α -生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯)。所述母育酚適宜地以免疫原性組合物總體積的0.25%至10% (ν/ ν)的量存在于佐劑組合物中。制備水包油乳液的方法是本領域技術人員熟知的。通常而言，所述方法包括將油相(任選包含母育酚)與表面活性劑例如PBS/TWEEN80 溶液混合，然后使用勻漿器進行勻漿；對本領域技術人員顯而易見的是，包括使混合物兩次通過注射器針頭的方法將適合于將小體積的液體勻漿。同樣地，本領域技術人員可以改造微射流(microfluidizer) (M110S Microfluidics儀器，最大通過50次，在最大輸入壓力為6bar (輸出壓力是大約850bar)時持續2分鐘)中的乳化方法來產生較小或較大體積的乳液。該改造可以通過常規實驗實現 包括測定得到的乳液，直至達到具有需要的直徑的油滴的制備物。在水包油乳液中，油和乳化劑應該處于水性載體中。所述水性載體可以是例如磷酸鹽緩沖的鹽水。特別地，本發明的水包油乳液系統具有亞微米范圍的小尺寸油滴。適宜的油滴尺寸可以是120至750nm的范圍，更特別的尺寸是120至600nm的直徑。更特別地，水包油乳液包含這樣的油滴，根據強度其至少70%具有小于500nm的直徑，更特別的根據強度至少 80%具有小于300nm的直徑，更特別的根據強度至少90%具有120至200nm范圍的直徑。根據本發明，油滴尺寸即直徑是根據強度給出的。有數種根據強度測定油滴直徑尺寸的方法。強度是通過使用尺寸測量儀測定的，適宜地通過動態光散射測定，例如Malvern Zetasizer 4000 或優選 Malvern Zetasizer 3000HS。第一個可能方式是通過動態光散射(PCS-光子關聯光譜法)測定ζ均徑ZAD ；該方法另外給出多分散指數(PDI)，根據累積量算法計算ZAD和PDI。這些數值不需要知曉顆粒折射率。第二種方式是通過另一種算法(Contin或NNLS或自動化的"Malvern"算法(由尺寸測量儀提供的缺省算法)) 測定全部的粒徑分布，從而計算油滴的直徑。多數情況下，由于復合組合物的顆粒折射率是未知的，所以僅考慮強度分布，如果需要的話，還考慮從該分布產生的強度均值。 本發明的免疫原性組合物可以包含不止一種類型的油滴。水包油乳液中的油滴可以具有不同組成，因此在本發明的一個實施方式中，提供了包含一種或多種不同油滴的免疫原性組合物。油滴的不同可以在于它們包含不同的元件或由不同元件組成，包含另外的元件，缺少某些元件，或者構成油滴的一種或多種元件的比例是不同的。油滴的不同可以在于其組成，即在于其所源自的脂。在進一步的實施方式中，提供了包含連接了不同寡核苷酸的油滴的免疫原性組合物。例如，本發明的免疫原性組合物可以包含一定比例的與特定寡核苷酸或寡核苷酸組連接的油滴，而其余的脂質體可以包含替代性寡核苷酸或寡核苷酸組。免疫原性組合物可以包含任意數目的不同類型的油滴，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 20,30或更多不同的油滴。ISCOM在本發明的一個實施方式中，提供了本發明的免疫原性組合物，其包含通過中間連接物連接的至少一種ISCOM和至少一種抗原。在本發明的一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種ISCOM和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述ISCOM連接，另一個互補性連接物組件與抗原連接。在本發明的另一個方面，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種ISCOM和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中連接物組件之一與所述ISCOM連接，另一個互補性連接物組件與抗原連接，并且其中所述2 個互補性連接物組件是雜交的。在本發明的具體實施方式
中，中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。ISCOM 是本領域熟知的(參見 Kersten&Crommelin[l995]Biochimica et Biophysica Acta 1241:117-138)。ISCOM包含皂苷、膽固醇和磷脂，并且形成開口箱子樣結構，通常尺寸是40nm。ISCOM形成于皂苷、膽固醇和其它磷脂的相互作用。制備ISCOM的典型反應混合物是5mg/ml皂苷和各lmg/ml的膽固醇和磷脂。適合用于本發明的ISCOM中的磷脂包括但不限于磷酸膽堿(二癸酰-L-α-磷脂酰膽堿[DDPC]、二月桂酰磷脂酰膽堿[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿[DMPC]、二棕櫚酰磷脂酰膽堿[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰膽堿[DSPC]、二油酰磷脂酰膽堿[D0PC]、1_棕櫚酰，2-油酰磷脂酰膽堿[P0PC]、二反油酰磷脂酰膽堿[DEPC])、磷酸甘油(1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1_棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[P0PG])， 磷脂酸(1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕櫚酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺[DMPE]、1， 2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE 1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸絲氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂 (mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端激活的磷脂)。在本發明的一個實施方式中， ISCOM包含1-棕櫚酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在進一步的實施方式中，使用高度純化的磷脂酰膽堿，其可以選自磷脂酰膽堿(卵)、氫化磷脂酰膽堿(卵)、磷脂酰膽堿(大豆)、氫化磷脂酰膽堿(大豆)。在另一個實施方式中，ISCOM包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。多種皂苷適合用于本發明的ISCOM之中。在本領域中已經深入研究了各個皂苷的佐劑和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，見上文)。例如，Quil A(源自南美洲樹木皂樹(Quillaja Saponaria Molina)的樹皮)及其組分描述于US 5，057，540和“Saponins as vaccine adjuvants，，，Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12 (1-2) 1-55 ；和 EP O 362 279 Bi。包含Quil A的組分的ISCOM已經用于生產疫苗(Morein，B.，EP O 109942 Bi)。 已經報道這些結構具有佐劑活性(EP O 109 942 Bl ；WO 96/11711)。QuilA的組分、QuilA的衍生物和/或其組合是用于本發明的ISCOM中的適宜的皂苷制備物。溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的經HPLC純化的組分)被描述為強有力的佐劑，其產生方法公開于美國專利No. 5，057，540和EP 0 362 279 Bl中。這些文獻中還描述了 QS7 (Quil-Α的非溶血性組分)的用途，其作為全身性疫苗的強有力的佐劑。QS21的用途進一步描述于 Kensil 等人(1991. J. Immunology vol 146,431-437)。QS21 與聚山梨醇酯或環糊精的組合也是已知的(W0 99/10008)。包含QuilA的組分例如QS21和QS7的顆粒佐劑系統描述于WO 96/33739和WO 96/11711，這些文獻并入本文。其它的特定的QuilA組分 (稱為QH-A、QH-B、QH-C以及被稱為QH-703的QH-A與QH-C的混合物)公開于W01996011711 中的ISCOM的表格中，其并入本文。微粒在本發明的一個實施方式中，提供了本發明的免疫原性組合物，其包含通過中間連接物連接的至少一種微粒和至少一種抗原。微粒、包含微粒的組合物和制備微粒的方法是本領域熟知的(參見Singh等人 [2007 Expert Rev. Vaccines 6(5) :797-808]和 W0/1998/033487)。如本文使用的術語“微粒”是指直徑為大約IOOOnm至大約150 μ m的顆粒，其源自具有多種分子量的聚合材料，在共聚物例如PLG的情況下，所述聚合材料具有多種丙交酯乙交酯的比例。特別地，微粒的直徑允許非腸道給藥，不阻塞針頭和毛細管。微粒也被稱作微球。微粒尺寸可以通過本領域熟知的技術容易地測定，例如光子相關光譜法、激光衍射法和/或掃描電鏡。用于本文的微粒將由可滅菌的、無毒的和生物可降解的材料制備。此類材料包括但不限于，聚(a_羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內酯、聚原酸酯、聚酐。特別地，本發明的微粒源自聚(U-羥基酸)，特別地，源自聚(丙交酯) (〃 PLAII ")或D，L-丙交酯與乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)("PLGII 〃或〃 PLGAII")，或D，L-丙交酯與己內酯的共聚物。用于制備本發明的微粒的生物可降解聚合物可以容易地從商業途徑獲得，例如從 Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc.，Birmingham，AL 獲得。 例如，用于形成本文的微粒的有用的聚合物包括那些源自下列的聚合物聚羥基丁酸 ’聚己內酯；聚原酸酯；聚酐；以及聚(a_羥基酸)，例如聚(L-丙交酯)、聚(D，L_丙交酯)(二者在本文中都稱作"PLAII")、聚(羥基丁酸酯)、D，L-丙交酯與乙交酯的共聚物(例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(在本文中稱作"PLG"或"PLGA"))或D，L_丙交酯與己內酯的共聚物。特別的聚合物是PLA和PLG聚合物。可以獲得多種分子量的這些聚合物，針對給定抗原的合適的分子量由本領域技術人員容易地確定。因此，例如對于PLA，合適的分子量將是大約2000至5000的量級。對于PLG，合適的分子量一般是大約10，000至大約200，000的范圍，特別是大約15，000至大約150，000，更特別是大約50，000至大約 100，000。如果使用例如PLG的共聚物形成微粒，可以使用多種丙交酯乙交酯比例。具有不同的丙交酯乙交酯比例的微粒的混合物可用于制劑中以便達到針對給定抗原的需要的釋放動力學，并提供初級和次級免疫應答。本發明的微粒的降解速率也可以由例如聚合物分子量和聚合物結晶度的因素控制。具有不同的丙交酯乙交酯比例和分子量的PLG共聚物可以容易地通過商業途徑從多個來源獲得，包括Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc. , Birmingham, AL0 也可以使用本令頁域熟知的技術例如Tabata等人，J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22 :837-858中描述的技術通過乳酸組分的簡單聚縮合來合成這些聚合物。納米顆粒在本發明的一個實施方式中，提供了本發明的免疫原性組合物，其包含通過中間連接物連接的至少一種納米顆粒和至少一種抗原。納米顆粒是本領域熟知的。包含納米顆粒的組合物和納米顆粒的制備公開于 W0/2008/051245 和 Singh 等人(2007 Expert Rev. Vaccines 6(5) :797-808)，通過引用并入本文。如本文使用的術語“納米顆粒”是指源自聚合材料的直徑小于IOOOnm的顆粒。納米顆粒具有與微粒(見上文)相同/相似的組成，其區別僅在于它們的尺寸。納米顆粒也稱作納米球。本發明的組合物中的納米顆粒通常具有這樣的尺寸分布其中Z均值和/或 D (v，0. 5)值小于250nm,更通常小于150nm,并且其中Z均值和/或D (v，0. 9)小于350nm, 更通常小于200nm。可以使用本領域可獲得的方法測定(測量)粒徑。例如，可以使用光子相關光譜法、動態光散射或準彈性光散射測定粒徑。這些方法基于粒徑與獲自布朗運動測量值的顆粒擴散特性的相關性。布朗運動是由于環繞顆粒的溶劑分子的碰撞造成的顆粒的隨機運動。顆粒越大，布朗運動越緩慢。速度是通過平動擴散系數(D)定義的。測量值是指顆粒在液體內如何移動(水力直徑)。獲得的直徑是與顆粒具有相同的平動擴散系數的顆粒的直徑。還可以使用靜態光散射測定粒徑，該靜態光散射測定溶液中的顆粒單次散射的光的強度。靜態光散射測定的是作為散射角和溶質濃度的函數的光強度。穿過光源例如激光束的顆粒以一定角度使光散射，該角度與它們的尺寸成反比。大顆粒以低散射角和高強度產生衍射式樣，而小顆粒產生寬角度的低強度信號。如果作為角度的函數測定從樣品散射的光的強度，則可以計算粒徑分布。將角度的信息與散射模型(例如Mie理論)進行比較，以計算尺寸分布。一般地，在室溫測定粒徑，其包括多次分析待測樣品(例如對同一樣品至少3次重復測定)，以產生顆粒直徑的平均值。
對于光子相關光譜法，通常從累積量(單模態)分析計算Z均值(也稱作累積量均值或水力直徑)。對于靜態光散射測定(同樣對于在一些實施方式中的光子相關光譜法)， 可以測定基于體積的尺寸參數。例如，D(v，0.幻(其中ν表示體積)是這樣的尺寸參數，其值定義為所測定的組合物中的50%的顆粒(基于體積)具有小于D(v，0. 5)值的尺寸并且組合物中50%的顆粒具有大于D(v，0.5)值的尺寸的點。類似地，D(v，0.9)是這樣的尺寸參數，其值定義為組合物中的90%的顆粒(基于體積)具有小于D(v，0. 9)值的尺寸并且組合物中10%的顆粒具有大于D(v，0. 9)值的尺寸的點。寡核苷酸在本發明的進一步的實施方式中，提供了包含通過中間連接物連接的如本文描述的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的組合物，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。術語“寡核苷酸”是本領域熟知的。術語“寡核苷酸”在本文中用于指任意單鏈寡核苷酸序列。寡核苷酸可以是RNA或DNA寡核苷酸，或者寡核苷酸可以是肽核酸，或者在替代性實施方式中，寡核苷酸可以形成三鏈DNA螺旋。因此，根據本發明的“寡核苷酸”是指能夠與互補性核酸雜交的單鏈寡核苷酸序列。寡核苷酸的設計(長度和具體序列)將取決于抗原遞送顆粒和/或抗原的性質，以及使用該寡核苷酸的條件(例如溫度和離子強度)。 寡核苷酸的設計可以取決于所連接的抗原遞送顆粒或抗原的類型。寡核苷酸的長度可以決定連接的特異性和強度，并且可以根據抗原與脂質體表面之間的需要的長度而變化。寡核苷酸的序列可以根據寡核苷酸的需要的免疫刺激效應而變化。寡核苷酸可以是任意長度， 僅受到其雜交能力和/或可以合成它的容易性的限制。在一個實施方式中，寡核苷酸長度是8至250個堿基(例如10至200、12至75、13至50、10至45、14至40)，特別地，寡核苷酸長度可以是 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40 個堿基。互補性寡核苷酸對可以是任何序列，只要其適合于彼此結合并能夠連接至脂質體和/或抗原。在一個實施方式中，第一寡核苷酸序列的序列是SEQ ID NO :1至6的任意項的序列，或者可以是包含或包含于SEQ ID NO :1至6的序列的10、15、20、25、30、35、40、45、 50、75、100或更多個堿基。寡核苷酸對的第二寡核苷酸與第一寡核苷酸互補。當需要時，可以對寡核苷酸的長度和/或序列進行微小改變，以維持任意給定情況下所需的特異性和靈敏性。本文所列的寡核苷酸可以在例如任一方向延伸1至40或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 個核苷酸。在本發明的一個實施方式中，寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。術語“免疫刺激性寡核苷酸”在本文中用于指能夠激活免疫系統的成分的寡核苷酸。在本發明的一個實施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含一個或多個未甲基化的胞苷-鳥苷(CpG)基序。在進一步的實施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含一個或多個未甲基化的胸苷-鳥苷(TG)基序，或者可以富含T。“富含T”的意思是，寡核苷酸的核苷酸組成包含超過50^^60^^70% 或80%的胸苷。在本發明的一個實施方式中，寡核苷酸不是免疫刺激性寡核苷酸，并且不包含未甲基化的CpG基序。在進一步的實施方式中，免疫刺激性寡核苷酸不富含T和/或不包含未甲基化的TG基序。可以對寡核苷酸進行修飾以改善體外和/或體內穩定性。例如，在本發明的一個實施方式中，對寡核苷酸進行修飾以包含硫代磷酸酯骨架，即核苷酸間的鍵合。對寡核苷酸的其它合適的修飾(包括二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯修飾)以及替代性的核苷酸間的鍵合是本領域技術人員熟知的，且涵蓋在本發明內。在進一步的實施方式中，可以對寡核苷酸進行修飾以使其能夠與抗原遞送顆粒和 /或抗原綴合。修飾寡核苷酸的方法是本領域技術人員熟知的。在一個實施方式中，提供了經修飾以包含游離的巰基(SH)的寡核苷酸。在具體的實施方式中，提供了在其3’末端包含游離巰基的寡核苷酸。“游離巰基”的意思是該基團能夠進行化學綴合。在本發明的一個實施方式中，提供了本發明的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物的抗原遞送顆粒與一種或多種寡核苷酸連接。單一抗原遞送顆粒上的寡核苷酸可以是全部相同的，或者可替代地，一種或多種不同的寡核苷酸可以與單一抗原遞送顆粒連接。免疫原性組合物中的寡核苷酸可以是全部相同的，或者在進一步的實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含一種或多種不同的寡核苷酸。在本發明的進一步的實施方式中，提供了包含2個或更多個抗原遞送顆粒的免疫原性組合物，其中一定比例的遞送顆粒與一種類型的寡核苷酸連接，并且其中一定比例與一種或多種不同的寡核苷酸連接。在本發明的進一步的實施方式中，提供了包含與一種或多種不同寡核苷酸連接的抗原的免疫原性組合物，即本發明的抗原可以與任意數目的不同寡核苷酸連接，例如1、2、 3、4、5、6或更多個不同寡核苷酸序列。在本發明的進一步的實施方式中，提供了包含2個或更多個不同抗原的免疫原性組合物，其中一個抗原與一種類型的寡核苷酸連接，并且其中一種或多種不同抗原與一種或多種不同寡核苷酸連接。在進一步的實施方式中，提供了免疫原性組合物，其中抗原與一種或多種不同寡核苷酸序列連接。這句話意思是單一抗原分子可以與一種或多種不同序列的寡核苷酸連接，但是，在本發明的替代性實施方式中，抗原群體中的彼此相同的抗原與不同寡核苷酸連接。綴合.本發明的一個實施方式涉及免疫原性組合物，其中抗原遞送顆粒通過中間連接物與抗原連接。在具體的實施方式中，所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。所述寡核苷酸可以通過本領域技術人員已知的任意方法與抗原和/或脂質體連接。在本發明的具體實施方式
中，提供了如本文描述的本發明的免疫原性組合物，其中寡核苷酸通過化學綴合與至少一種抗原遞送顆粒連接，并且其中與所述的與至少一種抗原遞送顆粒連接的寡核苷酸互補的寡核苷酸通過化學綴合與至少一種抗原連接。抗原可以具有通過化學綴合而連接的一種或多種例如1至10，1至15，1至25，1 至 50，1 至 200，2至100，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多寡核苷酸。寡核苷酸可以通過本領域技術人員熟知的化學方法與抗原綴合。在一個實施方式中，抗原通過雙官能連接物(例如S-GMBS[N_(Y-馬來酰亞胺丁酰氧基)硫代琥珀酰亞胺酯])與寡核苷酸綴合，以向蛋白中導入馬來酰亞胺基團，繼而具有另外的巰基的寡核苷酸與所述馬來酰亞胺綴合。用于添加馬來酰亞胺基團的其它合適試劑可以選自Ν-[ α -馬來酰亞胺乙酰氧基]琥珀酰亞胺酯(AMAS)、Ν_[ β -馬來酰亞胺丙氧基]琥珀酰亞胺酯(BMPS)、Ν_[ ε -馬來酰亞胺己酰氧基]琥珀酰亞胺酯(EMCS)、Ν-[ γ-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)、間馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、琥珀酰亞氨基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]-環己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](LC-SMCC)、琥珀酰亞氨基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]-環己烷-1-羧基酯(SMCC)、馬來酰亞胺(聚氧化乙烯)2,4,6,8BS12N-羥基琥珀酰亞胺酯(SM(PEG)2,4,,6,8sai2)、琥珀酰亞氨基 4_ [對馬來酰亞胺苯基]丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亞氨基6-[ β-馬來酰亞胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-[ ε -馬來酰亞 胺己酰氧基]硫代琥珀酰亞胺酯(Sulf0-EMCS)、間馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基硫代-琥珀酰亞胺酯(Sulfo-MBS)、硫代琥珀酰亞氨基-4-[Ν-馬來酰亞胺甲基]-環己烷-1-羧酸酯(Sulf0-SMCC)、Ν-[ γ -馬來酰亞胺丁酰氧基]硫代-琥珀酰亞胺酯(Sulfo-GMBS)和硫代琥珀酰亞氨基4-[對馬來酰亞胺苯基]丁酸酯(Sulfo-SMPB) (Pierce ；Bioconjugate techniques Greg Τ. Hermanson Academic Press 1996)0在其中“蛋白包含一個或多個游離巰基”的其它實施方式中，在馬來酰亞胺激活之前，使用例如N-乙基馬來酰亞胺封閉游離巰基。本領域技術人員可以獲得多種另外的化學方法，因此在一個實施方式中，包含游離巰基的抗原可以被修飾，以便在使用例如N-琥珀酰亞氨基3-[2_吡啶基硫]丙酸酯(SPDP)的試劑進行DTT處理之后將游離氨基轉化為巰基。其它試劑可以選自琥珀酰亞氨基6-[3-(2_吡啶基硫]丙酰胺基]己酸酯LC-SPDP，4-琥珀酰亞氨氧基羰基-甲基-α - [2-吡啶基二硫]甲苯(SMPT)、LC-SMPT、硫代琥珀酰亞氨基3-[2-吡啶基硫]丙酸酯(Sulf0-SPDP)、硫代琥珀酰亞氨氧基羰基-甲基-α - [2-吡啶基二硫]甲苯Sufo_SMPT、 硫代琥珀酰亞氨基6-甲基-α-[2-吡啶基二硫]甲苯酰胺己酸酯Sulfo-LC-SMPT、硫代琥珀酰亞氨基6-[3’-2_吡啶基硫]丙酰胺基]己酸酯(Sulf0-LC-SDPD)和N-乙酰基高半胱氨酸硫代內酯寡核苷酸-SH+抗原-SH —寡核苷酸-S-S-抗原在替代性實施方式中，可以使用雙馬來酰亞胺試劑例如ΒΜ[ΡΕ0]2目3或DTME對包含巰基的抗原進行修飾，產生適合與巰基(thiol)修飾的寡核苷酸綴合的馬來酰亞胺激活的抗原Ag-SH+雙馬來酰亞胺試劑一馬來酰亞胺激活的抗原+寡核苷酸-SH在替代性實施方式中，可以通過與例如SBAP、NHS-BA, SIA、SIAB和硫代-SIAB的試劑反應而獲得鹵代乙酰基抗原。然后，得到的鹵代乙酰基抗原可以與巰基修飾的寡核苷酸綴合寡核苷酸-SH+抗原-Br —寡核苷酸_S_抗原+HBr脂質體可以與一個或多個例如1至100，000個寡核苷酸連接，這取決于脂質體的尺寸和其它限制，例如脂質體表面處的寡核苷酸的空間位阻。可以使用本領域技術人員熟知的化學方法使寡核苷酸與脂質體綴合。脂質體綴合物及衍生物的制備是熟知的(參見 Bioconjugate techniques. G Τ.Hermanson !preparation of liposome conjugates and derivatives，第528-569頁(1996))。可以使用異雙官能交聯劑激活包含磷脂酰乙醇胺基團的脂質體以添加馬來酰亞胺、碘代乙酰基或吡啶基二硫化物基團。寡核苷酸可以與脂質體的任一成分連接，例如與磷脂連接。在一個實施方式中， 脂質體包含馬來酰亞胺修飾的磷脂。在一個實施方式中，脂質體包含POPE-MAL(N-(3-馬來酰亞胺基-1-氧代丙基)L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕櫚酰-2-油烯基[N0F Americancorporation]，其中可以綴合例如巰基修飾的寡核苷酸。可以將脂質體配制為包含0. 5%至50% (摩爾)的百分比的修飾的磷脂。特別地， 修飾的磷脂的百分比是至20%，更特別是至10%。與寡核苷酸共價連接的修飾的磷脂的分數將取決于實驗條件和反應產率。寡核苷酸可以與ISCOM的任一成分連接，例如與磷脂連接。在一個實施方式中， ISCOM包含馬來酰亞胺修飾的磷脂。在一個實施方式中，ISCOM包含P0PE-MAL，例如巰基修飾的寡核苷酸可以與其綴合。ISCOM可以配制為包含修飾的磷脂。與寡核苷酸共價連接的修飾的磷脂的分數取決于實驗條件和反應產率。在進一步的實施方式中，本發明的ISCOM包含修飾的膽固醇。寡核苷酸可以與水包油乳液中的油滴綴合。本發明的水包油乳液的油滴可以包含能夠與一個或多個寡核苷酸綴合的修飾的表面活性劑。在一個實施方式中，提供了包含修飾的表面活性劑的本發明的油滴，其中所述表面活性劑是如本文定義的修飾的磷脂。在本發明的具體實施方式
中，修飾的磷脂占表面活性劑總體積的大約0. 至10% (ν/ν)。寡核苷酸可以與微粒和/或納米顆粒綴合。本發明的微粒/納米顆粒可以包含能夠與一個或多個寡核苷酸綴合的修飾的磷脂。在一個實施方式中，提供了包含如本文定義的修飾的磷脂的本發明的微粒/納米顆粒。在本發明的一個實施方式中，提供了制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使第一寡核苷酸與抗原綴合；b.使與步驟a中的寡核苷酸互補的第二寡核苷酸與抗原遞送顆粒綴合；c.在允許寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和抗原遞送顆粒。在進一步的實施方式中，提供了制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使用合適的試劑封閉抗原中的任何游離巰基；b.向所述抗原中加入馬來酰亞胺基團；c.使第一巰基激活的寡核苷酸與所述抗原綴合；d.使與步驟c中的寡核苷酸互補的第二巰基寡核苷酸與包含馬來酰亞胺激活的磷脂的脂質體綴合；e.在允許所述寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和脂質體。在進一步的實施方式中，提供了制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使用合適的試劑封閉抗原中的任何游離巰基；b.向所述抗原中加入馬來酰亞胺基團；c.使第一巰基激活的寡核苷酸與所述抗原綴合；d.使與步驟c中的寡核苷酸互補的第二巰基寡核苷酸與包含馬來酰亞胺激活的磷脂的ISCOM綴合；e.在允許所述寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和ISC0M。在進一步的實施方式中，提供了制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟
a.使用合適的試劑封閉抗原中的任何游離巰基；b.向所述抗原中加入馬來酰亞胺基團；c.使第 一巰基激活的寡核苷酸與所述抗原綴合；d.使與步驟c中的寡核苷酸互補的第二巰基寡核苷酸與包含馬來酰亞胺激活的磷脂的油滴綴合；e.在允許所述寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和油滴。在進一步的實施方式中，提供了制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使用合適的試劑封閉抗原中的任何游離巰基；b.向所述抗原中加入馬來酰亞胺基團；c.使第一巰基激活的寡核苷酸與所述抗原綴合；d.使與步驟c中的寡核苷酸互補的第二巰基寡核苷酸與包含馬來酰亞胺激活的磷脂的微粒和/或納米顆粒綴合；e.在允許所述寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和微粒和/或納米顆粒。在本發明的具體實施方式
中，提供了制備如本文描述的免疫原性組合物的方法， 其中以大約為6的雙官能連接物/抗原的摩爾比來進行步驟b。SiM本發明的疫苗或免疫原性組合物將包含能夠引發針對人或動物病原體和/或在人或動物中引起疾病發生的物質的免疫應答的抗原。在本發明的進一步的實施方式中，本發明的疫苗或免疫原性組合物將包含能夠引發針對人或動物中的腫瘤和/或腫瘤抗原或瘤的免疫應答的抗原。術語“抗原，，是本領域技術人員熟知的。抗原可以是能夠在人或動物中引起免疫應答的蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖綴合物、分子或半抗原。抗原可以源自病毒、細菌、 寄生蟲、原生動物或真菌，與病毒、細菌、寄生蟲、原生動物或真菌同源，或是合成的以模擬來自病毒、細菌、寄生蟲、原生動物或真菌的分子。在本發明的替代性實施方式中，抗原源自腫瘤細胞或瘤，與腫瘤細胞或瘤同源，或是合成的以模擬來自腫瘤細胞或瘤的分子。在本發明的進一步的實施方式中，抗原源自參與過敏癥、阿爾茨海默病、動脈硬化癥、肥胖和尼古丁依賴癥的物質，與參與過敏癥、阿爾茨海默病、動脈硬化癥、肥胖和尼古丁依賴癥的物質同源，或是合成的以模擬來自參與過敏癥、阿爾茨海默病、動脈硬化癥、肥胖和尼古丁依賴癥的物質的分子。在本發明的一個實施方式中，提供了包含一種或多種抗原遞送顆粒的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒通過中間連接物與一種或多種抗原連接。在本發明的進一步的實施方式中，提供了包含一種或多種抗原遞送顆粒的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒通過連接物與一種或多種抗原連接，并且其中所述連接物包含至少一對互補性寡核苷酸。本發明的抗原遞送顆粒與任意數目的抗原連接，例如1至200，000個抗原分子；這取決于特定的抗原遞送顆粒。抗原可以是全都相同的，或者在替代性實施方式中，可以有一種或多種不同抗原，因此本發明的抗原遞送顆粒可以與任意數目的不同抗原連接，例如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60 或更多個不同抗原。在本發明的進一步的實施方式中，抗原與不止一個寡核苷酸連接，例如1至200，2 至 100，1 至 50,1 M 25,1 M 15,1 M 10，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20或更多個寡核苷酸。與抗原連接的寡核苷酸可以是全都相同的，或者可替代地，一種或多種寡核苷酸可以是彼此不同的。本發明的免疫原性組合物包含與連接物組件連接的抗原遞送顆粒和與互補性連接物組件連接的抗原。適宜地，至少30%或更多的抗原分子與組合物中的抗原遞送顆粒連接。在本發明的進一步的實施方式中，至少大約40%或更多的抗原分子與抗原遞送顆粒連接。在本發明的進一步的實施方式中，多數抗原與抗原遞送顆粒連接，也就是說，組合物中的超過50%的抗原分子與抗原遞送顆粒連接。在本發明的進一步的實施方式中，組合物中的基本上所有的抗原分子與組合物的抗原遞送顆粒連接。“基本上所有”的意思是，至少 60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或更多的抗原分子與抗原遞送顆粒連接。在本發明的一個實施方式中，存在于本發明的免疫原性組合物中的所有(大約100%)的抗原與組合物中的抗原遞送顆粒連接。可以通過本領域技術人員已知的多種方法從組合物中除掉任何多余的未結合的抗原分子，例如，可以將免疫原性組合物離心，其中與抗原遞送顆粒連接的抗原被沉淀，而未與脂質體連接的抗原保留在上清液中。試劑盒本發明的一個優勢在于，連接至抗原的寡核苷酸可以與連接至互補性寡核苷酸的抗原遞送顆粒容易地連接。在本發明的范圍內包括包含與互補性連接物組件連接的抗原遞送顆粒和抗原的試劑盒。在具體的實施方式中，提供了包含與互補性寡核苷酸連接的抗原遞送顆粒和抗原的試劑盒。本發明的試劑盒中的與互補性寡核苷酸綴合的抗原遞送顆粒和抗原可以彼此雜交，或者可以是分開的，因此需要在向宿主給藥之前進行雜交。在本發明的一些方面，提供了試劑盒，其中所述試劑盒包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒。在本發明的進一步的方面，提供了試劑盒，其中所述試劑盒包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原。在本發明的一個實施方式中，提供了試劑盒，其中所述試劑盒包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒；和ii)與一種或多種與i)中的寡核苷酸互補的寡核苷酸連接的至少一種抗原。在本發明的進一步的實施方式中，提供了試劑盒，其包含i) 與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒；和ii)與一種或多種與i)中的寡核苷酸互補的寡核苷酸連接的2個或更多個不同抗原。在本發明的進一步的實施方式中，提供了試劑盒，其包含i)與寡核苷酸連接的一種或多種抗原遞送顆粒；ii)與i)中的寡核苷酸或不同的寡核苷酸連接的一種或多種不同類型的抗原遞送顆粒；和iii)與一種或多種與i)和/或ii)中的寡核苷酸互補的寡核苷酸連接的一種或多種抗原；以及任選的iv)與互補于i)和/或ii)的寡核苷酸的寡核苷酸連接的一種或多種不同抗原。在本發明的一個實施方式中，提供了試劑盒，其中至少一種抗原遞送顆粒通過經互補性寡核苷酸的雜交與至少一種抗原連接，或者，至少一種抗原通過經互補性寡核苷酸的雜交與至少一種抗原遞送顆粒連接。在本發明的替代性實施方式中，提供了試劑盒，其中抗原遞送顆粒和抗原裝在不
同的瓶中，因此不通過互補性寡核苷酸雜交，從而它們可以在給藥前的適當時間點進行雜交。試劑盒可以包含任意數目的不同類型的抗原遞送顆粒，例如1至100個不同類型的抗原遞送顆粒。在一個實施方式中，一種類型的抗原遞送顆粒與相同的寡核苷酸連接，在替代性實施方式中，每個不同類型的抗原遞送顆粒可以與不同的寡核苷酸連接。在本發明的進一步的實施方式中可以包含任意數目的不同抗原，例如1至100個不同抗原。試劑盒中的抗原適宜地與互補于連接至試劑盒中的至少一組脂質體的寡核苷酸的寡核苷酸連接。在進一步的實施方式中，提供了試劑盒，其包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒；和ii)與互補于該寡核苷酸的一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原；和iii)另外的免疫刺激劑。免疫刺激劑在本發明的進一步的實施方式中，提供了基本上如本文描述的疫苗或免疫原性組合物，其進一步包含至少一種免疫刺激劑或免疫刺激劑的組合。在本發明的一個實施方式中，提供了包含通過中間連接物連接的至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸，所述免疫原性組合物進一步包含一種或多種免疫刺激劑。免疫刺激劑可以在脂質體內(在脂雙層中或封裝在內部水相中)、ISCOM中或液滴中，與水溶液中的抗原遞送顆粒混合；或者在進一步的實施方式中，組合物的成分可以吸附至另外的免疫刺激劑。任選的免疫刺激劑選自皂苷、脂A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、金屬鹽、toll樣受體激動劑或其組合。在具體的實施方式中，免疫刺激劑/ 佐劑是Toll樣受體激動劑，特別是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動劑，或皂苷。具體的組合包括皂苷(尤其是QS21)佐劑和/或Toll樣受體4激動劑(例如3D-MPL)或Toll樣受體9激動劑(例如含有CpG免疫刺激性寡核苷酸)。其它組合包括皂苷(尤其是QS21) 和Toll樣受體4激動劑，例如皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體例如3D-MPL或烷基氨基葡糖苷磷酸酯。在一個實施方式中，免疫刺激劑是Toll樣受體(TLR) 4配體，尤其是激動劑，例如脂A衍生物，特別是單磷酰脂A，或者更特別是3脫酰單磷酰脂A(3D-MPL)。3D-MPL由 GlaxoSmithKline Biologicals N. A.以名稱 MPL 銷售，在文獻中被稱作 MPL 或 3D-MPL。 參見，例如美國專利 No. 4，436，727 ；4，877，611 ；4，866，034 和 4，912，094。3D-MPL 主要促進⑶4+T細胞應答，具有IFN-g(Thl)表型。可以根據GB 2 220 211 A中公開的方法制備 3D-MPL。在化學上，其為具有3、4、5或6條酰基化鏈的3-脫酰單磷酰脂A的混合物。在具體的實施方式中，小顆粒3D-MPL用于本發明的組合物中。小顆粒3D-MPL具有這樣的粒徑 其可以通過0.22 μ m的濾器進行無菌過濾。此類制備物描述于WO 94/21292.免疫原性組合物還可以包含是脂多糖的免疫刺激劑，適宜地是脂A的非毒性衍生物，特別是單磷酰脂A或更特別是3-脫酰單磷酰脂A(3D-MPL)。在本發明的一個實施方式中，免疫原性組合物包含3D-MPL。脂A的合成衍生物是已知的，被認為是TLR 4激動劑，包括但不限于0M174(2-脫氧_6_鄰_[2_脫氧-2_[(R)_3-十二酰氧基四-癸酰基氨基]-4-鄰-膦酰基-β -D-吡喃葡萄糖基]-2- [ (R) -3-羥基四癸酰基氨基]-α -D-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)，(W0 95/14026)OM 294 DP (3S，9R) _3—[ (R)-十二酰氧基四癸酰基氨基]_4_氧代_5_氮雜-9(R)-[(R)_3-羥基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和 WO 00/0462)OM 197 MP-Ac DP (3S_，9R) _3_[ (R)-十二酰氧基四癸酰基氨基]_4_ 氧代 _5_ 氮雜-9-[ (R) -3-羥基四癸酰基氨基]癸烷-1，10- 二醇，1- 二氫磷酸酯10- (6-氨基己酸酯) (W0 01/46127)
其它的可以使用的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，例如公開于 W09850399或US6303347中的那些(也公開了制備AGP的方法)，或公開于US6764840中的 AGP的藥學上可接受的鹽。一些AGP是TLR4激動劑，一些是TLR4拮抗劑。二者都被認為可以用作免疫刺激劑。其它合適的能夠通過TLR-4引起信號傳導應答的TLR-4配體(Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)是例如，來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，尤其是LPS 的非毒性衍生物(例如3D-MPL)。其它合適的TLR激動劑有熱休克蛋白(HSP) 10，60，65， 70，75或90;表面活性劑蛋白A、乙酰透明質酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纖連蛋白片段、纖維蛋白原肽和b-防衛素-2、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一個實施方式中，TLR激動劑是HSP 60，70或90。Toll樣受體(TLR)是I型跨膜受體，在昆蟲和人類中是進化上保守的。目前發現 7 10種TLR (TLR 1至10) (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。TLR家族的成員具有相似的細胞外和細胞內結構域；已經表明它們的細胞外結構域具有富含亮氨酸的重復序列，并且它們的細胞內結構域與白細胞介素-1受體(IL-IR)的細胞內區域是類似的。TLR細胞在免疫細胞和其它細胞(包括血管上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞和腸上皮細胞)之間有差別地表達。TLR的細胞內結構域可以與接頭蛋白Myd88(其在其細胞質區域內也具有IL-IR 結構域)相互作用，引起細胞因子的NF-KB激活；這種Myd88途徑是TLR激活影響細胞因子釋放的一種方式。TLR主要在例如抗原呈遞細胞(例如樹突細胞、巨噬細胞等)的細胞類型中表達。通過TLR刺激引起的樹突細胞的激活導致樹突細胞的成熟和炎性細胞因子例如 IL-12的產生。目前進行的研究已經表明TLR識別不同類型的激動劑，雖然一些激動劑對于數個TLR而言是共同的。TLR激動劑主要源自細菌或病毒，并且包括例如鞭毛蛋白或細菌脂多糖(LPS)的分子。“TLR激動劑”意指能夠通過TLR信號傳導途徑引起信號傳導應答的成分，其可以作為直接的配體，或者通過產生內源或外源配體而間接進行(Sabroe等人，JI 2003 1630-5 頁)。在另一個實施方式中，TLR分子的其它的天然或合成的激動劑用作任選的免疫刺激劑。這些可以包括但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激動劑。在本發明的一個實施方式中，使用能夠通過TLR-I引起信號傳導應答的 TLR激動劑(Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-I引起信號傳導應答的TLR激動劑選自三酰化脂肽(LP)；酚可溶性調控蛋白；結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)LP ；S_(2，3_ 雙(棕櫚酰氧基)-(2_RS)_ 丙基)_N_ 棕櫚酰-(R) -Cys- (S) -Ser- (S) -Lys (4) -0H,三鹽酸化物(Pam3Cys) LP (其模擬細菌脂蛋白的酰基化氨基末端)以及來自伯疏氏螺旋體(Borrelia burgdorfei)的OspA LP。在替代性的實施方式中，使用能夠通過TLR-2引起信號傳導應答的TLR激動劑(Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-2引起信號傳導應答的TLR激動劑是下列一項或多項脂蛋白，肽聚糖，來自結核分枝桿菌、伯疏氏螺旋體、梅毒螺旋體 (T. pallidum)的細菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的物種的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟菌屬孔蛋白(Neisseria porin)、細菌菌毛、耶爾森氏菌屬(Yersinia)毒力因子、CMV病毒體、麻疹血凝素和來自酵母的酵母聚糖。在替代性 的實施方式中，使用能夠通過TLR-3引起信號傳導應答的TLR激動劑 (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-3引起信號傳導應答的TLR激動劑是雙鏈RNA (dsRNA)，或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly IC)，這是一種與病毒感染相關的分子核酸式樣。在替代性的實施方式中，使用能夠通過TLR-5引起信號傳導應答的TLR激動劑 (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-5引起信號傳導應答的TLR激動劑是細菌鞭毛蛋白。在替代性的實施方式中，使用能夠通過TLR-6引起信號傳導應答的TLR激動劑 (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-6引起信號傳導應答的TLR 激動劑是分枝桿菌脂蛋白、二酰化的LP和酚可溶性調控蛋白。另外的TLR6激動劑描述于 W02003043572。在替代性的實施方式中，使用能夠通過TLR-7引起信號傳導應答的TLR激動劑 (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-7引起信號傳導應答的TLR激動劑是單鏈RNA(ssRNA)、洛索立賓(其為位置N7和C8的鳥苷類似物)或咪唑喹啉化合物，或其衍生物。在一個實施方式中，TLR激動劑是咪喹莫特。另外的TLR7激動劑描述于 W002085905。在替代性的實施方式中，使用能夠通過TLR-8引起信號傳導應答的TLR激動劑 (Sabroe等人，JI 2003 1630-5頁)。適宜地，能夠通過TLR-8引起信號傳導應答的TLR激動劑是單鏈RNA (ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉化合物，例如雷西莫特(R848)；雷西莫特也能夠被TLR-7識別。其它的可用的TLR-8激動劑包括描述于W02004071459中的那些。也可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它Toll樣受體(TLR)9激動劑(除了用于雜交中的那些以外)。用于本發明的疫苗或免疫原性組合物的特定寡核苷酸是含有CpG 的寡核苷酸，特別是含有由至少3個、甚至更特別是至少6個或更多個核苷酸間隔開的2個或更多個二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后跟鳥嘌呤核苷酸。本發明的CpG 寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在具體的實施方式中，寡核苷酸中的核苷酸間是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯鍵，雖然本發明范圍內也包括磷酸二酯和其它核苷酸間鍵合。本發明范圍內還包括具有混合的核苷酸間鍵合的寡核苷酸。制備硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于 US5, 666，153、US5, 278，302 和 W095/26204。用于本發明的具體寡核苷酸的實例具有以下序列。在本發明的具體實施方式
中， 序列包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合。(SEQ ID NO 1) :TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)(SEQ ID NO 2) :TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)(SEQ ID NO 3) :ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
(SEQ ID NO 4) :TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)(SEQ ID NO 5) :TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)(SEQ ID NO 6) :TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)替代性的CpG寡核苷酸可以包含以上序列，其中它們具有無關緊要的缺失或添加。用于本發明的CpG寡核苷酸可以通過本領域已知的任何方法合成(例如參見EP 468520)。可以使用自動化合成儀方便地合成此類寡核苷酸。因此，在另一個實施方式中，本發明的組合物還包含選自下列的免疫刺激劑 TLR-I激動劑、TLR-2激動劑、TLR-3激動劑、TLR-4激動劑、TLR-5激動劑、TLR-6激動劑、 TLR-7激動劑、TLR-8激動劑、TLR-9激動劑或其組合。在本發明的一個實施方式中，免疫原性組合物還包含皂苷。用于本發明的特別適宜的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分離自南美洲樹木皂樹的皂苷制備物，其首 T1C1 Dalsgaard ^A^: 1974 ^ ( "Saponin adjuvants", Archiv. fiir die gesamte Virusforschung, Vol. 44，Springer Verlag, Berlin, 243-254 頁)為具有佐劑活性。已經通過HPLC分離了 Quil A的純化的片段，其保持佐劑活性而沒有與Quil A相關的毒性(EP 0 362 278)，所述片段例如QS7和QS21 (也稱作QA7和QA21)。QS-21是源自皂樹的樹皮的天然皂苷，其誘導⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的IgGh抗體應答，是本發明上下文中的優選皂苷。本發明的免疫原性組合物中的皂苷佐劑特別是Quil A的免疫學活性組分，例如 QS-7或QS-21，適宜地是QS-21。在一個實施方式中，本發明的組合物包含基本上純的形式的免疫學活性皂苷組分。特別地，本發明的組合物包含基本上純的形式的QS21，也就是說， QS21是至少75%、80%、85%、90%純的，例如至少95%純的，或至少98%純的。在具體的實施方式中，在其低反應原性(reactogenic)組合物中提供QS21，其中以外源留醇例如膽固醇猝滅QS21。存在數種特定形式的低反應原性組合物，其中以外源膽固醇猝滅QS21。在一個實施方式中，本發明的包含皂苷的脂質體適宜地包含中性脂，例如磷脂酰膽堿，其適宜地在室溫下是非結晶形式，例如卵黃磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿 (DOPC)或二月桂酰磷脂酰膽堿。脂質體還可以包含帶電荷的脂，對于由飽和脂構成的脂質體，其增加脂質體-QS21結構的穩定性。在這些情況下帶電荷的脂的量適宜地是至 20% w/w，特別是5%至10%。甾醇與磷脂的比例是至50% (mol/mol)，適宜地是20% 至 25%。當與不含留醇的組合物比較時，本發明的包含QS21和留醇(尤其是膽固醇)的免疫原性組合物顯示出降低的反應原性，而保持了佐劑效應。可以根據WO 96/33739中公開的方法進行反應原性研究。根據本發明的留醇意指外源留醇，即對于從中制備抗原性制備物的生物體而言不是內源的留醇，而是向抗原制備物中添加的或者在配制時隨后添加的甾當活性皂苷組分是QS21時，QS21 甾醇的比例通常是1 100至1 1 (w/w)的量級，適宜地是1 10至1 l(w/w)，優選是1 5至1 l(w/w)。適宜地，存在多余的甾醇，QS21 甾醇的比例是至少1 2(w/w)。在一個實施方式中，QS21 甾醇的比例是 1 5(w/w)0甾醇適宜地是膽固醇。其它有用的皂苷源自植物歐洲七葉樹(Aesculus hippocastanum)或Gyophillastruthium。在文獻中描述的其它皂苷包括七葉樹皂角素(Escin)，其描述于Merck 索引(第12版，條目號3737)，其是存在于七葉樹(horse chestnut tree，拉丁名 Aesculus hippocastanum)的種子中的皂苷混合物。描述了通過色譜法和純化(Fiedler， Arzneimittel-Forsch. 4,213(1953))以及通過離子交換樹脂(Erbring 等人.，US 3，238，190)進行的其分離。已經純化了七葉樹皂角素的組分并顯示其具有生物學活性 (Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug ；44 (8) :1454-1464))。還已經描述了與例如制備ISCOM相關的來自Gypsophilla struthium的皂苷(R. Vochten等人，1968， J. Pharm. Belg.，42，213—226)。特別地，組合物可以包含兩種或更多種如上所列舉的免疫刺激劑。在一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含脂多糖和免疫學活性的皂苷二者。在本發明的進一步的實施方式中，脂多糖被摻入本發明的脂質體中。在本發明的具體實施方式
中，脂多糖是 3D-MPL，并且免疫學活性的皂苷是QS21，被摻入到本發明的脂質體中。包含本發明的免疫原性組合物的疫苗制備物可通過經由全身性或粘膜途徑給予所述疫苗而用于保護或治療易于被感染的哺乳動物。這些給藥可以包括通過肌肉內、腹膜內、真皮內或皮下途徑注射；或通過粘膜給藥至口 /消化道、呼吸道、泌尿生殖道。雖然本發明的疫苗可以以單劑給藥，但其成分也可以在同一時間或不同時間聯合共同給藥。此外，本發明的疫苗可以通過IM給藥用于初免給藥，并且通過IN用于加強給藥。疫苗中的蛋白抗原含量通常是l_500yg范圍，優選是5-350yg，最通常是 5-300 μ g范圍。初次接種之后，受試者可以接受間隔足夠的一個或多個加強免疫。疫苗制備物的一般性描述見 Vaccine Design( "The subunit and adjuvant approach，，(eds Powell M. F. &Newman M. J. ) (1995) Plenum Press New York)。脂質體內的封裝描述于Fullerton的美國專利4，235，877。每個疫苗劑量中的每個抗原的量選擇為誘導免疫保護性應答而沒有常見疫苗中的顯著性不利副作用的量。此量將根據所用的具體免疫原以及如何呈現它而變化。在進一步的實施方式中，提供了通過給予基本上如本文描述的組合物來治療易患疾病或患有疾病的個體的方法。還提供了預防個體患上疾病的方法，所述疾病選自感染性細菌和病毒疾病，寄生蟲疾病(特別是細胞內病原性疾病)，增殖性疾病，例如前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌或黑素瘤；非癌癥慢性病癥、過敏癥，所述方法包括向所述個體給予基本上如本文描述的組合物。在進一步的實施方式中，提供了用于病況或疾病的預防性治療或治療的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物包含復合物形式的至少一種脂質體和至少一種抗原，其中所述抗原和所述脂質體通過中間連接物連接。在進一步的實施方式中，提供了疫苗在制備用于病況或疾病的預防性治療或治療的藥物中的用途，其中所述疫苗包含基本上如本文描述的組合物。通過參考以下非限制性實施例進一步描述本發明。實施例I-通過中間連接物與抗原連接的脂質體制劑
I. 1. P27杭原與GdC-SH單鏈ODN(脫氧,寡核苷酸)的綴合方法I. 1. 1.使用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)封閉抗原的-SH官能團p27抗原含有內在的能夠與馬來酰亞胺反應的-SH。為了避免此SH與馬來酰亞胺
的預成熟反應，通過化學方式將其封閉。
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原，其中所述抗原和抗原遞送顆粒通過中間連接物連接。
2.權利要求1的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒選自脂質體、ISC0M、水包油乳液中的油滴、微粒、納米顆粒或油滴。
3.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是脂質體。
4.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是ISC0M。
5.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是水包油乳液中的油滴。
6.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是微粒。
7.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是納米顆粒。
8.權利要求1至7任一項的免疫原性組合物，其中所述連接物包含至少2個彼此互補的組件，并且其中第一連接物組件與所述抗原遞送顆粒連接，與所述第一連接物組件互補的第二連接物組件與抗原連接。
9.權利要求1至8任一項的免疫原性組合物，其中所述2個互補性連接物組件結合在一起和/或是雜交的。
10.權利要求1至9任一項的免疫原性組合物，其中所述中間連接物包含至少一對互補性寡核苷酸序列。
11.權利要求10的免疫原性組合物，其中第一寡核苷酸與所述抗原遞送顆粒連接，與所述第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸與抗原連接。
12.權利要求10的免疫原性組合物，其中一種或多種抗原與一種或多種抗原遞送顆粒通過互補性寡核苷酸的雜交而連接。
13.權利要求10至12任一項的免疫原性組合物，其中所述寡核苷酸選自DNA、RNA和PNA。
14.權利要求10至13任一項的免疫原性組合物，其中所述寡核苷酸是DNA。
15.權利要求14的免疫原性組合物，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯骨架。
16.權利要求14或15的免疫原性組合物，其中所述寡核苷酸中的至少一種包含一個或多個CpG基序。
17.權利要求14或15的免疫原性組合物，其中至少一種所述寡核苷酸不包含一個或多個CpG基序。
18.權利要求16的免疫原性組合物，其中所述包含一個或多個CpG基序的寡核苷酸序列包含 SEQ ID NO 4 的序歹Ij (0DN 2006)。
19.權利要求10至18任一項的免疫原性組合物，其中所述一種或多種寡核苷酸被修飾以促進所述寡核苷酸與抗原遞送顆粒和/或抗原的綴合。
20.權利要求10至19任一項的免疫原性組合物，其中通過添加巰基(SH)來修飾所述一種或多種寡核苷酸。
21.權利要求20的免疫原性組合物，其中所述巰基與所述寡核苷酸的3’末端綴合。
22.權利要求10至21任一項的免疫原性組合物，其中至少一種抗原遞送顆粒通過化學綴合與第一寡核苷酸連接。
23.權利要求22的免疫原性組合物，其中至少一種抗原通過化學綴合與互補于所述第一寡核苷酸的第二寡核苷酸連接。
24.權利要求23的免疫原性組合物，其中至少一種抗原通過基于馬來酰亞胺的化學綴合與所述寡核苷酸中的至少一種連接。
25.前述權利要求任意項的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物包含免疫刺激劑。
26.權利要求25的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是脂質體并且其中至少一種脂質體包含一種或多種免疫刺激劑。
27.權利要求25或26的免疫原性組合物，其中所述免疫刺激劑選自皂苷；Toll樣受體4(TLR4)配體；Toll樣受體7和/或8 (TLR7/8)配體；Toll樣受體9(TLR9)配體；或其任意組合。
28.權利要求26或27的免疫原性組合物，其中所述脂質體包含皂苷和/或TLR4配體。
29.權利要求27或28的免疫原性組合物，其中所述皂苷是QuilA的衍生物。
30.權利要求29的免疫原性組合物，其中所述QuilA衍生物是QS21。
31.權利要求27或28的免疫原性組合物，其中所述TLR4配體是單磷酰脂A。
32.前述權利要求任意項的免疫原性組合物，其中所述抗原遞送顆粒是脂質體，并且其中至少一種脂質體包含甾醇。
33.權利要求32的免疫原性組合物，其中所述留醇是膽固醇。
34.前述權利要求任意項的免疫原性組合物，其包含一種或多種不同抗原。
35.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使第一寡核苷酸與抗原綴合；b.使與步驟a中的寡核苷酸互補的第二寡核苷酸與抗原遞送顆粒綴合；c.在允許所述寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和抗原遞送顆粒。
36.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟a.使用合適的試劑封閉抗原中的任何游離巰基；b.向所述抗原中加入馬來酰亞胺基團；c.使第一巰基激活的寡核苷酸與所述抗原綴合；d.使與步驟C中的寡核苷酸互補的第二巰基寡核苷酸與包含馬來酰亞胺激活的磷脂的脂質體綴合；e.在允許寡核苷酸雜交的條件下混合所述抗原和脂質體。
37.用于醫藥的前述權利要求任意項的免疫原性組合物。
38.用于預防和/或治療易患或患有疾病的人的前述權利要求任意項的免疫原性組合物。
39.前述權利要求任意項的免疫原性組合物在制備用于預防和/或治療易患或患有疾病的人的藥物中的用途。
40.易患或患有疾病的個體的治療，所述治療通過給予前述權利要求任意項要求保護的免疫原性組合物進行。
41.一種試劑盒，其包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒。
42.一種試劑盒，其包含i)與一種或多種寡核苷酸連接的至少一種抗原。
43.一種試劑盒，其包含i)與寡核苷酸連接的至少一種抗原遞送顆粒；和ii)與互補于i)中的寡核苷酸的寡核苷酸連接的至少一種抗原。
44.權利要求41至43任一項的試劑盒，其包含一種或多種不同類型的抗原遞送顆粒。
45.權利要求41至44任一項的試劑盒，其包含一種或多種不同抗原。
46.權利要求41至45任一項的試劑盒，其包含一種或多種不同寡核苷酸。
47.權利要求41至46的試劑盒，其還包含一種或多種免疫刺激劑。
48.權利要求43至47任一項的試劑盒，其中所述至少一種抗原遞送顆粒與至少一種抗原通過經所述互補性寡核苷酸的雜交而連接，或者所述至少一種抗原與至少一種抗原遞送顆粒通過經所述互補性寡核苷酸的雜交而連接。
49.權利要求41至47任一項的試劑盒，其中所述一種或多種抗原遞送顆粒和一種或多種抗原不通過互補性寡核苷酸雜交。
全文摘要
本發明提供了包含至少一種抗原遞送顆粒和至少一種抗原的免疫原性組合物，其中所述抗原和抗原遞送顆粒通過中間連接物連接。
文檔編號A61K39/385GK102202689SQ200980143744
公開日2011年9月28日 申請日期2009年8月26日 優先權日2008年8月28日
發明者A·埃羅亞哈比, R·L·比曼斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司