用于治療血友病的方法

專利名稱：用于治療血友病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療血友病的方法。
背景技術(shù)：
血友病A是最常見的遺傳性凝固病癥，估計(jì)發(fā)病率為每5，000名男性1例。它是由因子VIII (FVIII)(即血液凝固的固有途徑的一種成分)的缺乏或結(jié)構(gòu)缺陷引起的。人 FVIII已經(jīng)以重組方式生成，而且已經(jīng)顯示其作為代替療法用于血友病A是有效的。血友病A的目前治療牽涉靜脈內(nèi)注射或輸注FVIII?；颊呖梢栽诹餮录l(fā)生時(shí)治療(“按需療法”(on-demand therapy))或者作為預(yù)防性療法一周施用數(shù)次。例如，為了預(yù)防性處理，F(xiàn)VIII可以每周給予三次。另外，可以用手術(shù)植入靜脈通路裝置(venous access device)以進(jìn)行施用。然而，感染可以是這些裝置的一項(xiàng)問(wèn)題。因此，這些麻煩的施用模式對(duì)患者順從性產(chǎn)生巨大的障礙。因此，需要開發(fā)備選的施用模式來(lái)鼓勵(lì)患者順次性。本發(fā)明提供了此類治療方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種治療血友病的方法，包括皮下施用有效量的凝固因子或其突變蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)處共價(jià)附接于一種或多種生物相容性聚合物。凝固因子的例子包括但不限于FVIII、因子VII (FVII)、或因子IX(FIX)。一種或多種生物相容性聚合物可以附接于隨機(jī)位點(diǎn)或者可以是位點(diǎn)特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性聚合物選自聚環(huán)氧烷(polyalkyleneoxide)、 右旋糖酐、多聚乙酰神經(jīng)氨酸(colominic acid)、基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇、聚羧酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物(polyethylene-co-maleic acid anhydride)、聚苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物 (polystyrene-co- malic acid anhydride)、聚 惡唑啉(polyoxazoline)、聚丙烯酰嗎啉(polyacryIoylmorpholine)、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解物、淀粉、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠(guar gum)、支鏈淀粉(pullulan)、菊粉、黃胞膠、角叉菜膠 (carrageenan)、果膠、和藻酸水解物。作為一個(gè)例子，聚環(huán)氧烷可以是聚乙二醇。此外，聚乙二醇可以具有5kDa至150kDa或更大的大小范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性聚合物是淀粉諸如羥乙基淀粉或羥丙基淀粉。 作為一個(gè)例子，羥乙基淀粉的大小范圍可以是I5OkDa或更大。在又一個(gè)實(shí)施方案中，將所述生物相容性聚合物共價(jià)附接于所述凝固因子或其突變蛋白上的預(yù)定位點(diǎn)。例如，可以將生物相容性聚合物共價(jià)附接于FVIII多肽或FVIII突變蛋白中選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、 711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII突變蛋白是B域缺失型因子VIII。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII突變蛋白進(jìn)一步包含一處或多處氨基酸取代，其選自81、129、377、378、468、487、 491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、 2118和2284。例如，氨基酸取代是半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性聚合物共價(jià)附接于FVII或FIX或其突變蛋白上的隨機(jī)或預(yù)定位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)防性施用凝固因子或突變蛋白。在又一個(gè)實(shí)施方案中，以初始負(fù)荷劑量接著以低維持劑量每日施用凝固因子或突變蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以維持谷水平為正常水平約1-2%的劑量施用凝固因子或突變蛋白。附圖簡(jiǎn)述

圖1。對(duì)未處理的HemA小鼠皮內(nèi)施用因子VIII。然后，通過(guò)Coatest測(cè)定法測(cè)定血漿FVIII活性。發(fā)明詳述應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物物種或?qū)?、?gòu)建體、和試劑，并且因此可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述具體實(shí)施方案的目的，而且并不意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅會(huì)以所附權(quán)利要求書限制。必須注意到，如本文中和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、 和“所述”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另有明確規(guī)定。如此，例如，提及“一種藥劑”指提及一種或多種藥劑，而且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用與本文中所描述的方法、裝置和材料相似或等同的任何方法、裝置和、材料，但是現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法、裝置和材料。為了描述和披露例如出版物中描述的可以與目前描述的發(fā)明結(jié)合使用的方法，在此通過(guò)提及而將本文中所提及的所有出版物和專利收入本文。上文及整個(gè)文本所討論的出版物僅提供其在本申請(qǐng)的提交日前的公開內(nèi)容。憑借在先發(fā)明，本文中的任何文字都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格早于所述公開。血友病A的預(yù)防性處理需要頻繁的靜脈內(nèi)注射或輸注FVIII，這由于其短的體內(nèi)半衰期(8-12小時(shí))而成為必要。用大體積進(jìn)行頻繁的靜脈內(nèi)注射是不方便的，難以對(duì)年幼的兒童施用，而且經(jīng)常導(dǎo)致靜脈導(dǎo)管相關(guān)感染。皮下施用提供了一種備選的施用模式，而且提供了未滿足的醫(yī)學(xué)需要。然而，在人中作為治療的皮下可注射FVIII目前是不可行的，很大程度上是由于其極端低的生物利用度(<5%)。低生物利用度需要高劑量，這在經(jīng)濟(jì)上令人望而卻步的。此外，注射體積的限制使技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性的高濃縮性配制劑成為必要。如本文中所描述的，F(xiàn)VIII的PEG化顯著改善皮內(nèi)施用的FVIII在血友病A小鼠模型中的生物利用度。小鼠中的皮內(nèi)施用與人中的皮下注射類似。本發(fā)明證明了在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)處共價(jià)附接于一種或多種生物相容性聚合物的FVIII或其突變蛋白實(shí)現(xiàn)功能活性FVIII的體內(nèi)回收改善。本發(fā)明涉及與一種或多種生物相容性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基淀粉(HES)、多聚唾液酸(PSA)、其它親水性聚合物偶聯(lián)的凝固因子或其突變蛋白、或用親水性聚合物配制的 FVIII(FVIII formulated with hydrophilicpolymer)?？梢云は率┯眠@些偶聯(lián)物以預(yù)防性處理血友病A。另外，偶聯(lián)物可以每周進(jìn)行皮下施用或者可以以初始負(fù)荷劑量接著以小體積的低維持劑量每日施用以維持正常水平約1-2%的穩(wěn)定有效的谷水平。生物相容性聚合物包括但不限于聚環(huán)氧烷，諸如但不限于聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)、右旋糖酐、多聚乙酰神經(jīng)氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、聚苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、聚P惡唑啉、聚丙烯酰嗎啉、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解物、淀粉諸如羥乙基淀粉和羥丙基淀粉、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、普、菊粉、 黃胞膠、角叉菜膠、果膠、藻酸水解物、其它生物聚合物及其任何等同物。其它有用的聚乙二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG_氧基羰基咪唑(⑶I-PEG)、分支聚乙二醇、線性聚乙二醇、分叉聚乙二醇和多臂或“超分支”聚乙二醇 (星-PEG)。如本文中所使用的，“PEG”和“聚乙二醇”可互換使用，包括任何水溶性聚(環(huán)氧乙烷)。通常，依照本發(fā)明使用的PEG包含以下結(jié)構(gòu)“一(0CH2CH2)n--”，其中(η)是2至4000。 如本文中所使用的，PEG 還包括"一CH2CH2--O (CH2CH2O)n-CH2CH2--"和"一(OCH2CH2) η0—，，， 這取決于末端氧是否已經(jīng)被置換。貫穿整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求書，應(yīng)當(dāng)記住，術(shù)語(yǔ)“PEG” 包括具有各種末端或“末端加帽”基團(tuán)諸如但不限于羥基或C1,烷氧基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ) “PEG”還指含有大多數(shù)(換言之，大于50%)--0CH2CH2—重復(fù)亞基的聚合物。就特定的形式而言，PEG可以采用許多分子量及結(jié)構(gòu)或幾何學(xué)諸如分支、線性、分叉、和多功能。PEG化是長(zhǎng)鏈聚乙二醇(PEG)分子共價(jià)附接于蛋白質(zhì)或其它分子。PEG可以是線性形式或分支形式。另外，PEG化可以是隨機(jī)的(例如靶向伯胺諸如N端和賴氨酸)或位點(diǎn)特異性的(例如靶向特定的氨基酸)。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性聚合物(例如PEG)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處共價(jià)附接于FVIII，所述氨基酸位置諸如但不限于81、129、377、378、468、 487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、 2091,2118 和 2284。 凝固因子的例子包括但不限于FVII、FVIII、FIX及其突變蛋白。因子VIII包括人全長(zhǎng)FVIII分子。FVIII的突變蛋白包括例如，但不限于B域缺失型FVIII (BDD)、功能活性FVIII片段、和在如下位置處包含一處或多處氨基酸取代的 FVIII 分子或其片段81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、 1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。作為一個(gè)例子，氨基酸取代可以包括在一個(gè)或多個(gè)如下位置處的半胱氨酸81、129、377、378、468、487、491、504、556、 570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。其它FVIII突變蛋白的例子和生成此類突變蛋白的方法記載于美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本號(hào)2006/0115876，將其收入本文。FVII的例子包括人全長(zhǎng)FVII分子及FVII突變蛋白，其記載于W099/20767、WO 00/66753、WO 01/58935、WO 03/093465、WO 04/029091, WO 04/083361、和 WO 04/111242。FIX的例子包括人全長(zhǎng)FIX分子及FIX突變蛋白，其記載于美國(guó)專利號(hào)6，531，四8 ；美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)PCT/US09/40691 ；及美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)PCT/US09/40813。突變蛋白的牛成突變蛋白是由于對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)突變生成的經(jīng)遺傳工程化改造的蛋白質(zhì)。氨基酸序列變化可以通過(guò)多種技術(shù)，諸如例如通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變修飾相應(yīng)的氨基酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。用于位點(diǎn)特異性誘變的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，并且記載于例如^ller 等，(DNA 3 :479-488，1984)或 Horton 等，(Gene 77 :61_68，1989，第 61 頁(yè)-第 68 頁(yè))。例如，本領(lǐng)域中公認(rèn)保守取代是用一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)具有相似特性的氨基酸，包括例如丙氨酸改變?yōu)榻z氨酸或者精氨酸改變?yōu)橘嚢彼?。如此，使用FVIII、FVII、或FIX的核苷酸和氨基酸序列，可以引入選擇的變化。同樣地，使用特異性引物使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)制備DNA構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如PCR Protocols, 1990，Academic Press, San Diego, California, USA)。編碼突變蛋白的核酸構(gòu)建體也可以通過(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如由Beaucage等， (Gene Amplif. Anal. 3 1_26，1983)所描述的亞磷酰胺方法來(lái)合成制備。根據(jù)亞磷酰胺方法，在例如自動(dòng)化DNA合成儀中合成寡核苷酸，將其純化、退火、連接、并在合適的載體中克隆。編碼突變蛋白的DNA序列也可以使用特異性引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)制備，例如如記載于美國(guó)專利號(hào)4，683，202或&iiki等，(Science 239 =487-491,1988)的。此外，核酸構(gòu)建體可以是混合的合成和基因組、混合的合成和cDNA、或混合的基因組和cDNA起源的， 其通過(guò)依照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)連接與整個(gè)核酸構(gòu)建體的各部分對(duì)應(yīng)的合成、基因組、或cDNA起源 (在合適時(shí))對(duì)應(yīng)的片段來(lái)制備?？梢允褂弥亟MDNA方法來(lái)將編碼突變蛋白的DNA序列插入重組載體中。載體的選擇常常會(huì)取決于載體要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。載體可以是自主復(fù)制型載體或整合型載體。自主復(fù)制型載體以染色體外實(shí)體存在，并且其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。整合型載體是整合入宿主細(xì)胞基因組中，并與其已經(jīng)整合入的染色體一起復(fù)制的載體。載體可以是表達(dá)載體，其中編碼突變蛋白的DNA序列與轉(zhuǎn)錄、翻譯、或DNA加工需要的別的區(qū)段諸如啟動(dòng)子、終止子、和多聚腺苷酸化位點(diǎn)可操作連接。一般地，表達(dá)載體可以衍生自質(zhì)?；虿《綝NA，或者可以含有這兩者的元件。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”指明布置區(qū)段以使它們出于其意圖的目的一致地運(yùn)行，例如，轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中啟動(dòng)，并行進(jìn)通過(guò)編碼多肽的DNA序列。表達(dá)突變蛋白中使用的表達(dá)載體可以包含能夠指導(dǎo)克隆基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，而且可以衍生自編碼對(duì)于宿主細(xì)胞而言同源或異源的蛋白質(zhì)的基因的任何DNA序列。適合用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼突變蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子是例如SV40啟動(dòng)子(Subramani等，Mol. Cell Biol. 1 854-864,1981)、MT-I (金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子(Palmiter 等，Science 222:809-814， 1983)、CMV 啟動(dòng)子(Boshart 等，Cell 41 :521_530，1985)、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)LTR 啟動(dòng)子(Lin等，Gene. 147 =287-92,1994)、或腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子(Kaufman等，Mol. Cell. Biol. 2 :1304-1319,1982)。若必要的話，也可以將編碼突變蛋白的DNA序列可操作連接至合適的終止子， 諸如人生長(zhǎng)激素終止子(Palmiter 等，Science 222 =809-814,1983)或 TPIl (Alber 等，J. MoI. Appl. Gen. 1 :419-434,1982)、或 ADH3 (McKnight 等，EMBO J. 4 :2093-2099,1985)終止子。表達(dá)載體還可以含有位于插入位點(diǎn)下游的多聚腺苷酸化信號(hào)。多聚腺苷酸化信號(hào)包括來(lái)自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信號(hào)、來(lái)自腺病毒5 EIb區(qū)的多聚腺苷酸化信號(hào)、人生長(zhǎng)激素基因終止子(DeNoto等，Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)、或來(lái)自人TF 基因或人凝血調(diào)節(jié)蛋白基因的多聚腺苷酸化信號(hào)。表達(dá)載體還可以包括增強(qiáng)子序列，諸如 SV40增強(qiáng)子。用于連接編碼突變蛋白的DNA序列、啟動(dòng)子、和任選地終止子，并將它們插入含有復(fù)制必需的信息的合適載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, New York,1989)。轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA序列的方法記載于例如Kaufman等， (J. Mol. Biol. 159 :601-621,1982) ；Southern 等，(J. Mol. Appl. Genet. 1 :327_341，1982)； Loyter 等，(Proc. Natl .Acad. ki. USA 79 :422-426,1982) ；Wigler 等，(Cell 14:725-731， 1978) ；Corsaro 等，(Somatic Cell Genetics 7 :603-616,1981), Graham 等，(Virology 52 :456-467,1973)；及 Neumann 等，(EMBO J. 1 :841-845,1982) 克隆 DNA 序列可以通過(guò)例如脂轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微注射、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒投遞、電穿孔、聲穿孔(sonoporation)、激光照射、磁轉(zhuǎn)染(magnetofection)、天然轉(zhuǎn)染、 和生物射彈轉(zhuǎn)化來(lái)導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(參見例如Mehier-Humbert等，Adv. Drug Deliv. Rev. 57 :733-753,2005)。為了鑒定并選擇表達(dá)外源DNA的細(xì)胞，一般將賦予可選擇表型(選擇標(biāo)志)的基因與感興趣的基因或cDNA—起導(dǎo)入細(xì)胞中。合適的標(biāo)志物包括例如賦予對(duì)藥物諸如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、和甲氨蝶呤的抗性的基因。選擇標(biāo)志可以是可擴(kuò)增選擇標(biāo)志，其在連接序列時(shí)容許擴(kuò)增標(biāo)志物和外源DNA。例示性的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志包括二氫葉酸還原酶(DHFI )和腺苷脫氨酶。選擇合適的選擇標(biāo)志在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)(參見例如美國(guó)專利號(hào)5，238，820)。用DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，將它們?cè)诤线m的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以表達(dá)感興趣的基因，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基”指含有細(xì)胞生長(zhǎng)和突變蛋白表達(dá)需要的營(yíng)養(yǎng)物和其它成分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一般包含例如碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖類、維生素、鹽、磷脂、蛋白質(zhì)；而且還可以提供生長(zhǎng)因子。然后，應(yīng)用藥物選擇來(lái)選擇以穩(wěn)定方式表達(dá)選擇標(biāo)志的細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于已經(jīng)用可擴(kuò)增選擇標(biāo)志轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以提高藥物濃度以選擇拷貝數(shù)增加的克隆序列，由此提高表達(dá)水平。然后，對(duì)經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的克隆篩選突變蛋白表達(dá)。用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的例子是C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼侖鼠腎(BHK)、 HKBll (Cho 等，J. Biomed. Sci, 9 :631_638，2002)、和 HEK-293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等， J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)細(xì)胞系。另外，可以在本發(fā)明內(nèi)使用許多其它細(xì)胞系， 包括大鼠Hep I (大鼠肝瘤；ATCC CRL1600)、大鼠H印II (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)、 TCMK-I(ATCC CCL 139)、H印-G2(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1),CH0-K1(ATCC CCL61)、和 CHO-DUKX 細(xì)胞(Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980)?？梢詮募?xì)胞培養(yǎng)基回收突變蛋白，然后通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法將其純化， 所述方法包括但不限于層析(例如離子交換、親和力、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳方法(例如制備等電聚焦(pr印arative isoelectricfocusing, IEF)、差別溶解度(例如硫酸銨沉淀))、提取(參見例如 ProteinPurification, Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York，1989)，或其各種組合?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的化學(xué)純化手段，諸如高效液相層析來(lái)實(shí)現(xiàn)別的純化。其它純化方法是本領(lǐng)域中已知的，而且可以適用于突變蛋白的純化(參見例如 Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag, N. Y.，1982)。一般而言，“純化的”應(yīng)當(dāng)指已經(jīng)進(jìn)行過(guò)分級(jí)以除去各種其它成分，而且基本上保留其表達(dá)的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)、多肽、或肽組成。在使用術(shù)語(yǔ)“基本上純化的”的情況中， 此名稱應(yīng)當(dāng)指如下的組合物，其中蛋白質(zhì)、多肽、或肽形成組合物的主要成分，諸如構(gòu)成組合物中約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、或更多的蛋白質(zhì)。多種用于量化蛋白質(zhì)純化程度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括例如測(cè)定活性級(jí)分的比活，或通過(guò)SDS/PAGE分析來(lái)評(píng)估級(jí)分內(nèi)的多肽量。用于評(píng)估級(jí)分純度的例示性方法是計(jì)算級(jí)分的比活，與初始提取物的比活比較活性，并且如此計(jì)算在本文中通過(guò) “倍值純化數(shù)目”評(píng)估的純度。當(dāng)然，用于表示活性量的實(shí)際單位會(huì)取決于特定的測(cè)定技術(shù)?！巴葱浴敝竷煞N蛋白質(zhì)或多核苷酸序列之間的相似性程度。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)測(cè)定兩種序列間的對(duì)應(yīng)性。例如，可以通過(guò)直接比較多核苷酸或蛋白質(zhì)序列的序列信息來(lái)測(cè)定同源性。通常，若兩種序列展現(xiàn)出至少75%序列同一性、80%序列同一性、85% 序列同一性、90%序列同一性、或95%序列同一性，則所述序列可以是同源的。為了測(cè)定兩種蛋白質(zhì)序列或兩種多核苷酸序列的百分比同源性，為了最佳比較目的而比對(duì)所述序列。例如，為了與另一種蛋白質(zhì)或多核苷酸進(jìn)行最佳比對(duì)，可以在一種蛋白質(zhì)或多核苷酸的序列中引入缺口。然后，比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。在一種序列中的位置被與另一序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在所述位置處是同源的。如本文中所使用的，氨基酸或核酸“同源性”與氨基酸或核酸“同一性”是等同的。兩種序列間的百分比同源性是由序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)，即百分比同源性等于相同位置數(shù)目/位置總數(shù)的100倍。本發(fā)明還涵蓋具有較低程度的同一性，但是具有足夠的相似性以實(shí)施由本發(fā)明的突變蛋白實(shí)施的一項(xiàng)或多項(xiàng)相同功能的突變蛋白。通過(guò)保守氨基酸取代來(lái)測(cè)定相似性。此類取代是用相似特征的另一種氨基酸取代蛋白質(zhì)中給定的氨基酸的取代。通常，視為保守取代的是脂肪族氨基酸Ala、Val, Leu、和Ile間的彼此取代；羥基殘基Ser與Thr的互換； 酸性殘基Asp與Glu的互換；酰胺殘基Asn與Gln間的取代；堿性殘基Lys與Arg的交換和芳香族殘基Wie、TrpJP Tyr間的取代。特定氨基酸的單字母縮寫、其相應(yīng)的氨基酸、和三字母縮寫如下A，丙氨酸 (Ala) ；C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨酸(Gly) ；H，組氨酸(His) ；I，異亮氨酸(Ile) ；K，賴氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，絲氨酸(Ser) ；T，蘇氨酸(Thr) ；V，纈氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。同一性和相似性兩者都可以容易計(jì)算(Computational Molecular Biology, Lesk, Α.Μ.編，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編，Academic Press, New York,1993 ；Computer Analysis of sequence Data, nP^ !,Griffin,A. M. ,and Griff in, H. G.編，Humana Press,
8New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in MolecularBiology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；及 Sequence Analysis Primer,Gribskov, M.和 Devereux, J.編，M.Stockton Press, New York，1991)。用于測(cè)定兩種序列間的同一性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于 GCG 程序包(Devereux 等，Nucleic Acids Res. 12 :387,1984)、BLASTP、BLASTN、 FASTA (Atschul 等，J. Molec. Biol. 215 :403,1990)。突變蛋白可以在氨基酸序列上相差一處或多處取代、缺失、插入、倒位、融合、和截短或任何這些的組合。另外，變型可以提供摻入突變蛋白的肽標(biāo)簽或肽表達(dá)標(biāo)簽。肽標(biāo)簽可以是FLAG標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、E標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽、或相似肽標(biāo)簽。肽標(biāo)簽可以存在于N端、C 端或突變蛋白中的別處。肽標(biāo)簽在體內(nèi)和在體外都可用于檢測(cè)、純化、或鑒定突變蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員一般會(huì)理解的是，肽標(biāo)簽序列通常會(huì)從最終藥物物質(zhì)的制備或表達(dá)中使用的序列除去。使用方法如本文中所使用的，下文定義了多項(xiàng)術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“治療/處理”包括任何方法、作用、應(yīng)用、療法等，其中以直接或間接改善受試者的狀況或者減緩受試者中的狀況或病癥進(jìn)展的目的，給受試者(或患者)(包括人)提供醫(yī)學(xué)幫助。短語(yǔ)“治療有效的”指施用的如下藥劑量，其會(huì)實(shí)現(xiàn)改善疾病、狀況、和/或病癥嚴(yán)重性的目的，而避免與給定治療性處理有關(guān)的不利副作用或者使所述副作用最小化。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”指主題項(xiàng)適合于在藥物產(chǎn)品中使用。因而，本發(fā)明的實(shí)施方案包括一種在患者中治療血友病的方法，其包括對(duì)所述患者皮下施用含有一定量的偶聯(lián)的FVIII、FVII、FIX、或其突變蛋白的組合物。術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合療法”或“綜合療法(co-therapy) ”指施用兩種或更多種治療劑以治療疾病、狀況、和/或病癥。此類施用涵蓋以基本上同時(shí)的方式共施用兩種或更多種治療劑或者以序貫方式施用每類治療劑。聯(lián)合療法包括施用含有偶聯(lián)的FVIII、FVII、FIX、或其突變蛋白和一種或多種別的治療劑的藥學(xué)單劑配制劑，及施用其自身分開的藥學(xué)劑量配制劑中的偶聯(lián)的FVIII、FVII、 FIX、或其突變蛋白和每種別的治療劑。例如，可以在單劑組合物中對(duì)患者一起施用偶聯(lián)的 FVIII、FVII、FIX、或其突變蛋白和治療劑或者可以在分開的劑量配制劑中施用每種藥劑。在使用分開的劑量配制劑的情況中，可以在基本上相同的時(shí)間(例如并發(fā)地)或在交錯(cuò)分開的時(shí)間(例如序貫地)施用偶聯(lián)的FVIII、FVII、FIX、或其突變蛋白和一種或多種別的治療劑。藥物組合物可以在包含藥學(xué)可接受載體的藥物組合物中提供如本文中所描述的偶聯(lián)的 FVIII、FVII、FIX、或其突變蛋白。藥學(xué)可接受載體可以是無(wú)熱原的。可以單獨(dú)地或者與至少一種其它藥劑諸如穩(wěn)定化合物聯(lián)合施用組合物，所述其它藥劑可以在任何無(wú)菌的、生物相容性藥物載體(包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖酐、和水)中施用?？梢圆捎枚喾N水性載體，包括但不限于鹽水、甘氨酸等。這些溶液是無(wú)菌的，而且一般沒有顆粒物質(zhì)。這些溶液可以通過(guò)常規(guī)的公知滅菌技術(shù)(例如過(guò)濾)來(lái)滅菌。組合物可以含有如合適的生理學(xué)條件所需要的藥學(xué)可接受輔助物質(zhì)，諸如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑等。依照特定的施用模式，偶聯(lián)的FVIII、FVII, FIX、或其突變蛋白在此類藥物配制劑中的濃度可以廣泛變化，而且可以主要基于流體體積、粘性等進(jìn)行選擇?？梢詥为?dú)地或者與其它藥劑、藥物或激素聯(lián)合施用組合物。在活性成分外，這些藥物組合物可以含有合適的藥學(xué)可接受載體，其包括促進(jìn)活性化合物加工成可藥學(xué)使用的制劑中的賦形劑和輔助劑(auxiliary)。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)皮下手段施用。適合于皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等的配制劑；合適的藥物載體；和用于配置和施用的技術(shù)可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法來(lái)準(zhǔn)備(參見例如Remington，s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，第 20 片反，2000)。治療有效劑量的確定治療有效劑量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。治療有效劑量指與缺乏治療有效劑量情況中明顯的功效相比，可以用于有效治療疾病(例如血友病)的藥劑量。治療有效劑量可以最初在動(dòng)物模型(例如大鼠、小鼠、兔、犬、或豬)中評(píng)估。還可以使用動(dòng)物模型來(lái)測(cè)定合適的濃度范圍和施用模式。然后，可以使用此類信息來(lái)在人中測(cè)定有用的劑量和施用路徑。從業(yè)人員根據(jù)與需要治療的患者相關(guān)的因素來(lái)確定精確的劑量?？梢哉{(diào)節(jié)劑量和施用以提供足夠的藥劑水平或維持想要的效果?？梢钥紤]的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、 受試者的一般健康、受試者的年齡、重量、和性別、飲食、施用時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性、和耐受性/對(duì)療法的響應(yīng)。通過(guò)提及而明確收錄本公開內(nèi)容中所提及的所有專利和專利申請(qǐng)。上述公開內(nèi)容廣泛地描述了本發(fā)明。通過(guò)提及以下具體的實(shí)施例來(lái)獲得更完整的理解，所述具體的實(shí)施例僅為了例示目的而提供，而且并不意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例為了使本發(fā)明可以得到更好的理解，列出了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅為了例示目的，而不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過(guò)提及而完整收錄本文中所提及的所有出版物。實(shí)施例1 對(duì)皮內(nèi)施用的FVIII的活性的分析給未處理的(naive)血友病A小鼠皮內(nèi)施用13個(gè)IU/小鼠的rFVIII、在 PEG-脂質(zhì)體(FVIII-Lip)中配制的14個(gè)IU/小鼠的rFVIII、12個(gè)IU/小鼠的PEG化的 FVIII (PEG-FVIII)、和以1 2的摩爾比率與vWF預(yù)混合的15個(gè)IU/小鼠的rFVIII。然后在劑量給藥后1、4、和8小時(shí)時(shí)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理3只小鼠)對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死，并獲得血液樣品。然后通過(guò)Coatest測(cè)定法來(lái)測(cè)定血漿FVIII活性。圖1中顯示了結(jié)果。與rFVIII、FVIII-Lip、和FVIII/vWF復(fù)合物(其僅具有勉強(qiáng)可檢測(cè)的血漿FVIII 活性水平，而且其在所檢查的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)是各輸入劑量的約0. 1-0.4% )相比， PEG-FVIII在所有時(shí)間點(diǎn)時(shí)實(shí)現(xiàn)平均高10倍的回收，范圍為輸入劑量的1-5%。
權(quán)利要求
1.一種治療血友病的方法，包括對(duì)有所需要的患者皮下或皮內(nèi)施用有效量的凝固因子或其突變蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)處共價(jià)附接于一種或多種生物相容性聚合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物相容性聚合物選自聚環(huán)氧烷、右旋糖酐、多聚乙酰神經(jīng)氨酸、基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇、聚羧酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、聚苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、聚P惡唑啉、聚丙烯酰嗎啉、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解物、淀粉、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、支鏈淀粉、菊粉、黃胞膠、角叉菜膠、果膠、和藻酸水解物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚環(huán)氧烷包括聚乙二醇。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述聚乙二醇包括甲氧基聚乙二醇。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述甲氧基聚乙二醇具有5kDa至150kDa的大小范圍。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述淀粉包括羥乙基淀粉和羥丙基淀粉。
7.權(quán)利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物共價(jià)附接于所述凝固因子或其突變蛋白上的預(yù)定位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述凝固因子選自FVII、FVIII、和FIX、及其突變蛋白。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將所述生物相容性聚合物在選自下組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)處共價(jià)附接于 FVIII :81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、 1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。
10.權(quán)利要求9的方法，其中用位點(diǎn)特異性半胱氨酸突變?nèi)〈┥锵嗳菪跃酆衔锔浇佑玫乃鲆粋€(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求8的方法，其中FVIII是B域缺失型FVIII。
12.權(quán)利要求11的方法，其中B域缺失型FVIII包含選自下組的一處或多處氨基酸取代81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、 1810、1864、1903、1911、2091、2118 和 2284。
13.權(quán)利要求12的方法，其中將生物相容性聚合物在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)取代處共價(jià)附接于B域缺失型FVIII。
14.權(quán)利要求1的方法，其中預(yù)防性施用凝固因子或其突變蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療血友病的方法，包括對(duì)有所需要的患者皮下或皮內(nèi)施用有效量的凝固因子或其突變蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)處共價(jià)附接于一種或多種生物相容性聚合物。
文檔編號(hào)A61K38/36GK102202684SQ200980142604
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日
發(fā)明者劉彤瑤, 張欣, 蔣海燕 申請(qǐng)人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司